ADO-Trastuzumab Emtansine

背 景 全球ADC药物研发和投资热度不断升级。因其良好的靶向性和明显的临床疗效，ADC已经成为抗体药物研发的前沿。随着技术的进步，ADC不仅在结构上已突破经典的抗体+连接子+小分子毒素模式，核素偶联药物、多肽偶联药物、双环肽偶联、抗体-siRNA偶联物、多靶点ADC等新型XDC药物风起泉涌；且从肿瘤治疗领域扩疆拓土到自身免疫疾病等其他创新领域。 ADC药物结构复杂多样化，体内作用及代谢过程复杂性，这些为CMC研究、临床前研究等带来多重挑战。不同的肿瘤微环境不同，靶蛋白不同，对于ADC药物来说选用何种抗体、有效载荷、连接子、连接方式等都需要进行特异性考虑。泛偶联时代，每一款偶联药物，都应该结合自身特点找准定位，形成差异化竞争策略，走创新化的研发之路，满足未被满足的临床需求。 01 ADC药物简介 抗体药物偶联物 (ADC) 是一种将高选择性的抗体  (Antibody) 和强细胞毒性的有效载荷 (Payload) 通过连接子 (Linker) 偶联而获得的药物。ADC经典有效载荷通常是有效的抗有丝分裂细胞毒素或DNA烷化剂或具有其他细胞杀伤机制的试剂。ADC结合了单抗对肿瘤细胞的靶向性以及细胞毒性药物的强大肿瘤杀伤力，且克服了单抗的细胞毒性弱和细胞毒性药物系统毒性大的问题，具有1+1>2的治疗优势。 ADC药物结构 [1] 目前，许多ADC药物已显示出治疗难治性肿瘤的活性，从而获得了众多不同适应症的批准。然而，它们的更广泛应用受到各种挑战的限制，包括毒性、预测性生物标志物等等。ADC的功效取决于抗体特异性、连接子特异性和有效载荷特异性等多种因素，每种因素都影响着ADC与肿瘤各组分及肿瘤微环境 (TME) 之间复杂的相互作用。 02 ADC药物发展史 「上下滑动了解」 鉴于有效载荷、连接子和偶联方法的改进，ADC的开发在过去十几年中取得了显著进展。特别是连接子的设计对调节ADC在体循环中的稳定性和肿瘤中的有效载荷释放效率方面起着关键作用，从而影响ADC的药代动力学 (PK)、药效和毒性等特征。 03 ADC技术变革迭代 第一代ADC药物 以靶向CD33的吉妥珠单抗 (Mylotarg™) 为代表，使用鼠源或嵌合人源化抗体，连接子不稳定，小分子毒素毒性低且是随机偶联，因而有效性不高，不足以杀死肿瘤细胞；毒素在血浆中提前释放而导致严重的毒性反应，所以毒副作用较大。 第二代ADC药物 以靶向CD30的维布妥昔单抗 (Adcetris®) 和靶向HER2 的恩美曲妥珠单抗 (Trastuzumab emtansine；T-DM1) 为代表，使用人鼠嵌合抗体、人源化单抗，采用毒性更高的细胞毒素和更稳定的连接子，抗体的靶向性更好；但药物/抗体比率 (DAR) 不均一，降低了疗效；且随机偶联造成的脱靶毒性仍继续存在。 第三代ADC药物 以靶向HER2的德曲妥珠单抗 (Trastuzumab deruxtecan；DS-8201) 为代表，使用完全人源化的抗体、高毒性小分子毒素及定点偶联技术，将不可裂解连接子升级为可裂解连接子，药物抗体比高达8，具有更好疗效，但毒副作用仍存在。在多个临床试验中发现了DS-8201有引发间质性肺炎的概率，因此被FDA黑框警告。2019年，DS8201获得FDA批准用于HER2阳性乳腺癌的后线治疗。第三代ADC药物 DS-8201给肿瘤治疗领域，尤其是靶向HER2低表达/HER2突变的肿瘤治疗带来了革命性的突破。 Trastuzumab deruxtecan (DS-8201) 结构 [2] 第四代ADC药物 要解决前面3代ADC的耐药问题，就需要新的ADC药物具备更大的治疗窗。比如从抗体、有效载荷、连接子、偶联技术等多方面进行优化。具备更多新技术加持的第四代ADC，再结合适当的转化医学研究势必会为肿瘤研究带来更多的突破。 04 ADC角逐赛 目前全球共有15款ADC药物获批上市，用于治疗血液恶性肿瘤和实体瘤。此外，超过400种ADC药物正处于不同的研发阶段。 靶点布局 较为热门的靶点包括：CD22、HER2、EGFR、Trop-2、BCMA、Nectin-4等。 适应症布局 以肿瘤为主，其次是自身免疫性疾病、细菌感染、湿性年龄相关性黄斑变性等。肿瘤主要为乳腺癌、肺癌、胃癌等。 