ISA-101

p16/Ki-67 双染检测用于子宫颈癌筛查异常人群分流的专家共识中国优生科学协会阴道镜和宫颈病理学分会 中华医学会妇科肿瘤学分会基金项目：浙江省尖兵领雁重点研发计划（2023C03169）；国家自然科学基金（82373260，52311530769）通信作者：汪 辉 Email: wang71hui@zju.edu.cn；孔北华 Email: kongbeihua@yahoo.com.cn；马 丁 Email: dma@tjh.tjmu.edu.cn；魏丽惠 Email: weilhpku@163.com【摘要】p16/Ki-67 双重染色检测（双染）作为一种相对客观的检测方法，已在多个国家获批应用于临床。本共识基于循证医学证据，对双染样本的取材与制备、检测流程、结果判读及报告规范达成共识，并推荐双染可用于高危人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus, HR-HPV）初筛不分型阳性或部分分型其他 12 种（HR 12）阳性人群的分流；也可用于联合筛查时 HR-HPV 不分型阳性或部分分型 HR 12 阳性，且细胞学正常或轻度异常时的人群分流；还可用于筛查结果异常（HR-HPV 检测或 HR-HPV 联合细胞学检测）后随访人群的分流。通过本共识的制定，旨在规范双染检测技术的临床应用，实施子宫颈癌精准筛查。【关键词】子宫颈癌筛查；高危人乳头瘤病毒；p16/Ki-67 双重染色检测；分流01一、背景子宫颈癌防控是全球面临的重大公共卫生健康问题为此 2020年世界卫生组织（World health organization, WHO）提出了加速消除子宫颈癌全球战略 [1]。子宫颈癌筛查是子宫颈癌防控重要且不可替代的手段，高危人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus, HR-HPV）初筛策略已在全球广泛采用 [2]。但是 HR-HPV 初筛在提高疾病诊断敏感性的同时，发现大量一过性 HR-HPV 感染，给女性带来的负担和相应的过度诊疗不容忽视，而应用细胞学分流策略仍存在敏感性较低的问题，因此有必要探索新的分流策略来实现精准筛查。子宫颈癌筛查和分流策略不仅要尽可能多的识别癌前病变，还应尽量减少阴道镜转诊的数量。p16/Ki-67 双重染色检测，简称双染（dual stain, DS），是一种基于免疫细胞化学的检测方法。细胞周期调控蛋白 p16 通过阻断 S 期抑制细胞增殖，但 HPV E7 癌基因过度表达可导致其异常增加；细胞增殖标志物 Ki-67 是一种与有丝分裂密切相关的增殖细胞核抗原。同一细胞中同时检测到 p16 和 Ki-67 时，与高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL）及以上（HSIL+ ）相关 [3]。双染结果的判断，主要依靠颜色判别，不仅相对客观，还能有效弥补 HR-HPV 检测特异性低和细胞学检查敏感性低的不足。首个 DS 试剂盒 2010 年在欧洲被批准用于辅助识别HSIL，2015 年开始 DS 技术被我国国家药品监督管理局（National Medical Products Administration, NMPA）批准用于子宫颈癌筛查辅助诊断，2020 年美国国家药品监督管理局批准其用于 HR-HPV 初筛阳性和联合筛查中 HR-HPV阳性检测结果的分流 [4-6]。2024 年， 美 国 阴 道 镜 病 理 协会（American Society of Colposcopy and Cervical Pathology, ASCCP）[3] 和 WHO 先后发布《双染用于 HPV 阳性女性分流的指南》[7]，随后中华医学会病理学分会细胞病理学组也发布了《子宫颈细胞学 p16/Ki-67 免疫细胞化学双染检测专家共识》[8]。