MK-2206

适合希望深度理解该研究的专业读者（如肿瘤学、细胞生物学、蛋白质代谢多组学领域的研究人员）或高年级本科生、研究生。完整文章六千四百字，在移动端需要连续滑动多次才能读完，读者请谨慎阅读。 研究亮点与核心突破 本研究是一项在肿瘤代谢与细胞生物学交叉领域的重大突破，其亮点集中体现在 “一个新机制，一个新靶点，一套新策略”。 机制创新：首次将“相分离”引入乳腺癌脂代谢调控。 研究颠覆了传统上从基因表达或酶活性变化理解代谢重编程的线性思维，首次发现关键脂酶DDHD2能通过液-液相分离形成“生物分子凝聚体”。这个动态的“微型反应器”能极大增强DDHD2的催化效率，如同将“单人作业”升级为“高效流水线”，从空间组织与化学反应动力学的全新层面，揭示了癌细胞高效重塑脂质代谢的底层逻辑。 靶点发现：明确DDHD2是Luminal型乳腺癌的代谢弱点。 研究从中国人群大规模多组学数据出发，不仅锁定DDHD2是驱动脂质异常的关键基因，更阐明了其通过降低促铁死亡脂质来帮助肿瘤细胞“金蝉脱壳”的具体机制。这为临床上内分泌治疗效果不佳或复发的患者，指出了一个全新的、可操作的分子靶点。 策略革新：提出“代谢靶向+铁死亡诱导+内分泌治疗”的联合治疗新范式。 研究并未止步于机制，而是强力推进至临床转化。实验证明，使用DDHD2抑制剂（KLH45）可显著“点燃”肿瘤细胞对铁死亡的敏感性，与铁死亡诱导剂（RSL3/IKE）联用显示出强大的协同抗肿瘤效果。更重要的是，该联合策略能有效增强传统内分泌药物（他莫昔芬）的疗效，为克服内分泌耐药提供了充满希望的新方案。 研究背景及问题聚焦 临床困境：Luminal型（ER阳性）乳腺癌占所有乳腺癌的约2/3，虽对内分泌治疗敏感，但仍是复发风险最高的亚型之一。其背后高度异质性和获得性耐药是临床管理的巨大挑战。 代谢谜题：脂质代谢重编程是肿瘤的十大特征之一，为癌细胞提供能量、构建膜结构并参与信号传递。在乳腺癌中，三阴性乳腺癌（TNBC）的脂质代谢和铁死亡敏感性已被广泛研究，但Luminal亚型独特的脂质代谢图谱及其功能意义却如“雾里看花”。 前沿机制：相分离是近年来生命科学领域的革命性概念，它通过蛋白质的“液-液相变”在细胞内形成无膜细胞器，实现对生化反应的时空精密调控。然而，这一机制在肿瘤，特别是在代谢调控中的作用，几乎是一片“无人区”。 本研究聚焦的核心问题： What：Luminal型乳腺癌是否存在独特的脂质代谢特征？这种特征与患者预后有何关联？ How：谁是驱动这种脂质代谢异常的“元凶”？其背后的分子机制是什么？是否有超越传统转录调控的新颖机制参与？ Why：这种代谢重塑如何影响肿瘤细胞的命运（如对铁死亡的敏感性）和治疗的响应？ So What（如何应用）：能否基于此发现，设计出新型的联合治疗策略来改善Luminal型乳腺癌的治疗效果？ 实验策略与核心发现 从临床现象出发，锁定关键分子，深入机制解析，最终回归临床治疗。 第一步：临床现象与靶点初筛 目标：系统描绘Luminal型乳腺癌的脂质代谢图谱，并寻找驱动基因。 how&why：利用中国乳腺癌基因组图谱队列的多组学数据（n=773），进行脂质组学和转录组学分析。多组学整合能全面捕捉从基因组变异到代谢表型的完整链条。 发现： Lumanl型肿瘤的甘油三酯、多不饱和脂肪酸磷脂等脂质水平显著低于其他亚型，且TAG代谢低下与患者不良预后显著相关。 通过分析拷贝数变异与基因表达的顺式调控关系，从776个脂代谢相关基因中，锁定DDHD2 的表达与绝大多数脂质含量呈强负相关，成为头号嫌疑分子。 第二步：功能验证：DDHD2是“脂质消耗者”与“铁死亡防火墙” 目标：验证DDHD2的生物学功能及其对肿瘤细胞行为的影响。 如何做与为何做：在Luminal乳腺癌细胞系（MCF7， T47D）中进行基因敲低、过表达、催化失活突变体（S351A）构建，并结合脂质组学、脂滴染色、细胞增殖和铁死亡敏感性检测。使用DDHD2小分子抑制剂KLH45进行药理学验证。 发现： 功能：DDHD2具有脂肪酶活性，能水解TAG，减少脂滴储存。敲低DDHD2使细胞内TAG增加超2倍，而过表达野生型（非催化失活突变体）能降低TAG。 表型：DDHD2促进肿瘤细胞生长。其机制在于，它通过消耗PUFA-TAG和PUFA-PL等促铁死亡脂质，降低了细胞的铁死亡敏感性。敲低DDHD2后，细胞在铁死亡诱导剂（RSL3）作用下死亡加剧，而铁死亡抑制剂可挽救此表型。 第三步：机制深挖：相分离——效率倍增的“开关” 目标：解释DDHD2如何被精确调控以实现其高效功能。 如何做与为何做：在显微镜下观察到DDHD2在细胞内形成动态的“点状”结构，怀疑其发生相分离。随后通过一系列相分离鉴定“金标准”实验进行验证：用1,6-己二醇（破坏液-液相分离）处理、荧光漂白恢复实验、体外重组蛋白液滴形成实验等。并分析其蛋白结构，探寻关键无序区。 发现： DDHD2确实在细胞内和体外能形成动态的、液态样的生物分子凝聚体。 其固有无序区1是相分离发生的关键结构域。 AKT1激酶可直接磷酸化DDHD2（Ser447/593位点），从而像“启动按钮”一样促进其相分离。磷酸化模拟突变体（S447/593D）能促进凝聚体形成，而磷酸化缺陷突变体（S447/593A）则抑制形成。 机制闭环：相分离形成的凝聚体，将DDHD2酶和底物TAG“浓缩”在微型反应器中，使其脂肪酶活性提升约40%。破坏相分离（ΔIDR1突变）或抑制其磷酸化（AKT1敲低），都会使DDHD2的酶活性和功能大打折扣。 第四步：治疗转化：从机制到床旁的最后一公里 目标：验证靶向DDHD2及其通路的治疗潜力。 如何做与为何做：在细胞系、患者来源类器官 和小鼠移植瘤模型三个层面上，测试DDHD2抑制剂（KLH45）与铁死亡诱导剂（RSL3/IKE）及内分泌药（他莫昔芬）的联合疗效。使用患者数据关联DDHD2表达与内分泌治疗响应。 发现： KLH45与铁死亡诱导剂在抑制肿瘤生长上表现出强协同作用。在动物模型中，联合用药使肿瘤体积和重量下降超60%。 临床数据分析显示，DDHD2高表达与内分泌治疗耐药相关。 三药联合（KLH45 + IKE + 他莫昔芬）在体内外模型中均展现出最佳的抗肿瘤效果，为克服内分泌耐药提供了全新方案。 关键数据与图表解读 Figure 1：描绘临床图谱，锁定问题。 整体发现：Luminal型乳腺癌具有独特的脂质代谢“指纹”——TAG和PUFA脂质普遍偏低，且这种低TAG代谢状态与患者不良预后（总生存期、无远处转移生存期）显著相关。 如何发现：通过大规模队列的脂质组学和转录组学数据比对分析。 解释问题：回答了“What”—— Luminal型乳腺癌存在特异的、与预后相关的脂质代谢紊乱，这构成了本研究的临床起点。 Figure 2 & 3：验证DDHD2功能，关联铁死亡。 