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点击上方蓝字关注我们 清华大学联合多家医院在Nature子刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》上公布了文章《Clinical investigation on nebulized human umbilical cord MSC-derived extracellular vesicles for pulmonary fibrosis treatment》，试验结果表明，雾化干细胞外泌体在治疗肺纤维化患者方面表现出安全性和有效性。 此文章内容在各个媒体和公众号上得到广泛的引用和解读，但部分引用断章取义或过度总结。因此翻译文章原文供学习使用，由于篇幅限制删去了一些内容和引文部分。翻译可能不尽完善，专业人士可阅读英文原版。 Clinical investigation on nebulized human umbilical cord MSC-derived extracellular vesicles for pulmonary fibrosis treatment Meng Li, Huaping Huang, Xiaofei Wei, Huajuan Li, Jun Li, Bingchen Xie, Yuze Yang, Xingyue Fang, Lei Wang, Xiaona Zhang, Heyu Wang, Mengdi Li, Yuting Lin, Dezhi Wang, Yinyin Wang, Tongbiao Zhao, Jianqiu Sheng, Xinbao Hao, Muyang Yan, Lu Xu & Zhijie Chang  Signal Transduction and Targeted Therapy volume 10, Article number: 179 (2025) 间充质基质细胞来源的细胞外囊泡(MSC-EVs)被认为是一种很有前景的无细胞疗法，然而，它们在肺纤维化中的治疗作用仍未得到揭示。本文，我们报告了在小鼠模型和肺纤维化患者中评估的人脐带MSC-EVs (hUCMSC-EVs) 的安全性和有效性。我们建立了一套严格的系统来生产高质量的hUCMSC-EVs，其特征是miRNA、蛋白质和代谢物谱。通过雾化给药时，hUCMSC-EVs 主要在小鼠肺部积聚并改善了博来霉素诱导的肺纤维化，存活率提高（从20%到80%），肺容量恢复，损伤严重程度减轻，同时氧合血红蛋白饱和度升高，肺功能评估改善。我们开展了一项I期临床试验，纳入24例患者，为治疗肺纤维化开展了一项随机、单盲、安慰剂对照研究（MR-46-22-004531，ChiCTR2300075466）。所有受试者均对雾化hUCMSC-EVs耐受良好，未发生严重不良事件。接受雾化hUCMSC-EVs与常规治疗联合治疗的患者的肺功能指标（用力肺活量和最大自主通气量）和呼吸健康状况（通过圣乔治呼吸问卷和莱斯特咳嗽问卷测量）均有显著改善。总体而言，与仅接受常规治疗的患者相比，接受雾化hUCMSC-EVs额外治疗的患者获得了显著益处。值得注意的是，两名患有晚期炎症后肺纤维化的患者在接受hUCMSC-EVs 治疗后，在连续CT扫描中表现出临床显著的消退。这些研究结果表明，雾化hUCMSC-EVs可作为治疗肺纤维化疾病的一种有前途的治疗策略。 肺纤维化是一种慢性进行性间质性肺疾病，其特征是肺实质中瘢痕组织异常积聚。这种疾病的特点是纤维化转化，导致肺组织增厚和僵硬，最终阻碍其生理功能。随着疾病的进展，有效氧气交换的能力逐渐减弱，引发呼吸困难、持续咳嗽和疲劳等症状。肺纤维化过程已被认为是一系列炎症级联反应，涉及巨噬细胞和T细胞等免疫细胞的激活。活化的巨噬细胞和T细胞会分泌大量细胞因子和趋化因子，它们通过募集更多的免疫细胞来加重炎症。同时，这些细胞因子会增强抗性成纤维细胞或激活静止的成纤维细胞分泌细胞外基质，如纤连蛋白、胶原蛋白和MMP。细胞外基质的积聚会重建正常的肺器官并破坏肺泡，从而阻碍氧气交换。目前，肺纤维化被认为是一种多方面的疾病，由多种因素引起，例如环境暴露、自身免疫性疾病、遗传易感性、某些药物和病毒感染。特别是病毒感染，包括但不限于流感病毒和冠状病毒，被认为是导致肺纤维化发展的主要致病因素。病毒感染可能直接损害肺组织，引发免疫反应或激活成纤维细胞，从而加剧肺部炎症和纤维化。这些挑战可能持续很长时间并造成损害，这进一步加剧了患者的炎症。因此，慢性炎症逐渐加重并使患者的病情恶化，使这些疾病无法治愈。 尽管人们对肺纤维化的发病机制有了显著了解，但人们仍在不断寻求有效治疗这种不治之症的方法。目前的治疗方式主要集中在对症治疗以减缓疾病进展，而不是直接消除导致纤维化的根本原因。例如，地塞米松、吡非尼酮和尼达尼布被广泛用于治疗肺纤维化的早期阶段，但疾病通常会继续进展。这些治疗方法通过调节免疫反应（包括激活巨噬细胞、T细胞和成纤维细胞）来抑制慢性炎症。不幸的是，所有这些治疗方法都无法治愈这种疾病，而只能减缓纤维化的进展。因此，需要更多创新的治疗模式来治疗这种疾病并同时促进肺组织的再生。 人脐带间充质干细胞(UCMSCs) 已被广泛用于治疗各种慢性疾病，包括肺纤维化。许多研究表明，UCMSCs易于制备，在治疗窗口内具有广泛的安全性。最近的报告显示，UCMSCs在治疗肺部疾病和急性呼吸窘迫综合征方面有优势。研究还表明，UCMSCs在多种炎症性疾病中的主要作用是调节免疫系统。我们之前的研究证实，USMSCs在治疗肺损伤方面保留了优越的抗纤维化能力。然而，更多的临床实践意识到MSCs的一些不足，包括它们在体内的潜在分化、长期治疗中的免疫反应以及储存和运输困难。因此，人类脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡(hUCMSC-EVs)，一种小的膜结合颗粒，已被开发用于治疗疾病，因为许多研究表明 MSCs 在体内通过其EVs发挥作用。这些囊泡以CD9、CD63 和 CD81 等特定分子为特征，通过其生物活性分子发挥强大的治疗作用，包括蛋白质、核酸（特别是mRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、snRNA 和其他 RNA）和代谢物（包括脂质）。