Cemiplimab-RWLC

维多利亚·帕帕（Vittoria Papa）|伊尔塞·德萨尔韦（Ilse De Salve）|弗朗切斯科·莫利纳罗（Francesco Molinaro）|安德烈亚·迪·伊安尼（Andrea Di Ianni）|斯特凡妮亚·蒙杰（Stefania Monge）|丽塔·马斯特罗伊安尼（Rita Mastroianni）|亚历山德拉·阿里奥多（Alessandra Ariaudo）|帕特里齐亚·塔瓦诺（Patrizia Tavano）|瓦莱里娅·卡斯塔尼亚（Valeria Castagna）|凯拉·考恩（Kyra Cowan）|费德里科·里卡迪·西托里（Federico Riccardi Sirtori） NBE-DMPK Innovative Bioanalytic，隶属于德国达姆施塔特的默克塞尔诺RBM S.p.A.（Merck Serono RBM S.p.A.），该公司是默克KGaA（Merck KGaA）的子公司，地址：Via Ribes 1, 10010 Colleretto Giacosa（托斯卡纳大区）。 **摘要** 生物治疗性抗体正日益受到重视，最近采用了多种策略来最大化其潜在的治疗效果。治疗性单克隆抗体（mAbs）的可结晶片段（Fc）区域通常通过引入点突变来定制其效应功能和药代动力学（PK）特性。值得注意的是，这些突变大多发生在重链的铰链区和恒定区，这可能会抑制抗体的效应功能。已经发表了多种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法来定量具有典型人类Fc部分的生物制剂。本研究介绍了一种快速且灵敏的混合免疫捕获液相色谱-串联质谱（IC-LC-MS/MS）方法，用于定量总抗体浓度，该方法专门针对LALA突变肽（L234A/L235A）。样品制备过程包括免疫捕获以及胰蛋白酶和Glu-C消化，通过自动化可在两天内高效完成。所开发的方法根据ICH M10指南和白皮书建议进行了验证，重点关注了准确性、精度、稀释线性、选择性、稳定性及回收率等参数，并使用人源化IgG1 LALA突变抗体teplizumab作为分析标准品。该方法在小鼠血浆样本中显示出总抗体检测的线性，动态范围为150 ng/mL（定量下限，LLOQ）至15,000 ng/mL（定量上限，ULOQ）。所有在小鼠血浆中测试的验证参数均符合预定义的接受标准，证明了该方法的可靠性和稳健性。此外，该方法还成功用于表征含有Fc区域LALA突变的抗体-药物偶联物（ADC-1）在小鼠体内的药代动力学特性。 **1. 引言** 在不断发展的生物医学研究和药物开发领域，新的生物实体（NBEs）[Hale, 2024] 代表了重要的范式转变。这些治疗剂包括多种生物分子，如单克隆抗体、基因疗法、细胞疗法和基于核酸的疗法。与小分子药物相比，NBEs具有许多优势[Hale, 2024, Liu, 2018]，例如更高的特异性、更低的副作用以及个性化医疗的潜力[Kulkarni et al., 2024]。它们能够与特定的生物途径相互作用并精确调节这些相互作用，为以前被认为无法治疗的疾病开辟了新的治疗途径[Li et al., 2025]。基于IgG的生物制剂[Schroeder and Cavacini, 2010, Chiu and Gilliland, 2016]由两个抗原结合片段（Fabs）通过一个可结晶的（Fc）片段通过核心铰链区域连接[Bartsch et al., 2025]组成。Fab域中的六个互补决定区（CDRs）[Guo et al., 2024]形成了抗原结合位点，负责抗体的特异性和亲和力。免疫球蛋白的药代动力学（PK）和效应特性在很大程度上受其Fc区域的影响。FcRn受体与Fc以2:1的化学计量比相互作用，从而延长了IgG的半衰期。此外，Fc区域还可以与补体系统相互作用并激活白细胞上的Fc受体，诱导抗体依赖性的细胞毒性（ADCC）或抗体依赖性的细胞吞噬作用（ADCP）[Boross et al., 2023]。值得注意的是，通过蛋白质工程可以精细调节Fc介导的活性，使其成为增强功能活性或减少不良副作用的多功能策略[Wang et al., 2018, Strohl, 2018, Liu et al., 2020, Saunders, 2019]。常见的Fc变异是L234A/L235A（LALA）[Mongkut and Ladkrabang, 2023, Anon 2023, Lund et al., 1991]，这种突变会抑制与FcγRI、FcγRII和FcγRIII受体的结合以及与补体成分C1q的结合。当不需要激活Fc受体时（例如在细胞因子拮抗剂中）[Jiang et al., 2017]，会采用这种突变。目前，至少46%含有Fc区域的治疗性抗体已经上市或处于监管审查阶段，其中45%的抗体处于后期临床试验阶段[CreSCIoli et al., 2025, Brennan et al., 2025]。