研发进度 目前绝大多数的研发项目均处于早期阶段。主要集中在临床前期和临床Ⅰ期。 05 ADC作用机制及药物设计要素 ADC的作用机制复杂，通常需要药物内化，然后进行细胞内处理和有效载荷释放。 ADC作用的典型模型假设如下：抗体与目标抗原的结合，随后内化，经内体运输进入溶酶体，在溶酶体中ADC的连接子或抗体部分降解并释放出有效载荷，有效载荷则进一步发挥作用产生细胞毒性进而杀死肿瘤细胞。但实际情况更为复杂，并且ADC之间存在明显差异。 ADC药物作用机制 [1] 靶抗原（Target Antigen） 靶抗原的选择是ADC药物设计的关键一环。需满足： 1. 特异性，肿瘤细胞高表达、正常细胞低表达或不表达； 2. 靶抗原需为肿瘤细胞表面抗原； 3. 高效诱导内在化过程等。 理论上ADC药物可在肿瘤细胞外释放毒素，不经过细胞内在化，通过“旁观者效应”对肿瘤细胞造成杀伤。但实际上目前大部分ADC药物疗效的实现均是以内在化后的药物释放为基础。因此，ADC药物中的抗体和肿瘤细胞表面抗原结合后，ADC-抗原复合物需能有效诱导内在化过程，进入肿瘤细胞内，并通过适当的细胞内转运和降解过程，实现小分子药物的有效释放。 通过细胞免疫荧光Confocal检测ADC内在化 抗体（Antibody） 基于抗体的药物出现，使得肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、良性血液病和骨骼疾病等多种疾病的治疗取得了实质性进展。抗体片段和双特异性抗体为创新疗法提供了很有潜力的治疗前景。抗体需要满足高特异性、强靶点结合能力、低免疫原性、低交叉反应活性，以达到肿瘤细胞对ADC药物更高效的摄入和ADC药物在血清中更长的半衰期。 免疫球蛋白G (IgG) 是ADC中使用的主要抗体骨架。所以，临床和临床前研究的ADC药物通常选择IgG作为靶向目的抗原的抗体。IgGs可分为四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 。其中，IgG1由于能够较好地平衡长血液半衰期和强免疫激活的关系，并且有着较高的自然丰度，是被研究和采用最多的ADC抗体。IgG4由于较低的免疫激活效应也经常被采用在一些对免疫原性反应要求较高的ADC药物设计中。 不同IgG对比 [3] 有效载荷（Payload） 早期的ADC药物设计旨在携带具有已知抗肿瘤活性的传统化疗药物，例如甲氨蝶呤、多柔比星或长春花生物碱。然而，这些ADC并不比它们的小分子细胞毒性药物更有效，有时需要极高的活性剂量，这反而增加了毒性。 数据表明，只有很小一部分肿瘤靶向的抗体的给药剂量到达肿瘤组织，这意味着需要具有更大细胞毒性的有效载荷才能实现治疗效果。对携带高效化疗药物（如澳瑞他汀类、卡奇霉素类、美登素类和喜树碱类似物）的ADC进行实验，这些高效化疗药物在亚纳摩尔浓度下可能具有细胞毒性。 澳瑞他汀包括单甲基澳瑞他汀 E (MMAE) 和单甲基澳瑞他汀 F (MMAF)，是微管去稳定剂。卡奇霉素，如奥佐米星，是一种DNA结合化合物，可导致双链DNA断裂。美登素类化合物，例如DM1，来源于美登素，并与微管蛋白结合，从而破坏微管动态不稳定性。喜树碱类似物，包括依喜替康衍生物DXd和伊立替康代谢物SN-38，可抑制拓扑异构酶 I (TOPO1)，导致DNA断裂。 选择小分子药物时，首先要求小分子药物IC50值低至纳摩尔级别乃至皮摩尔级别。除需要较低的IC50值以外，通常还需要小分子药物包括以下几点： 1. 在与抗体偶联后不易引起ADC药物发生聚集，以保证在体内拥有较长的循环时间； 2. 本身以及形成后的ADC药物需具有较低的免疫原性； 3. 在水溶液（血液）中足够稳定且具有合适的反应位点通过连接子与抗体偶联，偶联后仍然能够保证其生物活性；4. 可以通过相对具有经济效益的过程合成。 ADC药物的有效载荷 [3] 连接子（Linker） 自ADC开发早期以来，连接子技术取得了长足的进步。理想的连接子应在血液循环中十分稳定，以避免小分子毒素提前释放损伤正常的组织或细胞。同时，在肿瘤细胞内需能快速且有效地释放有效载荷。 连接子的设计具有双重目的： 1. 确保当药物在血浆中循环时，细胞毒性有效载荷仍然牢固地附着在抗体部分上。