A Prospective, Single - Arm Clinical Study on the Safety and Efficacy of Early Second Infusion of CD19 CAR - T Based on ctDNA Monitoring in the Treatment of Relapsed/Refractory Large B - Cell Lymphoma

The goal of this clinical trial is to evaluate the efficacy and safety of early secondary infusion of CD19 CAR T-cell therapy in adults with relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), guided by ctDNA monitoring. The main questions it aims to answer are:
1. Efficacy: Does early secondary CAR-T infusion improve the 3-month complete remission (CR) rate and long-term survival outcomes (e.g., 1-year PFS, OS)?
2. Safety: What are the adverse events associated with secondary CAR-T infusion, such as cytokine release syndrome (CRS), immune effector cell-associated neurotoxicity (ICANS), and infections?
This is a single-arm, single-center, prospective study. All participants will receive:
* Leukapheresis to collect T cells for CAR-T manufacturing.
* Preconditioning chemotherapy (fludarabine and cyclophosphamide) to prepare the body for CAR-T infusion.
* Two CD19 CAR-T infusions: The first infusion (2×10⁶ cells/kg) followed by a second infusion (same dose) if ctDNA remains positive when PET/CT shows CR or PET/CT shows PR within 60 days post-first infusion.
Participants will undergo:
* Frequent hospital monitoring for ≥14 days post-infusion to manage potential toxicities.
* Regular follow-ups (e.g., blood tests, ctDNA analysis, PET/CT scans) at scheduled intervals up to 12 months.
* Continuous safety assessments, including CRS grading, neurological evaluations, and infection monitoring.

开始日期2027-02-01

申办/合作机构-

NCT07725406

/ Not yet recruiting临床1期IIT

A Phase Ib, Dose-Escalation Study of Augmented Lymphodepletion and CAR T-cell Priming With Low-dose Total Body Irradiation in Patients With Relapsed or Refractory Diffuse Large B-cell Lymphomas and Multiple Myeloma Receiving Treatment With Commercial CD19 or BCMA-directed CAR T-cell Therapies

This is a clinical trial to evaluate the safety of combining CAR T-cell therapy with low-dose total body irradiation (LD-TBI) in patients with previously treated large B-cell lymphoma (LBCL) or multiple myeloma (MM). The investigators' hypothesis is that the combination will make the immune system more active in fighting cancer by increasing the display of antigens and activating pathways that lead to cell death, including death receptors like FAS and TRAIL2. This approach is expected to help the CAR T cells grow and last longer, leading to stronger anti-tumor effects and more cancer cell deaths. Participants will receive LDTBI treatment before their CAR T cell therapy and will be followed up for 2 years.

开始日期2026-08-01

申办/合作机构

Weill Medical College of Cornell University

NCT07606937

/ Recruiting早期临床1期

A Single-arm, Multicenter Clinical Study Evaluating the Efficacy and Safety of Axicabtagene Ciloleucel Injection Manufactured by an Automated Process in Patients With Relapsed/Refractory Large B-cell Lymphoma.

This study is a single-arm, multicenter, open-label clinical study evaluating the efficacy and safety of axicabtagene ciloleucel injection manufactured by an automated cell preparation process in adult subjects with relapsed or refractory large B-cell lymphoma (r/r LBCL) as second-line therapy.

开始日期2026-06-12

申办/合作机构-

100 项与阿基仑赛相关的临床结果

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100 项与阿基仑赛相关的转化医学

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100 项与阿基仑赛相关的专利（医药）

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689

项与阿基仑赛相关的文献（医药）

2026-08-11·Blood Advances

Impact of fludarabine exposure on CAR T-cell outcomes in patients with large B-cell lymphoma

Article

作者: Miarons, Marta ; Varela-González-Aller, Javier ; Feijoo, Samantha ; Valdivia, Carolina ; Farriols-Danes, Anna ; Barba, Pere ; Alonso-Martínez, Carla ; Guerra-González, María ; Carreras-Soler, Maria-Josep ; Bosch, Francesc ; Sánchez-Salinas, Mario Andrés ; Navarro, Víctor ; Rivera, Lucas ; Carpio, Cecilia ; Troconiz, Iñaki ; Rivas-Delgado, Alfredo ; Iacoboni, Gloria

Abstract:

The impact of fludarabine pharmacokinetics (PK) on chimeric antigen receptor (CAR) T-cell outcomes is not fully elucidated. We hypothesized that in patients with relapsed/refractory (R/R) large B-cell lymphoma (LBCL), measured fludarabine exposure during lymphodepletion would correlate with CAR T-cell results. We conducted a prospective, single-center study including patients with R/R LBCL treated with commercial, CD19-targeted CAR T-cell products. Up to 7 plasma samples per patient were collected at predefined intervals during lymphodepletion. Fludarabine exposure (area under the curve [AUC]) was estimated using a population PK model. An iterative cubic spline approach identified optimal AUC exposure ranges specific to each CAR T-cell product. The primary end point was progression-free survival (PFS). Among 54 patients with a median follow-up of 24.5 months, the median fludarabine AUC was 18.12 mg·h/L (interquartile range, 14.56-20.55). Optimal exposure windows were 17.5 to 21.5 mg·h/L for axicabtagene ciloleucel (axi-cel) and 14.0 to 18.0 mg·h/L for tisagenlecleucel, with 24 patients (44%) inside these ranges. Median PFS after CAR T-cell infusion was not reached vs 13.3 months in the optimal vs other cohort (P = .03). In the multivariable analysis, optimal exposure remained independently associated with improved PFS (P = .03), together with axi-cel treatment (P = .03). CAR T-cell expansion and rates of any grade cytokine release syndrome, immune effector cell–associated neurotoxicity syndrome, and hematotoxicity were similar between groups. In conclusion, the prospective measurement of fludarabine exposure identified an optimal AUC window associated with prolonged PFS in patients with R/R LBCL receiving CAR T-cell therapy. These findings support the integration of PK-guided fludarabine dosing to enhance therapeutic outcomes.

2026-08-04·Cancer Immunology Research

Low-Strength Type I Interferon Signaling Promotes CAR T-cell Treatment Efficacy

Article

作者: Zhang, Wenbo ; Aboelella, Nada S. ; Xie, Lishi ; LaBelle, James L. ; Kline, Justin P. ; Bishop, Michael R. ; Nguyen, Duy-Thuc ; Ruiz, Hanna A. ; Riedell, Peter A. ; Zhao, Yu ; Tang, Erting ; Huang, Jun ; Chen, Xiufen ; Hu, Yifei ; Cai, Xiaolei ; Cao, Guoshuai ; Asby, Nicholas W.

Abstract:

CD19-directed chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has significantly advanced the treatment landscape for relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma (r/r DLBCL). However, up to 60% of patients do not achieve a complete response. To uncover determinants of therapeutic efficacy, we analyzed the infusion products (IPs) of eight r/r DLBCL patients with distinct clinical responses to axicabtagene ciloleucel using single-cell transcriptomics. Compared with patients who exhibited progressive disease, IPs of complete responders demonstrated enriched signatures of type I interferon (IFN-I) signaling. Based on these findings, we developed a strategy to improve CD19-directed CAR T-cell treatment efficacy by incorporating IFN-I as an enhancer during the ex vivo manufacturing process, with IFN-I removal before CAR T-cell infusion to avoid in vivo toxicities. For both CD28- and 4-1BB–costimulated second-generation CARs, we found that low-strength IFN-I signaling enhanced CAR T-cell cytotoxicity and treatment efficacy against B-cell lymphoma and leukemia. Our low-strength IFN-I–enhanced CAR T-cell ex vivo manufacturing approach leverages an existing FDA-approved pharmacologic agent, circumvents in vivo interferon–associated toxicities, and remains fully compatible with current CAR constructs and manufacturing workflows. Together, our results establish IFN-I as a potent and costimulation-independent enhancer of CAR T-cell efficacy and provide a translationally feasible approach to enhance CAR T-cell therapies.

2026-08-01·Transplantation and Cellular Therapy

Prolonged Cytokine Release Syndrome is Associated with Hypofibrinogenemia after CD19-Directed CAR T-Cell Therapy in Adult Patients with Relapsed/Refractory Lymphoma

Article

作者: Jo, Tomoyasu ; Sakamoto, Takashi ; Bamba, Seiya ; Kitawaki, Toshio ; Arai, Yasuyuki ; Nagao, Miki ; Takaori-Kondo, Akifumi ; Yamashita, Kouhei ; Yoshinaga, Noriyoshi ; Kanda, Junya ; Nishikori, Momoko

CD19-directed chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has markedly improved outcomes for patients with relapsed or refractory B-cell malignancies, although coagulopathy characterized by hypofibrinogenemia has increasingly been recognized as a complication after CAR T-cell therapy. Nevertheless, its contemporary real-world incidence, risk factors, and clinical impact remain incompletely defined. This study aimed to determine the real-world incidence, risk factors, and clinical impact of hypofibrinogenemia following CD19-directed CAR T-cell therapy for relapsed or refractory B-cell lymphoma. This retrospective cohort study included all consecutive adult patients (≥16 years) with relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) or follicular lymphoma (FL) who received tisagenlecleucel (tisa-cel), lisocabtagene maraleucel (liso-cel), or axicabtagene ciloleucel (axi-cel) at Kyoto University Hospital between December 2019 and December 2024. We also evaluated detailed CRS severity according to modified CRS grading (m-CRS), in which grade 1 was subdivided into grade 1a (duration of CRS-related symptoms ≤5 days) and grade 1b (duration of CRS-related symptoms >5 days), as previously described; grade 1b CRS was defined as "prolonged CRS." A total of 111 patients (74 tisagenlecleucel [tisa-cel] [67%], 24 lisocabtagene maraleucel [liso-cel] [22%], and 13 axicabtagene ciloleucel [axi-cel] [12%]) were included. Hypofibrinogenemia (fibrinogen ≤150 mg/dL) was observed in 28 patients (25%) within 30 days after infusion (median onset, 10.5 days). FFP was administered to 15 patients (14%). Multivariable analysis revealed that grade ≥1b CRS (adjusted hazard ratio [aHR], 4.59; 95% confidence interval [CI], 1.89 to 11.14; P < .01), lower baseline fibrinogen levels (aHR, 1.07 per 10 mg/dL decrease; 95% CI, 1.02 to 1.14; P = .01), and axi-cel use (versus tisa-cel: aHR, 3.29; 95% CI, 1.38 to 7.83; P < .01) were independently associated with hypofibrinogenemia. In our cohort, no fatal bleeding events occurred. Hypofibrinogenemia was not associated with inferior overall survival or progression-free survival. Prolonged CRS (grade 1b) or grade ≥2 CRS, lower baseline fibrinogen, and use of axi-cel were independently associated with hypofibrinogenemia. Risk-adapted fibrinogen monitoring may help identify patients who could benefit from closer surveillance, and timely fibrinogen replacement may optimize supportive care. Further multicenter studies are warranted to validate these findings and clarify the clinical impact of hypofibrinogenemia, including hemorrhagic outcomes.

