Scopolamine Butylbromide

CELL-Mechanism-guided identification of antidepressant G protein-coupled receptor drug targets SUMMARY 抑郁症由离散神经环路功能异常引发，但仍需深入阐释其潜在的分子与突触机制，以指导治疗药物的研发。本研究解析速效抗抑郁药物氯胺酮的作用机制，以期鉴定 G 蛋白偶联受体（GPCR）抗抑郁靶点。研究发现，氯胺酮的行为学效应依赖 μ 阿片受体（MORs），该受体富集于内侧前额叶皮层（mPFC）生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）中。慢性应激会引发内侧前额叶皮层生长抑素阳性中间神经元突触前肥大，进而导致锥体神经元受到过度抑制，而氯胺酮可逆转这一病理改变。基于上述研究发现，本研究利用 RNA 测序筛选内侧前额叶皮层生长抑素阳性中间神经元富集的 G 蛋白偶联受体，并验证候选靶点的抗抑郁潜力。对多种 G 蛋白偶联受体进行协同靶向干预，可产生强效抗抑郁样效应并减少副作用。综上，本研究建立了一套鉴定脑部疾病 G 蛋白偶联受体治疗靶点的通用研究策略。 抑郁症及其他精神疾病由认知、动机、行为投入及奖赏功能层面复杂的适应性不良改变所诱发。近年来，调控上述生理过程的神经环路动态机制研究取得重大进展，学界逐渐认识到抑郁症相关行为异常源于离散神经环路功能失调，而抗抑郁药物可通过修复异常环路功能发挥疗效。然而，目前对于此类药物作用的分子、细胞及突触位点机制认知仍十分有限，难以理性设计更优治疗方案。 依托 G 蛋白偶联受体家族的多样性，靶向调控特定神经环路组分是极具潜力的研究方向。G 蛋白偶联受体是理想的药物靶点，其作为超家族包含 300 余种非嗅觉受体亚型，各亚型具有独特表达模式，可与特定细胞或突触靶点精准匹配。此外，现有大量靶向 G 蛋白偶联受体的化合物储备，其中多数已完成人体试验，便于对安全谱明确的药物进行老药新用。同时，G 蛋白偶联受体主要通过四类异源三聚体 G 蛋白（Gi/o、Gq、Gs、G12/13）介导信号传导，为多受体协同靶向干预提供了理论基础。但靶向 G 蛋白偶联受体治疗精神疾病仍面临诸多挑战：首先，大脑中 G 蛋白偶联受体的表达图谱研究尚不充分，病理生理状态下其表达水平相较于生理基线的改变仍不明确；其次，多数 G 蛋白偶联受体靶向药物会对同源受体亚型产生脱靶效应；再者，大量 G 蛋白偶联受体在多个脑区及细胞类型中广泛表达，全身给药时难以仅激活目标受体群体，非靶点脑区及细胞的受体易削弱药效或引发副作用。 既往抗抑郁药物研发几乎仅聚焦单胺能神经调质这一单一治疗靶点，此类药物需连续用药数周方可起效，且临床应答率有限。与之不同，氯胺酮具有起效迅速、药效显著的抗抑郁作用，为探索情绪状态转换的启动与维持机制提供了全新研究模型。 但目前关于氯胺酮及其代谢产物的分子作用靶点仍存在争议。氯胺酮可作为 N - 甲基 - D - 天冬氨酸受体（NMDAR）通道阻滞剂，另有部分研究表明其亦可通过 Gi/o 偶联的 μ 阿片受体发挥作用，但该结论尚未得到所有研究佐证。值得注意的是，氯胺酮存在解离效应、血流动力学紊乱、共济失调、焦虑及成瘾风险等多种副作用，亟需深入阐明其作用机制，区分治疗效应与不良反应的分子基础。 人类与啮齿类研究证据均表明，内侧前额叶皮层是抑郁症病理损伤与药物治疗的核心脑区。氯胺酮机制研究多集中于内侧前额叶皮层或海马脑区。向小鼠内侧前额叶皮层微量输注氯胺酮可诱发抗抑郁样行为；通过光遗传技术激活或抑制内侧前额叶皮层锥体神经元，可分别模拟或阻断氯胺酮的抗抑郁效应。现有研究认为，上述机制共同参与内侧前额叶皮层投射神经元新生突触生成，并逆转慢性应激对局部微环路集群同步活动的干扰。但本团队近期研究发现，内侧前额叶皮层投射神经元突触新生仅维持氯胺酮的长效抗抑郁作用，而非启动速效效应。因此，氯胺酮给药后数分钟至数小时内，启动情绪状态快速转换、恢复内侧前额叶皮层投射神经元同步环路活动的核心机制仍未阐明。 氯胺酮作为 N - 甲基 - D - 天冬氨酸受体通道阻滞剂，可在细胞层面产生整体抑制效应，但其如何引发皮层网络整体兴奋效应一直是研究关键。由此衍生出去抑制假说：氯胺酮初始通过抑制 γ- 氨基丁酸能中间神经元发挥作用。生长抑素阳性中间神经元是内侧前额叶皮层高丰度表达的异质性细胞群体，主要通过调控锥体神经元顶树突介导突触整合，参与认知调控与应激相关生理过程。内侧前额叶皮层生长抑素阳性中间神经元是氯胺酮及东莨菪碱发挥抗抑郁效应的关键细胞类型，提示该类神经元可能介导内侧前额叶皮层突触可塑性的修复过程。 本研究结合体外、离体及在体实验技术，明确内侧前额叶皮层生长抑素阳性中间神经元突触前富集的 μ 阿片受体是介导氯胺酮抗抑郁效应的关键靶点。内侧前额叶皮层生长抑素阳性中间神经元的 Gi/o 信号通路是启动抗抑郁样行为的必要且充分条件。慢性应激可破坏生长抑素阳性中间神经元突触前形态与生理功能，造成内侧前额叶皮层过度抑制，而氯胺酮可逆转该病理改变。鉴于生长抑素阳性中间神经元代谢型信号通路在介导氯胺酮与慢性不可预见性应激拮抗效应中的核心作用，本研究利用 RNA 测序筛选生长抑素阳性中间神经元富集的 G 蛋白偶联受体，解析慢性应激前后其表达谱变化，鉴定出大量潜在抗抑郁靶点。进一步验证发现，激活 Gi/o 偶联的松弛素 3 受体、阻断 Gq 偶联的促动力素受体 2，是靶向生长抑素阳性中间神经元的潜在抗抑郁策略。