此外，几种含有LALA突变的治疗性抗体正在临床试验中，包括teplizumab [Keam, 2023, Chavan et al., 2025]、NCT00385697)、bimagrumab (NCT01925209)、cemiplimab (NCT02383212)、galcanezumab (NCT03559257)、progolimab (NCT03912389)、risankizumab (NCT02684370)、spesolimab (NCT03482635 [Wilkinson et al., 2021])，以及不同的抗体-药物偶联物ADC，如LNCB74 [Tolcher et al., 2025] 和 TUB-040 [Vogl et al., 2024]。 历史上，配体结合测定（LBAs）一直是生物分析中总抗体定量金的标准[Fischer et al., 2015]。然而，随着生物模式的复杂性增加，结合免疫捕获与LC-MS/MS的混合技术越来越受到重视，因为它们结合了LBA和LC-MS方法的优点。通常，在免疫捕获（IC）步骤之后，这些技术会加入酶消化阶段，通过多次反应监测（MRM）实验来定量目标分子。这通常使用低分辨率仪器（如三重四极杆质谱仪）来实现。这些方法既支持定性表征也支持定量生物分析。选择不同技术取决于多种因素，如所需的灵敏度、样品通量、目标分析物以及试剂的可用性。然而，IC-LC-MS/MS广泛用于蛋白质定量[Neubert et al., 2018]，在复杂基质中提供了比LBAs更高的特异性。这种协同作用对于理解比传统药物和低分子量生物标志物更复杂的生物分子的体内行为至关重要[He et al., 2025, Riccardi et al., 2025]。此外，LC-MS/MS技术对于测量生物样本中的药物浓度及其代谢物以进行药代动力学/毒代动力学研究也是必不可少的[Marzo and Bo, 2007]。 **2. 材料与方法** 2.1. 材料 teplizumab（库存浓度为7.63 mg/mL）由Medchemexpress提供（纯度99.90%）。合成肽[NH2] AAGGPSVFLFPPKPK[Amide]（纯度>99%）用于系统适用性测试（SST），而合成肽[NH2] AAGGPSVFLFPPK (13C6, 15N4) PK[Amide]（纯度>96%，含有13C和15N精氨酸标记）用作内标（IS）。这两种化合物均由Thermo Fisher Scientific（加利福尼亚州圣何塞）提供。Smart Digest免疫亲和链霉亲和磁珠（目录编号：60109-101-MB）同样来自Thermo Fisher Scientific。磷酸盐缓冲盐水（PBS）、二硫苏糖醇（DTT）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）和碳酸氢铵（ABC）来自默克KGaA（德国达姆施塔特）。乙腈来自默克KGaA（德国达姆施塔特）。甲酸（FA）、Glu-C Endoproteinase MS Grade和Smart Digest Buffer购自ThermoFisher Scientific。用于样品制备的超纯水由Merck Millipore Water生产，适用于LC/MS。质谱检测使用LC-MS级试剂。小鼠血浆作为空白基质来自BIOIVT（德国法兰克福/美因）。通用移液器吸头购自Mettler Toledo（美国）。消化和洗涤步骤使用Kingfisher? Apex仪器（ThermoFisher Scientific）进行自动化处理。 2.2. 仪器与软件 LALA肽的定量分析使用Sciex三重四极杆6500+（Sciex, USA）质谱仪进行，该质谱仪配备ESI源，并连接到Exion LC AD液相色谱系统（Sciex, USA）。数据分析使用Analyst软件（Sciex, USA）进行。Skyline软件（Mac-Coss Lab Software, USA）用于预测多重反应监测（MRM）参数。数据在Watson LIMS（版本7.7, ThermoFisher Scientific, USA）和Analyst软件（版本1.7.1, Sciex, USA）上采集和处理。Phoenix WinNonlin?版本8.3.4（Pharsight Corporation, USA）也用于数据分析。 2.3. 磁珠涂层 将30 μL的Smart Digest免疫亲和磁珠（目录编号：60109-101-MB, ThermoFisher Scientific, 加利福尼亚州圣何塞）× n（其中n为分析所需的样本数量）移液到2 mL Eppendorf PP低结合管中，同时加入5 μL的生物素化捕获试剂（Biotin SP-偶联的AffiniPure Goat Anti-human IgG Fc片段特异性捕获抗体，工作浓度为1.5 mg/mL，目录产品：109-065-098，Jackson Immuno Research, 巴尔的摩派克，美国）。