2,970

项与阿基仑赛相关的新闻（医药）

2026-09-14

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一句让记者“滚开”，把易慕峰的港股IPO推到了悬崖边

深圳易慕峰生物科技股份有限公司（下称“易慕峰”）的招股书，每一页都写满了风险条款，却没有一页写下如何面对一位失去丈夫的妻子。2026年9月2日，时代周报记者致电易慕峰董事李佳昕，目的是求证一名临床试验受试者的死亡事件。而电话那头传来六个字：“滚开，烦不烦啊。”这六个字，把一家正冲刺港交所18A章上市的细胞治疗公司，推到舆论中心。但“滚开”只是表象。真正值得追问的是：一名受试者于4月26日在ICU离世，公司8月18日才递交招股书——中间近四个月，招股书对这起死亡事件为何只字未提？招股书曾写着IMC002“迄今为止在临床试验中表现出良好的安全性”。而在死亡事件发生后提交的第二版招股书里，这句话恰好是两版文本之间唯一被删掉的表述。一、61天：一条命，和四小时空白的护理记录从输注到离世55天，从入院到离世61天——这条时间线，是理解整场风波的起点。先还原事件经过。据多家媒体报道及家属提供的病历、输注记录与知情同意书等材料：受试者占某（化名），49岁，2025年3月确诊胃食管结合部腺癌，在上海长海医院接受全胃切除及6次化疗，病情一度平稳。2026年初，在主治医生（同时也是IMC002临床试验的研究者）推荐下，占某于1月14日签署知情同意书入组，2月25日至27日完成三天清淋预处理化疗，3月2日中午12时正式输注IMC002。输注当天下午，占某开始嗜睡，家属多次向医护反映其难以唤醒，得到的答复是“化疗后补觉”。当晚19时30分，占某已无法唤醒、瞳孔散大，急诊CT显示双侧硬膜下血肿、蛛网膜下腔出血并脑疝形成；当晚22时接受开颅手术，术后长期昏迷，4月26日在ICU离世——输注后55天，入院后61天。争议集中在三个层面：一是知情同意书仅以“CAR-T相关出凝血疾病”作概括性表述，未明确告知“颅内出血、脑疝、开颅手术”等致命后果；二是输注后15时30分至19时30分四个小时的护理记录空白，而国内CAR-T神经毒性管理专家共识建议输注后每日2次神经系统评估、密切监测凝血功能；三是责任认定——长海医院相关记录判定死亡与IMC002“不相关”、与环磷酰胺等清淋化疗药“相关”，公司亦持此立场，仅愿提供“人道主义补偿”，家属不予认可，已向法院递交材料等待立案，申请医疗责任鉴定。必须划清一条科学边界：输注在先、死亡在后，不等于药物导致死亡。颅内出血可能与患者基础状况、清淋化疗、联合用药等多种因素有关，最终结论只能等待独立医学鉴定。但同样必须承认：这起严重不良事件（SAE）发生于IMC002“未观察到治疗相关死亡”这一安全记录首次出现裂缝的时间节点。其性质尚未定论，冲击却已发生。二、招股书对一条命沉默4个月：三重失语，一处删改死亡发生在4月26日，二次递表在8月18日。中间近四个月，市场与投资者在招股书里看不到对这起事件的任何专项列示。这构成了本次IPO最核心、也最危险的信披争议。第一重沉默，是时间线本身。港交所18A章规则明确要求，生物科技公司须在上市文件中披露核心产品的所有重要安全数据，包括任何重大不利事件。4月死亡、8月递表，死亡在前、递表在后，公司却未专项披露。每经记者对照两版招股书后发现：2月版风险因素部分写有候选产品“迄今为止在临床试验中表现出良好的安全性”，而8月版同一位置删去了这句话——这是死亡事件前后，两版招股书关于安全性表述的唯一直接变化。临床数据截止日则停留在2025年12月31日，早于死亡事件。第二重沉默，是“静默期”的误用。IPO申报阶段的静默期，约束的是发行人不得违规开展面向证券发行的宣传推介，并不意味着企业可以对已经发生的重大安全事件回避舆论监督。每经热评的概括直指要害：静默期不是捂盖子的挡箭牌。第三重沉默，是责任的悬置。事件是否构成18A规则下的“重大不利事件”漏披、是否属于选择性披露，目前尚无权威认定，但市场普遍预期公司将面临多轮问询——保荐人华泰国际需要补充核查事件经过、因果评估与伦理调查结论，港交所可能要求补充更多安全性数据。参考行业先例，18A公司在临床期死亡叠加信披质疑的情形下，聆讯周期拉长甚至中止的可能性客观存在。市场不怕创新药研发出现失败与意外——风险本就写在每一份招股书里；市场怕的是风险被捂住。一家Biotech可以告诉投资人“药失败了”，但难以被接受的是：重大安全事件发生后，公司不愿解释、不愿回应，外界甚至开始怀疑，还有多少关键信息未被说出。三、签完“伦理自律书”，董事说了句“滚开”比死亡事件更刺目的，是时间线上的反差。2026年7月26日，易慕峰董事长孙敏敏刚签署了一份《坚守科研伦理行业自律书》——由中国食药安全促进会副会长、同写意CGT俱乐部等发起的倡议，91位CGT领域企业创始人、CEO联名支持。自律书第一条写着：“确保受试者充分知情、自愿参与，并对其安全置于首位。”然而仅38天后（9月2日），占某离世的消息被媒体揭开；就在记者致电求证时，电话那头传来董事李佳昕的六个字：“滚开，烦不烦啊”。纸面上的伦理与电话里的失态，构成公众最难接受的落差。这并非一句“高管情绪失控”可以概括。它暴露的是三重治理缺失：其一，企业对外沟通机制整体失灵——官方声明四平八稳（“配合官方调查、不做预判”），说明公司不是不会说话，而是无人把守对外发声的关口，最终由不擅长公关的非执行董事直面媒体；其二，危机应对失于主动——家属反映，患者去世后半年内公司未主动联系，沟通全部经医院转达，公司代表“无谈判权限”，只给出“人道主义补偿”方案（家属拒绝，认为“人道主义”的提法实质回避了责任认定）；其三，董事个人身份信息存疑——招股书显示李佳昕为“复健资本总经理”，而天眼查显示复健资本总经理为李凡，二者是否同一人存在信息出入，尚待核实。对18A审核而言，这是一条硬伤链条：港交所对未盈利生物科技公司的管理层诚信、风控体系与危机应对能力本就高度敏感。创始人主导过国内首款CAR-T奕凯达的上市申报，产业履历是真实加分项；但技术出身团队在商业化与资本市场经验上的短板，正在这场危机中被成倍放大。四、现金仅够支撑21个月：IPO是续命，不是扩张两年半累计亏损2.95亿元，账面现金仅够支撑约21个月——而2027年的NDA还在前方。抛开事件本身，易慕峰的基本面同样不容乐观：这是一家无主营收入、持续亏损、依赖融资存续的公司。招股书数据显示：公司无任何产品获批商业化，报告期内几乎没有主营业务收入，收入主要来自政府补助与银行利息（2024年约336万元、2025年约401.9万元、2026年上半年约663.2万元）。净亏损2024年为7131.2万元，2025年扩大至1.148亿元，2026年上半年已达1.089亿元——两年半累计亏损约2.95亿元。2026年上半年研发开支8220.3万元，同比增长约222%，其中IMC002单一管线占76.8%；经营活动现金净流出1.016亿元，同比扩大215.5%。截至2026年6月30日，公司账面现金及现金等价物约4.02亿元，另有结构性存款7030万元。招股书测算，假设未来平均现金消耗率为2025年水平的2.5倍，不计IPO募资，现有资金仅能维持约21个月的财务可持续性——即约至2028年第一季度。而IMC002预计2027年才提交NDA，即便一切顺利，从获批到商业化收入兑现仍需数年。于是，一个残酷的时间错配出现了：死亡事件9月2日曝光，恰逢8月18日二次递表后的审核启动期。若港交所多轮问询将聆讯推迟至2027年，公司将不得不在“临床事故责任未定、无收入、IPO停滞”的弱势状态下寻求D轮融资。招股书同时披露：投资方的赎回、反摊薄等特殊权利在递表期间临时终止，IPO一旦失败将自动恢复——投资人永远握有退出通道，而公司没有任何备选。首次递表（2月13日）满6个月失效后仅5天，公司便二次递表。这种紧迫本身说明：此次IPO的目的不是价值扩张，而是资金续命——若上市窗口因这起事件关闭，资金压力将以更快的速度显现。五、29例早期数据，正被一例死亡重新定价IMC002不是一条边缘管线，它是易慕峰的命门：2026年上半年公司研发投入的76.8%投向这款产品，20.75亿元投后估值几乎全部系于它一身，而它也是公司唯一符合18A规则“核心产品”定义的管线。为什么一款管线就能撑起全部估值？关键在于实体瘤CAR-T赛道的稀缺性。与血液瘤不同，实体瘤存在致密的物理屏障与免疫抑制微环境，靶点异质性高、CAR-T细胞难以浸润肿瘤内部，全球范围内长期没有获批先例——这既是易慕峰的机会，也是它必须独自跨越的技术鸿沟。IMC002瞄准的CLDN18.2靶点被视作胃癌领域最具潜力的方向之一，但这条赛道同样拥挤，ADC、双抗等多种技术路线正从不同角度发起围攻。支撑这条命门的早期数据，来自一个极小样本：I/IIa期仅29例入组、推荐剂量组客观缓解率69.2%、中位总生存期18.2个月，1例完全缓解持续超70周。数据表现突出，但从29例经筛选人群到150例III期真实世界的跃迁，本就是实体瘤CAR-T行业公认的难题；而死亡事件恰好发生在这一跃迁节点，让“未观察到治疗相关死亡”的安全纪录第一次出现裂缝。此外，CAR-T的商业化从来不只是“疗效”问题，更是“成本与可及性”问题。自体CAR-T需要为每位患者单独完成细胞采集、制备、质检与回输，单针生产成本远高于小分子与抗体药，患者等待周期长达数周。这意味着即便IMC002顺利获批，定价、产能与支付体系能否支撑起真实市场需求，仍是未经验证的能力——这恰是招股书论证最为单薄之处。更添变数的是外部竞争。2026年6月22日，科济药业的CT041（恺力美）获批，成为全球首款实体瘤CAR-T，定价99万元/针。易慕峰从“全球第二”变成了“追赶者”。同时，IMC002的关键VHH纳米抗体技术来自第三方授权，未来需支付连续十年的销售分成及高额里程碑付款，将持续侵蚀利润空间。若死亡事件被认定为治疗相关，III期150例入组将面临停滞——2027年NDA时间表作废，20.75亿估值的核心假设随之崩塌。即便事件最终被判定与药物“不相关”，冲击也不会消失：长海医院事件之后，各临床中心的入组与安全审查趋于审慎，受试者招募意愿与入组节奏难免受到影响，III期进度存在拖期风险。对一家将全部估值系于单一产品的公司而言，这种“拖”本身即是致命的。六、监管在收紧，行业在补课：易慕峰恰逢最严监管窗口易慕峰事件并非孤例，行业层面的风险更值得警惕。2026年5月1日，国务院令第818号《生物医学新技术临床研究和临床转化应用管理条例》正式施行，首次以行政法规形式确立卫健委技术审批与药监局药品审批并行的双轨监管；9月1日，新版《药物临床试验质量管理规范》生效，明确要求知情同意书应当充分完整、通俗易懂。短短几个月内两套制度密集落地，本身就是监管层对CGT行业“跑得太快、安全管控和伦理审查没跟上”的纠偏信号。两项制度变化的实质，是把细胞治疗从“灰色地带”推向“明码标价”。818条例确立的双轨监管——卫健委管“技术”、药监局管“药品”——意味着同一疗法可能同时接受两套审批体系的审视；新版GCP则把知情同意的充分性、不良事件的报告时效，从“行业自律”升级为“法定要求”。对以CAR-T为代表的CGT企业而言，合规成本与试验周期都在系统性抬升。同期，行业接连曝出受试者死亡事件：转录本生物的体内CAR-T疗法RXIM002出现患者治疗后死亡，辉大基因的基因编辑疗法HG302高剂量组出现受试者死亡，诺华rap-cel也因3例死亡暂停8项临床。三起事件、三种技术路线，指向同一个问题：当创新疗法从实验室走向人体，安全的边界在哪里、谁为风险负责。舆论环境同样在发生变化。过去，创新药研发失败常被视为“探索成本”；如今，随着患者权利意识觉醒与社交媒体放大效应增强，任何一起受试者死亡都可能迅速演变为公共事件。医院伦理委员会与临床研究中心对新疗法的准入审查因此明显收紧——这直接抬高了后来者的试验门槛，也让每一起个案都背负着行业性的信任成本。对易慕峰而言，这层行业背景意味着两件事：其一，监管对临床安全的审视只会更严，任何责任认定的不利结论都可能引发对整个试验方案合规性的倒查；其二，拟上市CGT企业正被要求翻越“合规、临床、商业化”三座大山，而死亡事件叠加信披争议，恰好同时踩中了前两座大山的红线。不可否认，如今行业竞争逻辑早已从“讲技术故事”转向“验数据、验伦理、验治理”。（资钛出品）