本研究最终构建三联药物组合，协同靶向生长抑素阳性中间神经元富集的 G 蛋白偶联受体并提升靶点特异性，可复刻氯胺酮的抗抑郁行为与突触调控效应，同时降低副作用风险。综上，本研究阐释了内侧前额叶皮层生长抑素阳性中间神经元启动氯胺酮抗抑郁作用的分子环路机制，鉴定出具有研发潜力的药物靶点，为基于环路机制筛选 G 蛋白偶联受体靶向治疗策略提供了通用研究框架。 RESULT PART1 氯胺酮的抗抑郁作用依赖于MOR受体的激活 FIGURE 1 FIGURE S1 我们首先验证如下假说：μ 阿片受体（MOR）激动作用是介导氯胺酮行为学效应的关键启动因素。已有多项人类 ¹⁷˒¹⁸˒⁵⁰及啮齿类 ¹⁶˒¹⁹˒⁵¹˒⁵² 研究表明，联合给予μ 阿片受体（MOR）拮抗剂可阻断氯胺酮的抗抑郁效应。本研究聚焦氯胺酮在悬尾实验（TST）中对动机逃避行为的快速作用，悬尾实验（TST）是筛选抗抑郁样化合物的经典临床前检测模型。研究发现，在全身性给予氯胺酮（10 或 30 mg/kg）前，预先全身输注μ 阿片受体（MOR）拮抗剂纳洛酮（1 mg/kg），可在给药 1 小时后显著削弱氯胺酮对雌雄小鼠动机逃避行为的快速调控作用（图 1A、图 S1A、图 S1B）。重要的是，无氯胺酮作用时，纳洛酮本身不产生行为学效应（图 1A、图 S1A、图 S1B），不改变氯胺酮对自主活动的影响（图 S1C），且无法阻断 ** 代谢型谷氨酸受体 2/3（mGluR2/3）** 拮抗剂 LY341495（LY34）对悬尾实验（TST）行为的作用（图 S1D）。 现有多项研究提示氯胺酮可作为μ 阿片受体（MOR）激动剂¹⁵˒⁵³⁻⁵⁷，也有观点认为其可通过促进内源性阿片肽释放产生间接效应⁵⁸。本研究虽不以厘清两种机制的相对贡献为主要研究目的，但仍通过放射性配体结合实验，分别采用小鼠源（图 S1E、图 S1F）与人源（图 1B）μ 阿片受体（MOR）（详见 STAR 方法），探究氯胺酮能否直接结合μ 阿片受体（MOR）。结果显示，氯胺酮可完全置换三种不同放射性标记配体：（1）纳洛酮，一种吗啡烷类正构拮抗剂；（2）二丙诺啡，一种吗啡烷类正构部分激动剂；（3）DAMGO，一种多肽类正构激动剂（图 1B、图 S1E）。相比之下，2R,6R - 羟基去甲氯胺酮（HNK）与 2S,6S - 羟基去甲氯胺酮（HNK）均无法置换放射性标记 DAMGO，表明仅氯胺酮可结合μ 阿片受体（MOR），其主要代谢产物无此结合能力（图 S1F）。 为明确氯胺酮是否具有激动剂活性，本研究利用纯化的小鼠源及人源 **μ 阿片受体（MOR）与含 Gαi1 的 G 蛋白异源三聚体，开展体外 G 蛋白活性检测⁵⁹。结果显示，氯胺酮可浓度依赖性促进三磷酸鸟苷（GTP）水解，但其效应强度远弱于完全激动剂 DAMGO（图 1C、图 S1G），提示氯胺酮为μ 阿片受体（MOR）** 弱效正构部分激动剂。 目前人体药代动力学数据有限，基于以下三项依据：（1）给药后数分钟氯胺酮血浆浓度为 0.4–0.8 μM⁶⁰⁻⁶³；（2）血浆与脑脊液（CSF）浓度比为 1:2~6⁶⁴；（3）氯胺酮的蛋白结合特性⁶⁵，可估算氯胺酮发挥抗抑郁效应的脑内浓度约为 0.4–2.4 μM，给药初期浓度可能更高⁶⁰，啮齿类动物脑内浓度处于相近水平 ¹⁰˒¹⁴˒⁶⁶⁻⁶⁸。 为阐明氯胺酮结合μ 阿片受体（MOR）的剂量依赖性及功能效应，本研究在 HEK 293 细胞中开展系列实验。通过全细胞膜片钳记录 **G 蛋白偶联内向整流钾（GIRK）电流，首先证实氯胺酮对小鼠及人源μ 阿片受体（MOR）亚型均表现为部分激动作用（图 1D、图 1E）。采用 Gαi3 或 GαoA 蛋白生物发光共振能量转移（BRET）** 检测，同样观察到氯胺酮呈浓度依赖性部分激动效应（图 S1H、图 S1I）。 多项实验结果一致显示，氯胺酮约在 1 μM 浓度即可诱发效应，处于治疗相关脑内浓度估算范围，其最大效应强度仅为完全激动剂 DAMGO 的 30%~60%。氯胺酮诱发的 **G 蛋白偶联内向整流钾（GIRK）电流可被纳洛酮阻断，且氯胺酮能够部分拮抗 DAMGO 诱导的电流（图 S1J、图 S1K）。重要的是，氯胺酮代谢产物 2R,6R-HNK 与 2S,6S-HNK 均无法激活G 蛋白偶联内向整流钾（GIRK）** 电流（图 S1L）。 值得关注的是，典型μ 阿片受体（MOR）激动剂（如 DAMGO）可同时激活 β- 抑制蛋白介导的内吞过程⁶⁹，而氯胺酮不会引发明显的μ 阿片受体（MOR）内化，提示其属于G 蛋白偏向性部分激动剂（图 S1M、图 S1N）。综上，本研究证实 **μ 阿片受体（MOR）信号通路在启动氯胺酮对回避动机行为的快速效应中发挥关键作用；该效应部分由μ 阿片受体（MOR）** 部分激动所介导，亦可与其他机制共同参与（详见下文 “研究局限性”）。 PART2 MORs在前额叶皮层（mPFC）的Sst+中间神经元（INs）中富集，这些神经元可降低兴奋性并减弱抑制性传递 FIGURE 2 FIGURE S2 由于内侧前额叶皮层（mPFC）微量输注可重现全身性氯胺酮的作用效应 ²⁵，本研究在内侧前额叶皮层（mPFC）全身性给予氯胺酮前，局部微量输注高特异性 μ 阿片受体（MOR）拮抗剂 CTAP⁷⁰，探究内侧前额叶皮层（mPFC）μ 阿片受体（MOR）是否介导全身性氯胺酮的行为学效应。