Mogamulizumab-KPKC

摘要：双特异性抗体（bsAbs）能够实现传统基于IgG的抗体无法达到的新型作用机制和/或治疗应用。因此，这些分子在过去十年中引起了极大的兴趣，并且截至2023年底，已有14种bsAbs获得批准：11种用于治疗癌症，3种用于非肿瘤学指征。bsAbs有不同格式，针对不同的目标，并通过不同的分子机制介导抗癌功能。在这里，我们提供了bsAbs在癌症治疗领域最新进展的概述。我们专注于已批准或处于临床开发中的bsAbs，包括bsAb介导的信号通路双重调节剂、肿瘤靶向受体激动剂、bsAb-药物偶联物、双特异性T细胞、自然杀伤细胞和先天免疫细胞的招募者，以及双特异性检查点抑制剂和共刺激因子。最后，我们对处于更早开发阶段的下一代bsAbs进行了展望，包括三特异性抗体、bsAb前药、诱导肿瘤目标降解的bsAbs以及作为细胞因子模拟物的bsAbs。 引言  bsAbs用于双重受体抑制 bsAbs用于配体-受体抑制 bsAbs用于受体激活 bsAbs用于靶向载荷递送 bsAbs用于癌症免疫治疗、 新兴概念 、展望，双特异性抗体通过新生儿Fc受体（FcRn）循环利用。Fc部分的突变可以改变与FcRn的结合，从而改变抗体的半衰期。在不包含Fc部分的bsAbs中，可以通过其他方式实现类似IgG的药代动力学，例如结合到人血清白蛋白（HSA）或其他可以延长半衰期的分子。目前有超过几百种不同类型的bsAb格式，其中多种格式在已批准和处于临床开发中的分子中使用。目前，大多数已批准的bsAbs和处于药物开发高级阶段的分子主要用于癌症免疫治疗。其他针对新型药物递送的实体也在开发中，例如基于bsAb的抗体-药物偶联物（bsADCs）或双重靶向与癌症相关的信号通路（图1）。我们最近在ClinicalTrials.gov、Cortellis和The Antibody Society的数据搜索显示，有超过200种不同的双特异性分子的300多项临床试验正在进行中，其中约75%用于治疗实体瘤，25%用于治疗血液恶性肿瘤（图1）。目前有十种bsAb药物已获批准用于癌症治疗，其中九种在美国和/或欧洲获批准，卡多尼利单抗在中国获批准。在这十种bsAbs中，有九种可以归类为TCEs。卡塔莫单抗是首个获批准的bsAb，于2013年退出市场（表1和图2）。值得注意的是，今天在临床开发中的相当一部分bsAbs已经处于后期阶段（第二阶段和第三阶段）。我们发现，用于治疗实体瘤的bsAbs主要由免疫调节剂主导，包括双重CPIs（约45%）和TCEs（约33%），其次是针对双重通路的bsAbs、ICEs和双重ADCs。相比之下，TCEs是用于治疗血液恶性肿瘤的主要bsAbs类别（约75%），其次是ICEs、双重CPIs和NKCEs（图3）。我们数据集中的bsAbs针对60多个不同的目标，使用超过50种不同的bsAb格式，涉及100多种目标组合。然而，我们承认，该领域的增长速度很快，新的bsAbs，可能具有新的目标和格式，已经进入临床试验，自我们分析以来。尽管如此，本综述旨在提供一份基于MoA的全面概述，介绍作为癌症治疗开发的bsAbs的最新进展，重点关注截至2023年底在同行评审出版物中描述的bsAbs。 双受体抑制的bsAbs  许多参与细胞信号传导的细胞表面蛋白，如RTKs及其相关受体，是抗体基疗法的验证目标。几十年前，对这些蛋白的研究，包括历史上的先行者表皮生长因子受体（EGFR；也称为HER1）、HER2、血管内皮生长因子（VEGF）和针对它们的抗体，为几乎所有后续的抗体基治疗发展奠定了基础。尽管结合一个定义的信号实体的抗体基疗法相当有效，但与疾病相关的表现型通常由多个通路触发。这种冗余允许细胞通过使用其他补偿性信号通路来克服单一目标或通路的药理学生长抑制或诱导细胞毒性。同时调节不同的与疾病相关的信号受体和/或通路的bsAbs可以减少或克服这种限制。Amivantamab（JNJ-61186372）靶向EGFR和肝细胞生长因子受体（MET）。两种受体都会触发非小细胞肺癌（NSCLC）的增殖，因此，阻断两者可以比仅阻断一个通路更有效地抑制NSCLC的生长。Amivantamab已获批准用于治疗携带EGFR外显子20插入突变的NSCLC亚型。 图1 | 用于癌症治疗的双特异性抗体在临床开发中。目前有200多种双特异性抗体（bsAbs）正在进行临床开发，根据癌症类型、临床阶段和作用模式进行分组。正在进行临床开发的bsAbs中有50%处于II期和III期或已经获批。大约四分之三的bsAbs被开发用于治疗实体瘤，实体瘤治疗主要由T细胞招募剂（TCEs；32.9%）和具有检查点抑制和/或免疫调节作用机制（MoAs）的bsAbs（45.1%）所主导。相比之下，血液系统恶性肿瘤的治疗主要由TCEs（75%）和其他MoAs（21.9%）所主导，这些MoAs涉及免疫学活动，如通过检查点抑制和/或免疫调节激活自然杀伤细胞和其他免疫细胞，这归功于高度肿瘤选择性或谱系特异性抗原的可用性。值得注意的是，约有10%用于实体瘤治疗的bsAbs采用双重信号抑制。迄今为止，正在开发的bsAb抗体-药物偶联物（ADCs）用于治疗实体瘤。CPI，检查点抑制剂；ICE，先天细胞招募剂；NKCE，自然杀伤细胞招募剂。 双特异性抗体用于配体-受体抑制  受体激活可以通过干扰受体二聚体化或复合物形成，或通过阻断受体的配体结合位点来抑制。在癌症中，通常来自几个互补或补偿通路的配体和受体有助于肿瘤进展和治疗抗性。bsAbs可以同时阻断两种不同的配体，无论是可溶的还是细胞膜结合的，或者是配体和受体的组合。这种方法不仅用bsAbs来解决，也用双特异性或双位点基于支架的结合剂来解决，这里我们不包括。双重靶向VEGF和血管素2（ANG2）以阻断分别参与血管生成的VEGFR和血管素-1受体（TIE2）的激活，已成为包括微转移的血管生成转换在内的实体瘤中几项临床试验的主题。BI836880是一种三特异性纳米抗体（Nb）融合蛋白，由三个靶向VEGFA、ANG2和HSA的纳米抗体组成，后者用于延长其血清半衰期。这种化合物目前正在对头颈鳞状细胞癌、NSCLC和其他实体瘤患者进行I期研究。值得注意的是，vanucizumab，一种靶向VEGFA和ANG2的bsAb，在与化疗联合使用的临床前模型中显示出抗肿瘤、抗血管生成和抗转移效应，但在与化疗联合使用时，并未在结直肠癌患者中提高无进展生存期，超过VEGF抑制。将VEGF抑制与另一种拮抗活性相结合的概念进一步应用于靶向VEGF和Delta样规范Notch配体4（DLL4）的bsAbs。DLL4是一种细胞表面配体，激活Notch-1受体通路，该通路在肿瘤血管生成中起着核心作用。几种靶向VEGF和DLL4的双特异性抗体已经进入临床试验，包括navicixizumab、dilpacimab和CTX009/ABL001。Navicixizumab是一种四价双特异性抗体，具有四个结合位点，其中两个基于单链可变片段（scFv）融合，它在与紫杉醇联合使用时在铂类耐药卵巢癌患者中展示了有希望的临床活性，并具有可管理的毒性，表明这种方法可能在某些适应症中提供临床益处。相比之下，另一项针对四价双特异性抗体dilpacimab的II期研究，与亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康（FOLFIRI）联合使用，揭示了安全问题。 表1 | 批准用于癌症治疗的双特异性抗体 ADCC，抗体依赖性细胞毒性；ALL，急性淋巴细胞性白血病；BCMA，B细胞成熟抗原；BiTE，双特异性T细胞招募剂；bsAb，双特异性抗体；DLBCL，弥漫性大B细胞淋巴瘤；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；GPRC5D，G蛋白偶联受体C类5成员D；MoA，作用机制；NSCLC，非小细胞肺癌；NHL，非霍奇金淋巴瘤；scFv，单链可变片段；TCR，T细胞受体；TDCC，T细胞依赖性细胞毒性。批准区域限于美国、欧洲联盟（EU）、日本和中国；产品也可能在其他国家获得批准。状态截至2023年底。 靶向VEGF和PDL1或PD1的双特异性抗体  基于VEGF抗体和免疫检查点抑制剂（CPI）联合治疗的积极结果，上述概念进一步适应于设计靶向VEGF和肿瘤细胞上的PDL1或T细胞上的PD1的双特异性抗体，从而将抗血管生成与免疫肿瘤学方法相结合。使用这种方法最先进的分子是ivonescimab（AK112），它针对PD1和VEGF。目前，ivonescimab的上市申请正在中国接受监管审查。其他双特异性抗体靶向PDL1和VEGF，包括PM8002，目前正在进行II/III期研究（NCT05756972），针对NSCLC患者。 受体激活的双特异性抗体  许多抗肿瘤反应是通过激活细胞表面受体介导的，包括免疫反应或通过诱导凋亡的细胞死亡。癌症治疗的一种方法是通过将受体激活配体（如生长因子、细胞因子和（共）免疫刺激配体）融合到抗体或抗体片段上，实现受体激活配体的靶向递送，以诱导局部或组织特异性的激动活性，从而引发细胞反应。越来越多的这些抗体-配体融合蛋白正在进入临床试验。受体激活也可以通过激动性抗体来实现。肿瘤坏死因子（TNF）超家族的成员，包括死亡配体（如TNF配体超家族成员10（TNFSF10）；也称为TRAIL）及其各自的死亡受体（如TRAIL受体1和2；也称为DR4和DR5），或具有免疫细胞共刺激活性的配体（如TNFSF9；也称为4-1BBL）及其受体（如TNFRSF9；也称为4-1BB或CD137）在癌症治疗中引起了特别关注。然而，单克隆抗体在临床试验中取得了相当令人失望的结果。原因是许多TNFRSFs需要超过两个受体的交联以激活，这只能通过Fc-FcγR介导的抗体在细胞表面的超聚集来实现，因此依赖于TME中表达足够数量FcγR的先天免疫细胞。作为替代方案，针对目标抗原和TNFRSF成员的双特异性抗体已被证明可以作为强大且肿瘤选择性的激动分子，模仿表面展示配体的活性。这尤其适用于DR4和DR5，DR5需要多个受体的聚集才能激活。值得注意的是，针对DR5和表面抗原的双特异性抗体，如成纤维细胞激活蛋白-α（FAPα；也称为脯氨酸内肽酶FAP）、钙粘蛋白17（CDH17）或叶酸受体-α（FRα），不仅有效地诱导受体激活，还避免了通过诱饵受体的隔离50。RG7386（RO6874813），一种针对癌症相关成纤维细胞上的FAPα和DR5的四价双特异性抗体，在体外和体内在表达FAPα的基质的小鼠中触发了强效且选择性的肿瘤细胞杀伤，并已进入临床测试，但由于战略投资组合优先级而随后中止。此外，BI905711，一种针对DR5和CDH17的四价双特异性IgG-scFv融合蛋白，目前正在进行I期临床研究，显示出在CDH17阳性目标细胞上的效力比单克隆抗体提高了1000倍以上，转化为在结直肠癌模型中的强效且选择性的抗肿瘤活性。