ISA-101

老朋友，应该知道，我们一直在持续输出关于 circRNA 技术方面的深度解析文章，并且在飞书搭建了涉及不同 circRNA 环化策略的骨架序列库。说实话，前两年，我们并不是那么看好 circRNA，因为相比线性 mRNA，circRNA 制备工艺更复杂，而且，在环化骨架设计、环化率、分离纯化、质量分析等方面存在一系列未被解决的难题。然而，近一年多以来，国内环状 RNA 公司接连拿到 IND，例如，转录本、环码、圆因，并且，越来越多的研究者开始探索采用 circRNA 技术实现 in vivo CAR-T 疗法。近日，BMS 更是以 15 亿美金收购了拥有 circRNA+in vivo CAR-T 药物平台的 Orbital 公司。在这种异常火爆的形势下，我们认为，circRNA 工艺已经成熟，完全具备了临床转化应用的条件。不过，与常规线性 mRNA 技术相比，circRNA 技术并非人人都可以玩转，存在较高的技术壁垒，这使得那些专注于 circRNA 药物开发的初创 biotech 迎来了又一轮的小春天。 近日，我们注意到中国科学院杭州医学研究所谭蔚泓院士团队在 bioRxiv 上传了一篇预印本文章：Programmable Aptamer-Embedded Circular RNAs for Targeted Antigen-Presenting Cells Immunotherapy。他们开发了一种无需载体递送，在适配体介导下可高效靶向淋巴结，编码肿瘤新生抗原的适配体嵌合 Apt-circRNA 疫苗，并且，在首次临床试验中已经证实其具备良好的安全性，能够触发抗原特异性的免疫反应。如此快速的进展，引起了我们极大的兴趣：Apt-circRNA 疫苗无需载体递送，直接注射裸 Apt-circRNA，难道不会发生降解吗？采用的是哪种环化策略呢？适配体序列是如何嵌入环化骨架的呢，不会对其环化效率造成影响吗？Apt-circRNA 在体内的靶向性如何，主要分布在哪些器官？Apt-circRNA 在临床研究中的安全性和有效性又是怎样的？带着这些困惑，我们对这项前卫的工作进行了深度解析。 1    如何制备 Apt-circRNA？ 从结构上看，Apt-circRNA 序列可分为三部分：第一，基于Ⅰ型内含子的 PIE 环化骨架，源自 Ana 或者 T4 噬菌体；第二，靶向 DC 细胞表面蛋白的适配体；第三，编码抗原的 CDS 序列。为优化 PEI 环化骨架，研究者用适配体序列替换掉Ⅰ型内含子两侧的外显子序列 E1/E2，将环化剪接位点置于适配体 Loop 结构中，突变 P1/P10 区域碱基，以维系其互补配对区域。适配体固有茎环结构的茎允许核酶产生独立的剪接气泡，从而促进 Apt-circRNA 的高效环化。最终，在不突变适配体序列的情况下，成功环化合成 Apt-circRNA，且环化效率可超过 80%。遗憾的是，文章中对于 GMP 级别的 Apt-circRNA 疫苗临床样品制备工艺并未详细说明，例如，纯化工艺，杂质去除等。适配体类型和数量对于环化效率的影响也并未作出研究。 2    Apt-circRNA 的稳定性 我们深感困惑的是，在没有 LNP 等载体包封的情况下，Apt-circRNA 怎么能够在体内复杂的环境（广泛存在 RNase）下避免被降解呢？由是如何被转运到靶细胞内的呢？研究者发现，相比于线性 m1Ψ-mRNA，在 10%FBS（胎牛血清）中，Apt-circRNA 稳定性更高，可在 24h 内可保持其完整性，不发生明显降解。胎牛血清的成分可是非常复杂的，Apt-circRNA 居然可以维系完整性将近 24h，我们表示大为震惊。Apt-circRNA 在 10%FBS 更长时间的稳定性数据，研究者并未放出。 我们查到，适配体主要通过受体介导的内吞作用进入细胞，那意味着 Apt-circRNA 需要承受胞内体的酸性环境。研究者发现，Apt-circRNA 在 4.0 至 8.0 的 pH 范围内（37℃）可稳定保持其完整性超过 24 小时。不过，Apt-circRNA 进入到内体后，是如何从中逃逸出来的，我们很困惑，研究者也并未提及。 3    适配体类型及密度影响 Apt-circRNA 靶向性 既然 Apt-circRNA 是通过适配体与细胞表面受体结合实现靶向性，那不同的适配体类型以及数量是否会影响其靶向性呢？研究靶向 DC 细胞表面不同标记物的三条适配体嵌合至编码 SIINFEKL 抗原的 circRNA 上，适配体分别为：nuc（核仁素），waz（转铁蛋白受体），min2（一种内吞受体）。