结果发现，内侧前额叶皮层（mPFC）预先给予 CTAP 可完全阻断氯胺酮对悬尾实验（TST）行为的快速作用（图 2A），表明内侧前额叶皮层（mPFC）μ 阿片受体（MOR）的激动作用是启动动机逃避行为调控效应的必要条件。 为探究 μ 阿片受体（MOR）激活启动抗抑郁作用的环路机制，本研究进一步明确内侧前额叶皮层（mPFC）中表达该受体的细胞类型。对内侧前额叶皮层（mPFC）前扣带回区及前外侧运动皮层（ALM）的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据集分析显示，编码 μ 阿片受体（MOR）的基因Oprm1在生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）中呈富集表达，表达水平显著高于锥体神经元（PNs）、非神经元细胞及其他中间神经元亚型（图 2B、图 S2A–S2E），与 Zamfir 等人的研究结果一致⁷¹。 为验证 μ 阿片受体（MOR）激动的功能效应由生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）介导这一假说，本研究采用成年 Sst⁺-Cre:tdT 小鼠制备急性脑片，开展全细胞膜片钳记录（图 2C）。结果显示，给予 μ 阿片受体（MOR）激动剂 DAMGO 可诱发生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）产生显著超极化电流与外向电流，并抑制动作电位发放；在马尔蒂诺蒂中间神经元与非马尔蒂诺蒂生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）中均观察到一致结果（图 2D–2G、图 S2E–S2H）。2/3 层（L2/3）、5 层（L5）锥体神经元（PNs）以及 1 层晚发放中间神经元（L1 INs）对 DAMGO 均无应答（图 2D–2G、图 S2F、图 S2I、图 S2J）。 为排除 N - 甲基 - D - 天冬氨酸受体（NMDAR）干扰、单独观察 μ 阿片受体（MOR）介导的效应，在灌流液中加入 NMDAR 拮抗剂 AP-5（50 μM），在此条件下浴式给予 100 μM 氯胺酮，同样可诱发生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）产生超极化电流（图 S2K、图 S2L）。而 100 μM 氯胺酮无法在锥体神经元（PNs）中诱发外向电流，部分锥体神经元（PNs）仅出现去极化反应（图 S2L）。 μ 阿片受体（MOR）常定位于轴突，通过突触前抑制调控神经递质释放⁶⁹˒⁷²（图 2H）。本研究进一步探究 μ 阿片受体（MOR）激动是否能够抑制生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）向锥体神经元（PNs）的 γ- 氨基丁酸能突触传递。向 Sst-Cre 小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）注射 Cre 依赖型 ChR2-YFP 腺相关病毒（AAV），饲养 2 周后，在 2/3 层（L2/3）与 5 层（L5）锥体神经元（PNs）中记录光诱发抑制性突触后电流（oIPSCs）（图 S2M）。 给予 DAMGO 可显著抑制光诱发抑制性突触后电流（oIPSCs）（图 2I、图 2J），同时升高配对脉冲比率（PPR）（图 2I–2K），提示其通过 μ 阿片受体（MOR）依赖的突触前机制发挥作用。DAMGO 处理还可诱导光诱发抑制性突触后电流（oIPSCs）产生长时程抑制（LTD），该效应在药物洗脱后仍持续存在，但在不同细胞间个体差异较大（图 S2N、图 S2O）。 与之相对，DAMGO 无法抑制对侧锥体神经元（PNs）的光诱发兴奋性突触后电流（oEPSCs）（图 2L）。与 DAMGO 作用模式相似，氯胺酮可抑制生长抑素阳性中间神经元 - 锥体神经元（Sst⁺-PN）光诱发抑制性突触后电流（oIPSCs）并升高配对脉冲比率（PPR），且在 1–100 μM 浓度范围内呈剂量依赖性效应（图 2I–2K、图 S2P–S2R）。预先灌流纳洛酮可完全阻断 DAMGO 与氯胺酮的上述作用（图 2I–2K），表明氯胺酮通过激动突触前 μ 阿片受体（MOR）调控生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）向锥体神经元（PNs）的突触传递。 PART3 在体内，mPFC Sst+神经元会受到氯胺酮的快速且短暂的抑制 FIGURE 3 FIGURE S3 本研究进一步探究氯胺酮能否在在体水平调控生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）活性，利用光纤光度法记录小鼠在饲养笼自由活动状态下内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺ INs 的整体神经元活动信号，并明确该效应的时间作用窗口（图 3A）。腹腔注射（i.p.）氯胺酮（10 mg/kg）后，Sst⁺ INs 活性几乎即刻下降，在给药 3–5 分钟后达到抑制峰值（图 3B），并于 20 分钟内恢复至基线水平（图 3B、图 3C）。给药约 1 小时后出现第二次活性低谷，提示 Sst⁺ INs 抑制可触发复杂的神经环路层面改变。重要的是，注射生理盐水后 Sst⁺ INs 活性未发生明显变化（图 3B、图 S3A、图 S3B）。