相同的格式用于针对DR5和FOLR1的双特异性抗体，FOLR1是一种富集于卵巢癌的受体，已被证明介导顺式（在同一细胞上）和反式（在两个不同细胞上）的细胞毒性，其中FOLR1作为有效DR5激活的聚集点。从概念上讲，这种MoA也可以转移到依赖于受体聚集的TNFRSF家族的共刺激成员，包括4-1BB、OX40和CD40（见图3），使用针对肿瘤相关抗原（TAAs）的双特异性抗体，但也针对其他目标，如PDL1，从而将共刺激与检查点抑制相结合（见下文）。 用于靶向载荷递送的双特异性抗体  存在两种概念上不同的方法，用于使用双特异性抗体进行有效载荷（如细胞毒素或放射性）的靶向递送。第一种方法，预靶向治疗，使用双特异性抗体的一个结合特异性来靶向肿瘤细胞，另一个结合特异性随后捕获肿瘤上的载荷。这类双特异性抗体结合到肿瘤上的癌症靶标，如癌胚抗原（CEACAM5）或HER2，然后捕获由双特异性抗体的第二个结合特异性识别的放射性标记载荷/复合物。 图2 | 已批准用于癌症治疗的双特异性抗体概览。a, 双特异性T细胞招募剂（TCEs）。b, 其他双特异性抗体（bsAbs）（非T细胞招募剂（非TCEs））。11种已批准的bsAbs中有6种具有IgG样结构，由2条重链（恒定区域以深灰色显示，Vh结构域以深蓝色或深红色显示）和2条轻链（恒定结构域以浅灰色显示，Vl结构域以浅蓝色或浅红色显示）组成。它们大多数具有1+1的化学计量比 —— 每个抗原一个结合位点 —— 还有一个TCE通过将一个额外的Fab片段融合到一条重链上，利用2+1的化学计量比。其他的bsAbs要么是不含Fc的融合蛋白，由两个单链可变片段（scFv）片段组成（blinatumomab），要么是将scFv片段与T细胞受体（TCR）片段融合，或者是具有2+2化学计量比的IgG-scFv融合蛋白。除了由小鼠和大鼠杂交瘤细胞技术生产的catumaxomab外，所有其他的bsAbs都是通过重组技术生产的。对于IgG样异二聚体分子，通过在CH3域使用突变来强制异二聚体化 —— 如旋钮-入洞技术 —— 或控制的Fab臂交换（cFAE），解决了两种不同重链的正确组装问题，cFAE还允许从两种不同的单特异性IgG组装IgG样分子。cFAE还解决了轻链问题，即轻链和重链的配对。或者，如CrossMab方法所示，对Fab臂进行进一步的修改，以强制正确的轻链和重链配对。值得注意的是，所有重组IgG样bsAbs都包含一个具有沉默或减少效应功能的Fc区域，这是通过在铰链/CH2域引入突变来避免或减少Fcγ受体和补体结合来实现的。BCMA，B细胞成熟抗原；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；GPRC5D，G蛋白偶联受体C类5成员D。 最近，被称为SADA的双特异性抗体利用改良的p53四聚体化域来延长GD2×DOTA在肿瘤中的滞留时间。GD2×DOTA是一种双特异性抗体，能够识别在癌症中高表达的二唾液酸神经节苷脂GD2，以及放射性载荷177Lu-DOTA，在肿瘤微环境中组装并滞留在那里，但没有四聚体化，它会迅速从周围清除，因为它缺乏半衰期延长。到目前为止，很少有临床试验中的双特异性抗体使用这种MoA，可能是由于与预靶向放射性相关的复杂物流限制了其普遍适用性。 图3 | 目前正在临床试验中的双特异性抗体的作用机制。a, 通过受体阻断两种不同的信号受体（以不同颜色表示）来抑制信号传导。b, 通过抑制可溶性配体（蓝色）和受体来抑制信号。c, 通过双重阻断两种不同的配体来抑制信号。d, 通过双特异性抗体（bsAb）药物偶联物（偶联物以浅蓝色表示）进行药物传递。e, 针对性阻断“别吃我信号”（CD47–SIRPα相互作用），导致巨噬细胞的吞噬作用。f, 结合检查点抑制，阻断“别吃我信号”。g, 通过T细胞受体（TCR）上的CD3或自然杀伤细胞上的CD16（FcγRIIIa）激活效应细胞。h, 肿瘤细胞结合介导的免疫细胞（共）刺激。i, PDL1结合介导的免疫细胞（共）刺激。j, 双重免疫细胞共刺激。k, 肿瘤靶向PDL1途径抑制。l, 肿瘤靶向PD1途径抑制。m, 检查点结合介导的免疫细胞（共）刺激。n, 双重检查点抑制。o, 通过配体阻断实现双重检查点和可溶性转化生长因子-β（TGFβ）信号的抑制。展示了用于实体瘤和血液系统恶性肿瘤的目标分子和肿瘤相关抗原（TAAs）的例子。注意：bsAbs可以同时发挥多种作用机制（MoAs）。Ang2，血管生成素2；APC，抗原呈递细胞；BCMA，B细胞成熟抗原；CDH17，钙粘蛋白17；DLL4，典型Notch配体4；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；FRα，叶酸受体α；GPRC5D，G蛋白偶联受体C类5成员D；HLA，人类白细胞抗原；ICOS，诱导性T细胞共刺激因子；LAG3，淋巴细胞相关基因3；TIGIT，具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体；VEGF，血管内皮生长因子。 双特异性抗体药物偶联物  第二种方法通过同时靶向肿瘤细胞表面的两个表位或两个目标，实现了通过双特异性抗体药物偶联物（bsADCs）传递细胞毒素载荷的特异性靶向。处于临床开发中的bsADCs的例子包括zanidatamab zovodotin（ZW49），这是一种双特异性HER2结合抗体zanidatamab与auristatin衍生的细胞毒素载荷偶联，双特异性MET×MET bsADC REGN5093或izalontaxab brengitecan（BL-B01D1），一种EGFR×HER3 bsAb与一种新型TOPO-I抑制剂偶联（NCT05194982）（表2）。 双特异性抗体用于癌症免疫治疗  大多数用于癌症免疫治疗的双特异性抗体通过T细胞驱动的自然或内源性免疫发挥作用，例如通过增强现有的抗肿瘤反应和/或克服检查点抑制，或通过提供合成免疫，例如通过bsAb驱动的免疫细胞的参与、激活和招募（图3）。在这一部分中，我们提供了包括CPIs、效应细胞招募剂（包括TCEs和ICEs）和共刺激双特异性抗体在内的最突出的MoAs的概述。 双重CPIs  许多干扰免疫检查点（如CTLA4或PD1/PDL1）的单特异性抗体已获批准用于癌症免疫治疗，包括ipilimumab、tremelimumab、nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab、avelumab、durvalumab或cemiplimab。将免疫检查点抑制抗体治疗扩展到包括双特异性抗体可能会减少不良副作用并提高观察到的单特异性抗体治疗的疗效。第一个方面，检查点抑制的安全性，包括预防自身免疫相关事件和/或不希望的免疫细胞激活。为了实现这一目标，正在开发针对检查点抑制功能和TAAs（如RTKs）的双特异性抗体，目的是将其活动更优先地集中在肿瘤上，正在开发中。第二个方面，检查点免疫治疗的疗效，通过双特异性抗体同时靶向两种不同的检查点蛋白来提高疗效并降低抗性的可能性，或提供互补的免疫刺激信号。值得注意的是，这些双特异性抗体的共同设计原则是提高对表达两种检查点蛋白的T细胞的选择性，如CTLA4/PD1或PD1/淋巴细胞相关基因3（LAG3），这些蛋白可能更具肿瘤反应性，目标是提供比单独检查点阻断更优越的治疗指数。 表2 | 晚期临床开发中选择的双特异性抗体概览 BiTE，双特异性T细胞招募剂；BCMA，B细胞成熟抗原；bsAb，双特异性抗体；BTC，胆管癌；cL，普通轻链；DART，双亲和重定向；DLL4，类似Delta的典型Notch配体4；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；Fchet，异二聚体化Fc；LAG3，淋巴细胞相关基因3；Nb，纳米抗体；NHL，非霍奇金淋巴瘤；NSCLC，非小细胞肺癌；PDC，胰腺导管腺癌；scFv，单链可变片段；TIGIT，具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体；TGFβ，转化生长因子β；VEGF，血管内皮生长因子。a晚期包括关键性II期、II/III期和III期临床研究。 例如，通过降低自身免疫不良事件的发生率 —— 而不是与联合检查点阻断相比。探索肿瘤靶向检查点抑制的工作包括开发双特异性抗体，这些抗体靶向肿瘤细胞表面的HER家族RTKs，并结合PD1/PDL1信号通路的阻断作为第二功能，从而将PDL1结合剂定向到肿瘤细胞。这些分子的特定肿瘤靶向导致了对表达EGFR的肿瘤细胞更具特异性和增强的活性。类似地，一种特别结合HER2和PDL1的双特异性抗体被证明可以在HER2表达的肿瘤细胞中特异性阻断PDL1活性，从而比单独使用每个实体或在不作为双特异性抗体结合时联合应用产生更大的治疗效果。 另一种双特异性抗体介导的靶向免疫治疗方法包括将PDL1阻断与识别黑色素瘤上的软骨素硫酸蛋白聚糖4（CSPG4）的结合物相结合。特定的肿瘤靶向增强了抗肿瘤T细胞的特异性、激活状态和疗效。概念上相关的方法包括将PDL1结合物与黑色素细胞刺激激素化学偶联。通过这种方式，PDL1抑制活性被定向到黑色素瘤细胞上的黑色素皮质素-1受体。同时靶向两个检查点蛋白而不额外包括常见的肿瘤细胞表面靶标的双特异性抗体的例子包括同时结合肿瘤细胞上的PD1和PDL1的双特异性抗体。Wan等人分析了这种双特异性抗体在高级别浆液性卵巢癌类器官与免疫细胞共培养中引发的联合活性。与单特异性结合物相比，双特异性抗体介导了优越的疗效，并在T细胞和自然杀伤细胞中诱导了表型变化，包括激活状态和细胞毒性的改变。双特异性抗体LY3434172也采用了这种方法。通过完全抑制PD1/PDL1途径，LY3434172显示出比每个亲本抗体或两者组合更大的抗肿瘤活性，再次证明以双特异性抗体形式的结合很重要，并且可以增加疗效。超越PD1/PDL1方法的界限，包括CTLA4在内的其他免疫受体的双特异性抗体正在开发或已获批准。同时靶向PD1和CTLA4是双特异性抗体cadonilimab的作用机制。Cadonilimab由于四价性，介导了对高密度PD1和CTLA4的增加亲和力驱动的目标结合，这与Fc突变以废除FcγR结合相结合，可能是其有利的治疗指数的基础。值得注意的是，cadonilimab还在PD1+和CTLA4+ T细胞之间介导了跨结合。在晚期实体瘤患者的I/Ib期研究中，cadonilimab显示出抗肿瘤活性和有利的安全性概况，免疫相关不良事件的发生率低。Cadonilimab已在中国获批准用于治疗在铂类化疗后或化疗期间进展的复发或转移性宫颈癌。