在血浆中不稳定的连接子可能会过早释放有效载荷，导致过度的全身毒性和肿瘤部位抗原接合时有效载荷的传递减少。考虑到许多ADC携带具有毒性特征的高效细胞毒性有效载荷，这使得它们不适合全身给药，因此这个问题尤其重要。 2. 确保有效载荷在肿瘤内有效释放，尤其是在癌细胞内。不能正确传递其有效载荷的ADC则失去了相对于裸抗和传统细胞毒性药物的独特优势。 连接子主要有两种类型：可裂解型 (cleavable) 和不可裂解型 (non-cleavable)。连接子需要考虑稳定性和释放效率的平衡。不可裂解连接子更具稳定性优势，可裂解连接子释放效率更高。可裂解型的连接子又可以分为：酸可裂解的、可还原的和蛋白酶可裂解的。不可裂解连接子的实例包括：硫醚连接子（如在T-DM1中使用）和基于马来酰亚胺的连接子（如在 Belantamab mafodotin 中使用）。在实际使用中，可裂解连接子在循环中表现出不同程度的稳定性，并且会随着时间在血浆中降解。相比之下，不可裂解的连接子在血浆中往往更稳定，但依赖于整个抗体-连接子构建体的溶酶体降解来释放其有效载荷，通常导致有效载荷上带电氨基酸的保留，这可能会影响其作用或细胞通透性。 ADC药物的连接子 [3] 偶联技术   偶联技术通过连接子将抗体和有效载荷连接到一起，涉及化学反应、抗体修饰与改造等相关技术。 ADC药物所采用的偶联技术与其最终的药物抗体比率（Drug to Antibody Ratio；DAR）密切相关，而DAR的数值及其分布会显著影响ADC药物性质。 DAR是连接到每个mAb的有效载荷部分的平均数量，可通过HPLC-MS等测试方法获得。DAR对药物药理学和活性有影响，DAR值对ADC药物研发后期阶段是必不可少的。ADC药物在体内循环过程中被肿瘤细胞摄入数量有限，因此通常较高的DAR有利于提高效力。然而ADC药物中采用的小分子药物有着较强的疏水性，DAR值过高时会引起ADC药物聚集，导致在体内循环半衰期减少以及毒副作用提高，这就导致过高的DAR不可取，临床前和临床用ADC一般DAR值在2-8范围。 为获得更高DAR以及均一性的ADC药物，可通过基因工程对抗体进行改造使抗体具有数量固定并且高效的反应位点用于偶联小分子药物。 药物抗体比 (DAR) [4] 06 ADC工艺开发和解决策略 ADC生产制备流程复杂，整体工艺与质控体系研发能力非常关键。ADC药物生产制造流程包括抗体生产、细胞毒药物/连接子生产、ADC原料药和制剂生产三大模块，均须进行工艺开发与验证，还须对所用工程细胞、起始原料及试剂制定合理的质量控制要求。 偶联生产用中间体的质量控制较为灵活，考验整体工艺与质控体系研发能力。由于抗体和细胞毒素有着不同的生物物理化学性质，例如分子大小以及疏水性等差异，ADC药物生产面临着巨大的挑战。工艺表征研究对后续工艺性能确认批次具有非常重要的导意义。 07 ADC药物CMC研究 ADC药物的CMC研究主要包括4部分：1. 抗体；2. 载荷-连接子中间体；3. ADC原料药；4. 制剂部分。 同时，还需要引入一些特殊的质量控制指标。如药物与抗体的比率，载荷与抗体的连接位点以及ADC药物中的药物负载分布等。此外，ADC中游离的载荷和抗体需要进行量化控制，载荷连接抗体后对抗体和靶点结合效力的影响以及ADC在人体血浆中的稳定性也需要进行研究。 08 ADC药物临床前研究 当下阶段，ADC对临床肿瘤的治疗格局已经产生了深远影响，在追赶研发浪潮的同时，也需审慎关注研发技术难关。由于ADC的复杂性和多样性，以及生物样本中释放的细胞毒药物含量较低等原因，对药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 表征提出了独特的挑战。此外，在安全性评价中生物分析方法的选择和检测的准确性也是考量要素。 总结 近年来，ADC药物领域发展很快，越来越多ADC药物获批激发了医药人对ADC的研发热情。无论是欣欣向荣的Biotech们还是根深叶茂的Biopharma们，都需要找到自己在该赛道的最佳位置，关注自身优势，差异化发展核心竞争力，推动更多更高效更低副作用的ADC药物获批上市。 随着抗体的发展、连接子不断的优化、高活性有效的发掘和偶联技术的不断完善，高效低毒的ADC药物将会不断涌现。