Fig 2：证明DDHD2是关键的“脂质消耗者”。其表达与脂质含量负相关（2B）；敲低或药抑DDHD2导致TAG和脂滴积累（2D, 2E, 2F）；其功能严格依赖酶活性（S351A突变体失效）（2H）。 Fig 3：揭示DDHD2的功能后果是抑制铁死亡。DDHD2低表达的肿瘤样本中，膜脂（铁死亡底物）和活性氧更丰富（3D）；敲低DDHD2使细胞对RSL3诱导的铁死亡极度敏感（3E-G）；此保护作用依赖其酶活性（3J-L）。 解释问题：回答了“Who”和“What consequence”—— DDHD2是核心调控因子，它通过脂酶活性消耗促铁死亡脂质，为肿瘤细胞穿上“防铁死亡盔甲”。 Figure 4 & 5：揭示相分离机制与上游调控。 Fig 4：证实DDHD2发生液-液相分离。展示了其形成动态、可融合、可恢复的液态凝聚体（4A-G），并在体外重现（4H-I）。结构域分析锁定IDR1是关键（4K-M）。 Fig 5：阐明上游调控开关。证明AKT1激酶直接磷酸化DDHD2（5B-E），并且此磷酸化是促进其相分离（5F-I）和凝聚体形成的关键。 解释问题：回答了“How in depth”—— DDHD2的功能受到“相分离”这一新颖机制的精密调控，而PI3K/AKT这条在乳腺癌中频繁激活的经典通路，正是触发这一机制的“扳机”。 Figure 6：机制闭环验证。 证明破坏相分离（ΔIDR1）或抑制磷酸化（S447/593A突变）会显著削弱DDHD2的酶活性，导致TAG和脂滴积累（6A-F），并恢复细胞对铁死亡的敏感性（6J-O）。AKT1敲低可逆转DDHD2过表达引起的TAG降低（6G-H）。 解释问题：将上游调控（AKT磷酸化）、核心机制（相分离）、功能输出（酶活性增强）和细胞表型（抗铁死亡）完美串联，形成一个完整的信号轴：AKT1磷酸化 → DDHD2相分离 → 酶活性增强 → 脂质水解 → 促铁死亡脂质减少 → 铁死亡抵抗。 Figure 7：治疗转化验证。 在细胞、类器官和小鼠模型三个层面，系统验证了DDHD2抑制剂KLH45能协同铁死亡诱导剂，有效抑制肿瘤生长（7A-J）。并进一步证明，该联合策略能显著增强内分泌治疗药物他莫昔芬的疗效（7K-O）。 回答了“So what”—— 基于上述机制，成功开发出具有强大潜力的联合治疗新策略，完成了从基础研究到临床前转化的闭环。  结论与讨论 本研究首次阐明，在Luminal型乳腺癌中，DDHD2在AKT1介导的磷酸化驱动下发生相分离，形成生物分子凝聚体，从而极大增强其脂肪酶活性，通过重塑脂质代谢、降低促铁死亡脂质水平，最终导致肿瘤细胞获得铁死亡抵抗能力，促进肿瘤进展和内分泌治疗耐药。靶向DDHD2可逆转此过程，与铁死亡诱导剂及内分泌治疗联用，形成极具前景的新型联合疗法。 研究的创新性与优势： 视角新颖：首次将“相分离”与“肿瘤脂代谢”和“铁死亡”三大前沿领域交叉融合，开辟了新的研究方向。 逻辑严谨：从临床数据→细胞功能→分子机制→动物验证→治疗探索，研究设计层层递进，证据链完整。 转化性强：不仅揭示了新机制，更直接指向了可靶向的分子（DDHD2）和可测试的药物（KLH45），并提供了清晰的联合用药方案。 研究的局限性与未来方向： 组分未知：DDHD2凝聚体中是否还有其他“乘客”蛋白或RNA共同发挥作用？其完整的“成员名单”和相互作用网络尚不清晰。 机制细节：DDHD2具体如何“选择性地”降低促铁死亡脂质（如PUFA-PL），而不影响其他脂质？其与铁死亡执行机器（如GPX4, ACSL4等）的直接或间接对话机制有待深究。 环境互作：肿瘤微环境（如脂肪细胞、免疫细胞）是否以及如何影响DDHD2的相分离和功能？这关系到疗法的实际应用场景。 工具开发：未来或可开发针对DDHD2相分离状态的活细胞探针或小分子干扰剂，实现更精准的靶向治疗。 核心数据、材料与方法 数据： 样本自主收集核心队列：中国乳腺癌基因组图谱队列， 773例样本，包含RNA-seq、脂质组、拷贝数变异、蛋白质组等多组学数据。 验证队列：TCGA、METABRIC公共数据库。 实验模型： 细胞系：Luminal乳腺癌细胞系（MCF7, T47D）。 类器官：患者来源的Luminal乳腺癌类器官。 动物模型：BALB/c裸鼠原位移植瘤模型。 关键技术方法： 组学与生物信息学：多组学整合分析、生存分析、通路富集分析。 脂质代谢分析：脂质组学、TAG含量测定、BODIPY脂滴染色。 分子细胞生物学：基因敲低/过表达、点突变构建、免疫印迹、免疫荧光、体外激酶实验。 相分离鉴定：活细胞成像、荧光漂白后恢复、体外液滴形成实验、1,6-己二醇处理。 功能与药理学：细胞增殖/活力检测、铁死亡敏感性分析（RSL3, Fer-1）、脂质过氧化（C11-BODIPY）和MDA检测、小分子抑制剂/激活剂处理（KLH45, SC79, MK2206）。 治疗验证：患者来源类器官药敏测试、小鼠体内药效实验。 文章点评 1. 长远看，这篇研究真正好在哪？ 本研究长远的价值，远不止于发现一个新基因或一条新通路，而是成功地将“相分离”这一前沿基础生物学概念，引入并牢固地镶嵌到了“肿瘤代谢重编程”和“治疗抵抗”这两个经典临床问题中，开创了一个新的研究范式。 其长远价值体现在： 1，为整个领域树立了一个标杆，证明相分离是调控代谢酶活性的关键机制。未来必将有大量研究在各类癌种和代谢通路中寻找类似的“相分离-代谢”调控模块。 2，不仅指出DDHD2是一个靶点，更阐明了靶向其“相分离能力”或“凝聚体形成”可能是比单纯抑制酶活性更精准、高效的新药研发思路。 3，它提出的“靶向代谢弱点+诱导铁死亡+联合标准疗法”策略，是一个可推广的治疗框架，为克服多种癌症的耐药问题提供了方法论启示。 2. 本团队研究进展脉络是什么？ 以江一舟/邵志敏教授为核心的团队，其研究呈现一条清晰的“临床问题驱动，多组学导航，向基础机制深处掘进，最终回归临床转化”的纵深脉络： 图谱绘制与分型：早期工作（如建立CBCGA中国人群乳腺癌多组学队列）旨在系统描绘乳腺癌基因组、转录组图谱，解决异质性问题，为精准分型奠定基础。 锁定关键临床表型：进而聚焦于最棘手的临床问题，如“复发转移”和“治疗耐药”，利用多组学数据关联寻找驱动这些表型的分子特征（如本研究聚焦Luminal型复发与脂代谢异常）。 机制深挖与概念引入：不满足于找到关联基因，而是深入探究其背后新颖、深刻的分子机制。本研究是典范——从代谢异常追溯到相分离这一极为基础的细胞生物学过程，将研究推至国际最前沿。 闭环转化：机制研究直接导向治疗假设，并在患者来源类器官、动物模型等多个临床前模型中快速验证，形成“从临床来，到临床去”的完整闭环。团队此前在TNBC铁死亡免疫治疗的研究也遵循此逻辑。 3. 