Edaravone

导读 肌萎缩侧索硬化症（ALS，渐冻症）是致命性神经退行性疾病，现有临床疗法获益有限，溶酶体功能障碍是其核心病理驱动因素。TFEB 是溶酶体生物发生的核心调控因子，而主流 mTOR 依赖型 TFEB 激活剂存在潜在安全风险。本研究中，澳门大学中药质量研究国家重点实验室、广州医科大学附属第五医院，联合帝国理工学院、奥斯陆大学等机构，通过 AI 驱动的虚拟筛选工作流，从超百万化合物中锁定天然小分子异银杏双黄酮（ISO）为新型 mTOR 非依赖型 TFEB 激活剂。研究证实 ISO 可作为 ATP 竞争性抑制剂，靶向结合 GSK-3β 的 Lys85 位点，通过 GSK-3β–TFEB 信号轴促进 TFEB 核转位，增强溶酶体功能，最终保护 ALS 患者 iPSC 来源运动神经元免于变性，为 ALS 治疗提供了全新候选药物与可成药靶点。 研究背景解读 肌萎缩侧索硬化症（ALS，又称渐冻症）是一种罕见、进行性且致命的神经退行性疾病，核心病理特征为大脑与脊髓运动神经元进行性变性死亡，最终导致患者肌肉萎缩、呼吸衰竭，目前临床获批的利鲁唑、依达拉奉等药物仅能有限延缓病程，无法逆转病理损伤，存在巨大的未满足临床需求。溶酶体功能障碍已被证实是 ALS 的核心病理驱动因素，C9orf72、TARDBP、TBK1 等多个 ALS 致病基因的突变，均会直接损伤溶酶体功能，进而引发运动神经元变性。转录因子 EB（TFEB）是溶酶体生物发生的核心调控因子，其药理学激活是恢复溶酶体功能的核心策略，但现有主流 TFEB 激活剂多依赖 mTORC1 抑制，而 mTOR 是细胞代谢、增殖与免疫稳态的关键调控因子，长期抑制会带来严重的潜在不良反应。因此，开发 mTOR 非依赖型 TFEB 激活剂，成为 ALS 治疗药物研发的关键方向，而 AI 技术的发展也为超大化合物库的高效筛选提供了全新技术路径。 研究思路解析 本研究以 “靶向 mTOR 非依赖的 TFEB 激活，改善 ALS 溶酶体功能障碍，实现运动神经元保护” 为核心科学问题，构建了 “AI 驱动虚拟筛选 - 分子机制解析 - 病理功能验证” 的全链条研究思路。首先，搭建 AI 驱动的配体虚拟筛选与结构虚拟筛选整合工作流，以 15 个已知 mTOR 非依赖型 TFEB 激动剂为参考，对超百万级化合物库进行初筛，再通过 GPU 加速的分子对接技术，对初筛候选物与 908 个自噬 - 溶酶体通路蛋白进行大规模交叉对接，排除对 mTOR 有潜在亲和力的化合物，最终锁定核心候选小分子异银杏双黄酮（ISO）。其次，通过细胞生物学、生物化学与结构生物学实验，系统解析 ISO 激活 TFEB 的分子机制，明确其直接作用靶点、结合位点与酶学抑制特性。随后，利用 ALS 患者脑组织样本与患者 iPSC 来源运动神经元模型，验证 ALS 病理状态下的溶酶体功能障碍，并系统评估 ISO 对 ALS 运动神经元的保护作用及通路依赖性。最终，明确 ISO 作为 ALS 治疗候选药物的潜力，同时验证 AI 辅助药物筛选平台在神经退行性疾病新药研发中的应用价值。 主要研究结果展示 本研究通过 AI 驱动的虚拟筛选工作流，成功从 115 万余个化合物中筛选出 4 个银杏来源的双黄酮类化合物，均能有效诱导 TFEB 核转位，其中异银杏双黄酮（ISO）可显著以 mTORC1 非依赖的方式促进 TFEB 核转位，上调溶酶体相关蛋白表达，增强溶酶体数量与水解活性，且不影响泛素 - 蛋白酶体系统的正常功能。机制研究证实，ISO 可直接靶向结合 GSK-3β 蛋白，是 GSK-3β 的 ATP 竞争性抑制剂，其核心结合位点为 GSK-3β ATP 结合口袋内的 Lys85 残基；ISO 通过结合该位点抑制 GSK-3β 激酶活性，减少其对 TFEB Ser134/138 位点的磷酸化，进而调控 GSK-3β–TFEB 信号轴，促进 TFEB 核转位与溶酶体生物发生。