研究者将三种 Apt-SIINFEKL circRNA 与鼠源 BMDC 细胞共孵育，无论使用哪种类型的适配体，检测到 BMDC 细胞表面抗原 SIINFEKL 的表达均会随着适配体数量的增加而逐渐增加，并且 min2 适配体嵌合 circRNA 表达更高水平的抗原。 由于双特异性适配体可增强与靶细胞的特异性结合，研究者设计了嵌合两种类型适配体的 circRNA，并且，通过筛选确定了一种包含 5 个 waz 和 4 个 min2 适配体的 Apt-circRNA 构建体具有最强的抗原呈递能力。因此，该适配体组合用于后续的 Apt-circRNA 构建。 与非嵌合适配体 circRNA 相比，Apt-circRNA 与小鼠 BMCD 或者人 DC 细胞的结合能力显著增强。同时，Apt-circRNA 能够快速被细胞摄取，转染后 4 小时内，便可在 DC 细胞中检测到标记 Apt-circRNA 的荧光信号。然而，Apt-circRNA 转染效率明显不及 circRNA-LNP。 4    Apt-circRNA 的体内分布特征 在小鼠尾部，通过皮下注射放射性标记的 Apt-circRNA，研究者观察 Apt-circRNA 的体内分布和代谢情况。PET 成像显示，Apt-circRNA 在腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结的摄取量分别可达到 15.7 ± 2.6 %ID/g 与 14.8 ± 0.3 %ID/g，相比之下，非适配体嵌合的 circRNA 在腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结的摄取量仅为 5.5±2.8%ID/g 与 4.3±2.9%ID/g。由于肾脏的清除功能，使其成为 Apt-circRNA 体内主要的累积器官。除去肾脏和淋巴结，在其他器官中未检测到 Apt-circRNA 分布，表明 Apt-circRNA 靶向特异性很高。 在小鼠尾基部皮下注射 Cy5 标记的 Apt-circRNA，注射 6h 后，分离淋巴结，制备细胞悬浮液，检测 Apt-circRNA 淋巴结内细胞的分布情况。与非适配体嵌合的 circRNA 组相比，Apt-circRNA 在 CD45+细胞和 DCs 细胞中的比例明显更高。 免疫组织学分析显示，大多数 Apt-circRNA 能够在注射部位被 DC 有效内化，随后在聚积在淋巴结中的囊下窦(SCS)和滤泡间区域（IFR），相比之下，在皮下注射部位未检测到任何非适配体嵌合的 circRNA 的荧光标记信号，仅在淋巴结内观察到极少量的荧光标记信号。有意思的是，在皮下注射部位可观察到完整的 LNP-circRNA 脂质纳米颗粒分布，而在淋巴结中，LNP-circRNA 中被 DC 细胞和 B 细胞摄取。这些发现表明，适配体的确可促进 DC 细胞特异性识别并内化 Apt-circRNA，最终将其靶向递送至淋巴结。 5    Apt-circRNA 的先天免疫刺激特异性 外源的 RNA 通过各种模式识别受体来激活先天免疫，从而为适应性免疫条件提供所必需的细胞因子和共刺激信号。Apt-circRNA 疫苗的自佐剂特性可激活多种先天免疫感应通路，包括 TLR1/2、TLR7/8 和 RIG-I，从而产生与 LNP 递送的 circRNA 相当的强大炎症信号传导和抗原呈递。通过表达抗原和激活靶向性的免疫细胞， Apt-circRNA 疫苗发挥免疫调节机制。 与 LNP-circRNA 相比，Apt-circRNA 能触发更低水平的反应原性相关的趋化因子和细胞因子（除 IL-12 外），表明 Apt-circRNA 具有良好的安全性。此外，Apt-circRNA 在 BMDC 中表现出更低的毒性。给予高剂量 LNP-circRNA 的小鼠表现出体重减轻，而 Apt-circRNA 组仅发生最小的体重变化。 6    多价 Apt-circRNA 疫苗实现强效联合免疫 构建同时编码 MHC-I 限制性的 Adpgk（MC38 肿瘤细胞特异性新抗原）、MHC-I 限制性表位 HPV16 E749-57（HPV 相关癌症）和黑色素瘤相关的小鼠抗原 TRP2180-190 和人抗原 gp10023-33 的多价 Apt-circRNA-AETG 疫苗。