如果能够更好地理解和利用ADC与肿瘤相互作用的微妙之处，则ADC技术的真正潜力会更好地发挥和更广泛地应用，最终可能对肿瘤患者的治疗产生变革性影响。 参考资料： [1] Kyoji Tsuchikama, et al. Antibody-drug conjugates: recent advances in conjugation and linker chemistries. Protein Cell. 2018Jan;9(1):33-46. [2] Ibrahim Azar, et al. Spotlight on Trastuzumab Deruxtecan (DS-8201, T-DXd) for HER2 Mutation Positive Non-Small Cell Lung Cancer. Lung Cancer (Auckl). 2021 Oct 7; 12:103-114. doi: 10.2147/LCTT.S307324.  [3] Joshua Z Drago, et al. Unlocking the potential of antibody-drug conjugates for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jun;18(6):327-344. [4] Dan Lu, et al. Semi-mechanistic Multiple-Analyte Pharmacokinetic Model for an Antibody-Drug-Conjugate in Cynomolgus Monkeys. Pharm Res. 2015Jun;32(6):1907-19. 服务平台推荐 ＞＞ 点击阅读 美迪西ADC药物研发服务平台 ＞＞ 点击阅读 美迪西PROTAC药物研发服务平台 ＞＞ 点击阅读 美迪西抗体药物研发服务平台 ＞＞ 点击阅读 美迪西细胞与基因治疗药物研发服务平台 ＞＞ 点击阅读 关于美迪西 美迪西（股票代码：688202.SH）成立于2004年，总部位于上海，致力于为全球制药企业、研究机构及科研工作者提供全方位的临床前新药研究服务。美迪西的一站式综合服务以强有力的项目管理和更高效、高性价比的研发服务助力客户加速新药研发进程，服务涵盖医药临床前新药研究的全过程，包括药物发现、药学研究及临床前研究。至2024年6月底，美迪西已为全球超2000家客户提供药物研发服务，参与研发完成的新药及仿制药项目已有490件IND获批临床，与国内外优质客户共同成长。美迪西将继续立足全球视野，聚力中国创新，为人类健康贡献力量！

关注小药说药，一起成长！ 前言 抗体偶联药物(ADC)是由靶向特异性抗原的单克隆抗体与小分子细胞毒性药物通过连接子链接而成,兼具传统小分子化疗的强大杀伤效应及抗体药物的肿瘤靶向性。ADC由三个主要部分组成：负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体，负责杀死癌细胞的药物有效载荷，以及连接抗体和有效载荷的连接子。 ADC对抗原的识别导致ADC通过内吞途径进入细胞内，通过溶酶体降解后，有效载荷以生物活性形式释放并发挥作用，导致癌细胞死亡。细胞内有效载荷的数量由每个细胞表面抗原的数量、每个ADC的药物有效载荷分子的数量（也称为药物抗体比率，DAR）以及抗原返回细胞表面所需的时间决定。有效载荷可能在癌细胞死亡和降解后逃逸，也可能从胞浆中透膜而出。这种释放的后果可能是有益的（也称为旁观者效应），也可能是有害的，导致全身毒性。 ADC中有几个变化的部分，成功显然没有通用的公式。因此，如何选择合适的抗体、在何处以及如何将连接子连接到抗体、每个抗体连接多少药物分子、如何连接连接子和药物有效载荷、最佳药物有效载荷是什么样的？这些问题需要我们深刻理解ADC各个组分的生物学和化学特性，才能获得满意的答案。 微管破坏药物 金盏花素 Auristatins是ADC中使用的重要有效载荷，最著名的家族成员MMAE存在于两种上市药物Adcetris和Polivy中。目前，超过10种以金盏花素（如MMAE）或一甲基金盏花素F（MMAF）为有效载荷的ADC正在进行临床试验。 