2026-09-13

·GCT药物递送技术随笔

CAR-T细胞治疗——和我一起学CAR结构的从头设计（三）

第四章铰链区：调节突触几何与激活阈值的"柔性手臂" 铰链区（Hinge region）是CAR胞外段中介于抗原识别域（如scFv/VHH）与跨膜域（TM，Transmembrane domain）之间的一段连接序列。它虽不直接结合抗原，却决定识别域相对T细胞膜与靶细胞膜的空间位置、取向与动力学，是调控免疫突触几何（immunological synapse geometry）和激活阈值（activation threshold）的关键"柔性手臂"。在靶向膜近表位、低抗原密度靶点或易内吞靶点时常成为限速模块。 4.1 铰链的物理属性：长度、柔性、二硫键与伸展距离 1）长度（Length）与伸展距离（Reach/extension）铰链的长度通常以氨基酸数目或物理伸展距离衡量。经典模块跨度很大： ·短铰链：如CD8α铰链（约9–12 aa，如CD8α的TSQTQTN…短段），伸展有限，把识别域"压"在膜近侧。 ·中等铰链：如CD28来源的短茎区（约10–20 aa）。 ·长铰链/柄（stalk）：如IgG4铰链‑CH2‑CH3截段（约40–60 aa）、CD8α长柄、非Ig来源的柔性柄（如白介素受体柄、GNC柄）。特别注意：伸展距离并非简单等于"氨基酸数×0.38 nm"：柔性linker呈无规卷曲，实际端到端距离服从蠕虫链模型（worm-like chain），有效伸展约为全长伸展的30–60%；刚性α螺旋或富含脯氨酸的铰链则更接近最大伸展。因此比较不同铰链时，应报告实测/建模的识别域质心到膜的距离，而非只报aa数。 2）柔性（Flexibility）与序列组成 ·高柔性：富含甘氨酸（G，小侧链、phi/psi自由度大）、丝氨酸（S，可形成氢键但不稳定二级结构），如(G4S)n、GSG、GS重复；利于识别域"搜索"表位、补偿取向偏差，但过长可增聚集/降低亲和。 ·刚性/半刚性：富含脯氨酸（P，破坏α螺旋、固定转角）、半胱氨酸（C，可成二硫）、或形成稳定α螺旋的亮氨酸/丙氨酸富集段；可把识别域"立"在固定高度，几何可预测，但太刚会限制膜贴合。 ·平衡原则：CAR常用"刚性段确定高度＋柔性段缓冲取向"的组合（如IgG4铰链二硫段＋GS linker），而非纯柔性链。 3）二硫键（Disulfide bond）与稳定性 ·铰链内二硫键：如IgG1/IgG4铰链区的Cys‑Pro‑Pro‑Cys等，可稳定两个重链的相对位置；在CAR中若来自双价识别域（如IgG4 hinge‑scFv），二硫键可维持二价/双特异性结构。 ·与识别域的二硫：scFv内部VH‑VL二硫（如44‑100位）与铰链无关，但铰链N端若紧邻scFv C端，需注意是否引入额外Cys导致错配二硫、聚集体。 ·还原环境风险：肿瘤微环境/胞内内吞通路偏还原，含二硫的铰链若被还原可能使识别域脱落或CAR二聚解体，需用非还原WB与还原动力学验证。 4）力学与动力学属性 ·拉伸刚度：决定识别域在受力（抗原流动、细胞爬行）下是否"甩动"，影响结合on‑rate与膜近端停留时间。 ·旋转自由度：影响scFv的CDR取向是否对准表位；这在双价/串联CAR中尤其关键。 ·蛋白酶敏感性：长柄（尤其IgG CH2/CH3）可能含金属蛋白酶/ADAM/ MMP切割位点，导致CAR胞外段"脱落"（shedding），降低表面CAR并释放可溶识别域充当诱饵；工程上常用点突变去切割或换非Ig短柄规避。 5）表征手段 ·结构：AlphaFold‑Multimer、HADDOCK、全原子/粗粒化分子动力学模拟，估算识别域质心到膜距离与摆动角；膜模型可用POPC/POPG双层或细胞膜系。 ·力学：光镊/磁珠牵引、原子力显微镜（AFM，Atomic Force Microscopy）、双光镊测伸展‑力曲线。 ·实验：圆二色谱（CD，Circular Dichroism）看二级结构含量、热熔（DSF/DSC）看稳定性；非还原WB/SEC‑MALS看二硫化与聚集。 4.2 铰链与表位膜距离、抗原密度、糖基化的匹配原则铰链的选择本质是几何匹配问题，应依据靶标表位特性反向设计，而非默认沿用参比。 1）与表位膜距离的匹配（核心原则） ·膜远表位（胞外域N端、远离膜，如多数CD19/BCMA表位）：可用短至中等铰链（CD8α/CD28短段），识别域本身已能"够到"；过长反致柔性摆动、降低有效亲和。 ·膜近表位（跨膜区邻近短胞外环、如ROR1 kringle、MUC1膜近端、某些GPCR/通道、NCAM）：需要长铰链/柄把识别域"抬高"离膜，或改用小识别域（VHH/DARPin/Affibody）；若用标准scFv＋短铰链，识别域CDR会被双膜间隙限制，"够不到"表现为结合弱、EC50右移。 ·估算方法：用胞外域截段、膜结合vs可溶性抗原竞争、结构建模定位表位离膜距离；再按"铰链伸展距离＋识别域半径＋表位离膜距离＝两膜间隙"匹配。一般两细胞膜间隙约15–20 nm，需留余量。 2）与抗原密度的匹配 ·高密度抗原（如B细胞恶性肿瘤CD19/BCMA）：短铰链＋高亲和scFv即可充分交联，长铰链反增tonic风险（识别域更易二聚/甩动）。 ·低密度/异质抗原（实体瘤、部分AML靶标）：适度长铰链＋低/中亲和识别域可提高"扫描半径"，帮助T细胞在低抗原下捕捉靶点；但必须与共刺激、ITAM（免疫受体酪氨酸激活基序）数协同，避免"高背景低特异性"。 ·原则：铰链长度与抗原密度常呈"钟形"关系——过短够不到、过长降低局部浓度并增加tonic；需以抗原梯度（高/中/低密度靶细胞）实测EC50，而非理论推测。 3）与糖基化的匹配 ·糖遮蔽（glycan shielding）：黏蛋白样抗原（MUC1、MUC16）、某些EGFRvIII/实体瘤抗原胞外域被密集O‑糖/N‑糖覆盖，糖链如"树冠"遮挡CDR。此时长铰链让识别域深入糖层，或选非糖遮蔽表位、用小识别域（VHH长CDR3）穿透。 ·铰链自身糖基化：若铰链含NXS/T（N‑糖基化 motif）或S/T富集（O‑糖），可被糖基转移酶修饰，改变伸展、电荷与免疫原性；工程上常去潜在糖基化位点，尤其临床CAR需避免异质糖型。 ·验证：去糖酶处理（PNGase F、Endo H、O‑糖苷酶）后测结合恢复；凝集素结合/糖芯片/质谱确认糖型；比较天然靶细胞与去糖靶细胞的杀伤曲线。 4）匹配矩阵（设计用）表位特征推荐铰链策略识别域配合关键验证膜远、高密度短（CD8α/CD28短段）高/中亲和scFv 表面MFI、EC50、tonic 膜远、低密度中（含柔性GS段）中亲和、可双价低抗原EC50、扫描半径膜近、高密度长刚性柄 VHH/DARPin或scFv＋长柄截段表位结合、结构模型膜近、低密度/糖遮蔽长柔性＋刚性组合柄 VHH/非Ig小域优先去糖恢复、双膜模型易内吞/蛋白酶敏感靶短、去切割位点柄稳定scFv 胞外段脱落（shedding）检测 4.3 开发策略：从已知模块的有限矩阵筛选 1）常用已知铰链模块 ·CD8α铰链/柄：人源、与CD8α leader/跨膜天然衔接，临床验证最多（Kymriah类）；短段刚柔适中，长柄版可用于膜近表位。需注意CD8α柄含潜在糖基化位点，工程时需评估。 ·CD28铰链/跨膜邻近区：短、较刚性，Yescarta/Tecartus类常用；与4‑1BB或CD28共刺激配合需整体评估，不宜只换铰链。 ·IgG4铰链‑CH2‑CH3截段：长、含二硫键、稳定，适合"抬高"识别域；但较长、可能含蛋白酶切割位点与N‑糖基化，需截段优化。 ·IgG1/IgG2/IgG3铰链：各有二硫模式与柔韧性差异，IgG1较柔、IgG3长而带电，需实测。 ·非Ig来源柄：如细胞因子受体柄（GNC、IL‑2Rγ）、CD4/CD7柄、合成GS/PE重复柄；用于规避专利或调节几何，需验证折叠与免疫原性。 ·柔性连接子类：(G4S)n、(GSG)n、含P的刚性段；常用于识别域与铰链之间，而非作为主铰链，但边界模糊时可合并筛选。 2）有限矩阵设计（推荐做法）固定识别域（scFv/VHH）、跨膜域、共刺激域、CD3ζ，仅变换铰链： ·长度梯度：短（CD8α短段，约10 aa）/ 中（CD8α长柄或IgG短截段，约25–30 aa）/ 长（IgG4铰链‑CH2‑CH3，约45–60 aa）； ·柔性梯度：刚性（富含P/α螺旋）／柔性（GS重复）／刚柔组合； ·二硫梯度：含铰链二硫（如IgG4天然二硫）/ 去二硫突变（Cys→Ser）； ·糖基化：野生型 / 去NXS/T突变体； ·对照：参比已上市/已验证构建（如CD19用Kymriah/Yescarta类铰链基线）。典型矩阵为 3长度 × 2柔性 × 2二硫 × 2糖型＝ 24 个，可控；若识别域有VH‑VL两种取向，先固定取向再做铰链矩阵。 3）筛选终点 ·表达与加工：原代T表面MFI、阳性率、前体/成熟比、非还原WB看二硫与聚集。 ·几何/可及性：用膜近表位靶细胞与膜远表位靶细胞双系测结合；胞外域截段/插入间隔序列做"膜距离—杀伤"曲线。 ·功能：抗原高/中/低梯度EC50、杀伤、CD107a、IFN‑γ/IL‑2；无抗原tonic（pZAP70/pERK、CD69、基础细胞因子）。 ·稳定性：热稳（DSF）、蛋白酶敏感性（共培养上清shedding ELISA/流式测脱落CAR）、循环稳定性。 ·体内：NSG/人源化模型扩增、持久、浸润、CRS替代标志物（IL‑6/IFN‑γ/体重）、on‑target/off‑tumor（正常组织抗原梯度）。 4）工程化注意 ·明确铰链与信号肽、识别域、跨膜域的边界：CD8α"leader（N端21 aa）—柄（hinge/stalk，胞外）—跨膜—胞内"四段独立，不能把柄全算作leader。 ·避免引入新的N‑糖基化（NXS/T）、蛋白酶切割位点、疏水斑块；若用IgG铰链二硫，确认Cys配对不形成错配二硫。 ·长铰链需测shedding：收集T细胞/肿瘤共培养上清，抗识别域ELISA或质谱定量可溶CAR，脱落>10–20%提示需截短或去切割位点。 ·铰链改变可能影响内吞/再循环与CAR表面半衰期，需结合动态流式（表面CAR随时间的衰减）评估。 4.4 专利FTO：铰链单独专利少，但作为构件的风险与自有化数据要求 1）单独封铰链的产品专利少铰链多为天然人源短序列（CD8α/CD28/IgG4来源的短段），创造性和"产品独占性"论证难，单独以铰链序列发独立产品权要的情形较少；且铰链功能偏"结构调节"，难以仅凭序列本身主张广泛独占。因此铰链单独FTO风险通常较低。 2）作为构建体构件的风险更高 CAR专利普遍按"信号肽—识别域—铰链—跨膜—共刺激—CD3ζ"整体撰写，铰链常以构件形式落入宽泛权要： ·具体序列限定：如"含SEQ ID NO:X所示的CD8α铰链序列"； ·功能限定：如"长度约10–60 aa、含二硫键、将识别域定位于距膜X nm的柔性连接段"； ·同源性/组合限定：如"与CD8α铰链≥90%同一性且与特定跨膜/共刺激组合"。即使你用"自有"识别域，若铰链沿用参比序列且与跨膜、共刺激、靶标整体相同，仍可能字面落入或按等同侵权主张。 