其他在高级临床试验中结合相同特异性的双特异性抗体是MGD019和MEDI5752。MGD019结合了PD1和CTLA4结合物，在进行中的临床研究中观察到可接受的安全性和组合阻断以及在多种实体瘤中的客观反应。MEDI5752目前正在进行临床评估，它结合了PD1和CTLA4，并显示了PD1介导的靶向，因为它优先饱和了PD1+ T细胞上的CTLA4，并引起了PD1的快速内化和降解。与cadonilimab相比，MGD019和MEDI5752似乎对双阳性T细胞显示出更强的亲和力驱动的选择性增益。双重失活也在探索中，通过结合PD1/PDL1阻断与LAG3或TIM3抑制。例子是IBI323和FS118，它们都结合了PDL1和LAG3，并在临床前模型中显示出增强的双重功效。LY3415244结合了PDL1和TIM3的阻断，作为一种不同的免疫调节剂，但由于在I期研究中观察到的免疫原性，该分子的开发被终止。最近，I期剂量递增和扩展数据的临床试验显示，PD1×LAG3双特异性抗体tebotelimab在实体瘤或血液系统恶性肿瘤患者中作为单药治疗以及与HER2抗体margetuximab联合治疗时显示出有希望的活性。双配体抑制是另一种基于双特异性抗体的检查点抑制方法。PDL1和转化生长因子-β（TGFβ）是具有互补且非冗余免疫抑制活性的受体结合配体。TGFβ不仅具有免疫抑制作用，还可以进一步诱导促血管生成因子的上调和癌症相关成纤维细胞的激活。目前正在开发几种靶向PDL1和TGFβ的双特异性抗体，如类似双特异性抗体融合蛋白的bintrafusp alfa（M7824）。在这种情况下，PDL1的结合是通过一个“标准”的抗体结合模块实现的，而TGFβ则被人类TGFβ受体II的细胞外域捕获。Bintrafusp alfa在临床前研究中显示了激活先天和适应性免疫系统，从而比单独使用抗PDL1抗体或TGFβ陷阱模块更好地抑制肿瘤生长和转移，目前正在进行临床试验。Retlirafusp alfa（SHR-1701），另一种以类似方式靶向PDL1和TGFβ的双功能融合分子，正在对宫颈癌和胃癌或胃食管结合部癌症患者进行III期研究（表2）。YM101是一种TGFβ×PDL1双特异性抗体，目前处于临床前开发阶段。YM101的一个替代品，Y101D，正在对晚期实体瘤患者进行评估（NCT05028556）。所有同时对抗抑制性TGFβ和PD1/PDL1途径的方法在体内模型中显示出比单独使用各自结合物更高的抗肿瘤活性，但迄今为止尚未在临床上证明概念。针对性的TGFβ信号阻断也已经在临床前研究中通过阻断CD4+ T细胞中的TGFβ信号的双特异性抗体实现。为此，将非免疫抑制性的CD4靶向抗体ibalizumab与TGFβ陷阱以类似于上述的双特异性抗体方式结合。这导致在辅助T细胞中针对性阻断TGFβ信号，可以释放抗肿瘤反应。通过双特异性抗体招募磷酸酶抑制PD1是一种最近报道的新型MoA88。这是通过一个单域（Vhh）融合到一个scFv实现的，将PD1连接到细胞表面磷酸酶CD45，这反过来触发细胞内去磷酸化。这种方法与单独使用PD1抗体介导的配体阻断相比，增强了检查点阻断的抑制。按照同一原则，双特异性抗体可以将细胞表面磷酸酶CD45与抑制性自然杀伤细胞表面受体NKG2A或Ly49连接，以进行后续去磷酸化。这样的双特异性抗体可以阻断并同时去磷酸化它们的目标，可能比相应的单特异性抗体及其抑制信号的组合更有效的拮抗剂，以增强自然杀伤细胞和T细胞的抗肿瘤活性。使用双特异性抗体对CD73的不同表位进行双位点靶向是另一种双特异性抗体相关方法，以抵消免疫抑制活性或增强针对肿瘤的免疫能力。CD73产生免疫抑制性腺苷，其通过内化的双特异性抗体介导的抑制和耗尽比单一位点CD73抗体更有效。 效应细胞招募剂 T细胞招募剂 在过去二十年中，专门结合肿瘤表面抗原和TCR的CD3ε链的T细胞招募剂（TCEs）在这一类双特异性抗体中占据主导地位，描述了数百种TCEs，并且有100多种进入临床开发。事实上，第一个获准上市的双特异性抗体是鼠/大鼠嵌合的上皮细胞粘附分子（EpCAM）×CD3ε双特异性抗体catumaxomab，它在2009年被欧洲联盟（EU）批准用于恶性卵巢腹水的腹腔内治疗，但后来因商业原因退出市场。目前正在中国再次进行临床试验，用于腹腔内给药。系统应用的catumaxomab显示出严重的输注反应和高免疫原性发生率，可能由于其鼠/大鼠嵌合的恒定区域和保留的FcγR结合，导致在没有抗原结合的情况下非特异性FcγR和TCR激活。随后，下一代TCEs被设计为缺乏Fc部分，如基于串联scFv的CD19×CD3ε双特异性T细胞招募剂（BiTE）blinatumomab，它在2014年首次被批准用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）。然而，由于缺乏通过FcRn的循环，这种疗法需要持续输注，FcRn通过从分拣内体循环到细胞表面，从内溶酶体降解中挽救IgG。基于blinatumomab的成功，针对血液和实体瘤的各种目标的BiTEs被开发出来，但最终没有进入晚期临床试验，由于BiTEs和相关短半衰期的药代动力学特性不佳。人们尝试通过纳入FcγR结合惰性Fc结构域（沉默Fc）或HSA结合部分来实现bsAbs的IgG样半衰期，目前大多数处于开发中的TCEs是基于IgG和/或具有IgG样药代动力学的。值得注意的是，大多数TCEs使用单个单价结合位点用于CD3作为T细胞上的触发分子，以避免在没有同时目标结合的情况下TCR交联引起的系统性T细胞激活。然后它们使用一个（1+1）或两个（2+1）肿瘤目标的结合位点，因为双价结合可以在肿瘤选择性和效力方面提供优势。CD20×CD3ε双特异性抗体mosunetuzumab106和B细胞成熟抗原（BCMA）×CD3ε双特异性抗体teclistamab是第一批异二聚体1+1 IgG基TCEs，分别在2022年被批准用于治疗复发/难治性滤泡性非霍奇金淋巴瘤（NHL）或多发性骨髓瘤。在2023年，异二聚体2+1 CD20-TCE glofitamab104,108和1+1 CD20-TCE epcoritamab109被批准用于治疗复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），以及1+1 G蛋白偶联受体C类5成员D（GPRC5D）-TCE talquetamab110和BCMA-TCE elranatamab111用于复发/难治性多发性骨髓瘤（表1）。CD20-TCE odronextamab112和BCMA-TCE linvoseltamab的上市申请正在等待监管决定。鉴于它们在复发/难治性B细胞和浆细胞恶性肿瘤患者中显示出的有希望的临床疗效和完全缓解率 —— 包括在CAR-T细胞治疗后复发的患者中的活性 —— 以及它们作为现成疗法的简单可用性以及皮下给药的可能性，可以预期TCEs将成为CAR-T细胞疗法的主要替代品，特别是随着它们开始被开发用于更早期的治疗线并且可以让患者轻松获得。免疫动员单克隆T细胞受体针对癌症（ImmTACs）是结合了工程化TCR以识别人类白细胞抗原（HLA）呈递的肽抗原与抗CD3 scFv的TCEs，实现对细胞内TAAs的靶向。值得注意的是，短暂存在的ImmTAC tebentafusp，它包含一个针对由HLA-A*02:01呈递的黑色素细胞谱系特异性抗原糖蛋白（gp100）表位的可溶性TCR融合到CD3靶向scFv，已在2022年被批准用于治疗葡萄膜黑色素瘤，为TCEs在实体瘤中的细胞内靶标空间开辟了新的领域。值得注意的是，tebentafusp介导了总体生存益处，尽管它只诱导了少数临床反应，因此直接杀死肿瘤细胞可能不是其唯一的MoA。与此同时，各种基于重组TCR或使用类似TCR的抗体（TCR模拟物）的TCEs已进入临床开发，包括针对WT1和突变新抗原如KRAS122或p53的TCEs。重要的是，高通量动力学筛选和通用TCR类似库可以促进高度选择性的TCR和TCR模拟物的开发，用于TCEs。有趣的是，使用共价KRASG12C抑制剂sotorasib，可以产生一种类似TCR的TCE，可以特异性识别HLA呈递的sotorasib-肽共轭物，并随后诱导KRASG12C突变细胞的T细胞杀伤。细胞因子释放综合征的发生，主要是由于靶向T细胞激活，一直是TCEs临床开发的一个主要挑战。尽管在许多情况下，这可以通过使用类固醇预处理和逐步剂量增加来管理，但最近的努力已经研究了使用具有降低CD3ε亲和力的CD3ε抗体，目标是将T细胞杀伤与细胞因子分泌解耦。与CAR-T细胞一样，由于TCEs的杀伤效力非常高，因此需要严格肿瘤特异性和/或谱系特异性表达目标抗原，以避免靶向非肿瘤毒性。对于血液癌症中的B细胞和浆细胞抗原，如CD19、CD20、CD79b、BCMA140141和FcRH5，通常认为它们只存在于B细胞和浆细胞恶性肿瘤以及非必需的B细胞和浆细胞谱系中。然而，即使对于CD19等抗原，其在正常组织中的表达可能并非绝对不存在，有报道称CD19在围绕内皮细胞的壁细胞/血管周细胞上表达，这些细胞对血脑屏障完整性至关重要，作为一种靶向非肿瘤机制与神经毒性有关。相比之下，在急性髓系白血病中，典型的抗原如CD33或CD123也存在于髓系造血谱系上，使得它们的临床开发更具挑战性。类似地，许多主要的（上皮）实体瘤抗原如EGFR、HER2、EpCAM、肿瘤相关钙信号转导蛋白2（也称为细胞表面糖蛋白Trop-2）、MUC1、CEACAM5和glypican 3也可以在（必需的）正常组织中找到。因此，由于更免疫抑制性的肿瘤微环境，TCEs（和CAR-T细胞）在实体瘤的开发在过去几年中进展较少。重要的是，必须认识到对于TCEs，与ADCs150相比，由于更高的效力，对肿瘤选择性的要求更严格，固体瘤ADC靶标如HER2和TROP-2可能无法用传统的TCEs靶向。与此同时，与TCEs相比，ADCs可能由于在肿瘤微环境中释放有毒载荷而受益于更强的旁观者杀伤效应，对抗原阴性肿瘤细胞进行杀伤。因此，很少有肿瘤选择性抗原似乎是TCEs的可行靶标，包括新抗原如p95-HER2和EGFRvIII，或者MUC16、claudin 18.2、DLL3和STEAP1等靶标。对于DLL3靶向的TCE tarlatamab，目前正在美国食品药品监督管理局（FDA）的优先审查中，已在小细胞肺癌中报告了有希望的I期临床数据，总反应率达到23%。随后的II期研究证实了活动性，持久的客观反应和有希望的生存结果，使用每2周10毫克剂量治疗的患者。基于这些数据，已启动了一项随机关键研究，比较tarlatamab与标准护理（NCT05740566）。