预先注射纳洛酮可减弱 Sst⁺ INs 对氯胺酮的应答反应（图 3C、图 S3A、图 S3B），证实 μ 阿片受体（MOR）在介导氯胺酮功能应答中发挥核心作用，与既往研究结论一致⁷³。 为验证上述效应由 Sst⁺ INs 突触前活性下调所驱动，本研究借助双光子钙成像技术，通过颅窗对表达轴突靶向遗传编码钙指示剂的 Sst⁺ INs 单个突触前膨体进行在体活性记录（图 3D–3F、图 S3E）⁷⁴。研究共分析 8 只小鼠、24 个视野下 10129 个突触前膨体的钙信号，分别记录生理盐水注射后 10 分钟、氯胺酮注射后最长 30 分钟的钙活动变化（图 3G、图 3H）。与前述结果一致，腹腔注射（i.p.）氯胺酮（10 mg/kg）可使约 20% 的 Sst⁺突触前膨体活性快速降低，仅小部分群体（约 8%）出现活性升高（图 3G、图 3H、图 S3F–S3H）。对逾 10000 个突触前膨体进行整体分析发现，氯胺酮可快速降低轴突钙瞬变的发放频率与幅度，给药后前 5 分钟效应最为显著，并在约 30 分钟内逐渐减弱（图 3I–3K）。该效应与突触前膨体给药前的基线活性存在相关性：给药前本底活性越高的膨体，其突触前活性受抑制的程度越明显（图 3L）。综上，研究结果表明氯胺酮可诱导内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺ INs 发生快速且一过性的活性抑制，且对高本底活性的突触前膨体抑制效应尤为显著，揭示了氯胺酮产生快速治疗效应潜在的神经环路机制。 PART4 mPFC Sst+中间神经元中的Gi/o信号传导是氯胺酮产生抗抑郁样效应的必要且充分条件 FIGURE 4 FIGURE S4 为直接验证氯胺酮的作用是否依赖内侧前额叶皮层（mPFC）生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）中的 μ 阿片受体（MOR），本研究采用基于 shRNAmir 的策略实现局部特异性敲低μ 阿片受体（MOR）（图 4A）。腺相关病毒（AAV）注射 5 周后，靶向 μ 阿片受体（MOR）的 shRNA 可完全阻断内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺ INs 对 DAMGO 的应答，而乱序对照 shRNA 无此效应；且敲低处理不改变 Sst⁺细胞数量及其基础电生理特性（图 4B、图 4C、图 S4A–S4D）。值得注意的是，在靶向 Sst⁺ INs 敲低 μ 阿片受体（MOR）后，小鼠悬尾实验（TST）不动时间出现本底性降低，提示存在一定代偿效应，但该处理可完全消除小鼠对氯胺酮的行为学应答（图 4D）。该结果表明，μ 阿片受体（MOR）介导的 Gi/o 蛋白激活是氯胺酮产生抗抑郁样效应的关键机制。 为直接探究内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺ INs 中 Gi/o 信号通路的作用，本研究构建 Cre 依赖型载体，细胞特异性表达百日咳毒素（PTX）的 S1 亚基（AAV-flex-PTX），以阻断全部 Gi/o 信号通路⁷⁵。结果显示，PTX 可完全消除 DAMGO 诱发的 Sst⁺ INs 超极化反应（图 4E–4G）；PTX 不造成 Sst⁺ INs 丢失，仅轻微降低其输入阻抗、升高细胞兴奋性（图 S4E–S4H）。同时，PTX 可阻断氯胺酮在悬尾实验（TST）中的效应（图 4H），证实内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺ INs 的 Gi/o 信号通路是氯胺酮发挥作用的必要条件。已有研究表明 μ 阿片受体（MOR）可与 Gz 蛋白偶联⁷⁶，但该 G 蛋白亚型不被百日咳毒素（PTX）抑制，提示其并非 MOR 介导抗抑郁样效应所必需。此外，利用 PTX 阻断 mPFC Sst⁺ INs 的 Gi/o 信号通路，并不会影响 LY34 在强迫游泳实验（FST）中的作用（图 S4I）。 本研究进一步探究内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺ INs 中短时 Gi/o 信号激活是否足以诱发行为学效应，采用本团队新近研发的高效光开关正交受体靶向配体（PORTLs），可对基因靶向的 SNAP-mGluR2 实现快速、可逆激活⁷⁷⁻⁷⁹，该受体属于 Gi/o 偶联 G 蛋白偶联受体（GPCR）。首先向 Sst-Cre 小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）注射编码 Cre 依赖型 SNAP-mGluR2（AAV-flex-SNAP-mGluR2）与 Cre 依赖型 GFP 的腺相关病毒（AAV）（图 4I、图 4J）。2 周后向 mPFC 局部注射 PORTL 配体 BGAG12,400，16–20 小时后对急性脑片 GFP 阳性细胞进行全细胞膜片钳记录。结果显示，385 nm 短时光照可使记录神经元产生快速、显著的超极化，该效应在避光条件下稳定维持，并可经 525 nm 光照逆转（图 4K、图 4L）。GFP 阴性神经元无光照应答（图 S4J）。SNAP-mGluR2 光激活还可介导突触前抑制，减弱 Sst⁺ INs 向邻近锥体神经元（PNs）的突触传递（oIPSC 幅度降低、配对脉冲比率（PPR）升高）（图 4M–4O）。 