hUCMSC -EVs 已被证明具有抗炎、抗纤维化22和再生特性，因为它们具有丰富的成分。这些作用似乎与 UCMSC 的功能相似，UCMSC通过不同的成分（包括其分泌的细胞因子）调节慢性疾病过程中巨噬细胞和T细胞的免疫反应。此外，UCMSC-EVs易于制备、储存和运送到床边，与基于细胞的疗法相比具有明显的优势，同时还能够降低相关的肺栓塞风险。近年来，hUCMSC-EVs已被用作治疗小鼠模型肺纤维化的一种有前途的策略。 尽管 MSC-EV注射是治疗其他疾病（包括肝病和心血管疾病）的首选方法，但药物输送技术的最新进展已经实现了从传统静脉注射到雾化吸入的转变，成为一种有针对性且有效的给药途径。雾化输送可将治疗药物直接沉积在肺部，最大限度地提高其局部浓度并最大限度地减少全身不良反应。这种方法显示出在肺纤维化管理中改善治疗结果和提高患者依从性的潜力。在本研究中，我们提供了一种具有质量控制的hUCMSC-EV制造程序，并进行了治疗肺纤维化的I期临床试验（MR-46-22-004531，ChiCTR2300075466），并在小鼠中进行了一系列临床前研究。我们的结果表明，雾化hUCMSC-EVs可有效改善肺纤维化的症状，且对患者无不良副作用，凸显了雾化MSC-EVs 作为一种新型治疗方法的潜力。hUCMSC-EVs的制备和特性 为确保可靠、安全且持续稳定的细胞外囊泡(EV)，我们建立了工作细胞库并开发了工业化流程（图1a）。我们实施了一套全面的系统，以严格遵守材料和方法中所述的所有阶段的良好生产规范(GMP)标准。纳米粒子跟踪分析(NTA) 结果表明，hUCMSC-EV的尺寸分布范围为50至400nm（图1b）。使用透射电子显微镜观察了 hUCMSC-EV 的形态（图1c）。我们使用电子显微镜检查了雾化前后EV的形态，未观察到形态变化（图1d）。此外，hUCMSC-EV显示出特定标志物的富集，包括 CD9、CD81和CD63，但没有显示出在UCMSC中表达的标志物CANX的富集（图1e - h）。 Western blot分析显示，雾化前后EVs标志蛋白总量无差异，表明雾化器对EVs的形态和质量无影响（图1 i- l）。这些观察结果验证了hUCMSC-EVs的制备和生产成功。 图1 hUCMSC-EVs的制造和特性。a hUCMSC -EVs制造工艺和关键质量控制点 (CQCP)。从培养 4 代 (P4) 的工作库中制备 UCMSCs。在细胞扩增和EV分离的不同阶段进行CQCP。将最终的EVs储存起来，用于雾化器患者应用。主要制造参数已标记。该图是使用 MedPeer创建的。b hUCMSC -EVs 的浓度和尺寸分布。通过纳米粒子跟踪分析 (NTA) 确定hUCMSC-EVs。标记了特定的 EV尺寸。分布曲线 (黑色) 是根据检查值 (红色) 拟合的。c hUCMSC-EVs 的代表性电子显微镜 (EM) 照片，比例尺= 500 nm。通过 EM 制备 hUCMSC-EVs 以供成像。d 雾化前后 hUCMSC-EVs 的代表性电子显微镜照片。雾化后从冷凝物中收集 hUCMSC-EVs。比例尺 = 100 nm。EV 标志物水平。对 EV 标志物的蛋白质水平进行蛋白质印迹分析，包括 CD9 ( e )、CD63 ( f )、CD81 ( g ) 和 CANX ( h )。雾化后 EV 标志物的变化。蛋白质印迹显示雾化前后 hUCMSC-EVs 中的蛋白质标志物 (Neb)。检查了CD81 ( i )、纤连蛋白 ( j )、CD63 ( k ) 和 CD9 ( l)。关键加工点的质量控制 为了确保hUCMSC-EVs的质量，分别对工作库细胞、细胞培养上清液、纯化的 hUCMSC-EVs 和雾化 hUCMSC-EVs实施了关键质量控制点 (CQCP)（图1a，表1）。首先，在工作细胞库的生成过程中建立CQCP 1，通过确认 hUCMSCs没有缺失、易位、突变和细胞短串联重复序列 (STR) 改变的状态（补充图1a）。其次，对细胞培养上清液进行CQCP 2，以避免任何潜在的支原体和外源病毒污染（数据未显示）。随后，对纯化的 hUCMSC-EVs 进行 CQCP 3以测试支原体、外源病毒、无菌性和抗生素残留（数据未显示）。同时，进行了NTA分析以确认50至400nm之间的颗粒占总EVs的90％以上（补充图1b）。此外，为了评估hUCMSC-EVs的生物活性，在共培养细胞中检查了NF-κB信号通路（补充图1c），并通过抑制Th1/2/17反应和促进Treg细胞证实了它们的免疫调节作用（补充图1d）。最后，将CQCP4应用于雾化的hUCMSC-EVs，通过重新检查支原体，外源病毒和无菌性以确保其无污染状态（未显示数据）。此外，检查了内毒素以允许其水平阈值设定在0.25 EU/ml以下。进行了NTA分析，以确保hUCMSC-EVs的工作浓度保持在标定浓度的±20%范围内（数据未显示）。总而言之，所有CQCP均经过严格操作，以确保hUCMSC-EVs的质量，达到预期的浓度和生物活性。hUCMSC-EVs的RNA含量 由于RNA尤其是miRNA被认为是EVs中的主要功能分子，我们进行了全面的小RNA 深度测序以分析 hUCMSC-EVs 的 RNA 丰度。结果表明，hUCMSC-EVs中存在各种RNA，其中miRNA为主要类型（58.69%），其次是tRNA（20.72%）、rRNA（8.53%）、重复元素（3.18%）、snoRNA（1.01%）、snRNA（0.23%）和一小部分编码mRNA（6.23%）（图2a，补充数据1）。共鉴定出超过 1400 个独特的 miRNA，其中前 20 个占总 miRNA读数的68%（图2b，补充数据2），而其余 miRNA 仅贡献了读数的32%。值得注意的是，3.18%的RNA对应于功能不明的转座子、逆转录转座子和内源性逆转录病毒等重复元件（图2c）。这些发现突出了hUCMSC-EVs中RNA的多样性。以miRNA为重点，我们按读取数排名前37位（图2d）。基因本体论分析表明，这些miRNA主要调控磷酸化、细胞分化和跨膜运输等生物过程（图2e）。进一步分析表明，它们的靶基因参与转录、细胞周期、蛋白质转运、神经系统发育和磷酸化（图2f）。