同样，xaluritamig，一种2+1 STEAP1 TCE，具有亲和力驱动的活性，能够选择性地针对高表达STEAP1的肿瘤细胞与正常细胞相比，已在转移性去势抵抗性前列腺癌患者的I期剂量递增研究中展示了有希望的临床活性。综上所述，这些概念验证数据表明，TCEs仅限于血液癌症活跃的共同假设，特别是B细胞恶性肿瘤，并不适用，并且TCEs也有可能治疗某些实体瘤，只要能够管理靶向非肿瘤活性。正在使用多种方法来克服实体瘤选择性挑战。例如，在双特异性抗体中使用具有降低亲和力的肿瘤抗原结合物（2+1格式）可以实现亲和力介导的选择性增益（也称为亲和力调节），目标是利用肿瘤和正常组织之间的表达差异，如CEACAM5、HER2和FOLR1，以提高肿瘤选择性。或者，双重靶向和亲和力介导的选择性增益应用于三特异性TCEs，这些TCEs选择性地杀死共同表达这些靶标的肿瘤细胞，但不会影响只表达这些靶标中一个的正常细胞。此外，针对两种不同的肿瘤抗原如CD19和CD22的三特异性TCEs可以防止通过抗原丢失的免疫逃逸。尽管大多数传统的TCEs可以招募常规T细胞和非传统先天样γδ T细胞（表达TCRγ/δ而非TCRα/β的T细胞），但一类特定的γδ TCEs已被设计为通过TCRγδ特别招募γδ T细胞，目标是通过只针对可以在患者中进一步扩展的T细胞亚群来提高安全性和有效性。在临床前研究中，γδ TCEs作为单一药物显示出强大的抗肿瘤活性。或者，为了此目的，制造了针对肿瘤的双特异性异二聚体BTN2A1和BTN3A1抗体融合蛋白。由于γδ T细胞生物学在小鼠模型中没有完全反映，这种方法的最终概念验证将不得不依赖于正在进行的临床试验的临床数据，如针对PSMA的γδ TCE LAVA-1207（NCT05369000）。而不是针对CD3ε或TCRα/β的双特异性抗体，肽-MHC复合物可以被应用来特别招募特定pMHC复合物的T细胞，如由于自然发生和普遍的巨细胞病毒感染而存在的巨细胞病毒衍生肽。在另一种方法中，病毒表位可以被传递到肿瘤细胞中，以便加载相应的MHC分子，并招募病毒特异性T细胞攻击这些细胞。还描述了用于更有效介导双特异性抗体介导的聚集和补体依赖性细胞毒性的双特异性抗体。有趣的是，通过应用两对独立的抗体，可以建立一种逻辑门，通过补体依赖性细胞毒性选择性地消除共表达两种抗原的细胞。例如，使用这种方法，可以消除共表达CD20和CD52的B细胞，而单独表达这些抗原的细胞则不会被杀死。随着对采用CAR-T细胞疗法的极大兴趣，一类特定的TCEs，作为CAR-T细胞和肿瘤细胞之间的双特异性适配器，已被设计为特别招募采用转移的T细胞用于治疗各种癌症，同时不涉及自然T细胞。其中一个例子是合成激动性受体（SAR）-T细胞系统，其中一种双特异性抗体识别肿瘤抗原和一个引入到采用转移的T细胞中的合成抗原受体。这种在合成生物学背景下的方法提供了多种方式。 进一步工程化和控制采用T细胞疗法方法，超出了传统抗体疗法或经典CAR-T细胞疗法所能提供的范围。另一种结合细胞疗法和双特异性抗体的方法是体外武装T细胞与多种TCEs，目标是克服肿瘤异质性。为此，T细胞在体外与针对肿瘤抗原如GD2、HER2、PSMA和STEAP1的TCEs孵育，并给药于肿瘤携带动物，在这些动物中，由于抗原丢失，它们阻止了肿瘤进展。 固有细胞招募剂  尽管TCEs在效应细胞招募剂领域占据主导地位，但正在大力开发下一代ICEs，包括NKCEs和双特异性抗体，这些抗体招募髓系衍生细胞（MDCs）进行吞噬作用，包括中性粒细胞和巨噬细胞/单核细胞。介导ADCC的单克隆抗体，如利妥昔单抗、西妥昔单抗或曲妥珠单抗，因为ADCC/抗体依赖性细胞吞噬作用对其MoA至关重要，除了其他作用如信号抑制外，可以被视为第一代ICEs。基于这种经验，已经批准了几种与常规单克隆抗体相比具有增强ADCC功能的Fc工程化IgG1抗体，包括obinutuzumab、mogamulizumab、tafasitamab、margetuximab和amivantamab。基于这种经验和目标，进一步增强ADCC功能，超越Fc工程化IgG1抗体，已经开发了各种双特异性NKCEs，它们针对自然杀伤细胞上的不同表面分子，如CD16、NKG2D、NKp46或NKp30，作为免疫疗法。这些NKCEs中最先进的是一种短半衰期的CD30×CD16双特异性抗体，用于治疗霍奇金淋巴瘤，可以作为单一疗法、与检查点抑制联合或与自然杀伤细胞输注联合使用。最近，开发了针对抗原如EGFR或BCMA的半衰期延长的四价IgG基双特异性抗体，以及利用双重靶向实现肿瘤选择性的三特异性抗体。对称的三特异性NKCEs通过ADCC特别针对通过其CD16结合区域共表达EGFR和PDL1的细胞，使用两种合一抗体技术。另一种激活自然杀伤细胞的方法依赖于双特异性融合蛋白，该蛋白由NKG2D配体（例如UL-16结合蛋白2（ULBP2））与针对HER2的scFv融合，以实现有效的ADCC介导的肿瘤细胞杀伤。或者，保留FcγRIII结合的双特异性抗体，针对NKp46或NKp30和各种肿瘤抗原，可以提供强大的抗肿瘤效果。与TCEs不同，其中FcγR结合是不需要的，这些双特异性抗体依赖于保留或增强的FcγRIII结合，以实现有效的自然杀伤细胞参与。值得注意的是，当IL-2变体被融合到NKp46双特异性抗体上，产生四功能分子时，由于同时诱导自然杀伤细胞扩增，效果大大增强。另一个积极研究的领域是双特异性抗体，这些抗体通过结合，例如，巨噬细胞和中性粒细胞上的FcαRI受体（CD89）或通过双特异性IgE抗体的IgE受体，参与吞噬作用或MDCs以及中性粒细胞的杀伤。或者，肿瘤靶向双特异性抗体可以阻断肿瘤细胞上基于'不要吃我信号'的CD47–SIRP1α相互作用，以便这些细胞被MDCs攻击和吞噬。双特异性CD19 x CD47或间皮素x CD47抗体结合了肿瘤靶向和CD47抑制以及通过效应功能完整的Fc部分招募效应细胞。在这种情况下，对CD47具有低亲和力的双特异性抗体有利于克服不必要的结合到红细胞上的CD47。 各种团队应用这一概念进行PDL1×CD47共靶向。或者，SIRPα融合蛋白可以用来阻断CD47–SIRPα“不要吃我”信号。 共刺激双特异性抗体  有效、持久且局部限制的抗肿瘤免疫反应需要共刺激和共抑制信号来紧密调节细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的激活、分化和维持。TNFRSF家族成员（如4-1BB、CD40、OX40、TNFRSF18（也称为糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（GITR））、CD27或CD30）以及CD28免疫球蛋白超家族（如CD28、CTLA4、PD1、诱导性T细胞共刺激因子（ICOS）和B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减因子（BTLA））及其相应的配体，在通过细胞-细胞接触（如抗原呈递细胞（APCs）和T细胞之间）提供的局部免疫调节信号中发挥着显著作用。这些受体为T细胞提供了所谓的信号2，这对于维持TCR通过肽-MHC-TCR相互作用或通过TCE交联TCR所提供的信号1是必需的。针对这些免疫调节途径的靶向可能增强免疫疗法。研究表明，针对共刺激受体的激动性单克隆抗体通常只会导致微弱的激活，但这种激活可以通过FcγR介导的受体超聚集显著增加。此外，抗体与受体之间的化学计量比、结合亲和力和表位特异性等因素可以影响共刺激抗体的活性。因此，降低免疫调节抗体的亲和力可以作为一种策略，通过增加受体聚集来增强激动性活性，这一原则经常应用于双特异性抗体激动剂（见上文）。然而，由于增加的趋化因子和细胞因子产生导致的免疫相关系统性不良事件是共刺激抗体药物开发的限制因素。抗体-细胞因子融合蛋白和双特异性抗体能够以目标依赖的方式提供共刺激信号，通过双重靶向两种不同的共刺激受体或通过靶向共刺激受体和CPI来规避这一限制。 肿瘤靶向共刺激双特异性抗体  用一个臂结合到TAA上，另一个臂结合到免疫细胞上的共刺激受体上的双特异性抗体，可以通过在癌细胞和免疫细胞之间跨作用来局部介导受体聚集，从而提供信号2。目前正在临床试验中的共刺激双特异性抗体包括针对4-1BB、CD40和CD28的分子。T细胞激活后诱导表达的4-1BB使其成为增强CD8 T细胞反应的T细胞共刺激的有吸引力的靶标。使用针对4-1BB的激动性抗体（如urelumab和utomilumab）作为单一疗法在临床试验中的安全性问题和较差的疗效，使人们重新将努力集中在可以克服这些毒性的双特异性抗体上，通过引入肿瘤特异性共刺激。大约一半的癌症靶向共刺激双特异性抗体在临床试验中通过4-1BB发挥作用。先进的双特异性抗体包括PRS-343（cinrebafusp），一种针对HER2和4-1BB的四价双特异性抗体-抗钙蛋白融合蛋白，在IND使能研究中被发现耐受性良好，没有明显和相关药物相关毒性；FAP-4-1BBL（RG7872），作为单一疗法和与PDL1抑制联合使用时显示出药理活性；或englumafusp alfa，正在研究中作为与glofitamab联合用于DLBCL的信号2提供者。其他在临床试验中通过4-1BB进行肿瘤选择性共刺激的双特异性抗体目标包括EGFR、PSMA、CLDN18.2、B7H4、CEACAM5、HER2、PDL1（见下文）和FAP48。此外，使用CD28作为共刺激受体的双特异性抗体，目前在临床试验中。通过与APC上的CD80（也称为B7.1）或CD86（也称为B7.2）的结合，CD28为幼稚T细胞提供了必要的二次信号，以实现完全的T细胞激活和存活。这种信号也可以通过激动性CD28抗体提供，即使在没有初级TCR参与的情况下，如超激动剂TGN1412所示，它在I期研究中因大量细胞因子释放综合征而显著失败。后来发现，TGN1412特别在低剂量下作用于调节性T细胞（Treg细胞），而在高剂量下激活传统T细胞和Treg细胞，为选择性靶向T细胞亚群提供了窗口，但也突出了T细胞共刺激与超激活之间的微妙平衡。一些双特异性抗体可以以目标依赖的方式提供这种二次共刺激信号，以增强肿瘤限制性的抗肿瘤T细胞反应。值得注意的是，双特异性抗体可以被设计为单独使用时活性有限且无毒性，但可以增强T细胞激活和TCEs的抗肿瘤活性。REGN5837是一种针对CD22和CD28的双特异性抗体，已进入与针对CD20的TCE odronextamab联合用于NHL治疗的I期试验。肿瘤靶向CD28双特异性抗体也可以与PD1协同作用，提供长期抗肿瘤免疫反应，目前，多个针对TAAs如EGFR、MUC16、PSMA、B7-H3、CD19、CD22或PDL1的双特异性抗体正在进行临床试验，与检查点抑制联合使用或作为单一疗法。 