Atazanavir Sulfate

G蛋白偶联受体（GPCR）是哺乳动物细胞感知激素、神经递质等多种胞外信号的关键膜蛋白家族，具有七次跨膜结构（此处突然想到 Yi Rao老师），在调节生理和病理过程中发挥重要作用。GPCR也是药物研发的重中之重——约三分之一的已上市药物以GPCR为作用靶点。经典GPCR信号传导模型中，受体被配体激活后首先与异源三聚体G蛋白偶联，触发下游第二信使（如cAMP、Ca^2+等）的产生。然而，激活后的受体很快被GPCR激酶（GRK）磷酸化并招募β-arrestin（又称β-阻断蛋白），后者与受体胞内尾部结合，引发受体的脱敏和内化，从而终止G蛋白通路信号。大量GPCR-β-arrestin复合物的结构研究表明，β-arrestin通常通过其“指环”结构插入受体的胞内核心区域，与G蛋白结合位点重叠，因此G蛋白和β-arrestin对受体的结合往往是相互排斥的。这种“G蛋白 vs. β-arrestin”竞争机制在进化上确保了信号的及时终止和调控，但对于需要持续信号的生理过程来说，β-arrestin介导的快速脱敏可能反而限制了药物疗效。 为克服上述限制，“偏向性激动剂”（biased agonist）的概念应运而生。所谓偏向性激动剂，是指能够选择性激活GPCR某一支路（G蛋白或β-arrestin）的配体，相比传统平衡激动剂同时激活两条通路，偏向性激动剂可在保留有益信号的同时减少另一通路介导的不良作用。例如，激动μ阿片受体（μOR）的镇痛药若偏向G蛋白途径则可减少β-arrestin介导的耐受等副作用，激动β_2肾上腺素受体的抗哮喘药物如能减少β-arrestin介导的受体内化与脱敏将降低耐药性。尽管学界已开发出多种GPCR偏向性配体，但通常只能做到相对偏向，难以完全避免另一通路。GPCR信号偏向性的调控机制仍在深入研究中。 GPCR根据其与β-arrestin的结合亲和力，一般分为两大类：class A（瞬时结合型，β-arrestin易解离）和class B（稳定结合型，β-arrestin紧密结合）。后者包括典型的甲状旁腺激素受体PTH1R、血管加压素V_2受体等，这类受体的磷酸化胞内尾巴对β-arrestin具有高亲和力，即使受体内化后仍能保持与β-arrestin的结合，从而在内吞泡中持续激活G蛋白通路。在class B型受体中，由于β-arrestin主要通过结合受体磷酸化尾部（尾部介导型结合模式），并不占据受体胞内G蛋白结合位点，因此受体可以同时束缚G蛋白和β-arrestin形成“三元复合物”。例如，V_2受体或PTH1受体在细胞内吞后仍能维持cAMP等第二信使的产生，被认为正是受益于这种“三元信号复合物（megaplex）”的形成。相比之下，大多数class A型GPCR的胞内尾部较短，与β-arrestin亲和力低，β-arrestin往往通过“指环”插入受体七跨膜核心（核心介导型结合），从而排斥G蛋白。因此传统观点认为class A受体不会与G蛋白和β-arrestin同时形成稳定复合物。这一陈规在2019年被一定程度打破：美国杜克大学的研究者通过构建带有V_2受体尾巴的β_2肾上腺素受体嵌合体（即“β_2V_2R”），首次解析了包含G蛋白和β-arrestin的GPCR“三元超复合物”结构。在该嵌合体中，β-arrestin完全依赖V_2R长尾巴结合，而受体核心仍能腾出空间结合G蛋白。这一研究提示，对于原本不与β-arrestin稳定结合的class A受体，如果通过某种方式引入类似class B受体的尾部作用，也可能人为构建出“三元复合物”（学界形象地称为Mega-complex或Mega-plex）。然而，在天然条件下，class A受体的G蛋白和β-arrestin信号仍被视为基本互斥。有没有可能无需改变受体本身，而是通过其它途径让经典class A GPCR同时招募G蛋白和β-arrestin、实现“双通路齐发”呢？2026年发表在Cell的一项研究给出了令人耳目一新的答案。 Atazanavir：酵母SPS筛选发现的广谱GPCR变构激活剂 为寻找能延长GPCR信号的新策略，清华大学药学院刘翔宇课题组发展了一种创新的酵母生长筛选平台。该方法称为“生存压力筛选（Survival Pressure Selection, SPS）”，核心思想是将GPCR激活事件与酵母的生长表型关联起来。