上图描述了auristatine及其常用的连接位点。金盏花素的构效关系（SAR）已被广泛研究，主要集中在末端亚单位：P1（N-末端）和P5（C-末端），最常见的方法是在P1上引入氨基甲酸酯功能。 2015年，西雅图遗传学的研究人员将ADC有效载荷的范围扩大到包括叔胺，特别是N-二甲基auristatine，首次通过铵键将药物与单克隆抗体结合。所得ADCs在生理条件下稳定，体内外活性高，免疫特异性强。这些结果扩大了ADC可用于靶向给药的药物种类。 最近，Agensys公司通过调节中心亚基P2-P3-P4，将叠氮化物基团引入P2和P4亚基，在与蛋白酶可裂解的连接子偶联后，产生了在体外和体内效力提高的亲水性衍生物，这为连接子的连接提供了新途径。 一般来说，在同时含有胺和醇反应的auristatin中，首选的连接点是胺通过氨基甲酸酯键偶联。西雅图遗传学开发了一种新的策略，将含醇的有效载荷与亚甲基烷氧基氨基甲酸酯（MAC）偶联。为了稳定MAC键，碱性基团和吸电子基团都靠近氨基键，结果表明，该偶联物在生理条件下是稳定的，具有很高的效价，并且在体内外都具有免疫特异性。 此外，乌普萨拉大学的研究人员还开发了AZASTATIN，作为一类新的强有力的auristatin衍生物，包含一个中心胺侧链的抗体结合位点。他们的研究结果证实，这些auristatin衍生物是一类新的细胞毒性有效载荷，适合ADC开发。 美登素衍生物（DM2，DM4） 美坦辛是一种非常有效的微管组装抑制剂，可诱导细胞的有丝分裂停止。但是这种结构很难共轭，因为它没有反应性官能团，为了克服这个问题，一系列含有SMe基团的非常有效的衍生物被创造出来。这一类分子的第一个例子是DM1和DM4，它们带有甲硫丙酰基而不是天然N-乙酰基。 从有效载荷DM1和DM4中，通过使用二硫键与连接子偶联。稳定的二硫键连接子在血液循环中表现出良好的稳定性，同时在细胞内保持有效的分裂。 此外，几种基于maytansine的ADC利用相同的二级羟基作为附着点，并在大多数情况下携带转谷氨酰胺酶生物结合的连接子。例如，一种基于Daratumumab的ADC被证明能向CD38过度表达的癌细胞特异性地传递DM4。最近ImmunoGen开发了一种新型的ADC，它包含一种含硫的maytansinoid，通过一种高度稳定的三肽连接体连接到抗体上，附着点与上述羟基相同。与先前的美登素ADC相比，增加连接物中亚甲基单元的数量增加了旁观者杀伤活性，并提高了小鼠体内的疗效。在类似的方法中，保持核心大环不变，Regeneron和Abzena的研究人员研究了N-甲基丙氨酸氮取代的影响，也改变了大环上侧链的长度，以及通过伯胺和仲胺连接的连接子。 微管溶素 Tubulysins是微管聚合的有效抑制剂，可导致分裂细胞的细胞骨架迅速解体，并导致细胞凋亡。它们是一个天然存在的四肽家族，含有Mep、Ile、Tuv和Tut，R3=OH或Tup，R3=H。 利用Tubulysins作为ADC有效载荷，其广泛的附着点已被充分开发。这种结构中一个明显的附着点是Tut或Tup模块的羧酸，如Endocyte的EC1428，其中羧酸通过酰肼部分连接到连接子。Oncomatryx公司也采用了同样的方法，以同样的方式安装了可切割的PABAValCit马来酰亚胺连接子。 阿斯利康、百时美施贵宝和辉瑞使用的另一种方法依赖于Tup或Tut中苯环的衍生化。 连接子与Mep基团的连接也得到了广泛的研究。Ingenica研究人员报告说，去甲基Mep类似物保留了强大的细胞毒性活性，可被视为有价值的有效载荷，允许在仲胺上引入不可切割的马来酰亚胺己基连接子。 Oncomatryx的研究表明，当Mep被另一个拥有仲胺的基序取代时，通过氨基甲酸酯键引入可切割的连接体是产生ADC的有效途径。特别有趣的是，基因泰克关于通过季铵基团将连接子连接到含叔胺的有效载荷上。在有效载荷上引入mc-Val-Cit-PABA连接子导致更多亲水性结合物并改善了血液中的稳定性。西雅图遗传学也采用了同样的方法，通过过度表达葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸连接子也可以改善亲水性和选择性的细胞内切割通过癌细胞中过表达的β-葡萄糖醛酸酶。 