通路分析显示这些miRNA通过调节细胞移动性和血管形成参与血管生成和代谢途径。此外，他们还靶向了Rap1、Ras和PI3K-Akt信号通路，以及肌动蛋白细胞骨架调控（图2g），提示其在纤维化调控中可能发挥作用。总之，这些分析表明hUCMSC-EVs参与了肺纤维化中的炎症调节和组织修复。 图2 hUCMSC-EVs的 RNA 含量。a常见非编码和编码 RNA 的组成分析。b饼图显示了排名前 20 的 miRNA，它们占 hUCMSC-EVs 中miRNA总数的68%。c代表重复序列的原型序列分析。d显示了排名前37的 miRNA 的总读取量。所有miRNA均已标准化为阳性和阴性对照。e hUCMSC-EVs 中排名前 37的miRNA靶向的生物过程的富集图。节点代表显著富集的生物过程的单个基因以及靶向它们的miRNA，由边连接。与生物过程相关的基因显示为红色小圆圈，miRNA 基因显示为蓝色圆圈。靶向相似基因簇的miRNA彼此靠近。每条彩色线代表一个生物过程。f富集的生物过程和g miRNA 靶向的富集 KEGG 通路。hUCMSC-EVs的蛋白质组成 接下来，我们通过蛋白质组学分析来研究蛋白质是否有助于hUCMSC-EVs的功能。通过 LC-MS共鉴定出1409种蛋白质。GO分析显示它们参与生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）（图3a，补充数据3）。关键功能类别包括细胞成分组织、伤口愈合、细胞粘附和超分子纤维组织（图3b）。KEGG分析显示在肌动蛋白细胞骨架调节、内吞作用和粘着斑等途径中富集（图3c）。我们进一步根据亚细胞定位对蛋白质进行分类：40％为细胞质，15％为膜相关，14％为分泌（图3d）。为了鉴定核心功能蛋白，我们重点关注占总蛋白质含量80％ 以上的蛋白质，得到19种高度丰富的蛋白质（图3e）。值得注意的是，这些蛋白质中有许多参与了超分子纤维的组织（COL1A2、VIM、ANXA2、TF、COL1A1、FN1）和细胞骨架的组织（KRT1、COL6A3、COL1A1、KRT86、KRT10）（图3f）。鉴于它们中的大多数是与纤维化相关的细胞外基质成分，我们的研究结果表明，hUCMSC-EVs可能递送有助于组织重塑和靶向细胞行为调节的功能性蛋白质。 图3 hUCMSC-EVs的蛋白质组成。a与 hUCMSC-EVs 蛋白相关的基因簇。BP：生物过程，CC：细胞成分，MF：分子功能。b与hUCMSC-EVs 蛋白相关的生物过程的基因本体饼图。c hUCMSC -EVs 蛋白靶向的富集KEGG气泡图。d hUCMSC-EVs中所有蛋白质的蛋白质亚细胞定位饼图。e hUCMSC-EVs 中鉴定出的19种细胞外蛋白质的相对丰度。f与前10种蛋白质相关的生物过程的基因本体和弦图hUCMSC-EVs的代谢组学分析 为了确定其他成分是否对hUCMSC-EVs的功能有贡献，我们分析了它们的代谢特征。MS 分析鉴定了104 种代谢物（图4a，补充数据4），其中排名前23位的代谢物占总丰度的91%，其余89种代谢物含量较低（图4a，绿色部分）。功能注释显示氨基酸代谢富集，包括谷氨酰胺代谢和糖异生（图4b）。为了评估hUCMSC-EVs制剂的一致性，我们使用三个独立批次进行了主成分分析（PCA）。三个批次的 PCA1 值几乎相同，PCA2值仅显示出微小差异，表明重现性高（图4c）。热图分析进一步证实三个批次的代谢物组成保持高度相似（图4d）。综上所述，这些结果表明，hUCMSC-EVs携带一组富含关键代谢途径的特定代谢物，且批次间表现出高度的一致性。这些结果支持了我们hUCMSC-EVs制剂的质量和稳定性，并提示代谢物可能参与其生物学功能。 图4 hUCMSC-EVs代谢组学分析。a饼图显示所有代谢物的比例。b条形图表示代谢组学功能分析，显示涉及 EVs 代谢物的代谢途径。c PCA图显示三个样本在前两个主成分（PCA1 和 PCA2）上的分布，这两个主成分分别解释了 99.98% 和 0.02%的变异。每个点代表一个样本。d热图表示三个样本之间的相关性。雾化 hUCMSC-EVs 的生物分布 为了探索hUCMSC-EVs在肺部疾病治疗中的应用，我们决定采用雾化给药的方式，追踪了28天雾化吸入荧光染料标记的hUCMSC-EVs（1×10 8个/只小鼠）在C57BL/6小鼠体内的分布情况（图5a）。全身荧光检查显示，hUCMSC-EVs在1小时内进入胸腹，4小时达到最高峰（图5b）。对各脏器进行详细解剖显示，hUCMSC-EVs分布于气管、肺、胃、肠和肝脏，未在大脑、心脏、脾脏和肾脏中分布（图5b）。有趣的是，我们观察到雾化吸入24小时后，hUCMSC-EVs集中在肺、胃和肝脏（图5c、d，24小时）。荧光信号似乎在72小时后逐渐变弱，雌性在第21天、雄性在第28天减弱（图5d）。然而，在解剖器官中分析时，第28天在肺部可检测到信号（图5c、d）。所有这些结果表明，hUCMSC-EVs进入体内，并在吸入后主要维持在肺部。 图5 雾化hUCMSC-EVs的生物分布。a.动物实验示意图。第1天，小鼠气管内注射标记的UCMSC-EVs（每只小鼠1×10 8 个，n = 72）。根据时间点收集活体成像和处死器官成像。图像使用MedPeer创建。b. DiR标记的hUCMSC-EVs在体内的生物分布， 持续至雾化后28天。c . DiR标记的hUCMSC-EVs在体外的生物分布，持续至雾化后28天。术语列表代表分离器官的布局。d .统计曲线描绘了体内和体外成像信号随时间的变化。数据包括对男性和女性组的单独分析，以及不同器官的信号分布。雾化hUCMSC-EVs预防小鼠损伤性肺纤维化的安全性和有效性 为了评估雾化hUCMSC-EVs治疗肺纤维化的安全性和有效性，我们在小鼠身上进行了一项临床前研究。将不同剂量（2.5×10 7、7.5 × 10 7和 2.25 × 10 8颗粒）的雾化 hUCMSC-EVs分别给予接受博来霉素 (BLM) 诱导 (2.5 mg/Kg) 的C57BL/6 小鼠，给药剂量为两周，共14次，并于第18天进行微型CT扫描 (图6a )。安全性评估 (补充数据5 ) 包括ALT、AST、Glu、HDL、TC、BUN、CREA、Hb、LDL、TG、LYM、NEUT、PLT、RBC、WBC 和 IL-6 (补充图2a - 2p，补充数据5 )。