涂层步骤在Thermomixer中以22°C和1200 rpm的速度进行40分钟。之后，磁珠用PBS冲洗三次，每次使用35 × n μL的体积。 2.4. 免疫捕获和消化 为了进行免疫捕获和消化步骤，准备了八个96孔板（Kingfisher 96孔浅板，ThermoFisher Scientific）： (1) 磁珠板； (2) 预洗板； (3) 样品板； (4) 第一次洗涤板； (5) 第二次洗涤板； (6) 第三次洗涤板； (7) 浸出板； (8) 吸头板。 磁珠板含有35 μL磁珠和165 μL PBS。预洗板含有1000 μL PBS。样品板含有10 μL样品和400 μL PBS。浸出板含有200 μL Smart digest缓冲液、10 μL内标（IS）用于STD、QCS、样品以及10 μL水用于对照空白。洗涤板含有300 μL (Tris)洗涤缓冲液。Kingfisher磁珠处理器被编程为执行磁珠收集（收集次数：3次；收集时间：5秒）和磁珠洗涤（洗涤时间=1分钟，收集次数：3次；收集时间：1秒），然后进行生物素化捕获试剂的涂层（每个结合步骤的速度=中等，释放时间=30秒；收集时间=7分钟；混合时间=30秒；最后一个步骤仅收集时间=10秒，收集次数=5次）。随后，磁珠依次在洗涤板1–3中洗涤（释放时间=30秒，速度=慢；洗涤时间=1分钟，速度=中等；收集次数=3次；收集时间=1秒），然后在浸出板中进行消化（释放时间=10秒，速度=慢，混合时间=1:15小时；加热=73°C；收集次数=3次；收集时间=5秒）。最后，磁珠从浸出板转移到预洗板（收集时间=10秒，速度=中等）。消化和最终浸出步骤在Kingfisher站外进行。从浸出板中转移100 μL上清液到低结合回收板。然后，向样品中加入120 μL的50 mM NH4HCO3和20 μL的Glu-C（10 ng/μL），并将样品放置在Thermomixer中过夜，温度为37°C，转速为1000 rpm。Glu-C的消化完成后，将100 μL的样品转移到最终注射板上。在注入LC-MS系统之前，加入10 μL的10% v/v HCOOH水溶液。实验方案的详细信息见补充信息（SI）。2.5. UHPLC–MS/MS 条件样品以全循环配置注入SCIEX Exion LC AD，该仪器与SCIEX Triple Quad 6500+系统（AB Sciex USA）相连。使用Waters公司的Acquity UPLC BEH C18柱（1.7um，2.1mm×100.0mm）进行LC分离，柱温保持在60°C。流动相A由超纯水和乙腈H2O/ACN（95:5）组成，并含有0.1%的FA；流动相B由乙腈和超纯水ACN/H2O（95:5）组成，也含有0.1%的FA。流速设定为0.5 mL/分钟，使用以下梯度：0.0–1分钟，10%B；1–6分钟，从10%增加到30%；6–8分钟，从30%增加到100%；8–9分钟，保持在100%；9–10分钟，从100%减少到10%；10.0分钟，保持在10%。自动进样器温度设定为4°C，每次进样量为40 μL。ESI源工作在正离子模式下（喷雾电压为3.8 kV）。源温度和离子喷雾电压分别设定为550°C和5500伏。气体1和气体2的流量分别设定为20 (L/min)和9 (L/min)。质谱仪工作在正离子模式下。对于分析物[NH2] AAGGPSVFLFPPKPK[Amide]及其同位素标记的IS [NH2] AAGGPSVFLFPPK [13C6, 15N4]PK[Amide]，在Q1扫描和产品离子扫描中检测多个离子。根据分析物和IS的质谱信噪比（S/N），选择了以下MRM跃迁：y5+3= 504.957 → 566.366；三电荷前体b8+3= 504.957 → 685.700 m/z 和 y5+3= 507.957 → 573.500 m/z；b8+3= 507.957 → 689.600 m/z。所有MRM跃迁的入口电位（EP）、去簇电位（DP）、碰撞能量（CE）和细胞出口电位（CXP）分别设定为10V、30V、22V和25V。2.6. Teplizumab富集样品的LC-HRMS/MS分析使用Dionex UltiMate 3000 LC系统（配备5 μL样品环）和Orbitrap Eclipse质谱仪（Thermo Scientific，德国不来梅）进行部分循环设置，注入3 μL的Teplizumab富集样品消化液。样品被加载到C18反相柱（75 μm × 150 mm，PepMap RSLC C18，2μm，100?，ES904；Thermo Fisher Scientific）上，在分析过程中柱温保持在35°C。样品以10 μl/分钟的速度加载到Acclaim PepMap C18陷阱柱（300μm×5mm，160454；Thermo Fisher Scientific）上4分钟。然后以400 nl/分钟的流速使用线性梯度（2?22% B）洗脱肽段，接着进行7分钟的95% B柱洗脱，再平衡11分钟（缓冲液A：0.1% [vol/vol]甲酸水溶液；缓冲液B：0.1% [vol/vol]甲酸乙腈溶液）。