隐粘菌素 隐粘菌素（Cryptomycins，CR）是一个具有抗肿瘤活性的六元大环二肽家族。已有的临床试验的结果表明，在达到治疗效果所需的剂量下，其毒性水平是不可接受的。 几个小组尝试将CR用于ADC，但是由于在CR中缺少偶联位点，目前，有两种不同的方法通过引入其它基团，使得能够连接ADC的连接子。一种是由基因泰克的研究人员将苯转化为苄胺以产生有效的有效载荷，这种有效载荷适合通过氨基甲酸酯键连接。在第二种方法中，四川大学的研究人员利用了隐霉素-52的前药形式（CR55），它可以在生理条件下重新环化为CR52。  抗有丝分裂EG5抑制剂 纺锤体驱动蛋白（KSP，也称为Eg5或KIF11）是一种ATP依赖性运动蛋白，参与细胞周期中心体的分离。因此，用KSP抑制剂（KSPis）阻断有丝分裂中的这一重要事件可产生抗肿瘤效力。 拜耳发现了一个新的吡咯亚类的KSPis，他们研究了该分子不同位置与保持对KSP强亲和力的连接子的连接兼容性。 同样，诺华的研究人员使用含咪唑的KSP抑制剂作为Eg5 ADC。利用伯醇或仲酰胺部分，他们安装了带有马来酰亚胺端基的不可裂解连接子。当与靶向HER2和c-KIT的抗体偶联时，得到的ADC显示出优于Kadcyla的体内疗效。 DNA损伤药物 吡咯苯并氮卓类和吲哚氯苯并氮卓类 吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮杂卓（PBD）是一类具有抗肿瘤活性的天然产物。它们的作用方式是在DNA的小凹槽中进行选择性烷基化，其中鸟嘌呤的N2与PBD上的亲电N10/C11亚胺形成共价键。 西雅图遗传学使用SGD1882的苯胺作为附着点，模仿可切割连接子中常用的PAB单元，释放自由的PBD有效载荷。StemCentrx与Spirogen合作，利用PBD的N-10位置连接一个氨基甲酸酯的连接子。同样的氨基甲酸酯键也被Immunogen用于结构相似的吲哚氯苯偶氮卓二聚体（IBD）有效载荷。他们还报道了同一类IBD的不同方法，其中一个取代的苯环被用作两个IBD单体的C8/C8'位置之间的连接物。 以类似的方法，Spirogen和Genentech设计了一种碘苯连接的PBD，允许在过渡金属催化反应中引入不同的连接子。通过使用Sonogashira偶联、Buchwald–Hartwig偶联或叠氮化物-炔烃点击反应，分别获得炔烃、哌嗪或三唑连接的连接子有效载荷共轭物。 杜卡霉素 杜卡霉素是一种强大的细胞毒性物质，通过其高活性的环丙烷环与DNA的小凹槽结合，并在N3位置烷基化腺嘌呤。非环化的，卤甲基形式的杜卡霉素细胞毒性活性显著降低。由于分子中苯酚基团可作为内消旋体激活剂，从而形成亲电环丙烷，因此杜卡霉素ADC开发中的连接策略集中于酚官能团的连接子连接。 在Synthon开发的SYD985中，苯酚基团是通过双氨基甲酸酯连接连接子与Mc-val-cit-PABC有效载荷的位置。组织蛋白酶B裂解后，游离苯酚促进分子内重排成亲电环丙基形式。Medarex采用了一种不同的方法，通过分子非烷基化部分的芳香胺连接连接子，并用N-甲基哌嗪氨基甲酸酯部分掩蔽苯酚前药。在体内，苯酚将被释放，随后活性环丙烷将在羧酸酯酶的作用下形成。 喜树碱 喜树碱（CPT）及其衍生物是拓扑异构酶I抑制剂的经典例子。它们稳定了拓扑异构酶诱导的DNA单链断裂，当三元DNA-TOP1-抑制剂复合物遇到复制叉时，DNA发生双链断裂。天然喜树碱是一种五环结构，其极低的溶解性阻止了其作为癌症治疗药物的广泛应用。其水溶性前药伊立替康获得了转移性结直肠癌的上市许可。SN-38是伊立新坦的活性代谢物，通过人体肝脏羧酸酯酶的作用在体内生成，其可通过打开内酯环而失活。 Immunomedics建立了两种不同的策略，通过其羟基部分结合SN-38。在一个例子中，连接子通过反应性更强的C-10苯酚基团连接，从而产生稳定的氨基甲酸酯键，而在另一个例子中，通过C-20羟基，同时稳定内酯形式，而C-20羟基对体内效力至关重要。 另一种适合ADC的非常有效的药物是依沙替康（DDX-8951f）。这种喜树碱类似物在其环己烷环上具有胺取代基，桥接7和9位。依沙替康的氨基有助于其水溶性，而环己烷环赋予的刚性被认为有利于活性内酯形式与非活性水解羟基酸的平衡。