MDCs和树突细胞激活双特异性抗体  CD40在包括APCs、其他MDCs和B细胞在内的多种细胞类型中表达，但也在广泛的恶性细胞上表达。单克隆激动性CD40抗体可以通过诱导APCs成熟和激活抗原特异性T细胞和其他免疫细胞来触发抗肿瘤效应，从而促进肿瘤特异性免疫反应，特别是通过启动细胞毒性T细胞。除了具有剂量限制毒性的激动性CD40抗体外，还开发了针对CD40和各种TAAs如CEACAM5、EpCAM或间皮素的双特异性抗体。与其他TNF超家族成员一样，受体聚集在受体激活中起着关键作用。将CD40激动性抗体与针对肿瘤靶向抗原的抗体结合在双特异性抗体中，允许共刺激活性定向到TME，从而提高安全性和有效性。例如，针对CD40和CEACAM5或EpCAM的四价双特异性抗体的概念验证表明，与单一CD40抗体相比，它们增强了T细胞交叉启动。针对间皮素和CD40的双特异性抗体（ABBV-428）在体外和体外模型中展示了增强的APC和T细胞激活，并且在I期试验中显示出可接受的安全性概况。为了在肿瘤内而不是外周选择性激活CD40，生成了FAP×CD40，一种包含两个CD40结合位点和一个FAP结合位点的双特异性抗体。该抗体提供了一个强烈的FAP依赖性CD40刺激信号，展示了良好的安全性概况以及肿瘤积聚和肿瘤内免疫激活，目前正在进行I期临床试验。MP-0317是一种多功能设计ankyrin重复蛋白（DARPin），应用相同的概念，针对FAP、CD40和HSA进行半衰期延长，目前正在进行I期临床研究。或者，双特异性抗体可以通过Clec12a标记物直接靶向树突细胞。 双特异性抗体的双重共刺激  在免疫细胞上双重靶向两种不同的共刺激受体已被用于诱导强大的抗肿瘤反应。FS120是一种针对活化T细胞上表达的4-1BB和OX40的四价双特异性抗体，以一种不依赖FcγR的方式激活CD4和CD8 T细胞。这种活性需要两个受体的共刺激才能有效激活免疫细胞并发挥抗肿瘤活性，支持使用四价双特异性抗体双重靶向共刺激受体以诱导有效的受体聚集和激活的概念。在动物研究中，FS120的替代品没有引起肝脏炎症和肝毒性，这是激动性4-1BB抗体观察到的限制。FS120目前正在进行I期临床试验。类似的方法中，开发了一种双价双特异性抗体，用于双重靶向4-1BB和CD40（BNT-312，tecaginlimab），因此靶向T细胞和APCs。APCs的CD40激活导致共刺激分子的上调和免疫刺激性细胞因子的分泌，从而在不依赖CD4 T细胞帮助的情况下，实现强大的CD8 T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。 双特异性抗体用于双重检查点抑制和共刺激  抗共刺激受体的抗体还被与CPIs结合使用，以释放T细胞免受抑制信号的影响，同时增强T细胞反应，特别是在对检查点抑制有抵抗力或难治性的肿瘤中。大多数目前正在临床试验中的双特异性抗体使用跨作用的方式结合这些信号，通过靶向肿瘤细胞上的PDL1和免疫细胞上的共刺激受体，其中4-1BB是最突出的靶标。超过十种不同的针对PDL1和4-1BB的双特异性抗体正在进行I期或II期试验。II期候选物包括一种IgG-anticalin融合蛋白（PRS-344），其中配体结合anticalin框架代表第二特异性，一种双价双特异性IgG抗体（acasunlimab，也称为GEN1046）和一种三价，三特异性单链二抗体-scFv融合蛋白，进一步包含一个HSA结合位点以延长半衰期（NM21-1480）。这些类型的双特异性抗体可以增强免疫反应，超越单一抗体及其组合，进一步提供针对PDL1表达肿瘤细胞的靶向共刺激，以及TME中的MDCs和肿瘤引流淋巴结。与此一致，TME中表达4-1BB的肿瘤浸润CD8 T细胞亚群表达高水平的PD1，因此容易受到PDL1×4-1BB双特异性抗体的治疗。值得注意的是，由于4-1BB信号需要超聚集，与PDL1的结合可以导致TME中条件聚集和激活的4-1BB，减少肝脏毒性，如四价双特异性IgG-scFv（ABL503）所示。遵循这一概念的进一步双特异性抗体包括四价双特异性单克隆抗体（FS222）和双价双特异性IgGs，如MCLA-145。同样，CD28共刺激和检查点抑制可以通过在肿瘤内顺式作用的T细胞双重靶向进一步实现。ATOR-1015的可行性已得到证明，它是一种针对OX40的IgG，融合到针对CTLA4的优化版本的V型域的CD86上。与4-1BB类似，CTLA4和OX40在活化的T细胞上上调，并由Treg细胞表达，特别是在TME中。与GITR和ICOS不同，CD27由naive T细胞表达，因此有助于促进新的T细胞反应。 PDL1×CD27双特异性抗体在临床前研究中比PD1阻断和CD27共刺激的组合更有效，同时展现出良好的安全性概况。在概念上类似的方法中，PD1的结合位点与其他TNF超家族的共刺激成员结合，包括4-1BB（如与IBI319结合）、GITR和ICOS（XmAb23104）。GITR也在活化的T细胞上上调，并由Treg细胞恒定表达，在其中发挥着增强初始免疫反应的关键作用。PD1×GITR-L双特异性融合蛋白的概念验证已经展示。对于这些药物中的一些，与联合或分别协同效应相比，检查点抑制的相对贡献并不一定确立。 新兴概念  支持双特异性抗体开发的概念从早期探索性方法迅速发展到临床开发，双特异性抗体现在已确立为治疗原则。然而，双特异性抗体领域仍在不断进展，以进一步探索和扩展技术和应用。学术界以及生物技术和制药工业追求的各种早期探索性双特异性抗体方法是有希望的，其中一部分可能提供尚未由当前开发中的双特异性抗体解决的治疗概念。本综述的范围不允许我们涵盖所有或许多这样的早期方法，实际上在这个快速增长的领域中可能无法全面覆盖。因此，我们通过提及一些我们认为相关并有潜力进一步推动基于双特异性抗体的癌症治疗界限的新兴主题来结束我们的综述。 三特异性TCEs与集成共刺激  共刺激信号可以与双特异性TCEs结合，以促进有效的T细胞激活。这已经通过上述的双特异性TCEs和共刺激双特异性抗体的组合实现，但也通过在双特异性TCE中包含第三个结合位点来针对共刺激受体，从而生成三特异性抗体。目前有两种这样的三特异性TCE正在进行临床试验，它们针对TAA和CD3，并进一步包含一个针对CD28的结合位点。SAR443216是一种三价三特异性免疫球蛋白基抗体，针对HER2×CD3×CD28，包含一个突变的IgG4，缺乏Fc介导的效应功能。这种三特异性抗体目前正在I期临床试验中，能够激活初级CD4和CD8 T细胞，诱导T细胞增殖，释放细胞因子和颗粒酶B以及T细胞介导的HER2表达肿瘤细胞的杀伤，包括HER2表达低的细胞。类似地，一种针对在多发性骨髓瘤中过度表达的CD38的结合位点与CD3和CD28结合位点结合在三特异性抗体SAR442257中，目前也在I期临床试验中。 前药方法  一种新兴的方法旨在通过提供“安全关键”的特异性作为前药，在肿瘤处选择性激活，从而生成具有高度肿瘤特异性功能的双特异性抗体。一些应用于失活抗体以生成前药并在肿瘤处重新激活的概念如图4所示。前药转化为功能性双特异性抗体可以通过肿瘤微环境中存在的肿瘤特异性蛋白酶等环境触发因素来实现。例如，具有空间屏蔽的双特异性抗体可以通过蛋白酶激活。需要肿瘤特异性蛋白酶表达的蛋白酶激活TCEs，即所谓的probodies，需要肿瘤特异性蛋白酶在TME中的表达才能激活。另一种早期阶段的双重肿瘤靶向方法依赖于从两个具有分裂CD3ε结合基团的双特异性抗体中肿瘤特异性组装功能性CD3ε抗体片段。这些实体需要被设计为在循环中作为单独实体时不活跃，以便它们只在肿瘤抗原结合和随后的原位组装后被激活，如已经为半抗体或前药激活链交换（PACE）分子所描述的那样。这类分子面临的主要挑战仍然是以单体形式大规模生产它们，并防止在没有目标结合的情况下过早组装。通过目标链交换介导的分裂型I细胞因子的重建就是一个例子，说明如何实现肿瘤特异性组装。值得注意的是，最近开发了一种引入到抗4-1BB抗体结合位点的ATP依赖性开关，以增加肿瘤选择性并避免靶上、靶外毒性。这种开关使用肿瘤中升高的ATP水平作为触发因素，可能也适用于其他结合实体。 图4 | 双特异性抗体领域的新兴概念。a, 带有集成共刺激的三特异性T细胞招募剂（TCEs），用于通过CD3结合同时激活T细胞受体（TCR）（信号1）和通过结合CD28进行共刺激（信号2）。b, 双特异性抗体（bsAb）前药的作用方式。用于生成前药并重新激活所需作用位点的抗体的一般概念包括：阻断结合位点以使抗体失活，以及通过蛋白酶诱导激活被阻断的抗原结合位点，对目标环境（如酸性pH或ATP）的亲和性调节，以及由于通过高浓度局部富集互补前药而进行的组装或交换反应。c, 通过结合表面抗原（肿瘤相关抗原（TAA））和降解分子，例如膜E3连接酶，实现蛋白酶体靶向嵌合体（PROTAC）方法，这导致细胞表面目标的内化和蛋白酶体降解。d, 例如通过基因疗法将bsAb传递到CAR-T细胞中。e, 细胞因子模拟bsAb触发细胞因子受体途径，如通过将受体域引入立体接近性，模仿细胞因子作用的IL-2Rβ–IL-2Rγ异二聚体。 PROTAC双特异性抗体  另一个新兴概念和新的作用机制最近被描述，它使用双特异性抗体通过靶向降解来灭活与增殖相关的过程。类似于新兴的双特异性或多特异性小分子蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）领域，双特异性抗体可以被设计为触发内部化并随后降解参与癌症发展和/或进展的表面蛋白。这样的双特异性抗体同时结合到被靶向降解的蛋白质，以及触发结合目标蛋白的内部化和随后降解的因素，如膜可及的E3泛素连接酶或转铁蛋白受体。目前还没有已知的抗体-PROTAC概念进入临床研究，但这类实体的开发与“标准”双特异性抗体的开发完全兼容，并为靶向新途径并尽快将其概念带入临床提供了独特的可能性。 双特异性抗体的传递  双特异性抗体发展的另一个重要新兴概念是局部生产和随后的局部传递双特异性抗体，例如通过脂质纳米粒子介导的mRNA传递CLADN6 TCE，溶瘤病毒或类似基因疗法的方法，包括CAR-T细胞。 细胞因子模拟抗体  最后，双特异性抗体也可以作为细胞因子模拟物或所谓的合成细胞因子激动剂。在这种情况下，已经描述了scFvs或基于单一结构域Vhh的方法，通过模仿IL-2或IL-15、IL-18、I型干扰素和IL-10有效地触发细胞因子信号。或者，可以通过使用分裂方法使用新设计的IL-2模拟蛋白neoleukin实现肿瘤特异性细胞因子受体激动活性。这种基于抗体的细胞因子模拟物在癌症免疫疗法中可能有各种应用。 展望  双特异性抗体领域近年来取得了显著进展，到2023年底，已有十多种双特异性抗体获得批准，许多不同的方法正在临床测试中。然而，我们认为，由于癌症的异质性和适应性，这些方法中不太可能有一种成为通用的癌症免疫疗法。相反，抗体将需要为特定应用量身定制，并将依赖于与其他方法的结合，以最大化它们的疗效和安全窗口。具有多重特异性的抗体治疗的发展增长可能会在未来几个领域发生：针对具有明确依赖性的肿瘤的肿瘤相关RTKs的双特异性抗体；用于以增加的选择性靶向肿瘤的双特异性ADCs；用于靶向降解适用于各种途径的细胞表面蛋白的双特异性PROTACs；以及用于癌症免疫疗法的多特异性抗体。在后一个领域，特别是对于非常有效的基于T细胞的疗法，如TCEs或CAR-T细胞，识别高度肿瘤选择性抗原将是至关重要的，将需要能够通过肿瘤特异性蛋白酶激活和更好地调节效应功能来特别实现肿瘤特异性活性，同时保护正常组织。另一个重要方面是提供双重检查点抑制和/或补充共刺激信号给T细胞，以维持和延长T细胞反应，如已被证明对CAR-T细胞疗法的临床成功至关重要。重要的是，这种方法不仅适用于与TCEs的组合，也适用于与内源性免疫方法的组合。另一个重要方面是通过激活先天免疫系统，包括自然杀伤细胞、MDCs和树突细胞，促进二次免疫反应的产生。与其他癌症药物一样，通过改进的诊断方法和新的发展范式，使双特异性抗体和多特异性基于抗体的治疗能够在疾病早期应用于患者将是实现治愈癌症患者目标的关键。