我国已有一些医院在子宫颈癌机会性筛查中开展 DS，但目前仍缺乏如何规范化开展 DS 检测和用于临床管理等方面的共识，为此，我们依据循证医学证据 [9-18]，结合中国专家经验和临床实际，经过委员会成员充分讨论，形成本共识推荐意见。02二、DS 检测规范1. 检测标本取材及制备规范：严格按照细胞学取样标准操作，推荐使用液基细胞学制片，选择经过临床性能验证 [11-14]，与 DS 试剂适配的液基保存液，确保细胞形态完整、抗原蛋白得到良好的固定，以达到蛋白表达的最佳效果。2. 检测流程规范：为减少人为因素误差，首选推荐使用即用型试剂、全自动免疫细胞化学染片机进行检测，确保实验操作流程标准化。若为人工操作，技术人员需经专门培训，熟练掌握标本制备、抗原修复、抗体的选择、复染及显色等免疫细胞化学染色步骤。3. 检测结果判读及报告规范：检测结果的判读独立于子宫颈细胞学形态标准，由有资质的病理医生经过培训和考核后，在光学显微镜下对染色进行判断。报告主要包括标本质量评估、判读结果（若 DS 检测结果不能判读需要解释原因）、染色方式（免疫细胞化学自动染色 / 人工染色）、检测试剂盒名称等信息。不同试剂盒显色可能不同，常见显色包括 p16 棕染、Ki-67 红染（本文以此为例），或p16 红染、Ki-67 棕染等。其中 p16 定位在细胞质和或细胞核，而 Ki-67 定位在细胞核（图 1）。3.1 标本质量评估：参考子宫颈细胞学报告系统（the Bethesda system, TBS）[19] 进行标本满意度评估。若标本评估 TBS 为不满意标本，且无 DS 阳性细胞，视为标本不满足判读条件，建议尽可能在 4 个月内重新取样再次进行 DS检测 [20]；若不满意标本中至少存在一个 DS 阳性细胞，可以判读为 DS 阳性，该标本视为满意标本。3.2 标本结果判读（1）阴性判读标准：① 仅有呈蓝色的上皮细胞；② 仅有细胞质和 / 或细胞核棕染（p16）的上皮细胞；③ 仅有细胞核红染（Ki-67）的上皮细胞。（2）阳性（弱阳性到强阳性）判读标准：棕染细胞质（p16）与红染细胞核（Ki-67）必须位于同一显微聚焦平面，即 p16/Ki-67 免疫细胞化学染色在同一个细胞内同时着色，判读为 DS 阳性。① 单个、散在的细胞：细胞内棕染细胞质 p16 与红染细胞核 Ki-67 位于同一显微聚焦平面内，符合上述阳性判读标准，报告判读为阳性。② 细胞簇：弥漫性棕染的细胞簇，在同一显微聚焦平面内伴有红染的细胞核，判读为 DS 阳性；非弥漫性棕染的细胞簇，细胞密集的团簇中不容易辨别棕染细胞质与红染细胞核是否在同一显微聚焦平面，若在细胞簇边缘观察到上述标准的双染阳性细胞，报告判读为阳性。如果双染玻片中可被观察的鳞状上皮细胞少于满意标本的要求，但存在至少一个双染阳性细胞，无论细胞学信息是否充分，均判读为阳性。说明：p16/Ki-67 双染阳性提示可能与子宫颈高级别及以上病变相关，包括 HSIL[ 子宫颈上皮内瘤变 (cervical intraepithelial neoplasia, CIN）2，3]、原位腺癌（adenocarcinoma in situ, AIS）以及 HR-HPV 感染相关性浸润癌。03三、纳入共识的研究证据及推荐意见1. DS 用于 HR-HPV 初筛阳性人群的分流1.1 HR-HPV（不分型）阳性时的分流纳入的研究数据主要来源于以下几个前瞻性研究结果：（1）美国北加州凯撒医疗集团（KPNC）2012 年筛查队列 [11-12]：该队列基线入组 2 363 例 HR-HPV 阳性女性，结果显示：在既往细胞学结果未见上皮内病变或恶性细胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy, NILM） 的1 509 