3）检索与FTO评估要点 ·序列层：用候选铰链氨基酸/核酸子串比对专利全文与序列库（PATSEQ、Lens、Google Patents）；同时比对"全长CAR SEQ ID"中铰链‑跨膜区段（约40–80 aa），避免只搜独立铰链库漏掉其作为构件。 ·功能/结构层：检索CAR AND (hinge OR flexible linker OR stalk) AND (CD8α OR CD28 OR IgG4) AND 靶标 AND length/reach/activation threshold；若目标专利写"长铰链用于膜近表位CAR以提高结合"，即使序列不同也可能按功能等同评估。 ·同族层：按靶标＋识别域＋铰链/跨膜组合查关键申请人（UPenn/Novartis、St.Jude/Juno/BMS、MSK、NCI/Kite/Gilead、Juno/TCR²、国内CAR企业），重点看构建体独立权与从属权。 ·组合风险：铰链与跨膜、共刺激常"捆绑授权"，单独换铰链可能不足以规避整体权要。 4）自有化数据与授权支撑单纯"用公开CD8α铰链"难以形成自有护城河；若做铰链创新（新截段、刚柔组合、去二硫、去糖/去切割），应在说明书/专利中提供： ·具体截段坐标、序列、二硫键与糖基化位点定义； ·伸展距离/柔性的结构建模（AlphaFold/MD、端到端距离分布）与实验验证（CD、DSF、非还原WB）； ·与参比铰链的头对头数据：原代T表面MFI、前体/成熟比、抗原高/中/低EC50、无抗原tonic、重复刺激耗竭、体内持久； ·膜距离匹配证据：膜近vs膜远表位靶细胞的结合/杀伤曲线、胞外域截段与间隔插入实验、去糖恢复实验； ·稳定性：热稳、蛋白酶切割抗性、胞外段shedding定量； ·免疫原性：MHC‑II/T细胞表位预测（NetMHCIIpan、IEDB），人源化评估。仅有"长铰链提高低抗原杀伤"的泛化描述，既不利于创造性（易被认定为常规选择），也不利于FTO抗辩。 5）FTO处置建议 ·立项窄查：靶标＋拟定铰链候选＋跨膜/共刺激组合＋目标国（中美欧日）； ·IND前全栈：铰链并入"识别域—铰链—跨膜—共刺激—CD3ζ—靶标"整体同族比对，不能单独出"低风"结论；同步查核酸/载体、制造、适应症用途权要。 ·若铰链落入他方，不要只换铰链规避，应同步改识别域/跨膜/共刺激形成差异实施例，或争取许可； ·自由实施报告按"可规避／需许可／可无效／已到期"分类，铰链章节标注"构件风险"而非"独立产品风险"。综上，铰链区是CAR中"看似简单、实则精密"的几何调节模块：长度与柔性决定伸展和取向，二硫与糖基化决定稳定性，其与表位膜距离、抗原密度、糖基化的匹配决定能否有效结合；开发上应以有限矩阵在原代T中筛选，专利上始终放回整体构建体同族评估，并以结构建模、功能数据与稳定性数据支撑自有化。第五章跨膜域：膜锚定、二聚化与信号传导枢纽跨膜域（Transmembrane Domain，TMD）是CAR穿过质膜的单一跨膜螺旋段，通常仅约20–25个疏水氨基酸，却是连接胞外"识别/几何"与胞内"信号"的枢纽。它看似是最"惰性"的结构模块，实则同时承担四项功能：膜锚定与正确拓扑、寡聚态设定（单体/二聚/三聚）、表面稳定性与内吞动力学调控、以及与内源受体的特异性/非特异性串扰。近年研究表明，TMD的选择并非"CD8α或CD28任选"，而是直接影响激活阈值、tonic signaling、细胞因子释放、体内持久性乃至临床毒性的独立变量。 5.1 跨膜域的分子结构：疏水α螺旋、Cys二硫、带电残基 1）疏水α螺旋（核心锚定结构）天然Ⅰ型膜蛋白的TMD多为一段约21–25 aa、以亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸为主的跨膜α螺旋（TM helix）。螺旋每圈约3.6个残基，因此参与二聚界面的关键残基常以"每3–4位一个"的方式周期性排布（"knobs‑into‑grooves"或"GG4-like"包装）。CAR常用的CD8α、CD28、CD3ζ TMD均源于天然T细胞蛋白的跨膜段，其螺旋倾向与疏水厚度匹配质膜约30 Å的双层，保证稳定插入Sec61（是细胞质里合成的蛋白进入分泌途径（内质网→高尔基体→细胞膜）的唯一大门）转位通道并正确定位于质膜。TMD过短（<18 aa）可造成膜定位不稳、表面表达低；过长/过疏水则可能滞留内质网或诱导非特异聚合。 2）Cys介导的二硫键（寡聚稳定化）许多天然免疫受体的胞外近膜区（stalk/hinge）含保守半胱氨酸，可形成链间二硫键稳定二聚： ·CD8α 柄区Cys（如人CD8α的Cys-XXX-Cys模式）可介导同源二硫二聚； ·CD28 stalk含二硫键形成位点； ·CD3ζ 的ζ-ζ胞外/跨膜交界区可形成二硫稳定同源二聚（天然TCR中的ζζ异源/同源配对）； ·IgG CH2/CH3 铰链区含经典Cys‑Pro‑Pro‑Cys二硫。需要明确：二硫键的作用是"稳定已形成的相互作用界面"，而非"驱动蛋白结合"——即二硫不创造二聚，它只把由TMD及stalk的疏水/极性界面驱动的自缔合锁定。因此突变稳定半胱氨酸（Cys→Ala/Ser）通常削弱但不能完全消除二聚；这一区分对解释CAR功能实验至关重要。实验上用还原/非还原WB判断二硫键是否形成，用非还原条件看二聚/多聚条带。 3）带电极性残基（序列特异性互作的"密码"）若TMD全为疏水残基，自缔合通常较弱且非特异性；一旦引入丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、苏氨酸/丝氨酸富集的YxxxxT motif、带电残基（Lys/Arg/Asp/Glu），即可形成特异的TMD‑TMD识别界面： ·氢键/极性网络：S、T的侧链羟基可在螺旋界面形成交叉氢键（如"Ser zipper"、GxxxG-like motif）； ·带电极对：Lys/Glu、Arg/Asp可形成跨膜盐桥，方向性强、特异性高； ·CD28‑TMD的关键发现：Muller等证明，CD28跨膜域中的极性氨基酸（polar residues）是CAR与内源CD28异源二聚化的结构基础——将点突变这些极性位可破坏异源二聚。这一"极性密码"也是de novo设计可编程TMD的核心抓手。 4）天然TMD的功能印记天然T细胞蛋白的TMD并非"惰性疏水棒"，而是带有该蛋白进化形成的组装指令： ·CD3ζ TMD 既驱动ζ‑ζ同源二聚，又含指导TCR复合体组装、与CD3γ/δ/ε及TCRαβ相互作用的序列，是第一代CAR中与内源TCR/CD3复合体发生异源组装的根源； ·CD8α TMD 除二硫外，其stalk的O‑糖基化（Ser/Thr富集区）与功能性相关，并可与内源CD8α/coreceptor相互作用； ·CD28 TMD 如上述可结合内源CD28。因此"沿用天然序列"虽方便，也意味着把天然蛋白的组装/串扰潜能一并带入CAR，这串扰风险的分子基础。 5）表征手段 ·二级结构/拓扑：圆二色谱（CD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）测跨膜螺旋含量；膜模拟环境（脂质体、SDS胶、Triton X-100）下分析。 ·寡聚态：非还原WB/Blue Native PAGE、尺寸排阻色谱（SEC）、交联（如BM(PEG)n、DSP）后质谱；单分子/双色TIRF、FRET（荧光共振能量转移，Fluorescence Resonance Energy Transfer）测膜上二聚/簇大小。 ·结构与建模：全原子/粗粒化分子动力学（MD）、α螺旋二聚界面预测、AlphaFold‑Multimer对TMD螺旋束建模；突变验证用丙氨酸扫描/极性位点互换。 ·膜定位：共聚焦/TIRF看表面CAR puncta/簇；膜蛋白拓扑用蛋白酶保护、N‑/C端标签取向实验。 5.2 跨膜域在CAR二聚/寡聚、表面稳定性、与内源受体串扰中的作用 1）设定CAR寡聚态（单体—二聚—三聚） CAR的功能性激活依赖免疫突触中受体的有效簇（cluster）形成——ZAP‑70的最优反式自激活需要二聚/寡聚 scaffold。天然免疫受体多为二聚（如TCR/CD3复合体、CD8αα、CD28同源二聚），提示二聚可能是CAR的"功能友好"默认态，但这并不绝对： ·CD8α、CD28、CD3ζ TMD 在源蛋白中均能驱动二硫连接的二聚，体外比较研究表明CD8α、CD28、ζ形成二硫二聚； ·CD28 stalk/TMD 比CD8α更易形成同源二聚，这与"CD28‑HD/TMD CAR活性常强于CD8 counterparts、激活阈值更低"的现象一致（Majzner/Mackall团队报道CD28‑HD/TMD降低CD19激活阈值，与胞内域无关）； ·三聚/四聚等替代寡聚态过去几乎未被探索。Elazar、Call、Fleishman团队（Fujiwara等 2020 bioRxiv → 2022 eLife，提出 proCAR / programmed Membrane Proteins, proMPs）用计算设计的单穿膜α螺旋TMD，经晶体学验证的界面编程为单体、二聚（proCAR‑2, C2.1）、三聚（proCAR‑3, 1.2）精确寡聚态。关键结果：二聚、三聚 proCAR‑T 杀伤显著强于单体proCAR及临床参照CD28‑TMD CAR；且无论寡聚态如何，所有proCAR均显著降低炎性细胞因子释放。这说明"寡聚态"与"细胞因子输出"可解耦——精确设定二聚/三聚既能增强细胞毒又能降CRS，是TMD工程的重要范式。 2）调控表面稳定性与内吞/再循环 TMD影响CAR的膜动力学： ·表面半衰期：疏水性、二聚稳定性、与膜脂（如脂筏/脂鞘）的相互作用决定表面CAR衰减速率； ·内吞与再循环：识别域结合抗原后可诱导CAR内吞，TMD的序列/电荷影响内吞速度与回收效率——这直接关系到"持续的抗原暴露下CAR是否被耗尽"； ·蛋白酶敏感性：某些stalk/TMD边界含金属蛋白酶（ADAM/MMP/γ‑分泌酶）切割位点，可导致胞外段脱落（shedding），削弱表面CAR并释放可溶性识别域充当诱饵； ·表达水平：不同TMD的表面表达常呈CD8α ≈ CD28 > CD4 > ζ的趋势，而体外活性通常随表达水平变化，但CD28 stalk/TMD常表现出"表达相近却活性更强"，提示其有表达之外的信号贡献。 3）与内源受体的串扰（串扰是TMD选择的核心风险） CAR‑T细胞同时表达内源TCR/CD3、CD28、CD8等天然受体，CAR的TMD可能与这些内源伙伴发生同源/异源二聚，产生非预期的信号/表达后果。这是近年来TMD研究最关键的进展： (a) CD28‑TMD 与内源CD28的异源二聚（Muller et al., 2021） ·实验：构建仅在铰链区（HD：CD8/CD28/IgG4）与TMD（CD8/CD28）不同的CD19‑CAR系列，胞内域统一用4‑1BBζ以排除与内源CD28的胞内串扰；并用CRISPR/Cas9破坏TRBC（TCR β链恒定区）排除TCR干扰。 ·发现：含CD28‑TMD（而非CD8‑TMD）的CAR在人T细胞中经免疫共沉淀（co‑IP）证实与内源CD28形成异源二聚；抗CD28刺激可驱动CAR依赖的增殖；该二聚依赖CD28‑TMD中的极性氨基酸。 ·功能后果：CD28‑CAR异源二聚体不响应CD80/CD86（即未把共刺激信号完整转导），却导致细胞表面内源CD28表达显著降低。 ·意义：解释了"为何CD28‑HD/TMD CAR激活阈值更低、活性更强"的部分机制——通过结合/隔离内源CD28间接放大信号；同时提示潜在on‑target/off‑tumor风险（如CD19‑CAR对低水平CD19脑mural细胞敏感性被增强、CD28‑CD19在淋巴瘤中持续增殖）。 (b) CD3ζ‑TMD 与TCR/CD3复合体的组装（第一代CAR的历史教训）第一代CAR含全长CD3ζ序列，其TMD可同时驱动CAR同源二聚与和内源ζ及TCR复合体异源组装，导致CAR被"吸入"TCR/CD3体系、信号混杂且表达受限。基于此，现代二代CAR（Kymriah、Yescarta等）已不再用ζ‑TMD。但需注意：关于CAR与TCR是否cross‑talk仍存在争议——2023年研究（Front Immunol）用TIRF/快扫AiryScan显示，CAR与TCR形成各自独立的突触、无CD3ζ交叉磷酸化（即不互相激活），但二者可"协作"实现逻辑AND门；且tonic TCR信号可支持CAR介导的激活，TCR缺失的CAR‑T体内持久性更差。这说明ζ‑TMD虽已弃用，但"内源TCR对CAR的长期支持"仍是异体/通用型设计中需考量的变量。 (c) ICOS‑TMD 与Lck的组成性关联 Guedan等发现，ICOS胞内域（ICD）只有在直接融合至ICOS‑TMD时才表现出最优的体内活性与持久性——ICOS TMD与酪氨酸激酶Lck存在组成性（虽弱）结合，可募集额外Lck池、促进p85/PI3K激活、放大近端信号输出。这提示"共刺激域与其同源TMD"常需配对使用，把ICOS‑ICD配CD8/CD28‑TMD可能丢失部分功能。 (d) 串扰的双向性：风险 vs 可利用特性 ·风险：非特异寡聚可致tonic、增强低抗原敏感性（脱靶/神经毒性）、降低内源受体表达、干扰TCR功能、增加免疫原性； ·可利用：proCAR的精确寡聚编程（增强杀伤同时降CRS）、KIR‑CAR依赖KIR/DAP12（ITAM适配体）组装才激活、Tmod等"串扰工程"正是主动利用TMD介导的特异性相互作用。 4）TMD与tonic signaling的关系 Tonic的重要来源之一是CAR的抗原非依赖二聚/簇：scFv聚集（PCP，正电斑块）是主因，但TMD的自缔合倾向会放大这一效应。CD28‑HD/TMD常伴随更强的抗原非依赖增殖、PD‑1/TIM‑3上调与耗竭，部分源于其高自缔合；换为CD8α‑TMD或4‑1BB‑TMD、减ITAM、用低聚倾向识别域可缓解。机制上，Frigault、Long、Milone、Gomes‑Silva等的工作表明：tonic与CAR表面表达正相关，可被启动子强度（PGK vs EF1α）、CD28→4‑1BB替换、scFv去聚集共同调节；TMD是其中"几何/寡聚"层面的关键旋钮。 5.3 开发策略：CD8α/CD28/CD3ζ等TMD的扫描矩阵与工程化改造 1）常用天然TMD模块及其特性 TMD来源天然寡聚倾向二硫键与内源伙伴串扰表面表达典型激活特征临床使用情况 CD8α 中（同源二聚） stalk区Cys二硫较低（可与CD8α/coreceptor弱作用）高相对"温和"，阈值中等 Kymriah（CD8α HD/TMD） CD28 高（同源二聚） stalk Cys二硫高（与内源CD28异源二聚，极性残基驱动）高激活阈值低、活性强、潜在tonic/CRS偏高 Yescarta（CD28 HD/TMD）、Liso-cel（IgG4 HD/CD28 TMD） CD3ζ 高（ζζ同源/与TCR组装）胞外/交界Cys 很高（并入TCR/CD3、与内源ζ互作）较低强但混杂，第一代教训现代二代CAR已弃用ζ‑TMD CD4 低（不形成二硫二聚）无典型二硫低中低较"安静" 少数实验CAR IgG CH2/CH3/铰链高（二硫连接二价）经典Cys‑Pro‑Pro‑Cys 低（异源蛋白）取决于柄长/糖基化长柄抬高识别域实验性长铰链CAR ICOS 中 — 中（组成性结合Lck）高增强近端信号、记忆偏好与ICOS‑ICD配对使用 4‑1BB 可设计三聚 — 低高偏持久、氧化代谢常与4‑1BBζ配对；Schmith用4‑1BB TMD形成三聚降抗原逃逸 de novo proMP 可编程（单/二/三聚）通常在CD8α stalk引入Cys→Ala使其"哑化" 设计绝缘、极低与参比相当二/三聚增强杀伤且降CRS proCAR（临床前，eLife 2022） 2）扫描矩阵设计（推荐做法）固定识别域（scFv/VHH）、铰链区、共刺激域、CD3ζ，仅变换TMD，构建有限矩阵并在原代T中筛选： ·天然序列轴：CD8α / CD28 / CD4 / ICOS / 4‑1BB / ζ（对照，理解串扰上限）； ·寡聚态轴：单体（Cys→Ala、去极性界面）/ 天然二聚 / 设计二聚（proCAR‑2）/ 设计三聚（proCAR‑3）； ·极性/带电轴：扫描CD28‑TMD的极性残基（S/T/YxxxxT、带电位）定点突变，构建"异源二聚能力梯度"； ·二硫轴：保留/去除stalk Cys（Cys→Ser/Ala），区分"界面驱动"与"二硫锁定"的贡献； ·配对轴：共刺激域与其同源TMD配对（ICOS‑ICD+ICOS‑TMD、CD28‑ICD+CD28‑TMD）vs 交叉配对； ·对照：参比已上市构建（Kymriah: CD8α‑TMD/4‑1BBζ；Yescarta: CD28‑TMD/28ζ）。典型矩阵约3–4（TMD）× 3（寡聚态）× 2（二硫）× 2（配对）= 36–72个，可控；若识别域有VH‑VL两种取向，先固定取向再做TMD矩阵。 3）工程化改造策略 ·绝缘化（Insulation）：为降低与内源受体的非特异串扰，可将TMD改造为不与任何内源蛋白匹配的独特序列——proCAR的proMP即典型：用计算设计的非天然螺旋界面设定精确寡聚，同时CD8α stalk的Cys→Ala使天然二硫不再主导，实现"可编程+绝缘"。 ·界面理性设计：基于CD28‑TMD极性密码，将"驱动异源二聚的极性位"定点突变（如S/T→L/I、带电位互换）可削弱串扰而不破坏膜锚定；反之可增强特定同源二聚。 ·去二硫/加二硫：需要严格单体时用Cys→Ala；需要稳定二价/双特异构型时引入可控Cys（注意避免错配二硫、聚集体）。 ·去蛋白酶切割/去糖基化位点：去除stalk/TMD边界的NXS/T（N‑糖）、S/T富集区（O‑糖）及ADAM/MMP位点，降低脱落与异质糖型。 ·长度与疏水性调谐：微调TMD长度/疏水残基以匹配膜厚度、调节内吞与表面半衰期，避免过短定位不稳。 ·组合规则：TMD改造必须与铰链（几何）、识别域（聚集倾向）、共刺激（信号强度）联合优化——单独换TMD常不足以解决tonic/CRS。 4）筛选终点（原代T验证） ·寡聚态与加工：非还原WB（二硫二聚/多聚）、交联+质谱、FRET/TIRF看膜簇大小；还原/非还原WB测前体/成熟与前体积累。 ·表面表达与稳定性：流式测CAR MFI/阳性率随时间衰减（表面半衰期）；膜蛋白拓扑/定位。 ·串扰直接证据：co‑IP + 质谱验证CAR与内源CD28/CD8/TCR‑CD3的相互作用；抗CD28刺激下CAR依赖增殖（Muller范式）；TCR‑/CD28‑ KO或TRBC编辑细胞做对照。 ·功能与安全性：抗原高/中/低梯度EC50、杀伤、CD107a、IFN‑γ/IL‑2；重点测无抗原tonic（pZAP70/pERK、CD69、基础细胞因子、持续增殖）；重复刺激PD‑1/TIM‑3/LAG‑3、TCF1/LEF1、TCM/TEM；体内NSG模型扩增、持久、浸润、CRS替代标志物（IL‑6/IFN‑γ/体重）。 ·代谢与信号：Seahorse测糖酵解/氧化磷酸化（ECAR/OCR）、Lck/ZAP‑70/NF‑κB/ERK磷酸化动力学（ICOS‑TMD vs CD28‑TMD的近端信号差异）。 ·关键判据：二/三聚proCAR范式要求"杀伤增强 + 细胞因子下降"同时成立才算成功；若出现"活性强但tonic/CRS也高"，说明寡聚态未与信号正确解耦，需回调。 5.4 专利FTO：核心同族与规避 1）TMD单独封产品的专利相对少，但构件风险突出与识别域（CDR/序列）和胞内域（CD28ζ、4‑1BB组合）相比，短TMD序列本身创造性和"产品独占性"论证较难，独立以TMD序列发产品权要的情形较少。但TMD几乎总是作为构建体构件落入宽泛权要： ·具体序列限定：如"含SEQ ID NO:X所示的CD8α/CD28跨膜序列"； ·功能/结构限定：如"长度约18–30 aa的疏水α螺旋、含二硫键、驱动二聚/三聚、设定CAR寡聚态"； ·组合限定：如"识别域—特定铰链—CD28‑TMD—共刺激域—CD3ζ"整体同族，其中CD28‑TMD是关键区别特征之一； ·同源性：如"与CD28 TMD具有≥80/90%同一性且与内源CD28形成异源二聚"。即使你用自有识别域，若沿用CD28‑TMD且与跨膜/共刺激/靶标整体相同，仍可能字面落入或按等同侵权主张。 2）核心专利同族与关键玩家 CAR‑T基础IP高度碎片化，TMD相关权利常嵌于构建体同族中，需按"靶标 + 骨架"双维度检索： ·UPenn / Novartis：以CD19 CAR（FMC63 scFv + 4‑1BBζ/CD28ζ骨架）为核心的系列专利，Kymriah衍生同族覆盖多种铰链/TMD组合；其基础专利（如Sadelain、June团队）常把CD8α/CD28‑TMD作为构件纳入。 ·St.Jude / Juno / BMS：CD19/CD22等构建体专利，Breyanzi（Liso-cel）采用IgG4 hinge + CD28‑TMD + 4‑1BBζ，其特定铰链‑TMD‑ICD组合是重要区别特征；Juno v. Kite（Arias案）关于§101/§112的争议也涉及构建体特征的可专利性与充分公开。 ·NCI / Kite / Gilead：Yescarta/Tecartus系（CD28‑TMD + 28ζ）的核心同族，CD28 stalk/TMD与激活阈值、毒性相关的功能发现可能构成后续功能限定权要。 ·MSK / Sloan‑Kettering：共刺激域（尤其4‑1BB、ICOS）与TMD配对、第三代组合等；ICOS‑TMD与Lck关联的功能性发现可能支撑"共刺激‑TMD必须配对"类权要。 ·学术/新兴：proCAR/proMP的计算设计可编程寡聚TMD是新兴IP方向，涉及"精确单体/二聚/三聚TMD界面"的composition/方法权要。注：具体专利号、权利要求范围与法律状态（有效/过期/受审）需按目标市场（中美欧日）逐件在Patentscope、Google Patents、Lens、PATSEQ中核实；基础专利多集中于2000年代初至2010年代，家族正陆续到期，但改进型（如proCAR、logic‑gated、异体）仍在有效期内。 