ALT受博来霉素治疗的影响最大，而LYM、NEUT和WBC在hUCMSC-EV治疗后呈恢复正常的趋势。其他参数无显著变化，也未观察到不良反应。对于疗效，Kaplan-Meier生存分析表明，hUCMSC-EVs（每只小鼠2.5×10⁷颗粒）显著提高了博来霉素引起的肺损伤的生存率和中位生存时间（图6b）。接下来，在使用最佳剂量（1x）（每只小鼠2.5×10⁷颗粒）的预防模型中，微型CT分析显示，与对照组（盐水和L929-EVs）相比，用 hUCMSC-EVs治疗的小鼠的组织密度降低、支气管扩张和间隔增厚（图6c）。重要的是，雾化hUCMSC-EVs有效阻止了纤维化进展，纤维化病变面积显著减少证明了这一点（图6c）。此外，基于微CT图像的三维重建分析显示，BLM激发后肺体积显著减少（图6d，第2列对第1列），而雾化hUCMSC-EV治疗后肺体积基本恢复。此外，微CT图像的三维重建显示BLM激发后肺体积显著减少，而hUCMSC-EV治疗后肺体积基本恢复（图6d）。此外，还观察到呼吸扩张（图6e）和血氧饱和度（图6f）的改善。治疗后肺重（图6g）和肺系数（图6h）也有所改善。H&E染色组织学分析显示，hUCMSC-EVs可减轻BLM诱导的肺炎病变，包括肺泡结构丧失、隔膜增厚、肺泡扩大和炎症细胞浸润增加。雾化hUCMSC-EVs可显著减轻这些病理改变（图6i，H&E）。统计学分析显示Ashcroft评分显著下降（图6j）)和Masson染色显示hUCMSC-EV治疗后肺内胶原蛋白积累减少（图6i，底部）。此外，hUCMSC-EV治疗降低了Col1a1、纤连蛋白和Col3a1的表达（图6k - m），在蛋白质水平上观察到纤连蛋白和Col3a1水平降低（图6n、o）。这些数据表明雾化 hUCMSC-EV具有治疗肺纤维化的潜力。 图6 雾化hUCMSC-EVs 治疗小鼠损伤性肺纤维化的疗效。a提供了动物实验的示意图。第 1 天，小鼠气管内注射博来霉素 (BLM；1.5/2.5mg/kg 体重) 或等体积的盐水溶液。2 小时后，三组接受 BLM 攻击的小鼠接受三种不同剂量 (2.5 × 10 7、7.5 × 10 7、2.25 × 10 8颗粒) 的hUCMSC-EVs 雾化，而一组接受 BLM 攻击的小鼠和对照组（未接受 BLM攻击）接受相同体积的盐水治疗。将小鼠随机分为 5 组（ 每组n =5）。b 接受不同干预措施 (BLM；2.5 mg/kg 体重)的小鼠的Kaplan -Meier 生存曲线。c实验中小鼠肺部的微型 CT 图像。图像是在受伤后第 18 天拍摄的。（BLM；1.5 mg/kg体重，UC-EVs 代表 2.5 × 10 7，1 × EVs）d根据微型 CT 的三维重建数据评估肺体积；n  = 5，计算 p 值。e通过MouseOx 小动物生命体征监测仪测量呼吸扩张和 f 血氧饱和度水平。通过两个双尾 t 检验计算 P值；n = 5。g肺 重量直方图描绘了每组整个肺组织的重量。h肺系数确定为湿肺重量（g）除以总体重（g）。i受伤后 21天小鼠的代表性组织学肺切片用 H&E 和 Masson 三色染色。比例尺，500 μm 或 50 μm。j使用Ashcroft 评分对接受不同干预的小鼠肺组织纤维化严重程度进行定量评估。Ashcroft 评分根据 H&E染色计算。每张切片的纤维化改变严重程度以在显微镜下观察到的平均评分来评估。每张切片选取10个视野，由两名评估员评分，取平均值作为最终值。对小鼠肺组织中 Col1a1 ( k )、纤连蛋白 ( l ) 和 Col3a1 ( m ) 的相对 mRNA 水平进行定量 PCR 分析。对肺组织 ( n =3) 中纤连蛋白 ( n ) 和 Col3a1 ( o )的蛋白质印迹分析 。以 GAPDH 为上样对照。 hUCMSC-EVs在小鼠肺纤维化治疗中的作用 为了研究hUCMSC-EVs 是否可以减轻纤维化过程，我们治疗了BLM诱导的纤维化小鼠，涵盖增生期和纤维化期。在这种情况下，给予1-2mg/kg BLM，并在第 7 天通过微 CT成像确认纤维化开始（图7a）。根据纤维化严重程度，将小鼠随机分为轻度、中度和重度纤维化组，随后分配到三种治疗条件：盐水雾化、L929-EVs雾化或hUCMSC-EVs雾化。从第8天到第21天，小鼠接受了14轮治疗，随后在第22天进行微CT扫描以评估纤维化进展（图7b）。结果显示，在用盐水和L929-EVs治疗的 BLM攻击小鼠中，纤维化继续进展（图7b，绿色和橙色框）。有趣的是，用 hUCMSC-EVs治疗的小鼠的纤维化显著减少（图7b，蓝色框）。值得注意的是，hUCMSC-EVs治疗后，不同肺部区域（包括基底、中部和顶端部分）的纤维化病变均显著减少，这一趋势在实验重复中始终如一（图7b）。三维重建显示，PBS治疗组的肺体积进一步减小，而MSC-EVs治疗组的肺体积显著增加（图7c）。这些结果表明，雾化 hUCMSC-EVs可有效减缓BLM诱导的小鼠肺纤维化的进展。 图7 EVs在肺纤维化治疗中的作用。a动物实验示意图。第 1 天，小鼠接受气管内注射博来霉素 (BLM；1-2 mg/kg 体重)。第7天，所有小鼠接受微 CT 成像，并随机分为三组（每组n  = 3）。第8天，小鼠通过雾化接受 hUCMSC-EVs或L929-EVs（2.5 × 10⁷ 颗粒）或等体积的盐水溶液治疗。第22天，再次进行微CT成像，以评估治疗前后相同解剖位置的纤维化变化。b在受伤后第 7 天和 BLM 攻击后第 22 天，所有小鼠同一肺部横截面的代表性微 CT图像。重复两次。c 图示了治疗干预后观察到的肺体积变化。计算治疗前后的肺体积。负值表示治疗后肺体积减少。（n=3）。d小鼠肺组织中miR-486-5p 相对 mRNA 水平的 Stem-loop PCR 分析。e 代表性流式细胞术伪彩色图显示不同组小鼠肺泡巨噬细胞中 Siglec-F、CD11b 和 CD206 的表达。f 支气管肺泡灌洗液中Siglec - F+、CD11b+ 巨噬细胞的比例。g 支气管肺泡灌洗液中Siglec-F+、CD11b+ 和 CD206 巨噬细胞的比例。h支气管肺泡灌洗液中 Siglec-F-、CD11b+巨噬细胞的比例。