例 HR-HPV（不 分 型） 阳 性 女 性 中，DS（+） 者CIN2+/CIN3+ 风险高于细胞学≥ 未明确意义的不典型鳞状 细 胞（atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US），其检出 CIN2+ 分别是 21.0% 和 16.6%，CIN3 分别是 12.4% 和 10.3%，也高于该队列设定的阴道镜转诊阈值，即 HR-HPV 阳 性 /ASC-US 时 CIN2+/CIN3+ 风 险（10.2%、5.2%）和 ASCCP2019 持久指南建议的转诊阴道镜 CIN3+风险阈值（4%, 下文简称 ASCCP 转诊阈值）；DS（-）时CIN2+/CIN3+ 风险低于该队列设定的 1 年随访阈值，即细胞学 NILM 者（CIN2+: 3.6% vs 5.8%; CIN3+: 1.6% vs. 2.3%）。（2）KPNC2015 年队列 [13]：该队列基线入组 3 225 例HR-HPV 阳性女性，结果显示当不考虑既往筛查史时，HR-HPV 阳性（不分型）女性中DS（+）者 CIN2+/CIN3+风险显著高于≥ASC-US 者（CIN2+: 24.3% vs. 20.1%，CIN3+: 13.0% vs. 10.4%)，也高于该队列设定的阴道镜转诊阈值 CIN2+/CIN3+（12.8%、5.7%）和 ASCCP 转诊阈值；而 DS（-） 者 CIN2+/CIN3+ 风险为 5.0%、1.7%，均显著低于 NILM 者（CIN2+: 5.0 vs. 6.8%; CIN3+: 1.7% vs. 2.8%），低于该队列研究设定的 1 年随访阈值 CIN2+/CIN3+（6.8%、2.8%）和 ASCCP 转诊阈值。当将人群分层为无（2 066 例）和有异常筛查史女性时，结果相似。（3）美国 IMPACT 队列 [14]：该队列入组 4 927 例 无既往筛查和分型信息的 HR-HPV 阳性女性，结果显示在HR-HPV 阳性（不分型）女性中，DS（+）者 CIN2+/CIN3+ 风险与≥ASC-US 相近（CIN2+: 24.4% vs. 24.0%; CIN3+: 10.9% vs. 11.5%），均高于该队列设定的阴道镜转诊阈值（14.2%、4.8%）和 ASCCP 转诊阈值；DS（-）者CIN2+/CIN3+ 风险显著低于 NILM 者（CIN2+: 3.6% vs. 7.5%, CIN3+: 1.2% vs. 2.5%）；1 年随访结果相似。（4）其他研究：意大利的 NTCC2 队列和 Umbria队列研究、英国的 PaVDaG 队列研究均提示 DS 在 HRHPV 阳性女性中有良好的风险分层能力 [15-17]。我国一项横断面研究基于子宫颈癌组织性筛查人群和来自 5 家医院的机会性筛查人群（4 364 例），分别入组 2 465 例和1 899 例，结果发现 DS 分 流 CIN2/3 特异性达 88.09%，提示 DS 对女性子宫颈上皮内病变的检测效果较好，适用于 HR-HPV 阳性女性的分流 [18]。以上研究结果表明，无论前次筛查结果如何，DS 均比细胞学具有更好的风险分层能力。推荐意见：DS 可用于 HR-HPV 初筛（不分型）阳性女性的分流，若 DS（+）建议转诊阴道 镜检查，DS（-）建议 1 年复查，见图 2 和表 1。1.2 HR-HPV 部分分型阳性时的分流HR-HPV 部分分型指区分 HPV 16 和（或）HPV 18，其他 12 种高危 HPV 不分型（简称 HR 12）。在 KPNC2015年队列研究中，当不考虑既往筛查结果，或仅纳入有异常筛查史的女性时，HPV 16/18 阳性 /DS（+）、HPV16/18 阳性 /DS（-）、HR 12 阳 性 /DS（+）的即刻 CIN3+ 风 险（27%、4.3%、8.1%）与用细胞学分流相当，符合阴道镜转诊阈值；而 HR12 阳性 /DS（-）的即刻 CIN2+/CIN3+风险（3.9%、1.3%），低于转诊阴道镜阈值，与 HR 12 阳性经细胞学分流为 NILM 者效能相当。