摘要:嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法彻底改变了B细胞淋巴样肿瘤的治疗，并在某些情况下改善了疾病结果。因此，已经引入了六个FDA批准的商业CAR-T细胞产品，这些产品针对在恶性B细胞或浆细胞上优先表达的抗原，用于B细胞淋巴瘤、B-ALL和多发性骨髓瘤的治疗。 这些治疗成功激发了CAR-T细胞疗法在其他血液肿瘤，包括T细胞恶性肿瘤中的应用。然而，CAR-T细胞疗法在T细胞肿瘤中的成功明显受限，这是由于存在一些限制因素，例如：1）正常T细胞和CAR-T细胞与恶性细胞之间共享的共同抗原，决定了兄弟相残事件和严重的T细胞再生障碍；2）用于CAR转导的CAR-T细胞被恶性T细胞污染。异体CAR-T产品可以避免肿瘤污染，但引发了与免疫不兼容性相关的其他问题。 尽管存在这些限制，在过去几年中，在针对T细胞恶性肿瘤的CD7和CD5靶向CAR-T细胞疗法方面取得了显著进展。 介绍 T细胞急性淋巴细胞性白血病（T-ALL）约占成人ALL的25%和儿童ALL的10-15%。T-ALL来源于T细胞发育过程中胸腺祖细胞的白血病转化，这是通过累积遗传异常实现的。 根据分化阶段和一些膜抗原的表达，T-ALL被分类为早期/前皮质、皮质和成熟。随着分子遗传学分析（下一代测序）和细胞遗传学研究的出现，T-ALL根据这些遗传异常的存在被分类。在T-ALL中观察到两种类型的遗传异常：A型异常，特征是依赖于染色体重排或缺失的转录因子的异位激活；B型改变，与需要额外的遗传病变以实现完全白血病转化有关。根据遗传异常的存在，已确定四种T-ALL亚型，包括早期胸腺细胞祖细胞（ETP）/不成熟ALL、TLX、TLX1/NKX2.1和TAL/LMO。ETP-ALL的特征是表达造血干细胞标记物如CD34、异常HOX4和MEF2C基因表达、IL7信号级联中的复发突变和高BCL2蛋白表达。TLX亚群的特征是表达γ/δ T细胞受体、激活TLX3或HOXA转录因子的驱动遗传事件。TLX1/NKX2.1亚群的特征是涉及TLX1或NKX2.1转录因子的驱动遗传事件和TLX重排病例中NUP214-ABL1融合的发生。TAL/LMO亚群的特征是表达成熟细胞膜标记物、TAL1和LMO2转录因子的驱动激活和PTEN的复发突变。 过去三十年来，包括T-ALL在内的ALL治疗取得了显著进展，总体生存率得到了持续改善，特别是对于15岁以下的儿童。然而，成人T-ALL患者的生存率明显低于儿童和青少年。此外，复发/难治性疾病患者的预后较差，生存率在10-25%之间。 T细胞淋巴瘤是一种涉及T细胞恶性转化的非霍奇金淋巴瘤；已确定四种主要亚型，包括外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤（Sezary综合征和蕈样霉菌病）、间变大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。在理解这些疾病的分子发病机制方面取得了相当大的进展，从而改善了它们的治疗；然而，对于难治性或复发性疾病的患者，结果通常较差。 嵌合抗原受体（CAR）是一种新型的基于细胞的免疫疗法，显示出相当的疗效。CAR-T细胞被设计为专门识别细胞上表达的主要组织相容性复合体（MHC）无关的抗原，并因此杀死该细胞。CAR-T细胞的生产包括三个步骤：首先从患者或捐赠者那里获得健康细胞，然后使用基因组技术（如慢病毒基因转导和/或基因编辑）对T细胞进行工程改造，最后注入武装的CAR-T细胞以识别和杀死癌细胞。CAR-T细胞治疗在治疗B细胞恶性肿瘤方面取得了相当的成功，如B细胞淋巴瘤和B急性淋巴细胞性白血病。这些在治疗几种血液系统恶性肿瘤方面的发展激发了对T细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞治疗的探索；然而，将CAR-T细胞治疗扩展到T细胞恶性肿瘤尤其具有挑战性，因为正常和恶性细胞之间共表达许多细胞膜抗原靶标。 基于CD7靶向的T-ALL CAR-T细胞治疗。CD7是T-ALL细胞高表达的膜抗原。CD7是一种分子量为40 KDa的细胞膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超基因家族。CD7被认为是治疗T-ALL和T细胞淋巴瘤的良好潜在靶标。 最近，工程化的表达抗CD7的CAR-T淋巴细胞被用作T-ALL和T细胞淋巴瘤治疗的治疗剂。然而，由于CD7在正常T淋巴细胞和NK细胞上表达，T-淋巴细胞细胞膜上CD7的不受限制的表达将决定兄弟相残的杀戮；因此，生成靶向CD7的CAR-T细胞需要在它们被工程化以编码抗CD7的CAR之前，取消T-淋巴细胞膜上CD7的阻断。 为了开发靶向CD7的CAR-T细胞，已经使用了各种方法来抑制/阻断T细胞上CD7的表达：基因编辑、蛋白质阻断剂和自然选择。 基于基因编辑的CD7 CAR-T细胞。使用了两种基因编辑来生成CD7 CAR-T细胞：CRISPR/CAS9基因编辑和基础编辑基因编辑。 CRISPR/CAS9基因编辑。CRISPR/CAS9基因编辑系统涉及两个组成部分：caspase 9（CAS9）切割DNA，以及导向RNA（CRISPR，成簇的规律间隔短回文重复序列），将CAS9导向特定DNA序列的水平：因此，设计针对特定DNA序列的导向RNA，可以使用CAS9引入DNA的双链断裂，从而产生特定的基因敲除。临床前研究表明，CD7KO CD7 CAR-T细胞可以防止兄弟相残，增殖，并发挥针对恶性T白血病细胞的特定抗肿瘤活性。 可以使用自体T细胞或异体T细胞来生成CD7 CAR-T细胞。从患者那里获得的自体T细胞用于生成CD7 CAR-T细胞是有限的：从患者那里获得适当数量的健康细胞用于准备CAR-T细胞的困难；生成CAR-T细胞所需的程序持续时间；用于CAR-T细胞生成的T细胞可能被白血病或淋巴瘤T细胞污染的风险；自体、个性化CAR-T细胞制剂的相当大的成本。 Allo-CAR-T细胞没有这些限制；然而，这些CAR-T细胞有其他问题，主要与免疫兼容性有关：宿主免疫系统可能会拒绝被识别为非自身的异体CAR-T细胞；供体T细胞对宿主的移植物抗宿主病（GvHD）的发展。 基因编辑可以用来敲除T细胞受体基因，以减少T细胞的免疫不兼容性，消除人类白细胞抗原（HLA）II类基因和CD52。使用这种方法，谢等人最近报告了“通用”CAR-T细胞CD7-/-、TRAC-/-、CD7UCAR.的开发。这些细胞在体外有效增殖，并特异性诱导原发性T-ALL细胞的杀伤，分泌大量促炎细胞因子；此外，这些CAR-T细胞也能显著减少肿瘤负荷并延长T-ALL模型小鼠的生存期。胡等人报告了首次使用CD7靶向CAR-T细胞（RD13-01）进行的临床试验，这些细胞经过基因改造（敲除CD7/TRAC/RFX5相关基因），以抵抗同种异体杀伤、GvHD和异体排斥，并增强抗肿瘤活性。在这项I期试验中，共有12名患者（11名T-ALL/T-淋巴瘤患者和1名表达CD7的AML患者）接受了这些CAR-T细胞治疗。11 输注后4周，9/11的患者显示出OR，7/11的患者达到CR；3名患者接受了异体HSCT。中位时间为10.5个月时，4名患者仍然处于CR状态。（表1）张等人最近报告了一项I期研究的结果，该研究涉及7名T-ALL和3名T-LBL患者接受RD13-01 CAR-T细胞治疗， 80%的患者实现了CR，7/8的应答患者MRD阴性；有趣的是，三名之前自体CD7 CAR-T细胞治疗失败的患者在接受CD7异体HSCT治疗后实现了CR，4/6的患者直到315天仍然无进展。七名患有髓外病变（EMD）的患者中有四名在中位第30天获得了EMD CR。2/6的患者复发且没有CD7丢失，随后死亡。只有一名患者经历了3级细胞因子释放综合征，一名患者经历了3级神经毒性。这些观察结果支持进一步研究，以更好地定义RD13-01产品在治疗T-ALL和T-LBL患者中的安全性和有效性。 Leedom及其同事报告了WU-CART-007的开发，这是一种用于T细胞恶性肿瘤的同种异体CAR-T细胞疗法，使用正常T细胞通过CRISPR/CAS9基因编辑敲除CD7和TRAC（通过GUIDE-Seq控制可能的非目标事件的发生），随后通过慢病毒载体转导CAR，表达高亲和力和高特异性的抗CD7，细胞扩增和耗尽残留的TCRA/B+细胞。WU-CART-007细胞通过CD7靶向在体外和体内都展现出强大的抗肿瘤活性。使用WU-CART-007细胞，Ghobadi等人报告了I/II期研究WU-CART-007-1001的结果，该研究涉及12名R/R T-ALL或T-LBL患者，接受四个剂量水平（每次输注100、300、600、900百万细胞）的治疗。WU-CART-007显示出可管理的毒性，25%的患者出现与治疗相关的不良事件；在剂量水平<2的患者中，CRR为43%。Li等人报告了基于慢病毒转化的allo-CAR-T细胞GC027的开发，该细胞表达抗CD7，正常健康T淋巴细胞中的TCRα和CD7基因被CRISPR/CAS9基因编辑系统沉默。最初在两名难治性/复发性T-ALL患者中探索了GC027 CAR-T细胞的安全性和有效性，两名患者均实现了完全反应。最近，同一作者报告了涉及12名R/R T-ALL患者的GC027 CAR-T细胞的扩展研究结果：11/12的患者在CAR-T细胞输注后一个月内迅速清除了白血病性T淋巴母细胞并达到CR（CR率91.7%）。