氨基羟基乙酰化生成DXd（1），而4-氨基丁酰化生成DXd（2），这两种化合物都保留了依沙替康的生物活性。 悬垂的羟基和氨基是明显的附着点，可使用酶可切割的Gly-Gly-Phe-Gly四肽连接子连接有效载荷。与抗HER2抗体偶联产生的ADC在临床环境中显示出对抗HER2表达癌症的巨大潜力。 DXd的环己胺环虽然被认为稳定了生物活性内酯形式，但它携带了一个手性中心，使合成工作和SAR研究复杂化。为了克服这一困难，Immunogen的研究人员研究了一组新的喜树碱类似物，这些类似物能够与单抗偶联。并且在这里，这个环被打开，额外的手性中心被消除。从一种常见的中间产物开始，研究人员尝试了三种类型的结构，并随后使用不同的聚苯胺连接子连接有效载荷。当与抗人表皮生长因子受体（HuEGFR）的抗体偶联时，产生的ADC对EGFR阳性的HSC-2肿瘤异种移植模型有效。 卡奇霉素 卡奇霉素是一类被广泛研究的烯二炔类抗生素，其结构和作用机制特别有趣和复杂，使其成为ADC有效载荷领域的一类抗生素。在ADC中连接calicheamicin的策略以市场上的adc Mylotarg为例，还有Besponsa。 有效载荷的释放分两步进行：在酸性细胞内环境中对腙进行敏感的裂解，然后通过细胞内谷胱甘肽还原二硫键。释放的硫醇发生分子内1，4-加成的烯酮触发伯格曼环化反应，产生一个二自由基。这种活性中间体能够从脱氧核糖骨架中提取氢原子，产生双链DNA断裂，进而导致细胞死亡。 最近，从不列颠哥伦比亚地衣中发现的链霉菌中分离出一种新的烯二炔类天然产物，称为uncialamycin。这种结构通过全合成得到证实，从那时起，一些高效的合成类似物被制备成ADC的潜在有效载荷。 BMS的研究人员表明，由于在各种肽偶联条件下反应活性较低，因此，Uncialamycin的仲胺不是一个合适的连接点。研究人员合成了一种类似物，其中一个氨基直接引入到芳香环上，但这种苯胺的反应性也太弱，不能作为连接子引入的基团。另一方面，使用氨基乙基延伸物安装脂肪族胺，为连接子提供了合适的连接点。 从后一个有效载荷中，他们使用蛋白酶可切割的二肽和不可切割的连接子制备前体。CD70-ADC具有可切割连接体，对肾癌细胞株具有高度特异性的细胞毒活性，而相应的不可切割ADC在同一细胞株上不具有活性。 最近，为了继续这项工作，BMS的研究人员在设计的、高效的、化学稳定的uncialamycin类似物中使用苯酚基作为附着点。使用新开发的苯酚烷基化，在有效载荷的苯酚基团上添加了一个经典的可裂解连接子。将产生的有效载荷与抗体偶联，其在体外和体内均显示抗原特异性抗肿瘤活性。 创新药物 凋亡诱导剂（Bcl-xL抑制剂） 抗凋亡Bcl-2家族成员（包括Bcl-xL）的过度表达是癌细胞获得凋亡抵抗的机制之一。能够阻断Bcl-xL上BH3结合域的药物可以触发癌细胞凋亡。2017年，AbbVie首次以ADC的形式展示了BcL-xL抑制剂的有效载荷，其靶向表达EGFR的特定细胞或组织。有趣的是，研究人员在有效载荷上使用了三个不同的连接点来连接可切割的连接子。氨基烷基延伸的核心修饰用于在需要时建立合适的连接位点。 泰兰司他丁及其类似物 靶向剪接体是一种参与mRNA加工的大型核糖核蛋白复合物，为靶向癌症治疗提供了一种有希望的治疗选择。有几种天然产物能够通过与不同的剪接体亚单位结合来抑制RNA剪接。最具代表性的是thailanstatin A，它可以与剪接体的SF3b亚单位结合，从而阻止RNA剪接。 Thailanstatin A缺乏一个适合连接连接子的基团。为了解决这个问题，将羧酸与乙二胺偶联以引入含有胺的间隔基，该间隔基通常用于连接子的安装。 将这种天然产物用于ADC的另一个困难是存在多种反应性功能。例如，中心核中的二烯可以通过Diels–Alder反应与用于生物结合的马来酰亚胺部分反应。这个问题是通过使用另一个共轭部分，卤代乙酰胺来解决的。结合这两种修饰并包含可切割连接子的ADC首次在专利文献中报道，并且声称它们在几个表达HER2的细胞系中具有适度的活性。 最近，辉瑞报告说，羧酸直接与抗体的有效表面赖氨酸（无连接子偶联）结合导致迄今为止最有效的Thailanstatin ADC。这些赖氨酸偶联物的活性与药物负载有关，而其他有效载荷类通常没有观察到这种特性。ADCs在胃癌异种移植模型中显示出良好的作用。 