在无筛查异常史女性 中 HPV16/18 阳 性 /DS（-） 的 CIN3+ 风 险（1.5%），低于阴道镜转诊阈值。IMPACT 队列研究数据显示，HPV 16/18 阳性 /DS（+）者 CIN2+/CIN3+ 风险与≥ASC-US 相 当（CIN2+: 35.1% vs. 37.9%; CIN3+: 21.2% vs. 23.5%），均符合 ASCCP 转诊阈值；HPV16/18 阳性 /DS（-）者 CIN2+/CIN3+ 风险（3.5%、1.9%），低于该队列设定的 1 年随访阈值，且优于 HPV 16/18阳性细胞学 NILM 分流效能（7.9%、4.2%）。对于 HR12 阳性女性，DS（+）者 CIN2+/CIN3+ 风险与≥ASC-US 相当（CIN2+: 19.6% vs. 17.8%; CIN3+: 6.2% vs. 6.1%），均符合阴道镜转诊阈值；DS（-）者 CIN2+/CIN3+ 风险（3.6/0.9%）显著低于该队列设定的 1 年随访阈值（7.5%、2.5%），且优于 HR12 阳性细胞学 NILM 分流效能（7.4%、1.8%）。一年随访结果相似。以上研究结果提示，DS 对 HPV 16/18 阳性有一定的分流作用，但因缺少大样本以癌症为研究终点的大样本循证医学证据，结合 HPV16/18 的致癌高风险，不建议采用 DS分流。DS 对 HR12 阳性女性的分流作用优于细胞学，且不受既往子宫颈癌筛查史的影响。推荐意见：HPV 16/18 初筛阳性女性建议直接转诊阴道镜。DS 可用于 HPV 初筛 HR 12 阳性女性分流，若 DS（+）建议转诊阴道镜检查，DS（-）建议 1 年复查，见图 2 和表 1。2. 用于联合筛查时 HR-HPV 阳性，细胞学 NILM/ASC-US/ 低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL）人群分流2.1 HR-HPV（不分型）阳性时的分流（1）当 HR-HPV（不分型）阳性/细胞学 NILM 时：KPNC2012、2015 和 IMPACT 队列发现，无论既往筛查史如何，HPV 阳性 / 细胞学 NILM 女性中，DS（+）者患病风险高于阴道镜转诊阈值；DS（-）者低于该研究队列设定的 1 年随访阈值。以上结果提示 DS 可对 HR-HPV（不分型）阳性 /NILM 女性进一步风险分层。（2）当 HR-HPV（不分型）阳性 / 细胞学 ASC-US 时：KPNC2012、2015 和 IMPACT 队 列 均 发 现， 既 往 细 胞 学筛查正常、不考虑既往筛查结果或既往结果未知的 HPV阳 性 /ASC-US 女 性 中，DS（+）时患病风险进一步升高，而 DS（-）时低于该研究队列设定的 1 年随访阈值。但既往联合筛查结果异常时 HPV 阳性 /ASC-US 女性中，DS（+）时患病风险进一步升高，但 DS（-）CIN2+/CIN3+ 风险为 6.7%、4.7%，高于阴道镜转诊阈值。以上结果提示 DS 可以对既往筛查情况未知或无异常筛查史的HR-HPV（不分型）阳性 /ASC-US 女性进行风险分层，而对有筛查异常者需要谨慎处理。（3）当 HR-HPV（不 分 型） 阳 性 / 细胞学 LSIL 时：KPNC2012、2015 和 IMPACT 队列发现，无论既往筛查结果如何，HR-HPV 阳性 / 低级别鳞状上皮内病变（LSIL）女性 DS（+）时患病风险进一步升高，而 DS（-）时低于该研究队列设定的 1 年随访阈值。以上结果提示 DS 可对 HR-HPV（不分型）阳性 /LSIL 女性进一步风险分层。