四名EMD患者中有三名显示出病变的完全缓解。输注的GC027细胞在体内迅速扩增，并在输注后5-10天达到扩增高峰；在大多数患者中，GC0278细胞在输注后4周不可检测。值得注意的是，一名患者的PFS超过3年。毒性概况是可管理的。 基因编辑。基因编辑是一种新兴的基因组技术，它能够在特定的基因位点上以高特异性、精确度和效率产生可编程的单碱基对变化。在这项技术中，腺嘌呤碱基编辑器（EBEs）和胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）结合一个单链DNA脱氨酶酶与核酸酶CAS9，分别在特定的基因组靶位点安装A·T到G·C或C·G到T·A的点突变。由于ABEs和CBEs都不引起双链断裂，它们产生高效的靶向编辑，显著降低了核酸酶编辑中观察到的复杂基因组重排的风险。 利用这项技术，DiOrio等人开发了7CAR8，这是一种通过引入四个同时的碱基编辑：CD7、TCRα、CD52和PD1，产生的针对CD7的异体CAR-T。在临床前研究中，7CAR8-T细胞在体外和体内T-ALL模型中显示出高效性。 2022年，CD7 CAR-T基础编辑临床试验（ISRCTN 15323014）开始。在这个试验中，健康捐赠者的T细胞在TCRβC1和TCRβC2、CD7和CD52水平上进行了基础编辑，然后转导了编码识别CD7的CAR的慢病毒载体；使用这个程序，产生了基础编辑的CAR7（BE-CAR7）T细胞库。这项研究的I期将涉及10名患有难治性/复发性T-ALL或其他T细胞恶性肿瘤的儿童；这些患者首先接受了淋巴细胞耗竭，随后接受了0.2x10^6到2x10^6 CE-CAR7 T细胞每公斤体重的输注；在28天分子缓解的患者接受了异体HSCT，随后使用HSCT前使用的条件方案耗尽任何持续存在的BER-CAR7细胞。最近报告了前3名接受治疗的患者的结果：第一名患者，一名13岁的女孩，在异体HSCT后复发T-ALL，在接受BE-CAR7输注后实现了分子缓解，然后从她原来的捐赠者那里接受了移植，成功实现了免疫重建和持续的白血病缓解；第二名患者出现了致命的真菌并发症；第三名患者在BE-CAR7细胞输注后实现了分子缓解，随后在缓解期接受了异体HSCT。这些患者中观察到严重不良事件，包括CRS、多系细胞减少症和机会性感染。 CD7蛋白阻断剂。阻断T淋巴细胞中CD7表达的不同方法包括使用由单链可变片段和细胞内保留域组成的蛋白阻断剂，将目标抗原锚定在内质网和高尔基体中，然后进行蛋白降解。这种技术可以用来在不进行CD7基因编辑的情况下下调T细胞中的CD7表达。这种技术可以用来产生不在其细胞膜上表达CD7的功能和增殖的CAR-T细胞。Wong等人使用这种技术，最近报告了开发了既缺乏CD7又缺乏CD3表达的抗CD7 CAR-T细胞（PCART7），对T-ALL和T-淋巴瘤细胞表现出强大的细胞毒性。Zhang等人开发了一种基于串联CD7纳米体VHH6与内质网/高尔基保留基序的CD7阻断策略，以细胞内阻断CD7分子，从而促进其降解。临床前研究支持CD7阻断在预防同种异体杀伤和使用这种CD7阻断策略开发的CAR-T细胞对CD7阳性白血病细胞的强大细胞毒性方面的有效性。这些CAR-T细胞的I期临床试验显示，7/8的难治性/复发性T-ALL和T-淋巴瘤患者在CAR-T细胞输注后3个月实现了CR；1名患者实现了MRD阴性状态，一名T-淋巴瘤患者实现了超过12个月的CR。大多数患者只有1级或2级CRS。 Pan等人评估了供体来源的CD7 CAR-T细胞在治疗难治性/复发性T-ALL中的应用。为了最小化CD7 CAR-T细胞介导的同种异体杀伤，作者产生了一个包含抗CD7、4-1BB共刺激域和CD3ζ信号域的逆转录病毒载体，以及一个与内质网保留信号序列融合的CD7结合域，使CD7分子在细胞内保留。在I期临床试验中，从先前的HSCT供体或新供体生产的CD7 CAR-T细胞被用于20名难治性/复发性T-ALL患者。90%的患者实现了CR，其中七名患者在中位随访6.3个月后接受了HSCT，15名患者仍然处于缓解状态。2名患者（10%）出现了3-4级CRS，3名患者（15%）出现了1级神经毒性；这两种副作用都与T细胞供体类型或剂量水平无关。最近，这项试验的II期中期报告被提出，涉及20名难治性/复发性T-ALL患者的入组，中位随访11.0个月。90%的患者实现了CR；3名患者仍然处于缓解状态，7名患者复发，2名患者死于感染，8名患者接受了HSCT。1年的PFS和OS率分别为62%和60%。没有纵膈肿块的患者比有纵膈肿块的患者有更长的OS。在18名应答者中，有7名患者复发（3名CD7+，3名CD7-和1名未知）。 最近，Tan等人报告了CD7 CAR-T细胞I期研究中包含的T-ALL患者的长期（24-27个月）随访结果。在中位27个月的随访后，ORR和CRR分别为95%和85%，其中35%的患者接受了HSCT；20名患者中有6名复发，其中4名患者肿瘤细胞失去了CD7表达。在24个月的随访后，PFS和OS分别为37%和42%，中位PFS和OS分别为11和18.3个月。（表1）治疗后超过30天观察到的严重不良事件包括5次感染和1次4级肠道GvHD。在30天内，所有20名患者都出现了细胞减少症，而3名患者在输注后8、12.5和13个月出现了晚期3级细胞减少症。 在20名患者中有5人（25%）出现了非复发性死亡，主要原因是感染；在一例中，由于接受了SCT巩固治疗的患者发生了植入综合征。在所有患者中，非CAR CD7+ T和NK细胞在CD7 CAR-T细胞输注后15天内被清除，直到最后一次随访时在所有患者中几乎都无法检测到，除了一名患者。在2名患者中，长期监测T细胞表型显示中心记忆T细胞逐渐增加，并且在一名患者中，可以测量到低水平的原始和干细胞记忆T细胞亚群。 CAR-T细胞是通过自然CD7阴性T细胞或通过自然选择获得的CD7阴性CAR-T细胞生成的。从不表达CD7抗原的T淋巴细胞生成CAR-T细胞代表了一种潜在的替代CD7基因消除或阻断的方法。在这种情况下，Freiwa和同事提供了证据，表明自然发生的CD7- T细胞存在于健康受试者中，并且代表可以用于CAR-T细胞生成的功能效应T淋巴细胞。这些CD7- T细胞占T淋巴细胞的0.7-19%，主要具有CD4+记忆表型。从这些CD7-开始生成的CAR-T细胞主要表现出CD4+记忆表型，并且在体外和小鼠异种移植模型中对抗原暴露具有显著的抗肿瘤活性；重要的是，这些CAR-T细胞绕过了同种攻击。 Lu等人描述了通过体外自然选择过程获得CD7- CAR-T细胞的不同方法。特别是，这些作者比较了三种不同的方法来生成针对CD7的CAR-T细胞，并在临床前研究中评估了它们的特性：NS7CAR T细胞首先转导T细胞与CD7靶向载体，然后在两周的细胞培养过程中经历自然选择过程；Neg7CAR T细胞是通过转导CD3+CD7- T淋巴细胞与CD7靶向载体获得的；KO7CAR T细胞是通过CRISPR/CAS9基因编辑沉默CD7表达的T细胞生成的。与分选的CD7- CAR-T细胞和CD7敲除CAR-T细胞相比，NS7CAR T细胞显示出相似或更优的治疗特性，包括更高比例的CD8+记忆T细胞和更高比例的CAR+细胞。使用这些NS7CAR T细胞，对14名R/R T-ALL患者和6名T-LBL患者进行了I期临床研究；19名患者在骨髓中实现了MRD CR，5/9在髓外实现了CR。14名患者在接受NS7CAR-T细胞治疗后进行了allo-HSCT（10名巩固治疗，4名挽救治疗），没有复发；6名未接受allo-HSCT的患者中，有4名在中位时间54天时仍处于CR。只有一名患者经历了3级CRS。 Zhang和同事报告了在60名R/R T-ALL（35）和T-LBL（25）患者中使用CD7 CAR-T细胞NS7CAR在三个不同剂量水平：5x10^5/Kg、1-1.5x10^6/Kg和2x10^6/Kg治疗的结果。治疗后28天，94%的患者实现了骨髓CR；在32名EMD患者中，78%显示出客观反应，其中56%处于CR，22%处于PR；2年OS和PFS分别为63.5%和53.7%。重要的是，与未进行移植的10名患者相比，37名CR患者进行巩固HSCT的PFS明显更好（分别为67%和15%）；在未进行移植的10名患者中，有8名复发。在有或没有EMD的患者中，OS和PFS没有观察到差异，而有之前移植史的患者显示出较低的1年OS率（49.4% vs 77.6%）。具有复杂细胞遗传学改变的患者与没有这些改变的患者相比，OS和PFS显著降低（分别为30% vs 79%和25% vs 64.2%）；同样，携带TP53基因突变的患者显示出显著较低的OS（25% vs 77.9%）。安全性概况可接受，80%的患者出现1-2级CRS，11%的患者出现3-4级。两名患者（3.3%）经历了1级ICANS，1名患者（1.7%）经历了4级。CRS和ICANS的发生与NS7CAR的增殖无关。37名患者（61.7%）在输注后第30天或之后出现了未恢复的3级或更高级别的细胞减少。 自体和异体CD7 CAR-T细胞疗效的比较。Zhang等人对自体和异体CD7 CAR-T细胞治疗T细胞恶性肿瘤进行了比较分析。研究涉及10名R/RT-ALL和T-LBL患者，其中5名接受了自体CD7 CAR-T细胞治疗，5名接受了异体CD7 CAR-T细胞治疗；CAR-T细胞是Pan等人描述的Intrablock抗CD7 CAR-T细胞。尽管患者数量非常有限，但尝试了接受自体和异体CD7 CAR-T细胞治疗的患者之间的一些比较：CR率在异体中高于自体（分别为80%和40%）；复发率在异体中高于自体患者（分别为100%和25%）；CAR-T细胞在体内的存活率在异体中高于自体患者。 避免CD7 CAR-T细胞同种攻击的替代方法。最近，提出了两种避免CD7 CAR-T细胞同种攻击的替代方法，而无需进行基因组操作。Ye等人提出的一种方法是基于在制备CAR-T细胞期间，使用含有与CAR相同结合域的自由抗CD7单克隆抗体阻断T细胞膜上的CD7抗原。用抗CD7抗体培养的CAR-T细胞显示出抑制同种攻击、提高细胞活性，并能有效地介导对CD7阳性白血病细胞的细胞毒性。另一种方法是基于在这些细胞的体外扩增过程中向CD7 CAR-T细胞添加伊布替尼或达沙替尼，这些是关键CAR/CD3ζ信号激酶的药理学抑制剂：添加这些抑制剂可以挽救未编辑CD7 CAR-T细胞的体外扩增，在撤除抑制剂后恢复CAR-T细胞在体内介导的完全细胞毒性。使用这种方法制备的CAR-T细胞被证明适用于癌症治疗目的。 基于CD5靶向的T-ALL CAR-T细胞治疗。