同领域其他团队做的什么方向以及做到哪了、差异在哪？ 领域方向： 肿瘤脂代谢领域：多数团队聚焦于脂肪酸合成、氧化或胆固醇代谢，研究其对细胞生长、信号传导的影响。铁死亡研究也多集中于GPX4、ACSL4等经典调控分子。 相分离领域：在癌症中，研究多集中于相分离在转录调控、染色质结构、信号转导复合体形成（如转录因子、激酶）中的作用。 差异与本研究独特性： 关键差异：本研究首次将相分离与脂代谢酶活性及铁死亡敏感性直接耦合。此前，相分离在代谢中的角色零星报道，但如此完整地揭示一个脂酶通过相分离增强活性，并直接决定细胞死亡命运的链条，是独到的。 癌型差异：铁死亡研究在TNBC中火热，但普遍认为Luminal型对其不敏感。本研究精准回答了“为什么不敏感”这一关键问题，填补了空白。 视角差异：不同于许多研究关注“如何促进铁死亡”，本研究反向揭示了肿瘤细胞“如何主动防御铁死亡”，提供了新的干预视角。 4. 为什么选这个方向 / 选题？ 临床迫切性（天时）：Luminal型乳腺癌内分泌治疗耐药/复发是悬而未决的重大临床难题，亟需新策略。 尽管知悉脂代谢重要，但驱动Luminal型脂代谢紊乱的关键基因组事件和核心机制不明；同时，相分离在代谢中的角色几乎是空白。两者交汇处，存在一个高价值的“无人区”。 团队自身优势（地利人和）： 数据资源：拥有CBCGA这一大型、高质量、多组学中国患者队列，具备从海量数据中挖掘关键分子的能力。 技术积累：团队在代谢研究、铁死亡、类器官模型等领域已有深厚积累。 前沿视野：敏锐地捕捉到“相分离”这一新兴工具，并敢于将其用于解决传统代谢问题。 5. 实验设计、机制路线为什么这么做，而舍弃或不选别的？ 本研究实验设计是阶梯式、因果逻辑极强的“剥洋葱”策略，每一层都为解决上一层的疑问： 为什么从多组学开始，而非直接敲减基因？ 为了确保研究源于真实的、有预后价值的临床现象，避免“为了机制而机制”，保证了研究的临床相关性。 为什么在验证DDHD2功能后，不直接做抑制剂筛选，而是先探索相分离？ 因为核心科学问题是“DDHD2如何高效地实现其功能”。简单的酶活性检测无法解释其效率，而显微镜下观察到的“点状”结构引向了更深层的调控机制问题。探索相分离是为了回答“How”的终极问题。 为什么花大量精力验证AKT1磷酸化？ 因为这不仅是一个上游信号，更是连接“致癌信号通路”与“相分离-代谢”新机制的关键桥梁，使发现更具普遍意义，并链接到PI3K/AKT这一经典治疗靶点。 为何舍弃其他路径？ 研究也验证了（SI Appendix, Fig. S3D），DDHD2不通过改变经典铁死亡基因表达发挥作用，从而舍弃了在转录调控层面的过度延伸，聚焦于酶活性-底物消耗这一更直接的路径，使得机制更干净、有力。 6. 对未来科研或研究有什么启示？ 1，将最前沿的基础生物学概念（如相分离、相变）与长期未解决的临床病理学问题交叉融合，是产生突破性研究的突破口。 2，“反向思维”，不仅研究“如何杀死细胞”，更要研究“细胞如何抵抗死亡”。针对肿瘤的“防御机制”进行打击，可能带来新策略。 3，机制研究需深入至“效率”层面，所以未来对关键代谢酶或信号蛋白的研究，不应止步于其表达或活性变化，应追问其活性是否及如何通过空间组织（如相分离、细胞器定位）被精确调控。 4，从立项之初，就应构想好从临床问题→机制发现→治疗假说→临床前验证的完整回路，并以PDO、人源化模型等更贴近临床的模型作为验证终点，加速转化。 5，可沿此范式，探索DDHD2凝聚体中是否存在其他蛋白/RNA组分，其相分离是否受肿瘤微环境信号调控，以及能否开发小分子特异性破坏其相分离而不影响酶活性本身，实现更精准的干预。 本文原创仅指公众号文章创造，文献内容与图片版权归原著所有，文献解读仅用于学术分享，如有侵权请与后台联系。 关注公众号了解更多科研资讯、文献解读和期刊选择相关内容； 科研之路，规划比努力更重要，多组学技术服务赋能科研优人一步；欢迎交流合作；微信：BioArtOmics 欢迎大家一键三连，喜欢我，你就转发我；有话说，你就评论我；都不干你就点个赞！！！

Wenthur, C. J.; Gentry, P. R.; Mathews, T. P.; Lindsley, C. W. Drugs for Allosteric Sites on Receptors. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2014, 54, 165–184. https://doi.org/10.1146/annurev-pharmtox-010611-134525.0 摘要 在多种受体家族中发现具有可成药性且在拓扑结构上彼此不同的别构位点，为小分子调控受体功能提供了新的研究范式。与作用于正构位点的配体相比，靶向别构位点的配体在选择性方面具有显著优势，例如能够在同一受体家族内部实现亚型选择性，同时还可能赋予分子更优的理化性质。然而，别构配体并非解决所有问题的万能策略。随着研究的深入，一系列以别构调控为中心的化学与药理学问题逐渐显现，例如较为平坦的构效关系以及配体偏向性信号传导等。此外，由于别构位点在进化过程中保守性较低，这一特点虽然有助于提高选择性，但也可能带来物种之间的差异，从而在安全性评估中产生挑战。许多别构配体还表现出“分子开关”特征，即分子结构的细微变化(无论是化学修饰还是代谢变化)都可能改变其药理作用模式或受体亚型选择性。随着该领域不断发展，一系列关键原则与策略逐渐形成，用于指导针对别构位点的配体与药物设计。1 引言 尽管小分子对蛋白质产生别构调控的概念早在20世纪中期就已被提出，但这一思想经过数十年的发展才逐渐受到广泛关注。许多研究将1965年视为别构理论正式确立的关键节点，因为Monod-Wyman-Changeux模型提出了“构象选择”机制，用以解释配体在细菌调控酶中的作用方式。然而，别构药物发现真正作为一种可行的治疗策略受到重视，则是在苯二氮卓类药物取得临床成功之后。该类药物属于别构配体，通过增强神经递质γ-氨基丁酸(GABA)在离子型GABAA受体上的作用而发挥药效，并避免了直接作用型GABAA受体激动剂可能带来的致命副作用。自这一发现以来，开发别构配体作为药物的研究兴趣持续增长。事实上，自1985年至今，关于别构受体调节剂的研究论文数量几乎呈指数式增长，这一趋势在专利文献中也同样明显。文献与专利活动的显著增加反映出别构配体研究已扩展至广泛的靶标类别，包括离子通道、激酶、半胱天冬酶、G蛋白偶联受体(GPCR)以及磷脂酶等。这些类别中包含大量具有治疗潜力的靶标，许多学术机构和商业团队均开展了相关研究。该领域的发展表明，要将别构配体成功开发为安全有效的治疗药物，需要新的小分子设计策略，并对药理学特性以及体内分布和代谢进行更加深入的评估。 