接着进行全扫描目标数据依赖性MS2（FS-tddMS2）实验。选择LLA前体离子（504.95 m/z），并引入目标质量列表节点进行MS2采集，使用Orbitrap四极杆进行不同m/z的分离（m/z=3分离窗口）。应用基于CID的碎裂策略，归一化碰撞能量（NCE）为35%，以实现在气相中碎裂LLA前体离子。离子化使用正离子模式纳米喷雾离子化（NSI），喷雾电压为2000 V。转移管温度设定为275°C。目标MS2扫描的Orbitrap分辨率为30,000（在200 m/z处），RF Lens设定为30%。关于数据分析（处理工作流程和共识工作流程）的详细信息见补充图S1。2.7. 标准曲线样品和质控样品的制备Teplizumab和LAALA肽-IS的储备溶液分别用超纯水配制，浓度为7.63 mg/mL和1 mg/mL。所有储备溶液储存在1.5 mL的Eppendorf Protein Low Bind管中，并保持在-80°C。标准曲线和质控（QC）样品使用锂/肝素小鼠血浆稀释。稀释后的Teplizumab标准曲线最终浓度分别为150、250、500、1000、2000、3500、5000、7500、10,000、13,000和15,000 ng/mL。稀释后的QC样品最终浓度分别为450、1730和12,000 ng/mL。IS-AAGGPSVFLFPP(K)PK储备溶液（1mg/mL）用超纯水稀释至最终浓度10 ng/mL。2.8. 方法验证根据ICH M10生物分析方法验证指南以及[Kaur等人，2022年；Neubert等人，2021年；Neubert等人，2018年]的建议，使用小鼠血浆中的Teplizumab对所开发的方法进行了验证。验证参数包括校准曲线线性评估、准确度和精度、携带效应、基质效应、回收率、稳定性（台式、冻融、自动进样器、短期）、稀释完整性、再注射重复性。2.9. 校准曲线和线性使用三个校准标准的重复样本来评估线性。通过绘制分析物与内标（IS）峰面积比（y轴）与校准标准标称浓度（x轴）的关系来生成曲线。数据拟合使用加权最小二乘法（权重：1/x2）进行。2.10. 准确度和精度在验证过程中，使用含有不同浓度分析物的小鼠血浆加标样品（称为验证样品VS）来确认方法的准确度和精度：LLOQ_QC、L_QC、M_QC、H_QV和ULOQ_QC。验证还包括在三个浓度水平下制备的QC样品：L_QC、M_QC和H_QC。样品必须在分析前至少冷冻12小时，并至少进行三次分析以确保结果可靠。定义了以下接受标准：LLOQVS的平均准确度（表示为%偏差）必须在±25.0%范围内，其他水平必须在±20.0%范围内。此外，精度（表示为变异系数）必须≤25.0%（LLOQVS）和≤20.0%（其他水平）。2.11. 基质效应使用合并的小鼠空白血浆来评估基质效应。这涉及比较在低QC和高QC水平下加标的样品（每个水平三个重复样）与在相同浓度下用重组溶剂（10% v/v HCOOH水溶液）制备的样品（也是三个重复样）。目的是评估从生物基质中提取的成分如何影响分析物的响应，无论是抑制还是增强信号。结果将有助于确定基质对分析物测量的影响程度，公式如下：基质效应 = 加标后提取基质中的分析物面积 / 溶剂中的分析物平均面积2.12. 回收率回收率评估生物分析方法在提取阶段回收分析物和内标的有效性。对于混合方法，建议评估消化效率。QC样品在三个水平（低、中、高）下制备。这些样品在免疫捕获（post-IC）后并在与ADC/NBE分子消化前进行富集（样品定义为“消化前富集”）。这些样品与在测量LAALA肽的等浓度下用空白基质消化后的样品进行比较（样品定义为“消化后富集”）。为了评估测试，进行以下计算：回收率 = 消化前富集样品中的平均LAALA肽面积 / 消化后富集样品中的平均LAALA肽面积 × 1002.13. 携带效应测试涉及在定量上限（ULOQ）后分析空白基质样品，并将得到的响应（以面积表示）与定量下限（LLOQ，表S1）的响应进行比较。评估以下标准：分析物的携带效应（AN）必须≤LLOQ样品中分析物面积的25%；内标（IS）的携带效应必须≤STD-0样品中IS面积的25%。2.14. 稳定性通过将QC样品在室温下保持4小时来评估短期（台式）稳定性。在-80°C到室温下对QC样品进行五次冻融稳定性评估。为了评估处理样品的稳定性，将处理后的QC样品放置在自动进样器中4°C下48-72小时。在上述条件下制备的QC样品的接受标准如下：准确度（表示为相对于标称浓度的偏差）必须在20%范围内（LLOQ为25%），精度（表示为变异系数）必须在±15%范围内（LLOQ为20%）。2.15. 稀释线性通过以下步骤验证稀释线性：• 将高浓度样品至少稀释一个稀释因子。• 分析未稀释的高浓度样品。分析了5个独立重复样。对于每个稀释因子，测得的浓度必须显示出±20%的偏差。从最高浓度200,000 ng/mL开始，进行了1:80的稀释并评估稀释线性。