小鼠肺泡巨噬细胞中IL-10（ i）、MMP13（j）、HGF（k ）和SPP1（L）相对mRNA水平的定量PCR分析 为了探索hUCMSC-EVs的治疗机制，我们分析了肺组织中miRNA的表达，发现hUCMSC-EVs治疗组中miRNA-486-5p显著上调（图7d）。据报道，miRNA-486-5p通过靶向巨噬细胞36、37（在肺纤维化中至关重要）来抑制炎症反应38，我们进一步研究了肺泡巨噬细胞在hUCMSC-EVs治疗中的作用。收集接受BLM刺激和EVs处理的小鼠的支气管肺泡灌洗液（BAL），并通过流式细胞术进行分析。我们观察到，与健康小鼠相比，BLM攻击后所有组小鼠的肺泡单核细胞群水平均有所增加，以Siglec-F+/CD11b+细胞表示（39）（图7e，上图，Ctrl vs BLMs；图7f）。虽然hUCMSC-EV治疗后肺泡单核细胞总数仍然很高（图7e，30.75%、31.86%和47.71%vs9.87%；右上图），但M2巨噬细胞（CD206+）的百分比从 35.67~42.91% 显著增加到69.79%（图7e，下图；图7g）。同时，健康小鼠中M2型巨噬细胞比例保持在84.41%，但雾化吸入的hUCMSC-EVs可增加BLM攻击小鼠中M2型巨噬细胞数量（图7e-g）。另一方面，雾化吸入的hUCMSC-EVs显著减少了Siglec-F-/CD11b+细胞（图7e、h）。这些结果表明，hUCMSC-EVs在纤维化中的作用可能归因于miRNA-486-5p的升高和M2型巨噬细胞的增加。 为了鉴定与纤维化相关的巨噬细胞中表达的关键基因，我们进行了qPCR分析。结果显示，抗纤维化基因，包括IL-10（图7i）、40MMP13（图7j）、41和HGF（图7k）、42在hUCMSC-EV治疗后上调。此外，据报道在纤维化进展过程中在巨噬细胞中上调的SPP1 43、44在hUCMSC-EV治疗后下调（图7l）。这些发现表明，BLM诱导的肺损伤导致巨噬细胞募集至肺泡，而hUCMSC-EV治疗促进这些巨噬细胞向M2表型极化。综上所述，雾化吸入hUCMSC-EVs可通过减少纤维化病变、恢复肺容量和调节巨噬细胞极化，有效缓解已形成的肺纤维化。这些结果凸显了hUCMSC-EVs作为治疗已发病肺纤维化新策略的潜力。雾化hUCMSC-EVs治疗肺纤维化患者的临床安全性 为了确定雾化hUCMSC-EVs是否对肺纤维化患者有影响，我们从 2023 年 4 月 20日到2025年5月2日启动了一项临床试验(MR-46-22-004531，ChiCTR2300075466)。共筛选了26 名参与者以确定其是否符合资格；两名被排除 - 一名因退出，另一名因根据纳入和排除标准隐瞒癌症手术史（补充文本）。最终，24名经HRCT（高分辨率CT）诊断为肺纤维化病变的参与者参加了这项单盲试验。这些参与者被随机分为两组：一组接受常规治疗加雾化hUCMSC-EVs（实验组，12名患者），另一组接受盐水雾化（对照组，12名患者）（图8a）。总结了这24名患者的基线特征，实验组和生理盐水组之间没有显著差异（表2，补充表1）。所有患者在整个研究过程中均维持原有治疗方案（补充表2）。雾化包括6ml生理盐水与 2 ml hUCMSC-EVs（2 × 10 9颗粒）或生理盐水（对照组）的组合。每天进行两次雾化，治疗时间为09:00 ± 30 分钟和 20:00 ± 30 分钟，持续7天。所用的网状雾化器确保粒径< 5 μm。在第 1、8、28 和84 天进行随访评估，并在第 180 和 360 天进行电话随访（图8a，补充表3）。 图8 雾化hUCMSC-EVs 对肺纤维化患者的临床安全性。a I 期临床试验流程图。该图像由 MedPeer 创建。在临床试验中，使用雾化盐水和 hUCMSC-EVs 治疗前后，对 WBC ( b )、中性粒细胞 ( c )、LYM (d)、RBC (e)、Hb (f ) 、 PLT ( g ) 、 ALT ( h ) 、AST ( i)、BUN (j)、Cr ( k )、IL-6 ( l ) 进行实验室检查。WBC白细胞。LYM 淋巴细胞。RBC：红细胞。Hb 血红蛋白。PLT 血小板。ALT 丙氨酸氨基转移酶。AST 天冬氨酸氨基转移酶。BUN 血尿素氮。Cr 肌酐。IL-6 白细胞介素-6 首要目标是评估雾化hUCMSC-EVs的安全性。所有参与者均对治疗耐受良好，未观察到心脏功能、血液学参数、肝肾功能、急性过敏反应或免疫反应的显著变化。在初步调查期间，监测了体温、心电图 (ECG)、皮肤病学评估和血氧饱和度（数据保存在医院）。这些参数在试验期间保持在正常范围内，未出现过敏性皮肤反应、心律失常或ST-T段异常。血氧饱和度在整个治疗期间保持稳定（补充图3a，补充表4）。 接下来，我们在吸入后第0天和第8天对参与者进行了血清检查。结果显示，治疗期间从第0天到第8天，血液学指标，包括白细胞计数（WBC）、中性粒细胞（N）、淋巴细胞（LYM）、红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）和血小板（PLT），均无显著变化（图8 b– g，补充表5）。肝功能标志物，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST），以及肾功能标志物，包括血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr），保持稳定（图8 h– k，补充表5）。我们持续观察到，吸入第一周后，血脂（TG，甘油三酯；TC，总胆固醇；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白）（补充图3c - e，补充表5）和血糖（Glu）（补充图3f）保持在正常范围内。此外，我们发现使用雾化hUCMSC-EVs 后 IL-6 没有改变（图8l，补充表6），这表明该治疗不会引起炎症。所有这些观察结果一致表明，使用雾化hUCMSC-EVs 治疗对人体是安全的。 在治疗后的长期观察中，我们进一步记录了患者可能出现的不良事件。令人欣慰的是，未报告任何对hUCMSC-EVs的过敏反应，并且在12个月的随访中也未观察到任何不良事件。总体而言，我们得出结论，雾化hUCMSC-EVs治疗肺纤维化患者耐受性良好，并显示出良好的安全性。