在 MC38 小鼠结肠癌模型、TC-I 小鼠 HPV16 小鼠模型及 B16F10 黑色素瘤小鼠模型中，尾基部皮下注射多价 Apt-circRNA-AETG 疫苗，结果显示，Apt-circRNA-AETG 单次给药均可明显抑制三种类型的肿瘤生长。联合注射 Apt-circRNA 和抗 PD-1 抗体时，可协同增强抗肿瘤效果，延长小鼠生存期。值得注意的是，在三个月的观察期内，这种联合免疫可导致七分之二的小鼠肿瘤完全消退而没有复发。 KRAS 突变导致细胞生长不受控制，主要见于胰腺癌、结直肠癌（CRC）和肺癌。研究者构建了编码 KARS G12D 和 G12V 的二价 Apt-circRNA 疫苗，免疫在 Balb / c 小鼠，可触发 KRAS 特异性的、分泌 IFNγ / TNF 的多功能 CD8 + 和 CD4 + T 细胞。Apt-circRNA-KR2 免疫 KRAS G12D 突变的 CT26 荷瘤小鼠，显著抑制 CT26 肿瘤的生长。Apt-circRNA-KR2 与抗 PD-1 抗体联合注射，可协同增强抗肿瘤效果，延长小鼠生存期。值得注意的是，7 个肿瘤中有 2 个在 2 个月内完全消退，没有复发。 Apt-circRNA-KR2 免疫 CT26-luc 肺转移小鼠，表现出明显的抗肿瘤效果，并且，与抗 PD-1 抗体联合注射，可显著增强抗肿瘤效果。注射抗 CD20、抗 CD4 和抗 CD8 抗体分别耗尽 B 细胞、CD4+ 和 CD8+ T 细胞，结果发现，CD8+ T 细胞的耗竭完全消除了 Apt-circRNA-KR2 的肿瘤抑制作用，相比之下，B 细胞和 CD4+ T 细胞的耗竭仅对 Apt-circRNA-KR2 的抗肿瘤作用造成最小损害。上述结果说明，CD8+ T 细胞介导的免疫反应对于 Apt-circRNA-KR2 疫苗免疫后的肿瘤杀伤和生长控制起着关键作用。 在结直肠癌人 PDOX 源化小鼠模型中，通过尾静脉注射 Apt-circRNA-KR2 ，每三天注射一次，总共六次。第 5 天，每 3 天腹腔注射一次抗人 PD-1 抗体，共 5 次。Apt-circRNA-KR2 可明显抑制肿瘤生长，与抗 PD-1 抗体联合注射，可显著增强抗肿瘤效果。此外，研究还探索了 Apt-circRNA 疫苗治疗机制，简而言之，Apt-circRNA 既通过在人 APC 中有效表达抗原来扩大抗原呈递，又通过诱导癌症相关成纤维细胞的自噬和凋亡来重塑肿瘤免疫微环境，从而促进细胞毒性 T 细胞增殖。 7    Apt-circRNA-KR2 首次临床试验 7.1    安全性 在首次人体临床试验中，Apt-circRNA-KR2 疫苗表现良好的安全性。在剂量递增（50μg、100μg 和 250μg; 3 人 /组，共 9 人） 和重复给药 （250μg; 共 3 人） 的受试者中，唯一的不良事件是发生在一个受试者身上的短暂流感样症状。未观察到 ≥2 级毒性或注射部位反应。所有血液学和免疫参数在 180 天内保持在正常范围内。 7.2    免疫反应 受试者短暂流感样症状的观察表明，Apt-circRNA-KR2 疫苗可能引发了早期先天免疫反应。三名受试者的 PBMC 细胞 scRNA-seq 分析显示：APCs 细胞（B 细胞与 CD14⁺ 单核细胞）和 CD8⁺ T 细胞，在接种 Apt-circRNA 疫苗后 12 小时达到峰值，并在 7 天内恢复到基线。值得注意的是，在疫苗接种后第 30 天，一名受试者依然表现出 B 细胞和 CD14⁺ 单核细胞的升高。相比之下，浆细胞样树突状细胞（pDC）数量随着时间的推移逐渐增加，但也在第 30 天恢复到基线。γδ T 细胞数量在第二剂疫苗后增加，并在第 30 天保持在基线水平以上。这些结果表明，Apt-circRNA-KR2 接种确实会在体内引发免疫反应，并且在 30 天时开始过渡到免疫记忆。 接种 Apt-circRNA-KR2 疫苗前后的转录组学分析显示在 12 小时内，髓系细胞、B 细胞及 T 细胞出现数百个差异表达基因，反映了快速而强大的先天和适应性免疫激活。在接种疫苗后的第 7 天，所有这些基因的转录活性基本恢复至基线水平，表明激活周期是短暂但可重复的。基因集富集分析证实了抗原呈递、TCR/BCR 信号传导和炎症途径（例如 TNF、IL-17 和 JAK-STAT）的早期激活，干扰素反应基因在第 7 天仍然升高。G12D 和 G12V 肽刺激疫苗接种后的 PBMC 细胞，检测到 IFN-γ 分泌，表明接种 Apt-circRNA-KR2 疫苗触发了针对 KRAS 突变的抗原特异性 T 细胞反应。