2.16. 在两种ADC与LAALA工程Fc的疗效和药代动力学研究中的应用2.16.1. Tg32小鼠体内的PK研究管理此外，还对Tg32小鼠单次静脉注射ADC-1后进行了药代动力学研究。所有动物实验均符合《动物福利法》、AAALAC的建议以及国家动物健康法规。实验方案由Merck KGaA（德国达姆施塔特）和Istituto di Ricerche Biomediche “Antoine Marxer” – RBM S.p.A.（意大利伊夫雷亚）的机构动物护理使用委员会审查和批准。意大利卫生当局也批准了这项研究的所有动物护理和使用方面。药代动力学研究使用人类FcRn纯合转基因小鼠（系号#32，B6.Cg-Fcgrt < tm1Dcr> Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ，Jackson Laboratories）进行。ADC-1以3 mg/kg的剂量静脉注射给三只雄性小鼠。在整个28天的研究期间，每隔0.167小时（10分钟）、4小时、24小时、48小时、96小时、168小时、240小时、336小时和672小时采集血液样本（20 μL）。在每个时间点，合并血浆样本以获得足够的血浆体积，使用合格的IC-LC-MS/MS方法进行总抗体定量。使用Phoenix WinNonlin?版本8.3.4的非 compartmental分析方法对测得的血浆浓度-时间曲线进行解析。分析采用了线性梯形计算方法。相关药代动力学参数如血浆浓度-时间曲线下的面积（AUC）和清除率（CL）也被计算。2.16.2. 移植物抗宿主病（GvHD）小鼠样品疗效研究同样使用合格的IC-LC-MS/MS方法评估ADC-2治疗在患有移植物抗宿主病（GvHD）的人源化免疫缺陷小鼠中的疗效。共有9只小鼠接受了0.5 mg/kg的剂量，收集每只动物的样本以评估药物疗效。在IC-LC-MS/MS分析中，我们量化了两种肽：AAGGPSVFLFPPKPK和胰蛋白酶通用肽GPSVFPLAPSSK。评估在两个不同时间点进行：GPSVFPLAPSSK在胰蛋白酶捕获和消化后监测，而LAALA肽（AAGGPSVFLFPPKPK）在GluC消化结束时监测。选择这两种肽进行双重量化的决定基于它们的独特特性：GPSVFPLAPSSK是一种在各种人类IgG亚类中高度保守的“特征肽”，而突变的LAALA肽是工程分子的特有肽。这在GvHD背景下特别重要，因为预期人体IgG会因免疫反应而存在。相比之下，突变的LALA肽是工程分子所独有的，这使我们能够将其与天然人类IgG反应区分开来。这种区别消除了潜在的背景噪音或其他人类IgG变体的竞争，确保了信号更加清晰，且与注射剂量成正比。2.16.3. 突变LALA肽总抗体量化的交叉验证：使用MesoScale Discovery (MSD)的LC-MS和LBA量化方法进行比较。GvHD样本也使用配体结合测定（LBA）方法进行了分析，通过特异性捕获来克服IgG的干扰。这种基于MSD技术的夹心免疫测定法使用生物素化捕获试剂和钌标记（SULFO-TAG结合的抗人IgG）作为检测试剂。该过程包括阻塞预先涂布了链霉亲和素的MSD GOLD 96孔Quickplex板，用生物素化捕获试剂饱和板子，然后孵育未知样本、校准标准和质量控制样品。分析物被特异性捕获，洗涤循环后使用检测试剂进行检测。该方法的范围是50.0 ng/mL到4000 ng/mL。2.16.4. LBA分析程序：每孔加入200 μL的阻断缓冲液（SuperBlock? Blocking Buffer in PBS (BB)（Thermo Fisher Scientific 编号37515），并将板子在22°C下孵育60 ± 10分钟，同时以450 rpm的速度旋转，然后用Wash Buffer（PBS-0.05% Tween 20）洗涤。之后，每孔加入50 μL的捕获溶液（生物素结合的捕获试剂，浓度必须为1 μg/mL），盖上板子，并在相同的旋转条件下再次孵育。在此涂层期间，准备并稀释校准标准、质量控制样品和未知样品（最小稀释比为1:50，在PBS-0.05% Tween 20-1.0% BSA中）。洗涤后，根据板子布局将稀释的标准样品、对照样品和未知样品分装到孔中，密封板子并在22°C下持续旋转孵育60 ± 10分钟。进行最后一次洗涤，每孔加入50 μL的检测溶液（SULFO-TAG结合的检测试剂，浓度为2 μg/mL），并在相同条件下继续孵育。程序最后进行最后一次洗涤，加入150 μL的MSD Read Buffer T 2X（含表面活性剂的MSD Read Buffer T (4X)（Meso Scale Discovery，编号R92TC），并在5 ± 1分钟内获取ECL（电化学发光）信号。3. 结果与讨论3.1. 方法开发本研究选择了商业抗体teplizumab作为开发方法。小鼠血浆中的LALA突变抗体经过联合酶解步骤处理，首先使用胰蛋白酶，然后加入Glu-C。