图1｜根据Web of Knowledge数据库(http://www.webofknowledge.com/)统计，1985年至2012年间每年提及“别构受体调节剂”概念的文献数量。 美国专利商标局数据库(http://patft.uspto.gov/)中的相关趋势与之类似。2 正构调控与别构调控 每一种受体或蛋白质通常都具有一个特定的内源性配体结合位点，该位点被称为正构结合位点(orthosteric binding site)，而能够与该位点结合的天然或合成配体被称为正构配体。对于激酶而言，其正构配体为三磷酸腺苷(ATP)；对于GPCR和离子通道而言，正构配体可能是小分子神经递质，例如谷氨酸或GABA，也可能是较大的多肽，如orexin。经典的合成正构配体通常通过放射性配体结合实验被发现，它们通过与内源性配体竞争结合靶点来发挥作用，并表现出多种药理效应，例如抑制剂、激动剂、拮抗剂或反向激动剂。 历史上，绝大多数获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准的药物都作用于受体或蛋白质的正构位点。然而，这类配体往往存在疗效不足、长期用药后疗效下降、选择性有限或耐药性等问题。 在GPCR、离子通道、半胱天冬酶、激酶和磷脂酶等多类蛋白中，除了正构结合位点之外，还存在拓扑结构和功能上均与之不同的别构结合位点。别构位点的存在使得配体与受体之间能够形成更多样的相互作用方式，并产生不同于正构位点调控的信号调节现象。高通量筛选(HTS)技术和功能性实验方法的发展进一步推动了这一研究方向，使得能够识别出影响靶标功能但不必局限于正构位点结合的小分子。尽管不同靶标的药理特征各有差异，但对于具有构象动态变化特性的受体或蛋白质，小分子可以通过结合别构位点来稳定其特定构象，无论是在内源性正构配体存在或不存在的情况下均可发挥作用。当别构配体稳定蛋白质的活性构象时，会引发受体激活与信号传导；若稳定其非活性构象，则会阻断信号。由于别构配体能够稳定蛋白质的一种独特构象，蛋白质与配体形成的复合物实际上可以被视为一种新的受体状态，从而表现出独特的药理特性，例如配体偏向性信号传导。 在GPCR、激酶和离子通道等靶标中，由于正构位点或ATP结合位点高度保守，同时许多合成正构配体在理化性质以及药物代谢和药代动力学方面存在不利特征，因此开发具有高度选择性的正构化合物往往困难重重。 在许多情况下，直接作用型激动剂还可能产生毒性，或者由于长期持续激活受体而导致受体脱敏、内吞或下调。相比之下，别构配体通常结合于在进化上保守性较低的位点，因此往往能够实现更高水平的选择性。此外，别构配体具有“天花板效应”，即当别构位点被完全占据后，药效不会继续增加。同时，如果某种别构调节剂本身不具有激动剂活性，它仅在内源性激动剂存在时才发挥作用，从而能够保持内源性配体在时间和空间上的生理调控特征。多项研究还表明，与正构配体相比，别构配体在化学可优化性以及理化性质方面往往更具优势。 图2｜内源性正构配体1–4以及已上市别构配体5和6的结构。 缩写：ATP，三磷酸腺苷；GABA，γ-氨基丁酸。 在GPCR和离子通道体系中，别构配体可以表现出多种不同的药理模式。其中包括正向别构调节剂(PAM)，其能够增强激动剂诱导的受体反应；负向别构调节剂(NAM)，其通过非竞争方式降低受体活性。此外，还存在沉默型别构调节剂(SAM，也称中性别构配体)，这类配体同样结合别构位点并可阻断PAM或NAM的作用，但本身不会改变正构配体引发的受体反应。研究还发现更加复杂的别构调控模式。例如，部分研究致力于开发别构激动剂，即在没有正构配体存在时即可激活受体的别构化合物。然而，许多所谓的别构激动剂实际上可能是双位点配体(bitopic ligand)，即同时结合正构位点与别构位点的杂合配体。这类配体往往表现出依赖受体表达水平的药理行为、配体偏向性信号传导以及复杂的构效关系。此外，一些别构配体表现为部分拮抗剂，即完全占据NAM位点但只能部分阻断受体信号；还有一些被称为ago-PAMs，即既具有PAM作用又具有一定别构激动活性的分子。然而，在同一化学系列中，这些药理模式往往变化较大，使得构效关系分析变得更加困难。 对于激酶和磷脂酶而言，别构配体通常结合于远离正构(催化)位点的远端区域，并稳定蛋白质的特定非活性构象。靶向这些位点在亚型选择性、激酶组选择性以及安全性方面均展现出显著优势。尽管别构调控相较于正构调控具有诸多优势，但其并非药物发现的万能策略。在开发别构配体时仍需面对多方面的药理学与化学挑战。从药理学角度看，主要问题包括：别构位点较低的进化保守性可能导致显著的物种差异；别构调节剂的状态依赖性在某些伴随内源性正构信号逐渐减弱的退行性疾病中可能成为不利因素；别构调节剂引入的信号偏向性可能产生不期望或难以预测的生理效应；此外，别构调节剂还可能同时作用于受体的同源二聚体和异源二聚体，从而使生理反应更加复杂。从化学角度看，主要困难包括别构配体往往具有较为平缓的构效关系、难以引入极性或增溶基团(从而降低logP值)，以及分子开关现象的存在。这种分子开关既可能由细微的化学结构变化引发，也可能由体内氧化代谢产生，因此需要更加深入的分子药理学研究。 尽管存在这些挑战，已有两种GPCR别构调节剂成功上市，分别是钙敏感受体的正向别构调节剂cinacalcet以及CCR5受体的负向别构调节剂maraviroc。 此外，许多别构激酶抑制剂正处于不同阶段的人体临床试验中，而苯二氮卓类药物作为调控离子通道的别构调节剂，也已成为非常成功的治疗药物。3 别构调节剂的治疗靶点 作为临床前研究中的工具化合物和探针，别构配体已经针对多种治疗相关靶标被开发，包括离子通道、半胱天冬酶、激酶、磷脂酶以及G蛋白偶联受体(GPCR)。针对任何一个靶标类别的深入讨论都足以占据整篇文章的篇幅，并且已有大量综述对这些靶标及其别构配体进行了详细总结。因此，该节主要讨论激酶和磷脂酶，而下一节将重点介绍GPCR别构配体设计所呈现出的复杂性。3.1 利用别构调节剂靶向激酶 蛋白质磷酸化是细胞信号传导中的一种关键调控方式，几乎存在于所有已知的细胞信号通路中。激酶活性的异常与多种人类疾病密切相关，包括糖尿病、癌症以及多种神经系统疾病，因此激酶被认为是极具吸引力的治疗靶标。近年来美国食品药品监督管理局(FDA)批准的激酶抑制剂数量持续增加，也反映出制药企业在该领域的高度关注。然而，尽管已经取得了一些进展，激酶仍然是较难开发的靶标，这主要源于人类激酶组之间高度保守的结构特征。这种结构保守性来自激酶共同的催化功能，即将捕获的ATP中的γ-磷酸基转移到蛋白质底物上。 ATP结合口袋在结构上高度保守，而许多早期开发的激酶抑制剂正是作用于该位点，因此在500多种已知激酶之间往往缺乏选择性。