病理验证发现，ALS 患者脑组织与 iPSC 来源运动神经元中均存在显著的溶酶体功能障碍；ISO 处理可有效激活 ALS 运动神经元中的 GSK-3β–TFEB 轴，恢复溶酶体功能，减少神经突病理损伤，降低神经元死亡率，发挥显著的运动神经元保护作用，且该保护效应可被 GSK-3β 过表达完全逆转。 >> 图 1 GPU 加速的虚拟筛选流程用于鉴定新型 mTOR 非依赖型 TFEB 核转位激动剂 基于 AI 驱动的配体虚拟筛选技术，以 15 个已知 mTOR 非依赖型 TFEB 激动剂为参考，对 1155606 个化合物的商业库进行筛选，得到 1745 个结构相似度＞0.65 的候选化合物；对 1745 个化合物与 908 个自噬 - 溶酶体通路相关蛋白进行大规模交叉对接，排除对 mTOR 有潜在亲和力的化合物，按平均对接评分筛选出前 20 个候选分子；前 20 个候选物中包含 4 个银杏来源的 3′-8''- 双黄酮类化合物（白果双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮）；活细胞成像验证，4 种化合物均能显著诱导 TFEB-EGFP HeLa 细胞中 TFEB 的核转位。 >> 图 2 异银杏双黄酮（ISO）促进 TFEB 核转位并增强溶酶体生物发生与功能 核质分离实验证实，ISO 处理可显著促进 HeLa 细胞中 TFEB 的核转位；免疫印迹结果显示，ISO 不影响 mTORC1 下游底物的磷酸化水平，证实其以 mTORC1 非依赖的方式激活 TFEB；ISO 处理可显著上调溶酶体膜蛋白 LAMP2、成熟型组织蛋白酶 B/CTSB、成熟型组织蛋白酶 D/CTSD 的表达；活细胞成像证实，ISO 处理显著增加功能性溶酶体数量，提升溶酶体水解酶活性，该结果在 SH-SY5Y 细胞中得到验证；ISO 处理不会损伤泛素 - 蛋白酶体系统的正常功能。 >> 图 3 异银杏双黄酮（ISO）直接结合 GSK-3β 并抑制其激酶活性 整合靶点预测与热蛋白质组图谱结果，锁定 GSK-3β 为 ISO 的核心潜在结合靶点；等温滴定量热法与细胞热位移实验证实，ISO 在体内外均可直接结合 GSK-3β 蛋白；体外激酶实验证实 ISO 可显著抑制 GSK-3β 激酶活性，测得 IC50 为 16.97 μM；细胞实验显示，ISO 可抑制 GSK-3β 下游底物 β- 连环蛋白、c-Myc 的磷酸化，同时降低 TFEB 的磷酸化水平；TFEB S134D/S138D 磷酸化模拟突变体可完全阻断 ISO 诱导的 TFEB 核转位，抑制 GSK-3β 上游通路后 ISO 仍能发挥作用，证实 ISO 通过直接结合 GSK-3β 发挥功能。 >> 图 4 异银杏双黄酮（ISO）是 GSK-3β 的 ATP 竞争性抑制剂 GSK-3β 截短实验证实，其激酶结构域是 ISO 发挥作用的必需结构，截除激酶结构域后，GSK-3β 无法阻断 ISO 诱导的 TFEB 核转位；分子对接结果显示，ISO 可与 GSK-3β ATP 结合口袋内的 Lys85、Tyr134、Asp200 残基形成氢键；等温滴定量热法证实，Lys85 位点突变可使 ISO 与 GSK-3β 的结合亲和力下降超 10 倍，是 ISO 的关键结合位点；酶促动力学实验与 Lineweaver–Burk 作图证实，ISO 是 GSK-3β 的 ATP 竞争性抑制剂，高浓度 ATP 可逆转 ISO 对 GSK-3β 的抑制效应；Lys85 位点突变会导致 GSK-3β 激酶失活，且该突变体无法阻断 ISO 诱导的 TFEB 核转位，证实 Lys85 是 ISO 发挥抑制作用的核心位点。 >> 图 5 ALS 患者样本与 iPSC 来源运动神经元中存在溶酶体功能障碍 ALS 患者脑组织样本中，溶酶体相关蛋白 LAMP2、成熟型 CTSB 的表达水平较健康对照显著降低，证实 ALS 患者存在中枢溶酶体功能障碍；成功将 4 株健康对照 iPSC、4 株 ALS 致病突变（TARDBP A315T/A382T、SOD1 G94A/D90A）iPSC 分化为 MAP2+/HB9 + 运动神经元，磁珠分选后运动神经元富集度超 85%；成熟培养 28 天的 ALS 运动神经元中，LAMP2、成熟型 CTSB 的表达水平较健康对照显著下调；活细胞成像证实，ALS 运动神经元的功能性溶酶体数量、溶酶体水解酶活性均较健康对照显著降低。 >> 图 6 异银杏双黄酮（ISO）通过 GSK-3β–TFEB 信号轴改善 ALS 运动神经元的溶酶体功能 750 nM ISO 处理无明显细胞毒性，可显著诱导 4 种 ALS 运动神经元中 TFEB 的核转位；ISO 处理可抑制 ALS 运动神经元中 GSK-3β 活性，上调 LAMP2、成熟型 CTSB 的表达，促进溶酶体生物发生；ISO 处理可显著提升 ALS 运动神经元的功能性溶酶体数量与溶酶体水解酶活性；ISO 处理可显著减少 ALS 运动神经元神经突串珠样肿胀的比例，降低 LDH 释放，减轻神经元损伤，提升神经元存活数量；过表达 GSK-3β 可阻断 ISO 诱导的溶酶体功能改善，同时削弱其神经保护效应，证实 ISO 的保护作用依赖于 GSK-3β–TFEB 信号轴。 总结 本研究首次证实天然小分子异银杏双黄酮（ISO）可作为新型 mTOR 非依赖型 TFEB 激活剂，通过靶向 GSK-3β–TFEB 信号轴改善溶酶体功能障碍，发挥 ALS 运动神经元保护作用，为 ALS 治疗提供了全新的可成药靶点与候选药物分子；同时建立的 AI 驱动的超大库虚拟筛选工作流，也为神经退行性疾病的新药研发提供了高效、可拓展的技术范式。研究仍存在多方面局限性：其一，配体虚拟筛选依赖已知 TFEB 激动剂的结构，限制了阳性化合物的化学多样性，预测结果偏向已知结构骨架；其二，仅明确了 ISO 通过 GSK-3β–TFEB 轴发挥神经保护作用，尚未探究 ISO 是否存在其他作用靶点与潜在药理机制；其三，仅在细胞模型中完成了药效验证，尚未在 ALS 动物模型中开展体内药效、药代动力学与长期安全性评价；其四，GSK-3β 具有多效生物学功能，其长期抑制可能存在潜在致瘤风险，ISO 的组织特异性作用与长期安全性仍需系统的临床前评价，同时需对 ISO 进行结构优化，进一步提升其成药性与靶点选择性。 参考文献 Li A, Xiao X, Liu G, Li K, Ling Y, Deng S, Xu C, Cao SQ, Wen J, Lu G, Yang G, Fang EF, Qin D, Su H. Isoginkgetin protects against degeneration of ALS motor neurons via regulating the GSK-3β-TFEB signaling axis. Pharmacol Res. 2026 Mar 28;227:108172. doi: 10.1016/j.phrs.2026.108172. Epub ahead of print. PMID: 41912102. 实验环境及线上交流实录 线上交流实录 （为保护隐私，已对所有声音转变音色处理） 实验室环境实录