为验证异源 Gi/o 偶联受体的瞬时激活足以模拟氯胺酮的行为学效应，本研究向小鼠双侧 mPFC 微量输注 BGAG12,400，1 天后在饲养笼内以 385 nm 脉冲光照（每分钟 2 秒）光激活 SNAP-mGluR2，持续 20 min，随后给予 525 nm 光照 5 秒使受体失活，在时间进程上模拟在体实验中的药物作用模式。该干预处理 1 小时后，小鼠悬尾实验（TST）不动时间显著降低（图 4P–4R、图 S4K），表明 Sst⁺ INs 中短时 Gi/o 信号激活即可启动抗抑郁样效应，且该效应在受体失活后仍可维持。 PART5 慢性应激可导致Sst+中间神经元出现突触前肥大 FIGURE 5 FIGURE S5 FIGURE S6 慢性应激可诱发易感个体出现抑郁发作⁸⁰，并与内侧前额叶皮层（mPFC）环路突触重塑及同步活动减弱相关 ²³˒²⁸˒⁸¹˒⁸²。目前，慢性应激如何影响内侧前额叶皮层（mPFC）中生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）及其突触仍尚不明确⁴³˒⁸³⁻⁸⁷。因此本研究将雄性小鼠暴露于慢性不可预见性应激（CUS），每日给予两种应激刺激，持续 4 周。与未应激同窝对照小鼠相比，慢性不可预见性应激（CUS）可延长悬尾实验（TST）不动时间，并增强氯胺酮（10 mg/kg；给药 24 h 后检测）对该行为的调控效应（图 5A）。 随后本研究对慢性不可预见性应激（CUS）处理后的生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）开展形态学与功能学分析。结果显示，内侧前额叶皮层（mPFC）Sst:tdT⁺细胞密度、细胞固有电生理特性及自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）均未发生改变（图 S5A–S5E）。但慢性不可预见性应激（CUS）可使 Sst⁺ INs 对 μ 阿片受体（MOR）激活产生致敏效应，表现为 CTAP 敏感的氯胺酮诱导电流及 DAMGO 诱导电流均显著增强（图 5B、图 S5F–S5I）。荧光原位杂交（FISH）结果显示，内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺ INs 中Oprm1（MOR mRNA）表达水平上调（图 S5J），证实慢性不可预见性应激（CUS）可引发转录水平改变⁸⁴˒⁸⁵˒⁸⁸˒⁸⁹，也推动本研究进一步无偏分析慢性不可预见性应激（CUS）对 Sst⁺ INs 基因表达谱的影响。 本研究分别分选对照组与慢性不可预见性应激（CUS）组小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）的 Sst:tdT⁺神经元及 CamK2 阳性锥体神经元（PNs），进行批量 RNA 测序（RNA-seq）（图 5C）。差异基因表达分析显示，Sst⁺样本中共筛选出 119 个差异表达基因（DEGs）（Benjamini-Hochberg 校正后p < 0.05），其中绝大多数（89/119）呈表达上调（图 5C、图 S6A、图 S6B）。Camk2⁺样本共得到 71 个差异表达基因（DEGs），与 Sst⁺ INs 差异基因无交集，且以表达下调为主（图 5C、图 S6A、图 S6C）。 对 Sst⁺ INs 差异表达基因（DEGs）进行深入分析，筛选出多个与细胞内信号传导、神经突起及突触生长相关的关键基因（图 5D）。基因本体（GO）富集分析显示，差异基因主要富集于细胞突起、细胞连接、突触及细胞骨架等细胞组分（图 S6B）。基因集富集分析（GSEA）表明，“突触膜”“轴突发育”“G 蛋白信号通路”“突触组装” 及 “细胞黏附” 相关基因集表达上调（图 5E）。 基于上述结果，本研究进一步探究慢性不可预见性应激（CUS）是否诱导 Sst⁺ INs 发生突触前适应性改变。在内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺神经元中共表达突触囊泡标记物突触素（Syp）-GFP 与胞质定位 tdT。与对照小鼠相比，慢性不可预见性应激（CUS）小鼠 1 层（L1）Syp-GFP 荧光斑点数量增加约 20%–30%，2 层（L2）无明显变化，且 Syp-GFP 斑点体积增大（图 5F、图 5G），提示突触前膨体体积和 / 或突触囊泡含量增加。 脑片电生理记录显示，慢性不可预见性应激（CUS）处理后，Sst⁺神经元介导的锥体神经元（PNs）光诱发抑制性突触后电流（oIPSCs）幅度与动力学特征无显著差异（图 S6D–S6G），但配对脉冲比率（PPR）轻度降低（图 5H），提示慢性不可预见性应激（CUS）使神经递质释放概率升高。值得注意的是，光诱发配对脉冲比率（PPR）在基线状态下即可表现出释放概率升高⁹¹，难以单纯通过原始 PPR 数值直接解读。 为深入阐释慢性不可预见性应激（CUS）对 Sst⁺ IN-PN 突触的调控作用，本研究采用高频（10 Hz）长时程（30 s）刺激模式，评估突触囊泡储备量与动态变化特征。结果发现，尽管释放概率升高，慢性不可预见性应激（CUS）小鼠光诱发抑制性突触后电流（oIPSCs）幅度衰减更缓慢，稳态下残留电流幅度更高（图 5I、图 S6H）。