使用Glu-C的联合酶解是为了获得适当长度且不含半胱氨酸的肽段，如果仅使用胰蛋白酶进行酶解，则会产生半胱氨酸。在Glu-C酶解的优化步骤中，考虑了关键参数，包括理想维持在7.0到8.5之间的pH值以确保酶活性，以及设定在37°C的酶解温度。此外，为了避免PMSF（苯甲基磺酰氟）等抑制剂和非最佳盐类，以最大化酶解效率并获得高质量的肽段用于分析。此外，LALA突变肽位于铰链区域之后，这是抗体中相对受保护的区域，适合自下而上的方法使用特征肽进行检测。该协议包括基于链霉亲和素和胰蛋白酶磁微球的（IC）方法，用于提取和初步酶解含有LALA突变肽的目标分子。使用Skyline软件对Glu-C酶解后的半胰蛋白酶肽段进行了筛选，该软件支持从筛选到MRM优化的方法开发。方法开发中的一个关键步骤是使用Kingfisher?工作站进行过程自动化（参见方法部分中的“Immunocapture and digestion Kingfisher protocol”和补充协议SI）。具体来说，IC步骤被分为八个独立的步骤，以防止珠子沉淀和捕获的抗体丢失。自动化系统简化了实验室工作流程，并提高了结果的可靠性。在开发此方法时，测试了多种色谱柱。选择了不同的HPLC柱，包括C18和C8反相柱以及离子交换柱。最终选择了Acquity UPLC BEH C18柱，因为其在肽峰分辨率方面表现优异，其他固定相由于监测肽的独特疏水性和长度而表现不佳。该柱实现了可接受的最低定量限（LLOQ）为150 ng/mL，没有携带效应且峰形良好。通过将柱子操作温度从40°C提高到60°C，进一步优化了方法的分析效率。鉴定并分析了双电荷和三电荷状态的肽AAGGPSVFLPPKPK。选择三电荷肽AAGGPSVFLPPKPK作为主要肽片段，以最大化信号强度和灵敏度，通过合成肽AAGGPSVFLFPPKPK y11+=504.95-566.71 m/z和y2+2=504.95-685.76 m/z以及合成肽IS AAGGPSVFLFPP(K)PK y+3=y11+=507.95-573.65 m/z和y2+2=507.95-689.76 m/z进行了确认。肽的选择还通过Orbitrap Eclipse质谱仪的全扫描数据依赖性采集（FS-DDA）和使用Proteome Discoverer进行数据分析得到了进一步确认（图2和图S1）。作为示例，展示了抗体的ULOQ色谱运行（图3）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图2. 使用Orbitrap Eclipse质谱仪获得的LALA肽AAGGPSVFLPPKPK的质谱图。表格突出了分析片段的特征，包括它们对应的质量（m/z）值和离子损失。这些结果是用Proteome Discoverer 2.5获得的。对片段的详细分析有助于验证肽的结构组成（见图S1中的数据分析工作流程）。下载：下载高分辨率图像（220KB）下载：下载全尺寸图像图3. 合成肽AAGGPSVFLFPPKPK的提取离子色谱图（XIC），其中含有LALA突变（浓度为5.48 ng/mL），对应于抗体的定量上限（ULOQ）及其内标（AAGGPSVFLFPP(K)PK）。MRM模式优化和产物离子选择：肽AAGGPSVFLFPPKPK的y11+=504.95-566.71 m/z和y2+2=504.95-685.76 m/z，以及肽IS-AAGGPSVFLFPP(K)PK的y11+=507.95-573.65 m/z和y2+2=507.95-689.76 m/z。3.2. 方法验证结果3.2.1. 线性和灵敏度图3显示了空白血浆基质的一个代表性色谱图及其与LLOQ（150 ng/mL）加标血浆样本的比较。如图4所示，平均峰面积（n=3）与分析物浓度之间存在线性关系。线性回归得到的方程为y=0.9x+121.73，决定系数R2=0.9900。这些结果也适用于QC的分析（图4），证实了三个QC水平下的线性。下载：下载高分辨率图像（400KB）下载：下载全尺寸图像图4. 对照小鼠血浆空白（A）和定量下限（LLOQ）150 ng/mL（B）的色谱图比较。对照空白（A）对LALA肽和LALA-IS（分别为红色和橙色线条）几乎没有信号，证明了方法的特异性。（B）在LLOQ下获得的信噪比（S/N）峰为74.5，表明在小鼠血浆中150 ng/mL的灵敏度良好。3.2.2. 准确性和精确度准确性和精确度数据总结在表1和表S2中。对于所有QC水平，重复实验内的%偏差范围为-5.7%到14.2%，%CV范围为3.8%到32.9%。重复实验间的%偏差范围为-9.8%到2.6%，%CV范围为7.3%到21.6%。表1. 准确性和精确度（A&P）。准确性和精确度数据来自三天内进行的三次A&P实验。偏差百分比用于衡量准确性，而变异系数（%CV）用于评估精确度。