为了获得更具选择性的化合物，研究者开始寻找位于ATP结合口袋之外、可被小分子靶向的结合位点。 与ATP竞争结合的激酶抑制剂通常被称为I型抑制剂。 进一步研究发现，还存在三类额外的别构抑制剂，其区别主要在于作用位点的不同。 II型抑制剂结合于ATP位点并延伸至邻近的别构口袋；III型抑制剂则仅结合于靠近ATP位点的别构口袋。 这两类抑制剂通过将激酶锁定在非活性构象来实现抑制作用，使高度保守的激活环被迫离开ATP位点附近的疏水口袋。 相比之下，IV型抑制剂则结合于距离ATP位点更远的别构区域。 目前已报道的别构激酶抑制剂表现出多种作用机制，例如诱导蛋白结构重排、阻止活性复合物形成、阻断底物识别、稳定非活性复合物、诱导蛋白降解或占据自抑制位点等。然而，有证据表明许多别构抑制剂实际上倾向于稳定少数几种在激酶中反复出现的非活性构象。特别是作用于若干已知别构口袋的配体，例如MEK口袋、Akt1口袋、PIF口袋以及ANS口袋，被认为通过破坏与附近高度保守的αC螺旋之间的相互作用而实现抑制作用。此外，MEK口袋和PIF口袋在多个激酶家族中均被发现，并在同一激酶家族成员之间产生类似的调控效应。 由于激酶在治疗中的重要性，靶向这些保守性较低且能够稳定非活性构象的别构位点已成为激酶药物开发的重要策略。针对Akt、Abl、PDK1、JNK1、CHK1、IGF-1R、CDK2以及mTOR等激酶的别构抑制剂已经被开发出来，而且它们在结构上通常与ATP竞争性抑制剂几乎没有相似性。其中，针对Akt激酶的别构抑制剂代表了一种新的激酶抑制机制，并且已进入II期临床试验阶段。Akt包含三种人类同工酶Akt1、Akt2和Akt3，在细胞质中通常以PH-in闭合构象存在，此时pleckstrin homology(PH)结构域阻挡ATP结合口袋以及T308/S473位点。当Akt被招募到细胞膜后，激酶转变为PH-out构象，从而暴露ATP结合口袋并允许其被磷酸化。 Merck研究团队开发了一类依赖PH结构域的小分子Akt抑制剂，这些化合物对同工酶具有选择性，并且不与ATP竞争，也不会抑制激酶组中的其他成员。有趣的是，别构抑制剂7不仅能够抑制Akt的激酶活性，还能够抑制Akt自身的磷酸化。大量的生化实验、突变研究以及构效关系分析表明，别构抑制剂7以及随后开发的临床候选药物MK-2206能够稳定Akt的PH-in闭合构象。随后X射线晶体结构研究证实了这一机制：别构抑制剂7结合于由PH结构域与激酶结构域界面残基形成的疏水口袋中，并与Trp80形成π-π堆积作用，同时在蛋白两个结构域中形成氢键。进一步的体内荧光共振能量转移实验表明，该抑制剂能够将Akt锁定在PH-in构象，从而阻止T308和S473位点的磷酸化。 这一研究也进一步凸显了别构抑制剂的优势。例如，ATP竞争性Akt抑制剂(如化合物9和10)在结合ATP位点后会诱导Akt发生过度磷酸化，从而引发对靶标的调控性磷酸化。相比之下，别构Akt抑制剂(如7和8)不仅能够抑制Akt的生理性激活，还能够抑制药物诱导的Akt过度磷酸化，从而扩大治疗窗口，并可能提高MK-2206的临床疗效和耐受性。 该领域的发展在一定程度上受到高通量筛选技术不足的限制，因为识别能够稳定非活性构象的别构激酶抑制剂仍然较为困难。过去通常需要通过耗时且复杂的ATP竞争实验作为二级筛选手段，以识别非竞争性的别构配体。近年来，一代新的结合实验技术开始用于检测能够稳定激酶构象的配体。其中FLiK(kinase荧光标记技术)能够在不依赖激酶活性的情况下检测配体诱导的构象变化，例如在p38α和Abl激酶中。然而，即使有了这些技术进展，仍然需要更多新的筛选方法和实验体系，以更高效地在大规模化合物库中发现能够通过复杂别构机制调控激酶活性或磷酸化的小分子配体。 图3｜构象具有柔性的Akt蛋白。 (a) 细胞质中处于非活性状态的Akt构象，也称为PH-in构象。当受到PIP3招募至细胞膜时，激酶转变为活性的PH-out构象，从而暴露T308和S473位点以进行磷酸化。(b) 别构抑制剂7和8对Akt的抑制作用会使其保持在PH-in构象，从而同时抑制激酶活性和磷酸化。ATP竞争性抑制剂结合于催化位点，使Akt保持PH-out构象。尽管激酶活性受到抑制，但由于这种构象状态，Akt仍可能发生过度磷酸化。(c) 别构Akt抑制剂7和8以及ATP竞争性Akt抑制剂9和10的结构。缩写：ATP，三磷酸腺苷；PH，pleckstrin同源结构域；PIP3，磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸。3.2 利用别构调节剂靶向磷脂酶 调节酶活性的小分子化合物通常可以分为两大类：竞争性抑制剂和别构抑制剂。竞争性抑制剂通常被称为基于底物的抑制剂，其作用方式是靶向酶或受体中用于结合天然底物或配体的位点。这类抑制剂之所以被称为“竞争性”，是因为其结构往往模拟天然底物或配体，从而与其竞争结合。相比之下，别构抑制剂则结合于酶或受体表面上与底物结合域不同的位点。这种别构结合机制通常可分为两种形式：非竞争性抑制和反竞争性抑制。非竞争性抑制剂会在底物结合之前结合于酶的另一个位点，从而改变活性位点构象，使天然底物无法结合；而反竞争性抑制剂则与酶-底物复合物(ES复合物)结合，从而阻碍产物形成。竞争性抑制与别构抑制的作用机制可以通过酶抑制动力学特征加以区分。 基于底物的抑制剂通常模拟酶的底物，因此抑制剂 对酶 的活性位点具有亲和力。当抑制剂结合后，底物无法进入活性位点，从而降低产物形成。然而，天然底物可以通过提高浓度占据活性位点并竞争性地排挤抑制剂。因此，在竞争性抑制存在时，酶的最大反应速率 保持不变，而酶对底物的表观亲和力 则向右移动。相比之下，由于别构抑制剂结合于独立位点，底物浓度的增加无法将其排挤。因此在别构抑制剂存在时，酶的 与 会同时发生变化，表现为 向右移动而 降低。 竞争性抑制和别构抑制在药物设计中各自具有不同的优势与局限。然而，在脂质代谢酶的小分子抑制剂设计中，别构结合机制具有明显优势。酶-底物复合物的形成由体系自由能变化决定，可表示为 其中 表示复合物形成前后的键能变化， 表示体系的总熵变化。在蛋白质-配体相互作用中，去溶剂化能是形成ES复合物过程中影响熵变化的重要因素。当底物扩散进入活性位点时，原本包围底物的水分子变得更加无序，而对于疏水性较强的酶而言，其溶剂化过程需要更大的熵代价。因此，对于水溶性底物而言， 对底物结合的贡献较小，而对于更疏水的底物， 在ES复合物形成中则发挥更重要的作用。同样的情况也适用于疏水性较强的基于底物的抑制剂在形成酶-抑制剂(EI)复合物时的情况。传统上，有效的抑制剂构效关系分析通常依赖于优化自由能方程中 的贡献。然而，脂质代谢酶天然结合疏水底物，这意味着在ES复合物形成过程中 已经发挥了重要作用。