慢性不可预见性应激（CUS）未明显改变可立即释放囊泡池（RRP）大小（图 5K），但显著加快突触囊泡补充速率（图 5J–5L）⁹²，增大有效囊泡池容量，使高频放电状态下整体抑制性突触传递增强。综上，上述结果表明慢性不可预见性应激（CUS）可增强 Sst⁺ INs 介导的抑制作用，提升内侧前额叶皮层（mPFC）微环路的树突抑制水平。 PART6 在内侧前额叶皮层（mPFC）中鉴定内源性、Sst阳性且富含IN结构域的GPCRs作为抗抑郁靶点 FIGURE 6 FIGURE S7 本研究结果一致表明，内侧前额叶皮层（mPFC）生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）是介导病理生理机制与治疗作用机制的关键细胞载体，同时提示 ** 其他在 Sst⁺ INs 中富集表达的 G 蛋白偶联受体（GPCRs）** 可作为潜在靶点，有望启动快速抗抑郁效应并具备更理想的副作用特征。 重新分析批量 RNA 测序（RNA-seq）数据发现，相较于 CamK2 阳性细胞群体，Sst⁺ INs 中有 44 个 G 蛋白偶联受体（GPCR）基因呈显著富集表达（图 6A、图 6B、图 S7A–S7D）。其中包含Oprm1，以及多种已知或潜在抗抑郁药物的靶点基因，如 5 - 羟色胺 1A 型受体基因Htr1a（选择性 5 - 羟色胺再摄取抑制剂 SSRIs 作用靶点）、毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因Chrm3与Chrm5（东莨菪碱作用靶点）。慢性应激后仍可观察到相似的 G 蛋白偶联受体（GPCR）表达模式（图 6C、图 S7E、图 S7F），提示多数同类 G 蛋白偶联受体（GPCR）在慢性应激状态下仍具备作为抗抑郁靶点的可行性。 为验证该靶点筛选策略的有效性，本研究对筛选出的两种在 Sst⁺ INs 中富集程度最高的 G 蛋白偶联受体（GPCRs）开展神经生理学与行为学效应验证。 松弛素 3 受体（Rxfp3）是在 Sst⁺ INs 中富集程度最高的 G 蛋白偶联受体（GPCR），属于 Gi/o 偶联受体，可感受未定核神经元释放的神经肽松弛素 3（RLN3），并参与食欲、恐惧消退、昼夜节律调控及应激反应等生理过程⁹³⁻⁹⁵。脑片电生理记录显示，给予半数有效浓度（EC₅₀，10–20 nM）的松弛素 3（RLN3）⁹⁶可使 Sst⁺ INs 产生超极化反应，锥体神经元（PNs）无明显应答（图 6D），并可显著抑制 Sst⁺ INs 向锥体神经元（PNs）传递的光诱发抑制性突触后电流（oIPSCs）（图 S7G–S7I）。内侧前额叶皮层（mPFC）局部微量输注松弛素 3（RLN3）可剂量依赖性降低小鼠不动时间（图 S7J）。更为重要的是，松弛素 3（RLN3）可逆转慢性不可预见性应激（CUS）对悬尾实验（TST）行为的影响（图 6E），证实该受体可作为潜在抗抑郁靶点。 本研究进一步评估 Gq 偶联受体促动力素受体 2（PROKR2），其可响应视交叉上核及皮层神经元表达的神经肽促动力素 2（PROK2）⁹⁷。促动力素 2（PROK2）与情绪障碍、疼痛、炎症及昼夜节律调控密切相关⁹⁸⁻¹⁰¹。急性脑片实验中，Sst⁺ INs 对促动力素 2（PROK2）的功能应答存在个体差异，但相较于锥体神经元（PNs），Sst⁺ INs 可呈现更为稳定的去极化反应（图 6F、图 S7K）。全身性注射促动力素受体 2/1（PROKR2/PROKR1）拮抗剂 PKRA7¹⁰²，在低剂量条件下及慢性不可预见性应激（CUS）处理后均可显著降低小鼠不动时间（图 6G、图 S7L）。综上，上述数据表明促动力素受体 2（PROKR2）是另一通过 Sst⁺ INs 去抑制机制发挥作用的潜在抗抑郁靶点。 PART7 对Sst+ IN富集型GPCRs的协同靶向作用 FIGURE 7 FIGURE S8 本研究数据表明，理想的抗抑郁 G 蛋白偶联受体（GPCR）靶点应高度富集于生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）中，以最大程度减少在内侧前额叶皮层（mPFC）其他细胞类型中的脱靶效应。然而，所有内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺ INs 富集的 G 蛋白偶联受体（GPCR）均呈现复杂表达模式，同时在 mPFC 其他细胞类型及多个脑区中存在表达。在最大化靶向调控 mPFC Sst⁺ INs 的同时降低脱靶副作用，一种可行策略为低剂量同时靶向多种 Sst⁺ INs 富集 G 蛋白偶联受体（GPCR）：通过激活共同下游机制产生累加性抗抑郁样效应，并减少非靶点部位介导的副作用（图 7A）。 本研究选取三种研究较充分、富集于 Sst⁺ INs 的 G 蛋白偶联受体（GPCR）构建复方药物组合（图 7B）：第一组为代谢型谷氨酸受体 1（mGluR1），一种突触 Gq 偶联受体 ¹⁰³（图 S6A），参与 Sst⁺ INs 介导的抑制调控 ¹⁰⁴，同时在小脑与海马中表达，可能影响运动行为 ¹⁰⁵及学习记忆功能；第二组为 5 - 羟色胺 1A 受体（5-HT1AR），属于 Gi/o 偶联 G 蛋白偶联受体（GPCR），现有小分子激动剂具备理想的特异性与药代动力学特征，且可能参与选择性 5 - 羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）的作用机制 ¹⁰⁶⁻¹⁰⁸；第三组为 μ 阿片受体（MOR），基于本研究前述结果。