推荐意见：联合筛查 HPV 不分型阳性时，DS 可用于 NILM 或 LSIL 女性、以及既往筛查未知或无异常筛查史 ASC-US 女 性 分 流，DS（+） 建 议 转 诊 阴 道 镜 检 查，DS（-）建议 1 年复查，见图 3 和表 1。2.2 HR-HPV（部分分型）阳性时的分流（1）当 HR-HPV 部分分型阳性 / 细胞学 NILM 时：KPNC2015 研究提示，当不考虑既往筛查史时，HPV16/18阳 性 /NILM 女性中 DS（-） 者 CIN2+/CIN3+ 风险也高达 14.0% 和 5.6%；而 HR 12 阳 性 /NILM 女性中 DS（+）者 CIN2+/CIN3+ 风险进一步升高，DS（-）者风险仅为2.7% 和 0.8%。IMPACT 研究提示，既往筛查情况未知的HPV16/18 阳性 /NILM 和 HR12 阳性 /NILM 女性中 DS（+）者 CIN2+/CIN3+ 风险均进一步升高，而 DS（-）者低于该研究队列设定的 1 年随访阈值。DS 可以用于 HR 12 阳性 /NILM 女性的风险分层，但不建议用于 HPV 16/18 阳性 /NILM 女性分流。（2）当 HR-HPV 部分分型阳性 / 细胞学 ASC-US 时：KPNC2015 研究提示，当不考虑既往筛查史时，HPV 16/18阳 性 /ASC-US 女 性 中，DS（-） 者 CIN2+/CIN3+ 风 险（12.5%、4.2%）仍高于 ASCCP 转诊阈值，而在 HR 12 阳性 /ASC-US 女性中 DS（+）者 CIN2+/CIN3+ 风险进一步升高，DS（-）者风险低于该队列设定的 1 年随访阈值，当既往联合筛查结果异常时，HPV 16/18 阳性 /ASC-US 和 HR 12 阳 性 /ASC-US 女性中 DS（-） 者 CIN2+/CIN3+ 风 险均高于该队列设定的阴道镜转诊阈值。IMPACT 研究提示，对既往筛查情况未知的 HPV 16/18 阳性 /ASC-US 女性和 HR 12 阳性 /ASC-US 女性，DS（+）者 CIN2+/CIN3+ 风险均进一步增加，而 DS（-）者均低于该队列设定的 1 年随访阈值。因此，DS 可用于在既往联合筛查正常时和筛查结果未知的 HR12 阳性 /ASC-US 女性的风险分层。（3）当 HR-HPV 部分分型阳性 / 细胞学 LSIL 时：KPNC2015 研究表明当不考虑既往筛查史时，HPV 16/18阳 性 /LSIL 或 HR 12 阳 性 /LSIL 女性中 DS（+） 者CIN2 + /CIN3 + 风险进一步增加，而 DS（-）者低于该研究队列设定的 1 年随访阈值；当将人群分层为有或无异常筛查史女性时，结果相似。IMPACT 研究提示 DS在 HR12 阳性 /LSIL 女性中也有相似风险分层效果，但是 HPV16/18 阳 性 /LSIL 女 性 中，DS（-） 者 CIN2 + /CIN3 + 风险仍高达 18.2%/4.5%。因此，DS 可用于 HR12阳性 /LSIL 女性的分流。推荐意见：HR-HPV 部分分型 HPV 16/18 阳性女性建议直接转诊阴道镜；对于联合筛查 HR12 阳性女性，DS 可以用于 NILM 或 LSIL 女性、以及既往筛查情况未知或无异常筛查史 ASC-US 女性的分流，DS（+）建议转诊阴道镜检查，DS（-）建议 1 年复查，见图 3。3. DS 用于筛查异常后随访人群的分流KPNC2015 数据表明，既往筛查史对于 DS 结果准确性的影响明显小于细胞学，提示 DS 在筛查异常随访中也能发挥分流作用。