因此，基于底物的抑制剂需要依赖更大的熵变化才能在结合过程中战胜脂质底物的结合优势。在实际研究中，这一特点使得识别真正的构效关系变得困难。某些结构变化虽然提高了抑制剂在酶活性位点上的表观 ，但由于抑制剂疏水性的增加，结合过程中 的贡献也会增加，从而掩盖真实的结构效应。这些研究结果表明，在为脂质代谢酶设计基于底物的抑制剂时，需要克服底物扩散进入活性位点所带来的巨大去溶剂化熵效应，才能有效竞争ES复合物的形成。 随着脂质信号网络在疾病中的重要性不断提高，亟需开发能够阐明特定酶同工型在信号脂质生成过程中作用的化学工具。近年来，磷脂酶逐渐成为备受关注的潜在药物靶标。磷脂酶是一类催化磷脂水解反应的酶，根据催化反应类型可分为四大类：磷脂酶A(包括A1和A2)、磷脂酶B、磷脂酶C以及磷脂酶D(PLD)。PLD是一种脂质信号酶，能够催化磷脂酰胆碱水解生成磷脂酸这一重要的脂质第二信使以及胆碱。研究已经鉴定出两种哺乳动物PLD同工酶，即PLD1和PLD2，两者序列同源性约为53%，但在功能上存在差异。两种同工酶都具有保守的组氨酸-赖氨酸-天冬氨酸催化结构域，同时在N端具有保守的PX结构域和PH调控结构域。 图4|别构抑制剂与基于底物的抑制剂。 (a) 调节酶活性的小分子化合物通常可分为两大类：竞争性抑制剂(也称为基于底物的抑制剂)和别构抑制剂。基于底物的抑制剂(紫色)结合于酶的活性位点，从而阻止天然底物被催化消耗。别构抑制剂(蓝色)则结合于酶表面不同的位点，以阻止底物结合(该过程称为非竞争性抑制)，或阻止在酶-底物-抑制剂(ESI)复合物中产物的形成(该过程称为反竞争性抑制)。(b) 这两种机制可以通过动力学分析加以区分。基于底物的抑制剂会提高酶对底物的表观 值，而别构抑制剂会同时改变 和 的数值，因为别构抑制剂无法通过提高底物浓度被竞争性取代。缩写：E，酶；ESI，酶-底物-抑制剂复合物； ，对底物的亲和力； ，最大反应速率。 PLD功能失调与多种疾病相关，包括癌症、中枢神经系统疾病以及病毒感染过程中的关键阶段。然而，长期以来用于抑制PLD活性的工具主要局限于遗传学和生化方法，例如使用n-丁醇这一在转磷脂酰化反应中与水竞争的配体。2007年发现20世纪80年代开发的抗精神病药物halopemide能够抑制PLD活性，是该领域的重要突破。Halopemide是一种多巴胺受体拮抗剂(D2  )，同时也能有效抑制PLD1( )和PLD2( )。然而，与多数非典型抗精神病药物类似，它也具有多种脱靶作用。值得注意的是，在halopemide的临床试验中，当达到能够抑制两种PLD同工酶的暴露水平时，并未观察到明显不良反应，所有生化指标也保持正常，这表明在人类中抑制PLD具有良好的安全性和耐受性。 基于PLD酶的构象柔性、PH结构域的存在以及halopemide所含的哌啶苯并咪唑酮结构，该化合物在结构上与能够产生别构Akt激酶抑制作用的化学类型相似。因此，halopemide成为研究PLD抑制模式并开发同工酶选择性抑制剂的重要先导化合物。通过多样性导向合成策略构建了约260个类似物，其中VU0359595被发现是一种对PLD1具有1700倍选择性的抑制剂。研究表明，苯并咪唑酮核心结构有利于PLD1抑制，而乙二胺连接臂上的手性(S)-甲基基团进一步增强了PLD1抑制活性。另一方面，通过采用生物等排体三氮杂螺酮骨架，可以获得优先抑制PLD2的化合物VU0364739，其对PLD2的抑制选择性比PLD1高约75倍。VU0359595和VU0364739以及该系列更为优化的PLD抑制剂在药物代谢和药代动力学性质方面均显著改善，同时消除了生物胺相关活性。 有趣的是，当将手性(S)-甲基基团引入PLD2选择性的三氮杂螺酮骨架后，PLD1活性提高了150倍以上，从而得到能够同时强效抑制PLD1和PLD2的化合物。这一现象构成了磷脂酶配体中首个“分子开关”实例。针对缺失N端结构域(靠近PX和PH结构域)的PLD突变体研究表明，其活性明显降低。结合其他生化实验数据，可以确认VU0359595和VU0364739以高亲和力结合于PH结构域中的某个位点，并诱导蛋白构象变化，从而在酶的其他区域形成第二个结合位点。这种结合特征与Akt别构抑制机制类似，并能够实现前所未有的PLD同工酶选择性。 像VU0359595和VU0364739这样的化学工具在解析不同PLD同工酶在多种生物体系中的作用方面发挥了重要作用。与激酶别构调节剂类似，磷脂酶的别构调节剂也难以通过现有筛选方法和技术被直接识别。 图5 (a) PLD的生物化学反应。PLD催化磷脂酰胆碱PC(11)水解生成磷脂酸PA(12)和胆碱(14)。在存在一级醇(如 -丁醇)时，PLD会催化一种竞争性的转磷脂酰化反应，生成磷脂酰丁醇(15)。(b) PLD1和PLD2的结构。PLD1和PLD2的序列示意图标示了PX结构域、PH结构域、两个HKD基序、两个催化位点以及PLD1中特有而PLD2缺失的一个环区。总体而言，两种PLD同工酶之间的序列同源性仅为53%。(c) 双重PLD1/2抑制剂halopemide(16)、PLD1选择性抑制剂VU0359595(17)以及PLD2选择性抑制剂VU0364739(18)的结构及其PLD抑制活性。这些化合物均通过别构方式调控PLD，从而产生观察到的同工酶选择性。缩写：HKD，组氨酸-赖氨酸-天冬氨酸；PA，磷脂酸；PC，磷脂酰胆碱；PH，pleckstrin同源结构域；PIP2，磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸；PLD，磷脂酶D；PX，phox同源结构域。4 GPCR别构配体设计日益显现的复杂性 近年来的多篇综述已经系统总结了GPCR别构配体在药理学和药物开发中的注意事项，并列举了大量已知的GPCR别构调节剂。在所有别构配体类型中，调控GPCR功能活性及其下游信号通路的配体研究最为成熟，相应的动力学与功能性检测方法(如钙离子或铊离子通量实验)也已较为完善，可用于高通量筛选以及常规筛选流程，例如三重加样(triple-add)实验体系。正如前文所述，GPCR别构调节剂通常表现出较为平缓的构效关系(SAR)，即使是配体结构中细微的电子效应或空间效应变化，也可能导致活性完全丧失，从而显著增加化学优化以及药物代谢和药代动力学性质优化的难度。该节将讨论近年来关于分子开关、ago-PAMs、别构激动剂(更准确地说为双位点配体)以及配体偏向性信号传导的新认识与相关问题。4.1 分子开关 在别构理论的发展过程中，人们逐渐认识到，在三元复合物模型中，别构化合物的活性主要由两个因素决定：配体的亲和力以及协同作用。随后提出的激动剂作用操作模型进一步指出，这两个因素可以使受体复合物表现出独特的效能。