批量 RNA 测序（RNA-seq）与单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）均稳定检测到上述三种 G 蛋白偶联受体（GPCR），且在 Sst⁺ INs 中的表达水平高于其他中间神经元亚群（图 7B、图 S8A）。 本研究构建Sst⁺复方药物：选用代谢型谷氨酸受体 1（mGluR1）特异性负向变构调节剂 JNJ16259685、5 - 羟色胺 1A 受体（5-HT1AR）特异性激动剂 8-OH-DPAT，以及具有 G 蛋白偏向性的 μ 阿片受体（MOR）部分激动剂 PZM21；已有研究证实 PZM21 相较于传统阿片类药物可降低阿片相关副作用 ¹⁰⁹˒¹¹⁰。 阈下低剂量联合给予三种化合物，可诱导 Sst⁺ INs 产生超极化反应，但对锥体神经元（PNs）无作用，并显著抑制 Sst⁺ INs 向锥体神经元（PNs）的光诱发抑制性突触后电流（oIPSCs）（图 S8B、图 S8C）。单独使用各组分均可对动机逃避行为产生轻度剂量依赖性效应（图 S8D、图 S8E）。为尽可能减少脱靶副作用，本研究选用各药物低剂量方案（JNJ16259685：100 ng/kg；8-OH-DPAT：0.1 mg/kg；PZM21：10 mg/kg），该剂量单独给药几乎无明显效应，将三者配伍组成 Sst⁺复方药物。 Sst⁺复方药物给药 60 分钟后可显著降低悬尾实验（TST）不动时间（图 7C），效应强度略高于单一组分单独给药，与 30 mg/kg 氯胺酮作用相当（图 S8F）；雌性小鼠及强迫游泳实验（FST）中亦可观察到一致效应（图 S8G、图 S8H）。在 Sst⁺ INs 中表达百日咳毒素（PTX）阻断 Gi/o 信号通路后，Sst⁺复方药物的抗抑郁效应显著减弱（图 7D），进一步证实 Sst⁺ INs 中 Gi/o 信号通路的核心作用。值得关注的是，Sst⁺复方药物给药 24 小时后仍可显著降低不动时间（图 7E），而各单一组分无此长效作用（图 7F），且药效强度不低于 30 mg/kg 氯胺酮（图 7E、图 S8I）。该长效效应在应激模型小鼠中依然稳定存在，并可推广至其他抗抑郁相关行为学检测范式（图 7G–7I）。 基于上述结果，本研究进一步探究其内在功能机制。首先采用双光子钙成像技术，记录表达轴突靶向遗传编码钙指示剂的 Sst⁺ INs 突触前活性。结果显示，Sst⁺复方药物可在给药 5 分钟内快速降低 Sst⁺ INs 突触前钙瞬变的发放频率与幅度（图 S8K–S8N）。利用突触素 - GFP 标记 1b 层突触前膨体进行成像发现，Sst⁺复方药物可降低膨体密度，并呈减小膨体体积的趋势（图 7J、图 S8J）。此外，Sst⁺复方药物与氯胺酮均可在给药 24 小时后恢复内侧前额叶皮层（mPFC）5 层（L5）锥体神经元（PNs）的树突棘密度，并逆转慢性应激对海马树突棘密度的损伤作用（图 7K、图 S8O–S8Q）。 本研究系统检测氯胺酮常见的副作用指标：转轮实验结果显示，氯胺酮可显著引发运动共济失调，而 Sst⁺复方药物无此效应；且在内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺ INs 中表达百日咳毒素（PTX）无法阻断氯胺酮该副作用（图 7L），提示其由其他非 Gi/o 通路机制介导。旷场实验中，氯胺酮可诱发自发活动减少与空间定向障碍，Sst⁺复方药物无上述作用（图 S8R、图 7M、图 S8R）。Y 迷宫工作记忆检测中，仅氯胺酮可损伤工作记忆功能（图 7N）；空间回避行为检测显示，氯胺酮升高焦虑样行为，Sst⁺复方药物无明显影响（图 7O）。条件性位置偏爱实验结果表明，仅氯胺酮可诱发药物关联隔间偏好，提示存在成瘾风险，而 Sst⁺复方药物无成瘾相关效应（图 7P）。 综上，本研究证实：** 协同靶向 Sst⁺ INs 富集 G 蛋白偶联受体（GPCR）** 可复刻氯胺酮强效的行为学与突触治疗效应，同时规避部分限制临床应用的脱靶副作用。 DISCUSSION 本研究证实，氯胺酮的快速抗抑郁样行为效应，在给药后数分钟内即可通过 ** 内侧前额叶皮层（mPFC）生长抑素阳性中间神经元（Sst⁺ INs）** 的 Gi/o 信号通路受到抑制而启动。本研究同时证实，慢性不可预见性应激（CUS）可增强内侧前额叶皮层（mPFC）Sst⁺ INs 对锥体神经元（PNs）的抑制性驱动作用；靶向作用于富集在 Sst⁺ INs 中的 G 蛋白偶联受体（GPCRs），可筛选出具有抗抑郁潜力的靶点，能够有效逆转 CUS 诱发的行为异常、改善 Sst⁺ INs 轴突肥大及锥体神经元树突棘丢失，且具备更理想的副作用特征。 PART1 抗抑郁药物作用的神经调控机制 本研究结果与近期多项研究 ¹⁵⁻¹⁸˒⁵⁶˒⁵⁷˒¹¹¹ 共同表明，阿片受体是介导氯胺酮抗抑郁效应的核心分子。阿片系统与抗抑郁作用的关联自古已有记载 ¹¹²。自 20 世纪 70 年代起，已有研究提出氯胺酮可结合 μ 阿片受体（MOR）⁵³⁻⁵⁵，而内源性阿片系统被证实参与习得性无助行为调控 ¹¹³˒¹¹⁴，并介导氯胺酮的长效作用⁵⁸。在人体研究中，抑郁、悲伤及自杀倾向均与阿片信号通路异常相关 ¹¹⁵⁻¹¹⁸。