空单元空单元重复实验内重复实验间水平浓度（ng/mL）准确性（%RE）精确度（%CV）准确性（%偏差）精确度（%CV）LLOQ_QC150.0-16.3；14.24.0；19.1-2.620.3L_QC450.0-18.5；-3.25.0；32.9-8.921.6M_QC1730.0-16.0；12.43.4；22.8-5.018.6H_QC12000.0-11.7；-5.73.0；11.3-9.87.3ULOQ_QC15000.0-15.3；9.26.8；16.9-5.316.73.2.3. 重新注射再现性为了检查重新注射后的分析再现性，将校准标准和QC样本重新注入LC-MS/MS系统。所有重新注射的样本的结果都在预期值的±20%范围内，证实了测定的可靠性（图5）。下载：下载高分辨率图像（306KB）下载：下载全尺寸图像图5. 校准曲线和重新注射数据的线性回归图。图表显示了平均响应与浓度（ng/mL）之间的关系。浅蓝色线条代表校准曲线，方程为y=0.98x+121.73，R2值为0.9900，标准差（S.D.，n=3）。橙色线条代表重新注射数据，方程为y=0.96x+215.70，R2值为0.9900，标准差（S.D.，n=3）。绿色和金色标记分别显示了QC及其重新注射的SD，突出了方法在整个动态范围内的准确性和可靠性。3.2.4. 稀释完整性和基质效应200,000 ng/mL的teplizumab储备溶液在小鼠血浆中以1:80的比例稀释。稀释后的QC结果符合监管指南要求的接受标准；超出校准范围的高浓度样本成功稀释并定量，且对测定性能或分析物定量没有负面影响（补充表S3）。此外，方法的平均分析物基质因子为QC-H为1.43，QC-L为1.30（补充表S4）。3.2.5. 稳定性评估LVS的自动采样器稳定性（24-72小时）的%偏差范围为3.9%到14.7%，CV范围为7.3%到9.9%（表2）。HVS的自动采样器稳定性显示%偏差范围为-7.1%到0.3%，CV范围为5.9%到11.9%。LVS的冻融稳定性显示%偏差为-1.8%，CV为10.7%。HVS的冻融稳定性显示%偏差为-13.9%，CV为27%。LVS的台式稳定性显示%偏差为-8.7%，CV为23.6%。HVS的台式稳定性显示%偏差为-8.7%，CV为8.5%。表2. 稳定性测试总结结果。自动采样器（24-72小时）、冻融（5次循环）和台式（4小时）稳定性数据，适用于低（LVS）和高（HVS）浓度。稳定性测试浓度（ng/mL）水平回收率（%）准确性（%偏差）精确度（%CV）自动采样器450LVS103.93.99.9（24小时）12000HVS100.30.35.9自动采样器450LVS114.714.77.3（72小时）12000HVS92.9-7.111.9冻融（5次循环）450LVS98.2-1.810.712000HVS86.1-13.927台式（4小时）450LVS98.6-1.423.612000HVS91.3-8.78.53.2.6. 恢复率在LQC、MQC和HQC水平上评估了分析物的消化效率，以确定肽是否可以可靠地用于临床条件的诊断或监测。数据显示了预加标和加标后的精确度值以及开发方法的整体回收率。LALA肽（AAGGPSVFLFPPKPK）的平均回收率为65.1%，三个不同QC水平的范围为55.5%到71.2%（表3）。表3. 恢复率测试。表格显示了在不同浓度水平下三次重复实验（L_QC、M_QC、H_QC）的预加标和加标后的分析物响应。包括预加标和加标后样本的精确度（%CV）以及整体回收率，证明了方法在不同浓度下的有效性。空单元空单元分析物响应预加标分析物响应加标后空单元水平浓度（ng/mL）精确度（%CV）精确度（%CV）回收率（%）整体（%）回收率L_QC450.0019.110.871.265.1M_QC1730.008.711.968.4H_QC1200.0032.23.655.53.2.7. 携带效应两种ADC与LALA工程Fc的疗效和药代动力学研究中的方法应用3.3.1. 在Tg32小鼠PK研究中应用ADC-1合格的IC-LC-MS/MS方法用于评估一种专有内部ADC（ADC-1）在小鼠（n=3）中的药代动力学特征，单次静脉注射3 mg/kg后。收集了10个时间点（从10分钟到672小时）的数据，并使用LALA突变特异性方法进行了分析（图6）。在这里，所开发的方法用于量化含有L234A/L235A突变的ADC-1的总抗体浓度。下载：下载高分辨率图像（198KB）下载：下载全尺寸图像图6. 单次静脉注射3 mg/kg剂量ADC-1后的总抗体分析物的药代动力学特征。使用来自三只接受tg32治疗的小鼠（n=3）的混合血浆样本中的LALA特征肽，对ADC-1的总抗体进行了平均定量。计算了以下药代动力学参数：静脉注射给药后零时间（给药时间）的初始浓度（C0）；从给药时间到最后一个可测量浓度之间的曲线下面积（AUC0-t）；外推至无穷大的AUC（AUC0-∞）；从最后一个可定量时间点（tlast）外推至无穷大的AUC百分比（AUCext）；血管内给药的系统清除率（CL）、稳态分布体积（Vss）和半衰期（t1/2小时）（表4）。表4显示了以3 mg/kg剂量给药的抗体的药代动力学（PK）参数和平均血浆浓度值。