换言之，某些别构配体无论单独存在还是与其他配体共同存在，都可能对靶标具有较高的结合亲和力，但却不会对整体复合物的信号传导性质产生明显影响。当这一现象与蛋白质中微小构象变化即可显著影响信号功能这一事实结合时，就产生了一种可能性：一系列结构非常相似的化合物可能同样能够有效结合靶标，但各个成员却会表现出完全不同的药理模式。事实上，这种现象已经在多种化学系列以及多类蛋白靶标中被反复观察到。 在同一化学系列中，结构相近的化合物可能分别表现为激动剂、正向别构调节剂(PAM)、负向别构调节剂(NAM)或沉默型别构调节剂(SAM)，这种现象被称为作用模式转换(mode switching)，而导致这些差异的细微结构变化通常被称为分子开关。该现象在代谢型谷氨酸受体5(mGlu5)的研究中被频繁报道，不同研究团队在多个与2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridine(MPEP)别构结合位点相关的化学骨架中均观察到了这种分子开关现象。这一现象并不限于mGlu5，在II类和III类代谢型谷氨酸受体中也有类似报道。事实上，作用模式转换似乎在多种别构靶标中普遍存在，包括毒蕈碱型受体、趋化因子受体以及电压门控钾离子通道等。 尽管相关研究积累了大量构效关系数据，但对于导致作用模式转换的配体-受体相互作用机制，目前仍缺乏统一的解释。近年来，对沉默型别构调节剂(SAM，也称为中性别构配体)的研究为理解别构结合位点提供了重要工具，也在一定程度上促进了对亲和力与协同作用分子决定因素的认识，尤其是在mGlu受体研究中。SAM通常在放射性配体结合实验中表现出较高的别构位点亲和力，但在功能实验中不表现出明显效能，因此可用于与已知PAM或NAM进行竞争分析。然而，一种在某种功能实验中表现为SAM的化合物，在另一种功能实验中可能表现出活性，这通常与配体偏向性信号传导有关。此外，由于结构相似的化合物常在不同受体亚型之间表现出不同的活化模式，一些具有亚型选择性的化合物在相关受体上可能表现为SAM。这些复杂情况表明，需要在多种功能实验体系以及相关受体的结合实验中系统评估别构调节剂的活性，才能获得对其药理作用更加准确的认识。 除了利用SAM进行研究外，定点突变实验也被证明是揭示受体关键相互作用位点的重要方法，可用于区分导致正向或负向协同作用的结构因素。例如，在mGlu5受体的研究中，通过突变关键氨基酸残基，可以使原本的PAM转变为NAM，反之亦然。类似的方法也被成功应用于促甲状腺激素受体研究，为激素受体别构配体的理性设计提供了可能的结构基础，也证明了在研究作用机制时引入突变实验的重要价值。 在讨论作用模式转换时，还需要考虑代谢过程对别构调节剂药理特性的影响。由于结构极其相似的化合物可能表现出完全不同的药理模式，因此某些别构配体的代谢产物也可能通过形成分子开关而产生与母体化合物相反的作用。近期报道了首个由细胞色素P450(CYP)介导的分子开关实例。在该研究中，一种mGlu5 PAM化合物VU0403602在体外实验中不具有激动剂活性，但在体内却诱发了典型的mGlu5激动剂样癫痫样活动。这种体内效应可以被MPEP阻断，表明其与mGlu5有关，同时也可以被泛CYP抑制剂ABT(1-氨基苯并三唑)抑制。进一步的代谢研究发现，VU0403602经氧化代谢产生的代谢物M1实际上是一种强效的mGlu5别构激动剂，并由其引发了体内观察到的癫痫样活动，而非母体化合物本身。在药物研发过程中，如果某一代谢产物具有与母体化合物完全不同甚至具有毒性的药理特性，将对临床开发带来重大风险，因此需要更加重视别构配体主要代谢物的药理学特征。 最后，分子开关不仅可以改变药理作用模式，还可能影响受体亚型选择性。在某些情况下，这种变化可能带来不利影响，而在其他情况下，则可能使研究者获得此前难以获得的亚型选择性配体。近期的一项研究利用这一特性成功开发出首批高度选择性的mGlu3 NAM。在该研究中，一种强效mGlu5 PAM化合物VU0092273在mGlu3上仅表现出较弱活性。随后通过并行迭代合成寻找能够消除mGlu5活性并增强mGlu3活性的分子开关。结果发现，在南侧苯环上引入 -OMe取代基能够实现这一转变，从而得到亚微摩尔水平的mGlu3 NAM化合物VU0463597，其对mGlu3的效力比mGlu2高15倍以上。进一步优化后获得了能够穿透中枢神经系统的化合物VU0469942，其在mGlu3上的 比mGlu2低50倍以上。 该研究还同时解决了平缓SAR带来的问题。mGlu3 NAM VU0469942在大鼠体内清除率较高，其主要代谢途径是CYP介导的 -OMe基团去烷基化，而这一基团正是产生mGlu3活性和选择性的关键结构。所有通过电子效应或空间效应阻断这一代谢途径的尝试均未成功。最终，通过将 -OMe基团中的氢原子替换为同位素氘，成功将体外和体内清除率降低约50%，同时保持了mGlu3 NAM活性。这一策略为在别构配体平缓SAR条件下解决代谢稳定性问题提供了一种新的思路。4.2 Ago-别构调节剂 Ago-别构调节剂是指一类能够通过别构位点结合的配体，这类配体在没有正构配体存在时即可诱导受体产生反应，同时在正构配体存在时又能够增强其效应。此类配体的发现与鉴定过程通常较为复杂，因此需要将放射性配体结合实验与多种功能实验结合使用。在许多研究中，一种别构配体在进一步研究以及筛选技术不断发展的背景下，往往经历从最初分类到重新分类，甚至多次重新分类的过程。 例如，最早报道的ago-别构调节剂之一是2-氨基噻吩类化合物PD81,723。最初的研究认为该化合物是腺苷A1受体的纯正向别构调节剂(PAM)，因为它能够增强 -N6-环己基腺苷的结合，并提高豚鼠心脏组织中激活A1受体后的传导效应。然而，后续研究发现PD81,723还能稳定G蛋白与受体之间的结合，这提示其可能具有不同的作用机制。最终，当实验表明PD81,723能够以浓度依赖方式独立降低forskolin诱导的cAMP生成时，该化合物被重新归类为一种可能的ago-别构调节剂。 尽管ago-别构调节剂的鉴定与表征过程较为复杂，但对这类化合物及其作用机制的研究兴趣仍在不断增加。Noetzel等人近期比较了mGlu5受体ago-PAM化合物VU0360172和VU0092273与纯mGlu5 PAM在中枢神经系统中的功能差异。在大鼠体内实验中，这两类化合物在逆转安非他命诱导的过度运动方面表现出相似的效果，而该效应通常被用作潜在抗精神病活性的预测指标。此外，研究还在表达mGlu5受体的不同细胞系中分析了VU0360172和VU0092273的体外作用。这些细胞系的受体表达水平不同，实验结果显示，在受体表达量较高的细胞系中，这些化合物表现为ago-PAM，而在受体表达量较低的细胞系中则表现为纯PAM。