雾化吸入hUCMSC-EVs治疗肺纤维化的临床疗效 为了证明该疗法对肺纤维化患者的疗效，我们对肺功能指标进行了分析。结果显示，与接受生理盐水治疗的患者相比，接受雾化hUCMSC-EVs治疗的患者用力肺活量 (FVC)（图9a，补充表7）和最大自主通气量(MVV)（图9b，补充表7）均有显著改善。然而，其他指标在实验组和对照组之间没有差异，但在治疗后没有加重的趋势（补充图4，补充表7、8）。此外，我们使用了广泛认可的问卷来评估肺功能恢复情况。结果显示，与对照组相比，实验组患者的圣乔治呼吸问卷 (SGRQ) 评分显著降低，表明患者在接受附加雾化 hUCMSC-EV 治疗后活动受限减少，病情恢复正常（图 9c，补充表9）。另一方面，我们观察到接受雾化 hUCMSC-EV 治疗的患者的莱斯特咳嗽问卷 (LCQ)评分有所提高，该评分提高可反映患者生活质量的提高（图9d，补充表9）。为了评估治疗的整体效果，我们总结了治疗后所有有变化的指标。这些指标包括6分钟步行距离 (6MWD)、FEV 1、FVC、MVV、DL CO、SGRQ、LCQ、ALT和mMRC。通过比较雾化hUCMSC-EV治疗前后各项指标的变化，将患者分为好转组和未好转组。最后，计算获益事件，以好转/未好转参数定义（1：好转>未好转；0.5：好转=未好转；0：好转<未好转）。对各项指标进行配对t检验，结果p=0.05（图9e）。该结果提示，在常规治疗基础上，雾化hUCMSC-EV治疗对患者的总体疗效显著。 图9 雾化吸入hUCMSC-EVs治疗肺纤维化的临床疗效。临床试验中雾化生理盐水和hUCMSC-EVs治疗前后FVC（ a）、MVV（b）、SGRQ（c）和LCQ（d）水平及统计分析。e显示雾化生理盐水和hUCMSC-EVs治疗获益病例的热图。橙色表示改善，蓝色表示无改善。数字与病例标识符相对应。（1：改善>未改善；0.5：改善=未改善；0：改善<未改善）f三名参与者肺部的代表性HRCT图像。FVC用力肺活量，MVV 最大自主通气量，SGRQ 圣乔治呼吸问卷，LCQ 莱斯特咳嗽问卷 最后，我们分析了所有患者在治疗后第0、28 和 84 天检查的 HRCT 图像，并比较了观察期间的变化。结果显示，大多数患者没有明显改善，也没有聚集（数据未显示，但保存在医院的信息中心）。这与患者的常规临床治疗一致。有趣的是，我们观察到两名患者的HRCT图像有明显改善，如在雾化hUCMSC-EVs治疗后第 28 天所观察到的。这两名患者显示出进一步的改善，如在用雾化hUCMSC-EVs治疗后第 84 天所观察到的（图9f，顶部两个面板，红色箭头）。具体来说，参与者9在 0天时左肺可见斑片状影、毛玻璃密度影，胸膜下带状模糊阴影，这种CT图像特征在第28天有所改善，但在84天明显改善，表现为左肺病灶大部分消退（图9f，上排）。参与者15在0天时显示右下叶广泛实变和密度不均，并伴有散在斑片状毛玻璃密度影、线状阴影和左肺斜裂线状毛玻璃密度影。第28天，右下叶实变基本消退，周围毛玻璃密度影消失，仅残留细腻的网状、线状和毛玻璃状阴影。左肺斜裂的毛玻璃影也基本消退。第84天，该患者的右下叶实变主要消退（图9f，中排）。作为对照，我们发现对照组（常规治疗加生理盐水）中的18号患者在这些时间段内纤维化进展加剧（图9f，下图）。总而言之，所有这些观察结果表明，雾化hUCMSC-EVs治疗对肺纤维化患者在常规治疗期间有益。因此，我们得出结论，雾化hUCMSC-EVs治疗在临床应用中显示出初步疗效。 讨论 肺纤维化的治疗仍然是一项重大挑战，目前的临床治疗是采用多种策略来管理疾病，以维持患者的良好状态，而不会进展或加重。在本研究中，我们报告使用雾化hUCMSC-EVs（一种有前途的无细胞疗法途径）作为治疗肺纤维化患者的新策略。我们建立了一套全面的系统，以确保在生产的每个阶段都符合良好生产规范(GMP) 标准，并提出了4个关键质量控制点 (CQCP) 来保证质量。我们的结果表明，雾化hUCMSC-EV治疗是安全的，并且患者从治疗中受益，这通过多项临床指标进行评估。由于我们的试验基于常规基线治疗，我们得出结论，雾化hUCMSC-EV疗法进一步改善了患者状况，并可与现有疗法相结合。这为肺纤维化的治疗开辟了新的途径，也为肺纤维化患者未来更好的康复带来了希望。 已有多项研究深入探讨了雾化囊泡在治疗肺部疾病中的应用。宣伟霞等报道，雾化血小板衍生的细胞外囊泡可有效缓解小鼠慢性香烟烟雾诱发的肺气肿。石萌萌等报道了临床级雾化同种异体脂肪间充质基质细胞衍生的细胞外囊泡的临床前疗效和临床安全性。Phuong -Uyen C. Dinh 等报道了一项利用吸入肺球细胞分泌体 (LSC-Sec) 和外泌体 (LSC-Exo) 治疗小鼠模型中的肺损伤和纤维化的研究。本研究在临床前动物实验中，利用微雾雾化器系统地研究了不同浓度hUCMSC-EVs 的治疗效果。所有结果均表明，在临床前小鼠肺纤维化模型中，雾化给予 hUCMSC-EVs后，肺组织结构和功能得到显著改善。Micro-CT 分析显示，与单独接受盐水或 DMEM 治疗的小鼠相比，接受hUCMSC-EVs治疗的小鼠的纤维化病变、支气管扩张、间隔增厚和纤维化虚线区域减少。我们在动物模型中的结果巩固了 hUCMSC-EVs在肺纤维化治疗中的作用。我们的研究一致验证了先前关于使用雾化 EVs 治疗其他疾病（如 COVID-19 肺炎）的研究。 然而，由于外泌体或细胞外囊泡的内容物差异很大，将这些颗粒成功转化为临床实践的关键问题仍然具有挑战性。在本研究中，我们建立了一套严格的、符合GMP标准的hUCMSC-EVs生产流程，并提出了多项基于质谱、RNA深度测序和代谢物分析的质量控制标准。我们的研究也符合其他研究的要求，即在从间充质干细胞分离纯化以及用于治疗用途的制剂过程中，hUCMSC-EVs的生产过程应受到监控。由于异质性无法避免，我们认为分析内容物是保证批次间稳定性的一种方法。 为了探究其机制，我们分析了RNA、蛋白质和代谢物的含量。我们观察到 10 个 miRNA 占主导地位，其含量超过2%，占总 miRNA的 62%。我们的结果与Scott W Ferguson等人的研究结果相呼应，其中miR-451a、miR-221-3p、miR-21-5p、miR-100-5p和let-7a-5p被相互识别，在我们的分析中占总 mRNA 的 32%，在他们的报告中占22.7%。