这些结果表明，Apt-circRNA 可迅速引发抗原特异性免疫并促进协调的先天和适应性免疫反应。 8    小结 Apt-circRNA 疫苗最为显著的特色是完全不需要任何递送载体，使得 RNA 疫苗生产工艺发生巨大变革，再也不用担心 LNP 专利问题。通过皮下给药，Apt-circRNA 靶向 DC 细胞，借助细胞转运，将其递送至引流淋巴结，从而实现安全有效的抗肿瘤免疫。然而，与 LNP 递送相比，Apt-circRNA 转染效率较低，抗原表达时间较短，容易被肾脏清除，因而，可能需要频繁给药。未来，需要提升 Apt-circRNA 的转染效率和体内半衰期，还需要更加系统性的临床试验数据来验证 Apt-circRNA 疫苗的治疗效果。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

10月13日，第十四届中国国际专利技术与产品交易会开幕式暨第二十五届中国专利奖颁奖大会在辽宁省大连市举办。厦门万泰沧海生物技术有限公司（万泰疫苗）与厦门大学联合持有的发明专利“截短的人乳头瘤病毒16型L1蛋白”荣获中国专利金奖，这象征着中国生物技术创新的重大跨越，打破了国际制药巨头HPV疫苗的进口垄断。 中国专利奖由国家知识产权局和世界知识产权组织（WIPO）共同组织评选 揭开硬核技术的面纱 “截短的人乳头瘤病毒16型L1蛋白”专利在生产设施中可利用大肠杆菌的高密度发酵获得高产量的目的蛋白，从蛋白表达到HPV病毒样颗粒制备均易于实现工艺放大和验证，并可以推广到可实现至少9种型别HPV的病毒样颗粒制备[1]。 该项技术有三重意义： 1、突破国际专利壁垒，实现中国自主方案 突破了国外在HPV疫苗抗原生产领域的专利壁垒，开创了以大肠杆菌为载体的HPV抗原表达“中国方案”，实现了从核心技术到生产体系的自主可控。 2、免疫效果达到国际先进水平 基于这项技术研发的万泰旗下国产二价HPV疫苗和九价HPV疫苗，能够激发人体产生较高水平的特异性抗体[2,3]。 3、极大提升了疫苗生产的产能 相较于国外采用的真核表达系统，该技术具有工艺简单、高性价比、产量高和易于放大等优点，从而大幅提升生产效率[4]。 技术成果转化惠及全球女性 在过去，全球仅有2家外国企业能够生产和供应HPV疫苗，中国也完全依赖于进口产品，供应受限和疫苗价格成为阻碍中国消除宫颈癌的重要因素。万泰疫苗应用该专利生产的首款国产双价HPV疫苗自2019年上市以来，不仅迅速覆盖全国360多个地市、惠及千万女性，被纳入15个省级政府的免费接种项目，推动了中国女性HPV接种率的显著提升——十年临床持续监测显示，其接种约10年后HPV16/18型抗体阳性率仍保持在97%以上，并高效预防HPV16/18型相关癌前病变[5]。 该疫苗还于2021年通过世界卫生组织预认证（WHO PQ），目前已进入泰国、摩洛哥、印度尼西亚等21个海外国家市场，并被纳入泰国等8个国家的免疫规划，成为中国科技助力全球宫颈癌防治的重要力量。 国产九价HPV疫苗上市，开启新时代 2025年9月，首款国产九价HPV疫苗正式投入使用，使中国成为继美国之后，全球第二个拥有自主研发九价HPV疫苗的国家。自此，九价HPV疫苗进入普惠时代，是全球宫颈癌防治的重要里程碑。 “中国智造”，从跟跑到领跑，不仅是技术的追赶，更是健康中国愿景的践行。目前，搭载着诸多国人自主创新专利技术的首个国产九价HPV疫苗已经在全国多个省份开展接种，将为广大9-45岁的适龄女性提供新选择。让我们携科技创新之力，让理想照进现实，共建一个没有宫颈癌的世界。 参考文献： 1.https://std.xmu.edu.cn/_t1326/2025/0609/c4739a492522/page.htm 2.Zhong Guo-Hua, Bi Zhao-Feng, Chu Kai, et al. The Lancet Regional Health - Western Pacific,2025,62:101671-101671. 3.Agbenyega T, Schuind AE, Adjei S, et al. Lancet Infect Dis. 2025;25(8):861-872. 4.刘丽琴,等.中国新药杂志, 2020，29(21), 9 5.Zhao F, Chen Q, Zhao C, et al. Lancet Reg Health West Pac. 2025;61:101668.