3）检索与FTO评估要点 ·序列层：用候选TMD氨基酸/核酸子串比对专利全文与序列库（PATSEQ、Lens、Google Patents）；同时比对"全长CAR SEQ ID"中铰链‑TMD‑胞内域交界区段（约60–100 aa），避免只搜独立TMD库漏掉构件出现。 ·功能/结构层：检索式 CAR AND (transmembrane OR TMD OR hinge) AND (CD8α OR CD28 OR CD3ζ OR IgG4 OR ICOS OR 4-1BB) AND (dimerization OR oligomerization OR trimer OR crosstalk OR endogenous CD28) AND 靶标；重点关注"驱动二聚/三聚""与内源CD28异源二聚""设定激活阈值"等功能限定。 ·同族层：按靶标（CD19/BCMA/GPRC5D/CLDN18.2等）＋骨架（28ζ/BBζ/ICOS等）＋铰链‑TMD组合查关键申请人，逐代比对独立权与从属权。 ·组合风险：TMD与铰链、共刺激常"捆绑授权"，单独换TMD可能不足以规避整体权要（Muller发现提示CD28‑TMD的串扰特性本身可能成为区别特征）。 4）自有化开发与规避设计 ·规避路径：① 换用低串扰TMD（CD8α→CD4、或de novo proMP绝缘序列），尤其避免CD28‑TMD的极性异源二聚界面；② 改识别域/铰链/共刺激形成整体差异（不可只换TMD）；③ 用proCAR式可编程寡聚TMD形成自有IP，避开天然序列；④ 若必须用CD28‑TMD，定点突变极性/带电位以降低与内源CD28结合，并给头对头数据。 ·自有化撰写（支撑授权与FTO抗辩）：应提交— ① TMD的具体序列坐标、二硫键与极性残基定义、寡聚态（单/二/三聚）的实验测定（非还原WB、FRET、交联质谱）； ② 结构与建模（α螺旋二聚界面、MD/AlphaFold、端到端距离）； ③ 与参比TMD的头对头：原代T表面MFI与半衰期、抗原高/中/低EC50、无抗原tonic、重复刺激耗竭、体内持久； ④ 串扰证据：co‑IP证明是否与内源CD28/CD8/TCR‑CD3相互作用、抗CD28刺激增殖、内源受体表面表达变化； ⑤ 安全性：细胞因子释放谱（IFN‑γ/IL‑2/IL‑6）、CRS替代终点、on‑target/off‑tumor（正常组织抗原梯度）； ⑥ 绝缘性/免疫原性：MHC‑II/T细胞表位预测（NetMHCIIpan、IEDB），人源化评估。仅有"替换跨膜域可提高表达"的泛化描述，既难支撑创造性（天然序列选择常被视为常规），也不利于FTO抗辩。 5）FTO处置建议 ·立项窄查：靶标＋TMD候选（CD8α/CD28/IgG4/ICOS/4‑1BB/proMP）＋铰链/共刺激组合＋目标国； ·IND前全栈：TMD并入"识别域—铰链—TMD—共刺激—CD3ζ—靶标"整体同族比对，TMD单独出"低风"不成立；同步查核酸/载体、制造、适应症用途权要； ·若发现TMD落入他方（尤其CD28‑TMD的串扰功能权要），优先采用proMP绝缘序列或低串扰天然TMD（CD4/改造CD8α），并同步改其他模块； ·自由实施报告按"可规避／需许可／可无效／已到期"分类，TMD章节标注"构件风险＋串扰功能风险"双重属性。综上，跨膜域是CAR中"小而关键"的信号枢纽：其疏水螺旋、二硫键与极性残基共同编码寡聚态与串扰潜能；CD28‑TMD与内源CD28的异源二聚、CD3ζ‑TMD并入TCR、ICOS‑TMD结合Lck，说明TMD绝非惰性锚定杆；开发上应通过天然序列×寡聚态×极性/二硫×配对矩阵在原代T中筛选，并借鉴proCAR的可编程/绝缘化思路；专利上始终放回整体构建体同族评估，以结构与功能闭环数据支撑自有化。第六章胞内信号域：第一信号与共刺激的信号整合胞内信号域是CAR把“抗原结合”转化为“T细胞杀伤与增殖”的终端模块，通常由第一信号启动域CD3ζ与一个或多个共刺激域组合而成。其设计目标不是“信号越强越好”，而是在激活幅度、代谢重编程、耗竭程度、体内持久与细胞因子毒性（CRS，Cytokine Release Syndrome，细胞因子释放综合征）之间取得与靶标特征匹配的折中。 6.1 CD3ζ启动域：ITAM数量、位置与信号强度调控 1）CD3ζ与ITAM基本结构人CD3ζ胞内段含三个串联免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM，Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif），经典序列为YxxL/I‑X₆₋₈‑YxxL/I；抗原结合后Src家族激酶（Lck/Fyn）磷酸化ITAM酪氨酸，形成pYxxL接头，招募ZAP-70（Zeta-chain Associated Protein Kinase 70）并启动LAT/SLP-76、Ca²⁺、NFAT、NF-κB、MAPK级联。天然TCR复合物含CD3γ/δ/ε各1个ITAM、ζ同源二聚各3个ITAM，共约10个ITAM；二代CAR通常只用1条CD3ζ（3 ITAM）或与其他启动域组合，相当于把“天然多ITAM”压缩为可控启动单元。 2）ITAM数量工程 ·3 ITAM（野生型ζ）：标准第一信号，配合CD28常信号强、效应快，但高表达/易聚scFv下易tonic、早耗竭。 ·单ITAM：保留膜近端ITAM-A（常写作1XX，即仅A功能、B/C酪氨酸突变）可在CD28系CAR中降低激活幅度，偏向中央记忆（TCM，Central Memory）、提高持久；Feucht等在1928z背景证明单膜近端ITAM较3 ITAM减少终末分化与耗竭，且在低T细胞剂量Nalm6模型中持久控瘤，TRAC定点整合可排除CAR表达量干扰。另一综述汇总：单ITAM尤其膜近端可增强记忆与持久，但极低抗原下响应不足。 ·2 ITAM/选择性突变：如XX3（仅远端C功能）可增强持久但可能削弱短期杀伤；X2X（仅中段B）可降低凋亡与细胞因子；不同ITAM-A/B/C并非等效，ζAAA强信号、ζCCC弱信号但最抗耗竭与死亡。 ·超量ITAM：4-1BBζ低抗原不足时，附加第二条ζ（ζζ，共6 ITAM）可提高对CD19-low的敏感性而不显著升高PD-1/TIM-3/LAG-3；但ITAM过多在CD28背景下会加重tonic与CRS，需与共刺激、表达量协同校准。 3）ITAM位置与膜距离 ITAM距膜的远近影响Lck可及性与ZAP-70招募效率：膜近端ITAM-A磷酸化与信号贡献最大；远端ITAM-C更依赖高聚集/高抗原。CAR中若共刺激域置于ζ近端或远端，会改变ITAM有效顺序——例如“CD28膜近端＋ζ膜远端”为常见28ζ顺序，“4-1BB膜近端＋ζ膜远端”为常见BBζ顺序；换序可调节早期磷酸化与记忆/效应偏向，但必须与原代T头对头验证，不能仅按“都含3 ITAM”判断等价。 4）替代/补充启动域 ·CD3ε/γ/δ胞内段：CD3ε单磷酸化可招募Csk（C-terminal Src Kinase）负调，部分设计把ε片段置于CD28之前形成自限信号；CD3δ ITAM对SHP-1偏好不同于ζ，可用于细化阈值。 ·工程化启动域：如ZAP-70激酶域直接融合、CD3ε“RK motif”招募Lck、或人工ITAM序列替换天然ζ，用于降NFAT/升记忆；临床前显示可降炎症、保杀伤。 ·原则：第一信号强度应与抗原密度反相关——高密度靶用少ITAM/单ITAM降耗竭，低密度靶用多ITAM/双ζ或强共刺激补敏感，但须防tonic。 6.2 共刺激域的分类与功能：CD28家族与TNFR家族按起源分为两大类，信号性质、代谢与持久性差异显著。（1）CD28家族（IgSF，免疫受体酪氨酸共刺激基序驱动） ·CD28：通过胞内YMNM（PI3K/Akt）、PYAP（Grb2/Lck）、proline-rich（Itk/Lck）等基序激活PI3K-Akt、NF-κB、NFAT；代谢上偏有氧糖酵解（aerobic glycolysis），效应快、IL-2/IFN-γ/TNF-α/GM-CSF高，扩增强但易早耗竭。28ζ（CD28‑CD3ζ）代表如axi-cel类快速起效型。工程点：CD28中Asn→Phe（YMFM）降低PI3K过度激活、减耗竭、保记忆，是“rheostat”式弱化典型。 ·ICOS：与CD28仅关键残基差异（CD28含Asn、ICOS含Phe类基序），但下游偏向PI3K/Akt与转录重塑；ICOS胞内与ICOS-TM配合、膜近端放置最佳，单独ICOSζ或ICOS＋4-1BB可增持久；与CD28相比tonic/耗竭较低，但单ICOS效应常弱于CD28。 ·其他IgSF：CD2、CD7、CD28同源分子可用于特殊重定向，临床CAR经验有限。（2）TNFR家族（TRAF/NF-κB驱动，偏生存与氧化代谢） ·4-1BB（CD137）：胞内通过TRAF1/2激活NF-κB，经AKT/mTOR上调Bcl-xL、BFL-1，促进线粒体生物合成（TFAM、NRF1、NRF2、COX1）与氧化磷酸化（OXPHOS）；BBζ效应较慢但持久、中枢记忆多、CRS相对低。4-1BBζ代表如tisa-cel类。低抗原可加第二ζ或加4-1BB信号振幅；但某些载体/构建下4-1BB自身tonic可经TRAF2‑NF-κB促Fas依赖凋亡，需分别评估。 ·OX40（CD134）：TRAF依赖，偏生存、记忆与Th1样；常与CD28或其他域三联，单OX40ζ持久尚可但效应中等。 ·CD27：TRAF2/企鹅NF-κB与Akt并行，促进记忆与抗凋亡；在血液瘤与部分实体瘤CAR中用作“温和共刺激”，较CD28低炎症、较4-1BB中等效应。 ·其他TNFR：CD30、BAFF-R、TACI、HVEM等有条件用于降耗竭或特殊B细胞/骨髓瘤微环境，仍处于临床前/早期临床。（3）共刺激选择的功能对照表共刺激主要适配体/通路代谢效应速度持久性耗竭/CRS倾向典型适配场景 CD28 PI3K/Akt、NF-κB、NFAT 糖酵解为主快、强较短高CRS/易tonic耗竭高/中抗原、需快速缩瘤 ICOS PI3K/Akt、部分NF-κB 糖酵解＋一定氧化中中长（膜近＋ICOS-TM）较CD28低需记忆且避CD28高炎 4-1BB TRAF/NF-κB、AKT、Bcl-xL OXPHOS/线粒体慢、稳长低CRS、低tonic（但可特殊tonic）低中抗原、需长期持久 OX40 TRAF/NF-κB 混合中中长中联合共刺激、免疫记忆增强 CD27 TRAF2/Akt/NF-κB 氧化偏多中中长较低血液瘤辅助、降炎症 6.3 胞内域组合设计：代谢偏好、耗竭、持久性与CRS的平衡 1）按“第一信号×共刺激”双变量校准 ·强第一信号（3 ITAM）＋强共刺激（CD28）＝最大效应但高tonic/CRS；适用于高抗原、短疗程、可管理毒性的淋巴瘤。 ·强第一信号＋弱/中效共刺激（4-1BB）＝效应足够、持久更好、炎症较低；血液瘤低/中抗原常用。 ·弱第一信号（单ITAM/1XX）＋CD28＝降耗竭、保记忆，但低抗原可能不够；可加长铰链/高亲和补外段。 ·弱第一信号＋4-1BB＝最低炎症、最长持久，但低抗原/大肿瘤可能效力不足；可双ζ或加第二共刺激。 ·双共刺激（CD28＋4-1BB、ICOS＋4-1BB、CD28＋OX40）＝试图兼顾效应与持久，但信号非加性，常增加耗竭/CRS，仅推荐低抗原实体瘤或特定耐药模型，且须头对头。 2）代谢与耗竭指标联动 ·糖酵解偏向（CD28）用Seahorse测ECAR；氧化偏向（4-1BB）测OCR、基础/最大呼吸、线粒体DNA、TFAM、脂肪酸氧化（FAO，Fatty Acid Oxidation）；报告应同时给代谢表型与功能，不单看“扩增倍数”。 ·耗竭面板：重复抗原刺激后PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT、CTLA-4，配合TCF-1/LEF-1、CD62L、CCR7、CD45RA/RO区分祖耗竭/终末耗竭/记忆。CD28强ITAM易NFAT同质二聚、早耗竭；4-1BB、ICOS、单ITAM、CD3ε衰减可上移TCF-1＋干性。 3）CRS与体内安全平衡 ·体外：抗原梯度刺激后24–72 h上清IL-2、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-6；CD28系尤其看TNF/GM-CSF。 ·体内：NSG/人源化模型测体重、体温、血清IL-6/IFN-γ/TNF、脾脏/肺/肝CAR浸润、PD-1/TIM-3；神经毒性用ICANS评分（活动、抓力、惊厥）及脑脊液细胞因子。28ζ常急性高CRS，BBζ炎症较低但需看剂量与抗原密度。 ·降CRS工程：单/双ITAM校准、CD28 YMFM（把 CD28 胞内近膜信号基序 YMNM 突变成 YMFM，用来削弱过度激活、降低耗竭，间接减轻细胞因子释放综合征（CRS）风险）、ICOS替代、4-1BB替代（PI3K弱、NF‑κB/TRAF为主，细胞因子通常低于CD28ζ，持久更好）、低表达启动子（MND/减弱EF1α）、TRAC定点整合降随机高表达、外源开关（小分子降解域/达沙替尼可调）作安全层。 4）开发矩阵建议（固定外段，仅变胞内） ·第一信号：3 ITAM / 1XX / XX3 / ζζ（仅BB系低抗原） ·共刺激：无（一代对照）/ CD28 / ICOS / 4-1BB / OX40 / CD27 / CD28＋4-1BB ·顺序：共刺激膜近＋ζ膜远 vs ζ膜近＋共刺激膜远 ·表达：EF1α高（强组成型、CAR表面高密度）、MND中（病毒启动子、转导效率高但表面密度常低于EF1α）、TRAC定点低（用sgRNA切TRAC，AAV6/质粒供体把CAR cDNA敲入，用内源调控，两点同时发生：破坏内源TCRα→表面TCR/CD3下降/消失，异体产品降GVHD； CAR不再用EF1α/MND，而受TRAC内源启动子+增强子/染色质环境驱动。按靶抗原密度分高/中/低三档评EC50、杀伤、tonic、代谢、耗竭、体内持久与CRS，避免只以“体外杀伤最高”入选。 5）新共刺激域来源不要只盯着CD28/4‑1BB/ICOS/OX40/CD27，按功能家族建池更系统。经典T/NK/抗原提呈相关共刺激胞内域（ICD） ·TNFRSF：4‑1BB（TRAF→NF‑κB/p38，偏氧化代谢、记忆、持久）、OX40（NF‑κB/MAPK/PI3K，抗凋亡Bcl‑2家族、效应记忆）、CD27（与CD70三聚，扩增/抗凋亡/持久近似4‑1BB）、HVEM（双向，依配体/LIGHT→NF‑κB、Bcl‑xL；与BTLA/CD160可转抑制） ·CD28家族：CD28（YMNM/PRRP/PYAP→PI3K/AKT/ERK，快扩、糖酵解、高细胞因子但易耗竭/AICD）、ICOS（PI3K/AKT、细胞因子强，B7‑H3等实体瘤有优势） ·其他免疫受体ICD：NKG2D、DAP12、FCεRIγ、CD40（T细胞内表达可改造）、BAFF‑R、KLRG1（抑制性对照）等——CAR Pooling 40域库就覆盖了IgSF、TNFRSF、TREM、TIM、NK/B/髓系来源。先天/细胞因子/ Toll样类“非典型共刺激” ·MyD88‑CD40（可小分子二聚诱导，强增殖细胞因子，但NHP里可极度扩增、tonic高，需安全开关） ·TLR2/TIR、TLR类（TLR2 CD19/白血病有早期临床；偏先天激活） ·IL15Rα、IL2Rβ（含STAT3/5 YXXQ）、IL21R等“细胞因子受体ICD”作为第三信号，不叫严格共刺激但常放共刺激位。实体瘤/抑制微环境转换域 ·开关受体：PD1→CD28、TGFβR2→4‑1BB、CTLA4→CD28，把抑制信号转激活； ·装甲/TRUCK另算：NFAT驱动IL‑12/IL‑15/IL‑18，不纳入“共刺激ICD”主矩阵，作为附加层。 ·Dectin‑1（DC/髓系C型凝集素，CAR里可降终末分化、增记忆/细胞毒、降耗竭）。合成基序库（最值得做“新”的地方）不整段搬天然ICD，而是把信号基序模块化重组： ·增殖基序：CD28 YMNM/PRRP/PYAP、4‑1BB TRAF‑binding短段、ICOS PI3K基序； ·持久基序：4‑1BB非经典NF‑κB短段、CD27 TNFR短段、OX40抗凋亡短段； ·代谢/记忆基序：降mTOR、保FOXO/TCF1的截断版； ·安全基序：加入可酶切/小分子二聚/降解标签、与iCAR/synNotch耦合。 CAR Pooling思路证明：短模块化基序适合大规模合成库，比“整段天然受体”更容易归因。 6.4 专利FTO：MSK/CD28ζ、St.Jude/4-1BB、UPenn等核心专利与自由实施 1）胞内域专利的总体特点胞内信号域较“短且天然”，单独以CD3ζ序列授权价值有限；真正高风险的权要通常把“CD3ζ＋特定共刺激＋特定外段/靶标/载体”作为整体构建体，或以“ITAM数量/位置校准”“特定共刺激组合”“降低tonic的胞内突变”作为方法/产品权要。因此FTO不能只查“CD28胞内序列”，而要查整体CAR同族。 2）核心同族方向（检索用，不停留于单一专利号） ·MSK / 纪念斯隆凯特琳（Sadelain等）：二代CD28ζ（1928z类）、ITAM数量/位置校准（单ITAM、1XX、TRAC定位降低表达量干扰）、CD28弱化点突变、启动域组合；重点查其CD19/CD22等血液瘤构建体同族。 ·St.Jude / Juno / BMS系：4-1BBζ、BBζ低抗原加ζζ、共刺激＋ITAM组合、部分儿童/ALL适应症；Juno与St.Jude在CD19 BBζ、多共刺激上有交叉同族。 ·UPenn / Novartis系：早期二代/人源化CAR、CD19构建体、有时覆盖“识别域＋铰链＋跨膜＋共刺激＋ζ”整体；UPenn还在信号校准、外源开关与制备方法中有同族。 ·NCI/Kite/Gilead、MSK、Moffitt等：Kite多涉CD28ζ临床制备与靶标用途；其他机构覆盖OX40/CD27/ICOS、双共刺激、装甲型细胞因子。 ·企业同族：Juno/BMS、Novartis、Kite/Gilead、Autolus、Allogene、Cellectis（通用型）、国内CAR企业均把胞内域作为构件写入整体权要，检索须含申请人同义词。 3）检索式（中英文可拆分） ·序列/构件：CAR AND (CD3ζ OR CD3 zeta OR ITAM) AND (CD28 OR 4-1BB OR CD137 OR ICOS OR OX40 OR CD27) AND (hinge OR transmembrane OR scFv) AND target ·ITAM校准：CAR AND (ITAM number OR single ITAM OR 1XX OR membrane-proximal) AND (exhaustion OR persistence OR tonic) ·共刺激组合：CAR AND (CD28 AND 4-1BB) OR (ICOS AND 4-1BB) AND costimulatory domain AND FTO/target ·法律库：PATSEQ/Lens/Google Patents/PATENTSCOPE按SEQ ID查CD28胞内（约含YMNM/PYAP）、4-1BB胞内（TRAF结合区）、ζ ITAM全段；同时用功能词查“reduce CRS / improve persistence / calibrated activation”防规避设计落入等同。 4）规避与自有化撰写要求仅把“CD28换成4-1BB”或“3 ITAM改1 ITAM”通常不足以单独破整体专利；更稳妥路径： ·同时改外段（识别域/表位、铰链长度、TMD）＋胞内（ITAM数/位置、共刺激种类/顺序、点突变如YMFM、ε衰减、双ζ仅限特定低抗原）； ·提供头对头数据：不同ITAM配置的原代T pZAP70/pERK、抗原高/中/低EC50、无抗原tonic、重复刺激PD-1/TIM-3/TCF-1、Seahorse OCR/ECAR、体内持久与血清IL-6/IFN-γ/体重； ·若主张“降CRS/增持久”，说明书应给具体ITAM突变坐标、共刺激膜近/膜远顺序、与参比28ζ/BBζ的等效/优效边界；泛写“含共刺激分子的CAR”难以授权也难以抗辩。 ·商业化前按目标国（中/美/欧/日）逐件核法律状态：胞内域常作为从属权要，主风险在整体构建体同族；对核心专利按“可规避／需许可／可无效／已到期”分类，不凭“CD3ζ是天然序列”判断自由实施。胞内域设计的核心是“ITAM定幅度、共刺激定性质与代谢、整体顺序与表达量定安全边界”。高抗原可适度弱化第一信号以防耗竭，低抗原可加ITAM或选4-1BB补持久；专利上始终把CD3ζ/共刺激放回“识别域—铰链—跨膜—胞内—靶标—制备”全链路比对。经过三篇6个章节的拆解，我们终于将CAR结构的信号肽、抗原识别域、铰链区、跨膜域及胞内信号域五大物理模块，从分子结构、功能作用、工程化改造思路、实验验证方法到专利FTO要点进行了初步的了解，至于每一个具体理论的获取方法，还需要各位读者去查找相应的文献，进行具体的理论学习。然而，在实际药物研发中，绝不可能——也不应该——对每个模块都进行独立的深度工程化后再行拼装：一方面，模块间存在强烈的非线性关系，孤立优化单一模块极易因“组装效应”导致整体功能坍塌；另一方面，临床前资源（尤其是原代T细胞与体内模型）极为有限，穷举所有模块变异的组合在时间与成本上均不可行。因此，真正的设计理念应转向基于靶标特征的逆向设计——即以靶抗原的表位膜距离、糖基化状态、表达密度与异质性为起点，反向推导各模块的关键参数窗口，通过“固定核心骨架、变动关键变量”的方法不断优化候选结构。应进行分阶段的开发流程，按照：①计算预测与结构建模阶段；②报告系统/HEK293初筛阶段；③原代T验证阶段；④体内药效与安全性评估阶段。逐渐完善候选结构优化工作。与此同时，FTO与可开发性分析贯穿立项、候选锁定与IND申报全过程，确保自由实施。