鹅膏毒素  在ADC技术领域，使用类似amatoxins的转录抑制剂是一种相对较新的方法。九种天然存在的amatoxin衍生物具有相同的骨架结构，一个由八个L-构型氨基酸组成的大环，通过亚砜部分连接在色氨酸和半胱氨酸残基之间。amatoxins的三个侧链是羟基化的，OH基团具有良好的水溶性并与目标分子结合。两种肽，α-鹅膏糖蛋白和β-鹅膏毒素，占所有毒素的90%。 在amatoxins上共使用过三个附着点产生ADC。第一次尝试是将β-鹅膏毒素的羧基偶联到IgG上赖氨酸的氨基，这种连接具有良好的血浆稳定性和高细胞毒性，但这种生物偶联的产率很低。二氢异亮氨酸的羟基也被认为是一个连接点，引入谷胱甘肽作为连接子，然后通过赖氨酸结合，可获得体外细胞毒性和体内抗肿瘤活性优异的ADC，但不幸的是，由于血清羧酸酯酶裂解连接子，导致其循环稳定性差。第三种方法，附着于色氨酸的6-羟基代表了目前的标准程序，苯酚与各种连接子的醚化导致了高度稳定和有效的ADC。由于鹅膏毒素其它氨基酸要么不具化学活性，要么是与RNA聚合酶II结合的关键，因此不能将其它的鹅膏毒素氨基酸（即羟脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和半胱氨酸）用于偶联。 基于amanitin的代表性的ADC为HDP-101。有效载荷本身是一种合成的金刚烷醇衍生物，优化了稳定性。与天然天麻素相比，两个差异是色氨酸中没有6′-OH，硫醚链取代亚砜。通过天冬氨酸侧链上酰胺的形成，引入组织蛋白酶B-裂解连接子。 最近，Park及其合作者为含苯酚的有效载荷设计了一种新的连接基序（OHPAS）。它是一种二芳基硫酸盐，一个芳基部分来自有效载荷，另一个来自连接基序的潜在苯酚基团。将该技术应用于曲妥珠单抗ADC中的a-鹅膏毒素，在体外和体内表现出强大的细胞毒性。 烟酰胺磷酸核糖转移酶 烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）是一种负责将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸的酶，其抑制剂在各种临床前和临床研究中显示出有效性，但其临床应用受到靶向毒性和剂量限制性毒性的限制，如血小板减少和胃肠道不良反应。 诺华公司的研究人员在NAMPT抑制剂有效载荷中的苯环对位中引入哌嗪部分，确定了合适的连接子附着点。这种分子在c-Kit和HER2表达细胞系上表现出纳摩尔水平的效力，并且耐受性良好，在体内表现出靶向依赖性。 卡马霉素 从库拉索菌中分离得到两种新的蛋白酶抑制剂，卡马霉素A和卡马霉素B。两者都具有亮氨酸衍生的α,β-环氧酮弹头直接连接到甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜。他们被发现能抑制酿酒酵母20S蛋白酶β5亚单位活性（糜蛋白酶样活性）。此外，它们对肺癌和结肠癌细胞株具有很强的细胞毒性。 然而，由于它们的高效价，它们的选择性较差，经常表现出毒副作用。因此，剧毒的卡马霉素衍生物适合作为ADC的弹头，可以保持所需的效力，并获得更好的耐受性。所设计的类似物均在P2位置并入砜甲硫氨酸衍生物（如卡马霉素B），而不是卡马霉素A中的亚砜甲硫氨酸，因为这消除了亚砜基立体异构体混合物产生的结构复杂性。  第一代类似物在P4末端含有胺基，不幸的是，这个附着点并不合适，因为有效载荷显示细胞毒性活性降低。第二代卡马霉素类似物在P2侧链上含有一个胺基，当短乙基氨基链延伸磺酰基时，效果最好。在第三代类似物中，芳基连接砜和胺，因此降低了它的碱性。第二代和第三代有效载荷都显示出强大的体外活性，并用可切割或不可切割的连接子连接。不幸的是，没有一种ADC对受试癌细胞系表现出比曲妥珠单抗更高的细胞杀伤能力。 参考文献： 1.The Chemistry Behind ADCs. Pharmaceuticals (Basel). 2021 May; 14(5): 442. 公众号内回复“疫苗篇”或扫描下方图片中的二维码免费下载《小药说药疫苗篇》的PDF格式电子书！ 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