然而，关于氯胺酮的抗抑郁效应是否由 μ 阿片受体（MOR）信号介导、及其具体调控机制，目前仍存在较大争议 ¹⁶˒¹⁷˒²⁰˒⁵⁰˒¹¹⁹˒¹²⁰。 与此同时，大量研究已明确证实N - 甲基 - D - 天冬氨酸受体（NMDAR）通道阻断是氯胺酮发挥作用的关键环节 ¹²¹˒¹²²。本研究数据显示，单次单独给予 PZM21 无法产生与氯胺酮相当的抗抑郁样效应；同样，通过噻奈普汀激动 μ 阿片受体（MOR）产生抗抑郁作用需多次给药 ¹²³˒¹²⁴；除氯胺酮外，其他 NMDAR 拮抗剂的抗抑郁效应均较弱 ¹²⁵˒¹²⁶。上述现象提示，同时靶向 NMDAR 与 MOR可能是氯胺酮发挥强效作用的分子基础；氯胺酮既可直接激动 MOR，也可增强内源性阿片信号，或通过两种方式共同起效。值得注意的是，前额叶皮层 Sst⁺ INs 中 NMDAR 缺失同样可阻断氯胺酮作用⁴⁶˒⁴⁷，提示两类靶点可能共享下游调控机制。未来仍需进一步阐明下游信号通路，包括突触可塑性模式与转录调控机制，以解析前额叶皮层及相关脑区中 Gi/o 信号介导长效抗抑郁效应的分子基础。 在慢性应激研究背景下，既往临床前研究及抑郁症患者样本均发现 Sst⁺ INs 存在复杂的功能改变⁸⁷˒⁸⁸˒¹²⁷˒¹²⁸。本研究证实，CUS 可显著增强 Sst⁺ INs 对锥体神经元（PNs）的抑制效应，并使 1 层（L1）突触前膨体数量增多、体积增大（图 5），为锥体神经元树突棘丢失⁸¹˒¹²⁸与内侧前额叶皮层（mPFC）环路活动低下 ²⁸˒⁸¹˒⁸²˒¹²⁹提供了突触前形态学依据。RNA 测序（RNA-seq）结果显示，Sst⁺ INs 中 Rap1 通路相关分子（Dock4、Rap1Gap2、RapGef2）特异性上调，该通路在发育过程中与轴突生长密切相关 ¹³⁰。尤为关键的是，氯胺酮与 Sst⁺复方药物均可在给药 24 小时内部分逆转该形态学异常表型（图 6），证实突触前可塑性是抗抑郁药物作用的重要细胞靶点。本研究提出的慢性应激诱导 Sst⁺ INs 过度活化的结论，与既往研究一致：急性束缚应激下，杏仁核传入信号可强烈激活 mPFC Sst⁺ INs⁴²。本研究发现 CUS 可使 L1 层 Sst⁺ INs 轴突膨体更为显著，这一结果尤为值得关注；Sst⁺ INs 可分流中背丘脑向前额叶皮层的突触传递⁴²，该环路主要投射至 L1 层，且在慢性应激后功能减弱 ¹³¹。 尽管本研究证实抑制 mPFC Sst⁺ INs 活性是启动氯胺酮抗抑郁效应的必要条件，但维持氯胺酮长效作用仍需依赖不同环路组分及脑区参与，包括前额叶皮层（PFC）各亚区。已有大量研究表明，mPFC 背腹轴存在功能异质性，且对应激与抗抑郁药物的敏感性存在差异 ¹³²˒¹³³。 PART2 环路特异性 G 蛋白偶联受体（GPCR）药物靶点的通用筛选策略 本研究建立了一套基于环路机制解析、筛选治疗靶点的研究范式：通过筛选富集于关键细胞类型的 G 蛋白偶联受体（GPCR）—— 最主要的分子效应器家族，为临床前模型中基于机制研发抗抑郁药物提供新方向 ¹³⁴⁻¹³⁷。本研究聚焦两种高度富集于 Sst⁺ INs 的神经肽类 G 蛋白偶联受体（GPCR）：RXFP3 与 PROKR2，二者主要在脑内表达 ¹⁰¹˒¹³⁸。需注意，与多数神经调节型 GPCR 一样，RXFP3 与 PROKR2 亦在中枢神经系统（CNS）外表达，给靶向抗抑郁治疗带来潜在复杂性。但复方用药策略（详见下文讨论）或可有效规避脑外受体介导的潜在副作用。借助细胞类型特异性 RNA 测序，本研究筛选出大量 mPFC Sst⁺ INs 富集的 GPCR，其中包含既往已报道与抗抑郁效应及应激相关行为改变密切相关的受体亚型⁴⁸˒¹³⁹。本研究策略建立在啮齿类与人类基因表达模式具有一定保守性的基础之上，近期多项研究也为此假设提供了支撑证据 ¹⁴⁰˒¹⁴¹。 本研究同时提供了关键概念验证数据，支持靶向特定环路组分开发 GPCR 复方药物用于抑郁症治疗的可行性。基于互补作用机制的协同给药方案已在多个领域得到成功应用，包括艾滋病 ¹⁴³、肿瘤 ¹⁴⁴、高血压 ¹⁴⁵，在抑郁症领域也已有初步探索 ¹⁴⁶⁻¹⁴⁸。本研究的多药联用策略与传统多重药物联用模式不同：基于机制解析设计多种 GPCR 间协同作用，精准调控特定神经元亚型与环路功能。不同于联用两种抗抑郁药治疗剂量、易加重副作用的传统方案，本研究依据 GPCR 表达特征，采用亚治疗低剂量多药配伍，选择性靶向特定环路单元，同时降低脱靶效应。 LIMITATIONS 本研究明确证实 Sst⁺ INs 中的 MOR 是启动氯胺酮抗抑郁效应的关键，但仍存在若干局限性需说明：由于难以精准检测脑内实际有效药物浓度，且无法在体直接观测氯胺酮与受体的结合事件，目前尚不能完全证实氯胺酮直接激动 MOR是其抗抑郁效应的唯一驱动因素；部分实验所用氯胺酮浓度可能高于临床抗抑郁治疗的实际脑内浓度。氯胺酮的 MOR 依赖性作用，很可能是直接激动 MOR与促进内源性阿片释放共同介导。在向人类临床转化应用时，需注意本研究绝大多数实验基于小鼠模型，无法完全复刻抑郁症的疾病复杂性与异质性。本研究依托物种间保守的细胞类型特征（如受体表达、局部环路连接）鉴定启动抗抑郁效应的核心神经元群体 ¹⁴⁰。此外，本研究证实复方药物可实现快速抗抑郁并减少副作用，但该策略仍需突破多项技术瓶颈。未来临床试验可优先对已有 FDA 获批适应症的药物进行老药新用，严格考量药物间相互作用、血脑屏障穿透性、短期与长期安全性，并优化各药物给药剂量与方式，实现脑内同一时空位点的靶向协同作用。