这些结果表明，在体外实验中评估ago-别构调节剂时需要充分考虑受体表达水平的影响，同时也提示在天然生理体系中，由于不同脑区受体储备水平可能存在差异，现有实验方法未必能够完全准确地区分纯PAM与ago-PAM在实际生理系统中的效应。 别构调节剂长期以来被认为具有开发为新型治疗药物的潜力，其优势包括较高的受体亚型选择性以及较低的受体脱敏或内吞倾向。然而，这类配体通常依赖于内源性配体的存在才能发挥作用。因此，ago-别构调节剂所具有的内在激动剂信号特性，在某些情况下可能成为一种有吸引力的治疗策略，例如在退行性疾病中，随着疾病进展，内源性配体水平逐渐降低，或者在某些突触中内源性信号本身较弱。然而，在其他情况下，例如mGlu5 PAM的开发中，研究通常更倾向于获得纯PAM，因为ago-PAM可能会诱发癫痫样活动。 图6 (a) MPEP位点mGlu5别构配体系列中分子开关的经典实例。一个强效mGlu5 PAM(18)通过将环戊基酰胺替换为甲基酰胺转变为mGlu5 SAM(19)。相反，在PAM(18)的南侧苯环中引入一个氮原子后，得到吡啶衍生物(20)，其表现为mGlu5 NAM。(b) mGlu5 PAM VU0403602(21)在体内代谢生成具有mGlu5别构激动剂活性的代谢物(22)，从而导致毒性。缩写：mGlu5，代谢型谷氨酸受体5；MPEP，2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridine；NAM，负向别构调节剂；PAM，正向别构调节剂；SAM，沉默型别构调节剂。4.3 别构激动剂 在前文讨论PAM与ago-PAM时提到的受体储备依赖性药理学问题，同样适用于别构激动剂的研究。别构激动剂是指一类结合于不同于正构位点的别构位点、并在缺乏内源性配体时即可激活受体的配体。GPCR研究领域对这一策略的关注显著增加，部分源于Portoghese将此类配体应用于阿片受体二聚体研究，并证明这些配体相较于单价配体可能具有更高的结合亲和力以及更好的亚型选择性。近年来，双位点配体(bitopic ligands)的研究进一步利用了这些潜在优势，并结合GPCR丰富的别构药理学特性展开发展。 双位点配体在结构上类似于异源双价配体，它们通常由两个不同的药效团通过一段适当长度且具有一定柔性的连接臂共价连接而成。但与传统双价配体不同的是，双位点配体中的一个药效团作用于正构位点，而另一个作用于别构位点，因此能够同时靶向同一受体的正构与别构位点。由于具有这种独特的正构-别构组合特征，双位点配体往往表现出复杂的结合行为，其机制可能介于别构三元复合物模型与正构竞争结合模型之间。目前提出的结合模式主要包括三种情况：双位点配体同时占据正构位点与别构位点；双位点配体仅占据其中一个位点，即所谓的“翻转”(flip-flop)结合模式；或者两个配体以协同方式分别占据这两个位点。 将不同药效团组合以产生协同作用的思想可以追溯到20世纪70年代末Schwyzer提出的“双价配体的消息-地址(message-address)”概念。该概念认为，一个双价配体由两个功能部分组成：一部分为“消息”(message)，负责促进信号向效应系统的传导；另一部分为“地址”(address)，通过增强配体与受体之间的特异性相互作用来提高选择性。在双位点配体中，地址部分通常由别构药效团承担，从而能够为那些正构位点高度保守的GPCR家族(例如毒蕈碱型乙酰胆碱受体或代谢型谷氨酸受体)提供亚型选择性。在这种情况下，别构药效团作为“地址”引导相对缺乏选择性的正构药效团“消息”。此外，由于双位点配体本身具有正构激动信号，其在内源性配体水平降低的神经退行性疾病治疗中也具有潜在优势。 然而，双位点配体的复杂性不仅体现在设计方面，也体现在其功能表征上。一些最初被认为是单价配体的化合物，后来被怀疑实际上属于双位点配体。来自多个研究团队的大量研究表明，许多曾被报道为别构激动剂的化合物(例如M1受体激动剂)实际上是双位点配体。这些配体能够结合于特定的别构位点并诱导具有功能选择性的M1受体激活，但在较高浓度下，它们还能够结合正构位点，并通常作为M2至M5受体的正构拮抗剂。同时，还存在一些分子开关能够消除其在别构位点上的结合能力，从而得到广谱正构毒蕈碱受体拮抗剂。 Conn研究团队的一项研究进一步揭示了M1别构(双位点)激动剂开发中的复杂性。在该研究中，两种结构相关的M1别构激动剂表现出受体储备依赖的药理特性，呈现出不同程度的部分激动效应，并在不同脑区诱导不同的生理反应，这与M1受体表达水平和受体储备差异有关，并与动物模型中的行为学效应相对应。此外，这些双位点配体还表现出配体偏向性信号传导：尽管在标准钙离子动员实验中表现出相似效应，但在β-arrestin募集以及ERK1/2磷酸化方面却表现出不同作用。这些结果表明，M1别构激动剂能够差异性地调控M1受体与不同信号通路之间的耦联关系，从而显著影响这些化合物在特定脑神经环路中的药理作用。因此，相比之下，通过增强内源性乙酰胆碱作用的M1 PAM可能是一种更为简单且可控的选择性M1激活策略。 随着GPCR别构调控研究的不断深入，双位点配体已经成为一个重要且具有发展潜力的研究方向。这类配体不仅可能成为新的分子探针和潜在治疗药物，其结构特性也为理解GPCR正构位点与别构位点之间的空间与热力学相互作用提供了重要线索。然而，目前仍缺乏一种完全明确的方法来鉴定双位点配体，这一问题可能需要依赖GPCR晶体结构解析或针对相关靶标的放射性配体技术的发展才能得到解决。 图7|利用分子开关获得新的亚型选择性别构调节剂。 从mGlu5 PAM VU0092273(23)出发，通过结构优化得到具有高选择性和高效力的mGlu3 NAM VU0469942(25)。5 总结与结论 在过去十年中，对通过别构调控作用于多种分子靶标的理解以及其所带来的优势得到了显著提升。靶向GPCR的别构配体已经有部分药物成功上市，同时别构激酶抑制剂以及其他别构药物也正在针对多种中枢神经系统疾病和肿瘤适应症开展不同阶段的临床研究。在药物发现的早期阶段，别构配体凭借前所未有的选择性以及更优的理化性质，使研究者能够更深入地解析高度保守受体家族中不同成员的生物学功能及其潜在治疗价值。 尽管别构调控具有明显优势，但仍存在若干需要关注的问题，包括平缓的构效关系、化学或代谢产生的分子开关、配体偏向性信号传导在体内的生理影响以及不同物种之间可能存在的活性差异。然而，在过去五年中，针对别构位点设计和开发配体与药物的一系列关键原则和策略已经逐渐形成。这一研究方向为开发高度选择性的治疗药物提供了新的机遇，并有望在广泛的人类疾病领域中发挥重要作用。 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