除了CD7，其他在正常和白血病T淋巴细胞上表达的膜抗原也是CAR-T细胞的合适靶标。其中之一是CD5；CD5在正常细胞上的表达仅限于T淋巴细胞和B1细胞。正如CD7的情况一样，CAR-T细胞上的CD5表达会导致CD5 CAR-T细胞的同种攻击。由于CD5靶向的CAR-T细胞治疗可能是治疗T细胞恶性肿瘤的一个有吸引力的策略，一些实验研究已经描述了针对CD5抗原的CAR-T细胞的特性。因此，Dai等人报告了开发具有完全人类重链-only抗原识别域的CD5靶向双表位CAR；通过CRISPR/CAS9基因编辑敲除CD5的T淋巴细胞与编码抗CD5的慢病毒载体转导生成的CAR-T细胞，在临床前模型中对白血病性淋巴T细胞展现出强大的细胞毒性。Ho等人提供了证据，表明CAR和CAR-T细胞上认知抗原的亲和力影响CAR-T同种攻击的强度。因此，研究表明，在CD5表达下调的T淋巴细胞中表达单链片段变量（scFv）会诱导低强度的同种攻击，从而产生具有最大化抗CD25效应活性的CAR-T细胞。另一项近期研究报告了开发和描述了通过CRISPR/CAS9基因编辑敲除CD5和CD7基因，以减轻CD5和CD7基因敲除的CAR-T细胞，表达抗CD5和抗CD7的完全人类重链-only域。这些CD5/CD7双特异性CAR-T细胞对T细胞恶性肿瘤展现出强大的抗肿瘤活性。很少有临床研究探索了CD5 CAR-T细胞在T细胞恶性肿瘤中的安全性和有效性。2019年，Hill等人报告了一项I期剂量递增研究（MAGENTA研究）的结果，该研究调查了在T细胞中表达时产生最小和短暂同种攻击的自体CD5导向CAR-T细胞。这种治疗被视为异体HSCT的桥梁。这项研究包括了9名患者，其中4名患者显示出客观反应，其中3名在血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤和T-ALL患者中实现了CR。输注后，PB CD3+细胞数量有所下降，但没有完全的T细胞无能。2021年，同一作者报告了在接受自体CD5 CAR-T细胞治疗的另外9名R/R T细胞淋巴瘤患者中观察到的结果。这四名反应患者中的三名随后进行了HSCT，其中两名分别在29个月和24个月后仍然存活并且处于CR。临床反应与输注的细胞剂量或T细胞扩增程度无关。Pan等人报告了一项I期研究的初步结果，该研究涉及治疗五名CD7阴性T-ALL患者在CD7 CAR-T细胞治疗后复发并接受了先前HSCT供体来源的CD5 CAR-T细胞；所有这5名患者在第30天实现了CR，并在中位随访27个月时保持MRD阴性。尽管这些结果是有希望的，但需要更长时间的随访来评估反应的持续时间和功能性免疫系统的重建。Patel和同事开发了一种新的CD5 CAR-T细胞制剂，Senza 5TM，这是一种自体CD5 CRISPR-CAS9敲除抗CD5 CAR-T产品，对CD5靶标具有高特异性；他们的策略，>90%的CD5 KO和>30%的CAR转导，允许生成两种主要的细胞群体：一种是CD5 KO CAR-T细胞，另一种是CD5KO正常未转导细胞。预计CD5 KO CAR-T5细胞将针对CD5阳性T-白血病/淋巴瘤细胞，但会导致对正常T细胞的毒性，这将通过在输注后具有生存优势的CD5 KO正常T细胞来减轻。将在I期临床研究中评估自体Senza 5TM CART5细胞在CD5阳性T细胞淋巴瘤患者中的效果。Chun等人最初报告了开发了一种通过CRISPR-CAS9基因编辑消除CD5表达的抗CD5 CAR-T细胞群体：CRISPR-CASp KO的CD5一致增强了CAR-T细胞的抗肿瘤活性，通过增加CAR介导的激活和增殖。 针对CD37的CAR-T细胞治疗T细胞恶性肿瘤。CD37是四跨膜蛋白超家族的一种跨膜蛋白。部分T细胞淋巴瘤在其细胞膜上表达CD37。Scarfs等人报告了以CD37为靶点的CAR-T细胞（CAR37）的开发，其中4-1BB作为共刺激域。CAR-T细胞在周围T细胞淋巴瘤模型中显示出抗原特异性激活、细胞因子产生和细胞毒性活性。在CAR-37细胞中未观察到显著的同种相残相关事件。迄今为止，唯一进行中的涉及CD37导向CAR-T细胞（NCT 04136275）的试验涉及CD37阳性血液系统恶性肿瘤的患者，包括白血病、B细胞和T细胞淋巴瘤。在初步的I期报告中，4名患者接受了CD37 CAR-T细胞治疗，其中包括1名CTCL患者，在输注后第28天实现了CR。 CD70靶向CAR-T细胞在T细胞淋巴瘤中的应用。CD70是一种II型跨膜糖蛋白，是Tnf配体家族的成员。CD70与其配体CD27相互作用。CD70表现出一些特性，使其成为某些血液系统恶性肿瘤的合适治疗靶点：CD70仅在激活的T和B细胞、NK细胞和树突状细胞上短暂表达；CD70在某些血液系统恶性肿瘤中广泛表达，包括一些B细胞淋巴瘤和系统性T细胞淋巴瘤；CD70与其配体CD27的相互作用在T和B淋巴细胞激活中诱导共刺激信号。 在患者衍生的异种移植模型中，使用抗体-药物偶联物靶向CD70在CTCL中产生了显著的抗肿瘤活性。 I期COBAL-LYM剂量递增研究评估了异体抗CD70 CAR-T细胞（CTX 130）在R/R患者中的PTCL或CTCL。CTX 130细胞是经过CRISPR/CAS9基因编辑改良的异体T淋巴细胞，以消除TCRα、MHC-I的表达，通过β2-微球蛋白破坏和CD70，然后转导含有编码抗CD70的慢病毒载体。15名T细胞淋巴瘤患者接受了CTX 130治疗；在PTCL（ORR 75%）和CTCL（ORR 67%）患者中观察到反应；29%的患者实现了CR。 T细胞受体靶向CAR-T细胞作为T淋巴瘤治疗策略。另一种针对T细胞恶性肿瘤的靶向策略基于T细胞受体β链恒定域1和2（TRBC1和TRBC2）的最终独占表达。正常T淋巴细胞包含TRBC1+和TRBC2+细胞组分，而T细胞恶性肿瘤仅限于其中之一。45靶向TRBC1的CAR-T细胞可以识别并杀死正常和恶性TRBC1+细胞，保留TRBC2+ T细胞。 最近，一项I/II期临床研究（AUTO4）的结果涉及使用TRBC1导向的自体CAR-T细胞治疗10名R/R T细胞淋巴瘤患者，采用四个平坦剂量水平。40%的患者实现了CR。最常见的治疗相关不良事件是细胞减少症（贫血和中性粒细胞减少症）；然而，30%的患者有3级或更高的不良事件，PCR观察到没有CAR-T细胞扩增。随着随访时间的延长，接受最高剂量（450x10^6）治疗的50%患者在6个月和9个月时分别保持了完全的代谢反应。 使用CAR-T细胞治疗靶向CCR4在T细胞恶性肿瘤中的应用。趋化因子受体CCR4（也称为CD194）是一种七跨膜G蛋白偶联细胞膜分子，对造血系统细胞有选择性表达：特别是，CD4+CD25+Foxp3+调节细胞、TH2和TH7 T细胞主要表达CCR4。CCR4在许多T细胞恶性肿瘤中高度表达，包括ATL、CTCL、MF和SS，是这些疾病的生化治疗靶点。因此，mogamulizumab，一种去岩藻糖化的人性化抗体，经过工程改造以发挥增强的抗体依赖性细胞毒性，靶向CCR4，已被批准用于治疗R/R CTCL、MF、SS和ATLL。 这些观察结果为开发和评估靶向CCR4的CAR-T细胞提供了强有力的理由。因此，Perera等人产生了一个慢病毒载体，用于T细胞的遗传工程，以表达一个靶向CCR4的CAR，使用来自抗人CCR4抗体的人源化可变重链和κ轻链，与mogamulizumab不同。 CCR4靶向CAR-T细胞有效地溶解了患者衍生的CTCL细胞系，并在小鼠异种移植模型的ATL中发挥了强大的抗肿瘤活性。 Watanabe等人最近探索了靶向CCR4的CAR-T细胞的开发：在这些细胞的体外扩增过程中，同种相残事件特别耗尽了Th2和Tregs，同时保留了CD8+和Th1细胞。 在扩增过程结束时，产生了一种具有针对表达CCR4的T细胞恶性肿瘤的强大抗肿瘤效力的CAR-T细胞群。 CCR9在T-ALL中的靶向。最近的一项研究表明，CCR9在超过70%的T-ALL病例中表达，包括在R/R患者中超过85%的阳性率，与正常T细胞的低阳性率（<5%）相比。51靶向CCR9的CAR-T细胞对同种相残有抵抗力，并在体外和体内都具有强大的抗白血病活性，即使在抗原密度低的情况下。这些观察结果表明，抗CCR9 CAR-T细胞可能是R/R T-ALLs潜在的有希望的治疗策略。 靶向CD2的CAR-T细胞疗法。Xiang等人报告了一种异体“通用”CD2靶向CAR-T细胞（UCART2）的开发，其中CD2抗原被删除以防止同种相残，T细胞受体被移除以防止移植物抗宿主病（GvHD）；UCART2细胞对T-ALL表现出显著的疗效，并延长了T-ALL植入的免疫缺陷小鼠的生存期。使用rhIL-7-hyFc（一种长效重组人IL-7），在原发性患者T-ALL模型中延长了UCART2的持续时间和增加了生存率。根据这些观察，建议异体抗同种相残的UCART2与rhIL7-hyFc联合使用，可能是治疗T-ALL的合适方法。 靶向CD38的CAR-T细胞疗法。最近的一项研究报告了靶向CD38抗原的CAR-T细胞的临床前活性。CD38抗原是多发性骨髓瘤和T-ALL中经过验证的肿瘤抗原。激活的T细胞上的CD38表达并未损害CD38-CAR-T细胞的扩增和体外功能。在用原发性T-ALL细胞异种移植的小鼠中，CD38-CAR-T细胞介导了延长的生存期。 结论 CAR-T细胞疗法治疗T细胞恶性肿瘤仍处于起步阶段，在其被引入这些疾病的标准治疗策略之前，还需要更多的研究。 有几个因素阻碍了CAR-T细胞技术在T细胞恶性肿瘤治疗中的成功开发：（i）肿瘤污染，与制造的CAR-T细胞产品与白血病/淋巴瘤T细胞的混合有关；（ii）T细胞再生障碍，作为不希望的靶向扩展到正常T细胞的后果；（iii）同种相残，与CAR-T细胞不仅靶向恶性T细胞，还靶向其他表达目标抗原的CAR-T细胞的细胞毒性有关。 已经开发了一些策略来消除或减轻这些限制；因此，异体CAR-T细胞绕过了CAR-T细胞与肿瘤细胞污染的问题。另一方面，已经开发了各种策略来减轻同种相残，从使用CRISPR-CAS9技术或基础编辑的基因编辑到细胞内阻断或自然选择。然而，这些策略中的一些解决了一个问题，但同时也引发了其他问题。 尽管存在这些限制，只有一些基于足够数量的T细胞恶性肿瘤患者、至少两年随访的研究，提供了初步的鼓励结果，这些结果需要在更大规模的前瞻性研究中得到确认。 未来的研究必须阐明：（i）CAR-T细胞在恶性T细胞表面要靶向的“最佳”膜抗原；（ii）自体和异体CAR-T细胞在安全性和有效性方面的比较评估；（iii）CAR-T细胞疗法单独或作为异体HSCT的桥梁的作用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。