细胞疗法免疫疗法

2026-09-13

·今日头条

一家正在冲刺港股IPO的创新药企，因为董事一句“滚开”，被推到了舆论中心。9月2日，时代周报记者就“易慕峰CAR-T临床试验受试者死亡事件”致电公司非执行董事李佳昕。对方回应：“滚开吧，烦死了。”比起这句失态回应，更值得关注的是电话背后，易慕峰生物科技有限公司（以下简称“易慕峰”）的临床事件。李

一家正在冲刺港股IPO的创新药企，因为董事一句“滚开”，被推到了舆论中心。9月2日，时代周报记者就“易慕峰CAR-T临床试验受试者死亡事件”致电公司非执行董事李佳昕。对方回应：“滚开吧，烦死了。”比起这句失态回应，更值得关注的是电话背后，易慕峰生物科技有限公司（以下简称“易慕峰”）的临床事件。李佳昕今年39岁，中国科学院上海药物研究所药理学博士，在生物科技与制药行业摸爬滚打了十年，2025年11月才坐上易慕峰非执行董事的位置。一个受过完整科研训练的人，接到记者求证电话时给出的反应是“烦死了”。这话放在私人场景里顶多算脾气不好，放在一家正在接受港交所审视的拟上市企业身上，味道就变了。资本市场看到的不是一个博士的情绪失控，而是这家公司在遭遇重大负面事件时，对外沟通的闸门到底握在谁手里。该出面的人没出面，不该接枪的人接了枪。把镜头拉回到今年3月。49岁的胃癌患者占某，2025年3月确诊胃食管结合部腺癌，在上海长海医院做了全胃切除术和六次化疗，后续恢复平稳，身体状态不错。2026年初，主治医生推荐他加入易慕峰的IMC002临床试验。妻子程女士回忆，当时医生告诉他们这款CAR-T疗法效果“可能可以好”，占某跟朋友提起时语气里是带着期待的。3月2日，输注药物数小时后，占某突发双侧硬膜下血肿、脑疝，紧急开颅手术后陷入长期昏迷，4月26日在ICU离世。一个家庭的转折来得太快。程女士后来说起一件事，至今让人心里发堵：输注当天下午，护理记录有一段空白，她几次发现丈夫叫不醒，跟医护人员反映，得到的回复是“在睡觉、补觉”。等再次检查时，瞳孔已经散大。事发之后，程女士翻出签署的《受试者主知情同意书》，发现风险告知里写着“CAR-T相关出凝血疾病”，但没有任何地方明确提到颅内出血、脑疝这类致命后果。她的话很直接：“如果知道有这样的风险，谁会参加这样的试验？”这个追问的分量不在于她一个人有没有被充分告知，而在于整个知情同意流程里，风险描述究竟做到了什么颗粒度。更让家属难以接受的是时间。从3月出事到4月离世，再往后数五个月，易慕峰方面没有主动联系过程女士。所有沟通都由医院转达，公司提出的方案是“人道主义补偿”，始终不松口承认死亡与试验药物之间的因果关系。医院伦理委员会那边，记者打过去电话，工作人员反问一句“你只是个记者是吗”，随即挂断。国家药监局、卫健委、法院，截至媒体报道时均未就这例死亡公开给出正式结论。而就在占某离世四个月后，8月18日，易慕峰第二次向港交所递交了上市申请。翻看更新后的招股书，公司对IMC002临床数据的披露截止到2025年12月31日，白纸黑字写着“未出现治疗相关死亡”。今年4月的事，招股书里找不到专项说明。更微妙的一处改动是，2月第一版招股书的风险因素里还有“尽管候选产品迄今为止在临床试验中表现出良好的安全性”这句话，8月第二版直接删掉了。删了这句话，却对删它的原因只字不提，这中间的空白比任何文字都响。易慕峰创始人孙敏敏是复旦药学博士，曾在复星凯特深度参与国内首款CAR-T产品奕凯达的申报上市，2020年出来创业，公司累计融资超过6亿元，估值到了20亿。就在不久前，孙敏敏还签署了一份《坚守科研伦理行业自律书》，第一条就写着“将受试者安全置于首位”。签字的笔迹还没干透，核心产品的III期试验里人就没了，招股书里连一笔都不肯落。这件事的症结从来不在CAR-T疗法本身有多大的不确定性。新药研发本来就是踩着失败往前走，临床试验出现严重不良事件，行业里并非没有先例。问题出在企业面对一个具体的人、一个具体的家庭时，选择了什么姿态。沉默四个月，递表前不更新关键数据，记者打电话来就骂回去，这套动作连在一起看，传递的信号很清晰：在这个故事里，受试者的命是数据点，家属的追问是麻烦，媒体的电话是噪音。一家公司可以管线华丽、团队光鲜、故事动听，但如果连“出了事之后怎么面对人”这件事都没学会，招股书再厚也只是纸。占某的妻子要的其实不多，一个清楚的交代，一份对生命的基本尊重。这个要求不该由她反复打电话、反复被挂断才能换来。各位读者你们怎么看？欢迎在评论区讨论。

100 项与阿基仑赛相关的药物交易

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外链

KEGG	Wiki	ATC	Drug Bank
D11144	-	L01	DB13915

研发状态

批准上市

10 条最早获批的记录,

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适应症	国家/地区	公司	日期
原发性纵隔大B细胞难治性淋巴瘤	韩国	Gilead Sciences Korea Ltd.	2025-08-13
高级别B细胞淋巴瘤	加拿大	Gilead Sciences Canada, Inc.	2019-02-13
复发性滤泡性淋巴瘤	欧盟	Kite Pharma EU BV	2018-08-23
复发性滤泡性淋巴瘤	冰岛	Kite Pharma EU BV	2018-08-23
复发性滤泡性淋巴瘤	列支敦士登	Kite Pharma EU BV	2018-08-23
复发性滤泡性淋巴瘤	挪威	Kite Pharma EU BV	2018-08-23
难治性滤泡性淋巴瘤	欧盟	Kite Pharma EU BV	2018-08-23
难治性滤泡性淋巴瘤	冰岛	Kite Pharma EU BV	2018-08-23
难治性滤泡性淋巴瘤	列支敦士登	Kite Pharma EU BV	2018-08-23
难治性滤泡性淋巴瘤	挪威	Kite Pharma EU BV	2018-08-23
B细胞淋巴瘤	美国	Kite Pharma, Inc.	2017-10-18
弥漫性大B细胞淋巴瘤	美国	Kite Pharma, Inc.	2017-10-18
滤泡性淋巴瘤	美国	Kite Pharma, Inc.	2017-10-18
大B细胞淋巴瘤	美国	Kite Pharma, Inc.	2017-10-18
纵隔大b细胞淋巴瘤	美国	Kite Pharma, Inc.	2017-10-18

未上市

10 条进展最快的记录,

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适应症	最高研发状态	国家/地区	公司	日期
T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤	临床3期	美国	Kite Pharma, Inc.	2018-01-25
T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤	临床3期	澳大利亚	Kite Pharma, Inc.	2018-01-25
T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤	临床3期	奥地利	Kite Pharma, Inc.	2018-01-25
T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤	临床3期	比利时	Kite Pharma, Inc.	2018-01-25
T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤	临床3期	加拿大	Kite Pharma, Inc.	2018-01-25
T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤	临床3期	法国	Kite Pharma, Inc.	2018-01-25
T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤	临床3期	德国	Kite Pharma, Inc.	2018-01-25
T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤	临床3期	以色列	Kite Pharma, Inc.	2018-01-25
T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤	临床3期	意大利	Kite Pharma, Inc.	2018-01-25
T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤	临床3期	荷兰	Kite Pharma, Inc.	2018-01-25

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临床结果

适应症

分期

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研究	分期	人群特征	评价人数	分组	结果	评价	发布日期


ASCO2026	N/A	大B细胞淋巴瘤	1,311	Axicabtagene ciloleucel	膚鹽繭選製窪壓鬱艱衊(膚襯夢鏇積繭齋窪繭鑰): HR = 0.86 (95.0% CI, 0.66 ~ 1.11) 更多	积极	2026-05-29
				Lisocabtagene maraleucel
ASCO2026	N/A	血液肿瘤	1,117	Cilta-cel	鹽積積觸顧齋簾製壓觸(構鏇選遞構夢獵築廠蓋) = 壓膚鬱鏇糧醖艱膚鏇願鑰廠窪糧夢願憲積繭糧 (積鹹製窪艱鏇鹹鬱餘襯 ) 更多	积极	2026-05-29
				Ide-cel	鹽積積觸顧齋簾製壓觸(構鏇選遞構夢獵築廠蓋) = 襯網築願醖構壓築遞壓鑰廠窪糧夢願憲積繭糧 (積鹹製窪艱鏇鹹鬱餘襯 ) 更多
ASCO2026	N/A	大B细胞淋巴瘤	1,446	Axicabtagene ciloleucel (axi-cel)	衊夢糧憲繭鹹觸積鏇夢(積鏇糧壓網淵遞繭鑰艱) = 蓋網糧餘築艱醖築遞醖鏇觸顧範廠廠鹹膚憲壓 (築鬱膚淵願壓醖築襯窪 ) 更多	积极	2026-05-29
ASCO2026	N/A	弥漫性大B细胞淋巴瘤	818	Axicabtagene ciloleucel (aged <70 years)	餘餘膚願構蓋鹽範觸衊(淵築膚糧鏇繭範鏇夢襯) = 鹹鹹夢廠繭齋淵構糧構鑰醖衊衊繭壓夢憲艱構 (選鑰築鬱鬱選淵遞選鬱 ) 更多	积极	2026-05-29
				Axicabtagene ciloleucel (aged ≥70 years)	餘餘膚願構蓋鹽範觸衊(淵築膚糧鏇繭範鏇夢襯) = 糧選獵糧顧鏇鬱構夢簾鑰醖衊衊繭壓夢憲艱構 (選鑰築鬱鬱選淵遞選鬱 ) 更多
ASGCT2026	N/A	B细胞白血病 \| B细胞淋巴瘤 \| 多发性骨髓瘤 ... 更多	469	Idecabtagene vicleucel (Abecma)	夢餘願構構齋膚製淵獵(網積膚餘艱觸餘簾觸壓) = 構艱艱餘襯鏇齋醖醖鹽憲範鬱顧觸範餘遞廠醖 (簾憲蓋築鑰衊衊簾鹹範 ) 更多	积极	2026-05-13
				Lisocabtagene maraleucel (Breyanzi)	夢餘願構構齋膚製淵獵(衊淵簾製衊糧鏇範網繭) = 願衊簾遞淵願觸選齋醖鏇顧壓壓顧鹽獵顧觸範 (衊鑰鏇範齋膚構廠夢製 )
EHA2026	N/A	二线	22	Axicabtagene ciloleucel	窪艱網網餘製餘觸壓觸(觸夢廠選製觸鑰繭鹽憲) = 製窪願壓鹹鹽醖壓積觸艱遞蓋鏇積齋築顧鹹簾 (齋範淵餘願遞蓋範願築 ) 更多	积极	2026-05-12
EHA2026	N/A	弥漫性大B细胞淋巴瘤	413	Axicabtagene ciloleucel (axi-cel) (2L)	鬱顧鹽鹹餘選齋願蓋壓(窪鏇鬱構鏇願製積齋憲) = 壓衊淵壓醖觸鏇願窪糧鬱夢顧願壓選艱積鬱憲 (繭製積齋繭窪艱鏇構鏇 ) 更多	积极	2026-05-12
				Axicabtagene ciloleucel (axi-cel) (≥3L)	鬱顧鹽鹹餘選齋願蓋壓(窪鏇鬱構鏇願製積齋憲) = 鏇遞醖窪選蓋鑰窪製夢鬱夢顧願壓選艱積鬱憲 (繭製積齋繭窪艱鏇構鏇 ) 更多
EHA2026	N/A	B细胞淋巴瘤巩固	5	Axicabtagene ciloleucel (axi-cel)	鑰簾餘積積簾憲鏇壓醖(廠築糧憲選簾築壓艱壓) = 構蓋蓋艱齋鬱衊觸齋願鏇鹽艱鏇獵選廠築衊構 (膚積觸範壓鹽膚鹽膚鑰 ) 更多	积极	2026-05-12
EHA2026	N/A	大B细胞淋巴瘤二线	311	Axicabtagene ciloleucel	夢襯齋構艱蓋廠蓋鹹淵(觸繭構製鬱餘積網襯鬱) = Cytokine release syndrome occurred in 95% of patients (grade 2-4: 37%; grade 3-4: 4%), and immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome in 47% (grade 2-4: 26%; grade 3-4: 12.5%). 壓憲鏇窪夢壓網選顧壓 (願選夢蓋醖願窪築鏇糧 ) 更多	积极	2026-05-12
				Standard chemoimmunotherapy (CIT) (transplant-eligible)
EHA2026	N/A	滤泡性淋巴瘤	92	axi-celliso-cel + axi-celliso-cel + axi-celliso-cel	廠觸廠壓夢繭廠膚構鑰(鹹淵餘鏇鑰醖窪襯糧鏇) = 築壓齋窪餘選製遞膚獵醖齋鹽觸製壓壓網艱鬱 (鑰構壓衊選夢繭窪襯遞 ) 更多	积极	2026-05-12