这5 个miRNA 可能表明hUCMSC-EVs的主要功能。事实上，据报道，hUCMSC-EVs 中最丰富的 miRNA miRNA-451a是几种纤维化相关基因的转录调控因子。我们的研究支持了miR-451a转染的EVs显著减轻了 PHMG-p暴露肺中的纤维化发生的事实，突出了hUCMSC-EVs在纤维化治疗中的潜在治疗机制。另一方面，我们的结果中hUCMSC-EVs的蛋白质含量与其他人的有很大不同。最近，Youkun Bi 等人和Xiao Xu等人报道了hUCMSC-EVs 中的蛋白质。虽然GO分析揭示了几种来自蛋白质的重叠途径，但在他们的结果和我们的结果之间，hUCMSC-EVs中存在罕见的共同蛋白质。令我们惊讶的是，我们只观察到 COL6A3、MYH9 和 FN1 共同呈现在我们和Xiao Xu等人的结果中。在这种情况下，我们认为蛋白质的类型和数量可能更敏感，因为它们受温度、pH值和冻融循环等环境因素和储存条件的影响。此外，我们发现我们分析的代谢物中约有30种成分已被其他人报道过。我们的研究表明，纯化的hUCMSC-EVs在三批生产、纯化和储存过程中，代谢物保持了相对较高的一致性和稳定性。我们推测，不同研究组报告的蛋白质和代谢物差异可能是由于从不同供体分离的细胞不同所致。综上所述，我们使用蛋白质、代谢物和miRNA来评估纯化hUCMSC-EVs的一致性和稳定性。 关于hUCMSC-EVs应用的另一个担忧是剂量。与化学药物不同，生物制剂的给药策略通常具有更宽的治疗窗口。在我们的研究中，我们使用每只小鼠2.5 × 10 7 个颗粒作为基础剂量。然后，我们将剂量增加到每只小鼠2.25× 10 8 个颗粒，增加了9倍，作为最大给药量。我们观察到这个最大量hUCMSC-EVs对小鼠没有不良影响。另一方面，我们观察到在小鼠模型中，在其他更高剂量中，每只小鼠2.5 × 10 7 个颗粒的量仍然是最好的治疗效果。考虑到所有这些观察结果，我们决定每人使用 2 × 10 9 个颗粒，按照每只小鼠 2.5× 10 7 个颗粒的最小量计算。 此外，我们的数据支持雾化hUCMSC-EVs 治疗肺纤维化的临床疗效。在我们的临床试验中，我们对接受常规基线治疗的患者应用了雾化hUCMSC-EVs。令我们满意的是，我们观察到接受 hUCMSC-EVs 治疗的患者在几个指标上获得了比常规治疗更多的益处，特别是 FEV 1、FVC、MVV 和 DL CO。这些结果表明，hUCMSC-EVs 在肺纤维化患者的常规治疗中具有补充作用。最后但同样重要的是，我们招募了四种类型肺纤维化的患者，包括伴有纤维化的COPD、IPF、ILD和炎症后肺纤维化。虽然在肺纤维化亚型之间没有观察到组间差异，但两名炎症后肺纤维化患者在接受雾化hUCMSC-EVs治疗后表现出显著的放射学改善。相反，我们发现对照组中有一名患者的肺纤维化在放射学上出现进展。有趣的是，这些HRCT的改变与参数的变化相关，因为HRCT改善的两名患者比纤维化进展的患者显示出更多的有益参数。这些结果表明该治疗对患者总体有益。由于HRCT改善的两名患者是炎症后肺纤维化，因此有必要探究 hUCMSC-EV 疗法是否更适合这类肺纤维化患者。总之，我们的结果表明，雾化hUCMSC-EV 在治疗肺纤维化患者方面表现出安全性和有效性，这提示它可能是一种有前景的治疗这种顽固疾病的策略。 相关文章： 我们关注呼吸道问题，分享呼吸道相关问题的国际前沿指南、共识和资讯，欢迎关注！ 往期文章：【鼻炎相关】乐城自研外泌体喷剂，9天解决慢性鼻炎和过敏性鼻炎（一）过敏性鼻炎的鉴别诊断 （二）过敏性鼻炎的病理生理学和机制 （三）过敏性鼻炎的流行病学 （四）避免主要过敏原 （五）过敏性鼻炎的药物治疗 （六）过敏性鼻炎的免疫疗法 （七）过敏性鼻炎的手术干预 （八）过敏性鼻炎的儿科应用 （九）过敏性鼻炎的合并疾病【肺纤维化相关】7天改善肺纤维化？关于干细胞外泌体雾化治疗【国际指南】日本特发性肺纤维化治疗指南（修订版） 点击阅读原文

Third Independent Data Monitoring Committee (IDMC) review confirms safety and continuation of the study 94 patients enrolled out of 102 planned across Korea and the U.S. Interim baseline characteristics to be presented at the 2025 KATRD International Conference SEOUL, South Korea, Oct. 27, 2025 /PRNewswire/ -- Daewoong Pharmaceutical (Co-CEOs Seong-Soo Park and Chang-Jae Lee) announced that its first-in-class idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) drug candidate Bersiporocin (DWN12088) received a recommendation to continue its global Phase 2 clinical trial following a positive safety review by the third Independent Data Monitoring Committee (IDMC) held on September 23. Continue Reading Daewoong Pharmaceutical Third IDMC Reaffirms Safety of Bersiporocin and Recommends Continuation of Global Phase 2 Clinical Trial The IDMC conducted an in-depth evaluation of interim safety data from 89 enrolled patients and