KPNC2012 队列 5 年随访结果提示，在既往细胞学 NILM 的 HR-HPV 阳性女性中，DS（+）者 1~5 年累计 CIN2+/CIN3+ 风险均高于≥ASC-US 者和转诊阴道镜阈值；而 DS（-）者 1~5 年累计 CIN2+/CIN3+ 风险均低于 NILM 者，并且到第 3 年累计 CIN2+/CIN3+ 风险高于该研究队列设定的 1 年随访阈值，第 4 年才达到 ASCCP 转诊阈值，且各年累计风险均小于队列设定的阴道镜转诊阈值。以上结果提示 DS 比细胞学具有更好的远期风险分层能力，但持续 HPV 阳性的患病风险将逐年增加，不推荐延长HPV 持续阳性、DS（-）女性的复查间隔时限。推荐意见：既往筛查史异常时，DS 用于随访筛查结果异常（HR-HPV 检测或 HR-HPV 联合细胞学检测阳性）的分流也是可接受的，即 DS（+）建议转诊阴道镜检查，而 DS（-）建议 1 年复查。DS 结果不改变现有指南推荐的随访间隔，并且当 HR-HPV 持续阳性 /DS（-）时建议结合病史，谨慎选择 1 年复查或直接转诊阴道镜检查。04四、小结目前我国虽然已有大量 DS 检测试剂盒获批用于子宫颈癌筛查辅助诊断，但均未开展以具体临床用途为指征的临床试验。随着越来越多的国内临床研究证实多种DS 检测试剂盒在子宫颈癌筛查异常时的分流效能优于细胞学分流 [18, 21-23]，建议临床使用时谨慎选择获得 NMPA批准用于分流预期用途、且有循证医学证据支持的产品，严格按照规范进行操作，并按照分流策略和推荐流程进行临床管理。由于现有的循证医学证据均来源于 HR-HPV 初筛或联合筛查人群，因此不建议将 DS 直接用于子宫颈癌初筛和细胞学初筛人群，也不支持用于 HR-HPV 阴性女性的管理。值得注意的是，DS 在多个研究中展现出对细胞学初筛 ASC-US/LSIL、HPV 16/18 阳性、以及转化区 3 型等的风险分层价值 [24-26]，可能是未来研究的方向。执笔专家：李晓（浙江大学医学院附属妇产科医院）、汪辉（浙江大学医学院附属妇产科医院）、李静然（北京大学人民医院）、李明珠（北京大学人民医院）、王新宇（浙江大学医学院附属第一医院）、孔北华（山东大学齐鲁医院）、魏丽惠（北京大学人民医院）、马丁（华中科技大学同济医学院附属同济医院）、孔令华（北京协和医院）、沈丹华（北京大学人民医院）参与本共识制定与讨论的专家组成员（按姓氏汉语拼音排序）：毕蕙（北京大学 第一医院）、 陈飞（北京协和医院）、陈良（宁波大学附属妇女儿童医院）、狄文（上海交通大学医学院附属仁济医院）、耿力（北京大学第三医院）、李双（华中科 技大学同济医学院附属同济医院）、李长忠（北京大学深圳医院）、梁志清（重庆医科大学附属妇女儿童医院）、刘爱军（解放军总医院第七医学中心）、梅平（广东省人民医院）、孟元光（解放军总医院第七医学中心）、任琛琛（郑州大学第三附属医院）、宋坤（山东大学齐鲁医院）、隋龙（复旦大学附属妇产科医院）、孙蓬明（福建省妇幼保 健院）、王建六（北京大学人民医院）、王临虹（中国疾病预防控制中心）、吴丹（上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院）、吴琪俊（中国医科大学盛京医院）、向阳（北京协和医院）、徐海苗（浙江省肿瘤医院）、尤志学（南京医科大学第一附属医院）、余楠（华中科技大学同济医学院附属同济医院）、张静（空军军医大学西京医院）、张瑜（中南大学湘雅医院）、张国楠（四川省肿瘤医院）、张梦真（郑州大学第一附属医院）、张韶凯（河南省肿瘤医院）、张友忠（山东大学齐鲁医院）、张智慧（中国医学科学院肿瘤医院）、赵超（北京大学人民医院）、赵昀（北京大学人民医院）、赵方辉（中国医学科学院肿瘤医院）致谢：感谢各学（协）会专家给予的大力支持。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献略文章来源：中国妇产科临床杂志 2025 年 3 月 第 26 卷 第 2 期，转载请标注来源。