计算的药代动力学参数包括半衰期（t1/2）、曲线下面积（AUC）、清除率（CL0-∞）以及使用非房室模型得出的分布体积。表格展示了来自3只小鼠（n=3）在不同时间点（0.167、4、48、96、168、336和672小时）的血浆浓度。在给予3 mg/kg剂量后，观察到了典型的抗体药代动力学特征。血浆浓度呈双相下降趋势：最初血浆浓度迅速下降，随后在最后一个时间点（672小时）之前下降速度变慢。计算出的半衰期为334小时，清除率为0.178 mL/h/kg。稳态分布体积较低，约为血浆体积的两倍（84.5 mL/kg）。总体而言，这些药代动力学参数表明ADC-1具有适合治疗应用的良好特性。3.3.2. 在移植物抗宿主病（GvHD）小鼠样本中的ADC-2疗效研究随后使用开发的LC-MS/MS方法对GvHD样本中的LALA突变肽AAGGPSVFLFPPKPK和IgG Fc野生型特征肽GPSVFPLAPSSK进行了定量。这些样本来自一项使用ADC-2单次给药的人源化免疫缺陷小鼠疗效研究：第1组（n=1-9）接受了0.5 mg/kg的剂量，共9只动物。为了确保方法间的交叉验证，同一样本也使用配体结合测定（LBA）进行了分析。图7（表S5）展示了LC-MS/MS对GPSVFPLAPSSK和AAGGPSVFLFPPKPK（LALA）肽的定量结果与LBA结果的比较。替代通用特征肽GPSVFPLAPSSK的定量显示了体内样本之间的一致性存在显著偏差。这种现象是由于人IgG的额外贡献所致。LALA肽作为定量标记物的稳健性通过其与所有样本中LBA数据的高度一致性得到了进一步验证。这两种不同分析平台（LC-MS/MS和带有特定捕获试剂的LBA）之间的结果一致性表明，即使在存在人IgG的情况下，LALA突变也能确保准确且可重复的定量。最终，LALA肽信号与LBA结果之间的相关性证实了该方法能够有效监测GvHD模型中的Fc工程化人IgG，有效克服了样本中人IgG的干扰。下载：下载高分辨率图像（154KB）下载：下载全尺寸图像图7. GvHD样本的疗效研究。该图表展示了使用LC-MS和LBA方法，在患有移植物抗宿主病（GvHD）的人源化免疫缺陷小鼠中，通过两种肽AAGGPSVFLFPPKPK和GPSVFPLAPSSK对总抗体进行分析的结果比较。LALA突变肽（AAGGPSVFLFPPKPK）的浓度趋势与LBA方法获得的结果非常吻合。相比之下，GPSVFPLAPSSK肽的测量结果显示出明显的总抗体定量偏差，表现出显著的正偏倚。这种差异归因于该特定体内模型中循环人IgG的干扰。所有样本均在给药后72小时采集。4. 结论成功开发并验证了一种基于LALA特征肽和参考抗体（teplizumab）的混合免疫亲和IC-LC-MS/MS测定方法。该方法还应用于体内药代动力学样本，以定量ADC-1的总抗体浓度，并用于具有Fc骨架LALA突变的GvHD样本（ADC-2）的疗效研究。该方法显示出良好的灵敏度，使其能够应用于小鼠体内药代动力学和疗效研究，特别是在LALA突变生物制剂开发过程中。此外，LALA特征肽序列的特异性可以进一步扩展该方法在非啮齿类动物基质中的应用范围。这项工作为定量具有工程化Fc或特定突变的生物制剂铺平了道路，这些突变可以调节其效应子和生物功能。作者贡献概念设计：V.P.、F.M.、I.D.S、F.R.S；方法学：V.P.、S.M. 和 I.D.S；软件：V.P. 和 F.M.；数据分析：V.P. 和 S.M.；研究：V.P.；资源获取：F.R.S. 和 K.J.C.；数据管理：V.P.、R.M.、P.T. 和 A.A.；原始稿撰写：V.P.；审稿与编辑：V.P.、A.D.I.、I.D.S.、K.J.C.、F.R.S.；项目监督：I.D.S.、F.R.S.、K.J.C.；资金获取：F.R.S.、K.J.C.所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。资金来源本研究由德国达姆施塔特的Merck KGaA的医疗保健业务资助。CRediT作者贡献声明Vittoria Papa：撰写——原始草稿、验证、软件、资源、方法学、研究、数据分析、概念设计。Ilse De Salve：撰写——原始草稿、可视化、监督、方法学、研究、资金获取。Francesco Molinaro：方法学、研究、数据管理、概念设计。Andrea Di Ianni：撰写——审稿与编辑、监督、方法学。Stefania Monge：监督、资源、研究。Rita Mastroianni：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、数据管理。Alessandra Ariaudo：撰写——审稿与编辑、资源。Patrizia Tavano：撰写——原始草稿、数据管理。Valeria Castagna：方法学。Kyra Cowan：撰写——审稿与编辑、可视化。Federico Riccardi Sirtori：撰写——审稿与编辑、项目监督、方法学、概念设计。