found no significant safety concerns that would impact the trial's continuation. To date, Daewoong has enrolled 94 participants, representing approximately 92% of the target population (102 patients), and the study is progressing as planned. The ongoing Phase 2 trial (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT05389215) aims to evaluate the safety, tolerability, and efficacy of Bersiporocin as monotherapy or in combination with approved antifibrotic drugs (nintedanib or pirfenidone) in patients aged 40 years and older. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic, progressive lung disease characterized by abnormal collagen accumulation leading to irreversible loss of lung function. Currently available treatments can only slow disease progression, highlighting the unmet medical need for novel therapies that address the root cause of fibrosis. Bersiporocin is a first-in-class, orally administered antifibrotic therapy that selectively inhibits prolyl-tRNA synthetase (PRS) — a key enzyme involved in collagen synthesis. By directly blocking this pathway, Bersiporocin is designed to halt fibrosis at its origin, potentially overcoming the limitations of existing antifibrotic treatments. The trial is being conducted at major clinical sites in South Korea and the United States. Trial information is available at ClinicalTrials.gov (NCT05389215) and the Pulmonary Fibrosis Foundation (PFF) clinical registry. Professor Jin Woo Song of Asan Medical Center, who serves as the Coordinating Investigator and Principal Investigator of the global Phase 2 study, will present on October 30 a poster at the 2025 KATRD International Conference (Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory Diseases, October 29–31) featuring the interim analysis of baseline characteristics from 92 enrolled patients. The findings demonstrate consistency in key demographic and functional characteristics and treatment patterns between Korean and U.S. cohorts, supporting the applicability of the trial design across diverse populations and providing a foundation for interpreting future efficacy outcomes. "This third IDMC recommendation represents a major milestone reaffirming the safety and progress of Bersiporocin," said Seong-Soo Park, CEO of Daewoong Pharmaceutical. "We will continue to advance the Phase 2 study to deliver a new and effective treatment option for patients suffering from idiopathic pulmonary fibrosis worldwide." SOURCE Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd. WANT YOUR COMPANY'S NEWS FEATURED ON PRNEWSWIRE.COM? 440k+ Newsrooms & Influencers 9k+ Digital Media Outlets 270k+ Journalists Opted In GET STARTED