具体而言，研究人员将待筛选的人源GPCR和小型G蛋白miniGs分别与酵母色氨酸合成必需酶Trp1p的两个片段融合表达。当GPCR遇到能激活它的分子时，miniGs会与受体偶联，从而使Trp1p的两片段靠近复性，恢复色氨酸合成能力，使酵母在缺色氨酸培养基中存活生长。该方法利用酵母的抗逆生长报告信号，大大延长了检测窗口并降低成本，被证明对不同GPCR具有通用性。研究团队首先以GPR119受体为靶点建立SPS系统，并在约12,000个候选化合物中进行中等规模筛选。结果，在促使酵母生长的顶尖30个化合物中，他们意外发现了一种已获FDA批准用于抗HIV的药物Atazanavir。Atazanavir（阿扎那韦）是一种HIV蛋白酶抑制剂，结构骨架与已知GPR119激动剂完全不同。进一步细胞实验验证表明：Atazanavir可在无其他配体情况下直接激活GPR119，引发Gs蛋白介导的cAMP累积，以及β-arrestin的招募（基于NanoBiT报告）。其活性浓度（EC_50）在微摩尔级，表明Atazanavir本身即为GPR119的变构激动剂/正向变构调节剂（PAM）。 图1：利用酵母SPS系统筛选GPCR变构激动剂的策略和Atazanavir对GPR119的激活效应。 (A) GPR119-SPS筛选系统示意图：GPCR与Trp1p-CTD融合，小型G蛋白miniGs与Trp1p-NTD融合，受体激活促使两片段复性，使色氨酸营养缺陷型酵母在无色氨酸培养基中生长。(B) Atazanavir的化学结构式。（C）GPR119-SPS酵母在6天内的生长曲线，比较已知GPR119激动剂AR231453、筛选命中的Atazanavir与未加激动剂的对照。Atazanavir显著促进酵母生长，表明其能激活GPR119使miniGs募集。（D）Atazanavir在CHO细胞中诱导GPR119产生cAMP（Gs通路），（E）Atazanavir诱导NanoBiT报告的β-arrestin招募（偏向β-arrestin通路）。实验显示Atazanavir在两种检测试验中都有显著效力，证明其为GPR119的功能性激动剂。（F-H）（图1F-H省略，展示Atazanavir在GPR119结合位点的两种构象及关键位点突变影响等）。 值得注意的是，虽然Atazanavir可直接激活GPR119，但药理研究进一步提示其作用机理不同于传统正竞争性激动剂。Atazanavir与GPR119的正交激动剂AR231453联合作用时，能够提高后者的效力（降低EC_50并提升E_max），说明Atazanavir对GPR119具有正变构调节作用。换言之，Atazanavir可能结合于受体的别构位点，通过稳定受体构象来增强正激动剂作用或直接激活受体。这一推测很快得到结构生物学验证：作者解析了GPR119与Atazanavir结合的冷冻电镜结构（3.3Å分辨率），发现Atazanavir结合在受体跨膜6和7的胞内侧浅袋中（靠近G蛋白结合部位的膜内侧裂隙），这一位置与以往报道的一些GPCR别构调节剂类似。在GPR119受体中，引入Atazanavir结合口袋处的氨基酸突变（如R6.35D, S6.38W等）会选择性削弱Atazanavir的激活效应而不影响正激动剂作用，进一步支持了Atazanavir作为别构药物的作用模式。 更令人惊喜的是，Atazanavir并非“专一”针对GPR119。作者后续选取了数种代表性class A GPCR，发现Atazanavir能够跨受体激活多个GPCR，包括典型的Gs偶联受体β_1、β_2肾上腺素受体，Gi偶联的μ型阿片受体（μOR），以及Gq偶联的M_3胆碱受体和α1A肾上腺素受体等。在细胞实验中，Atazanavir对这些受体的激动效力多在微摩尔水平，但有趣的是，对于β_1AR和β_2AR，Atazanavir可达到与完全激动剂异丙肾上腺素相当甚至更高的最大响应；对M_3R和α_1AAR，Atazanavir表现为部分激动剂（E_max低于完全激动剂）且效力偏低；对μOR同样是低效部分激动作用。这些结果表明，Atazanavir可以作为广谱的GPCR正变构调节剂（pan-PAM），在多个class A受体中诱导信号。进一步分析发现，Atazanavir之所以具有“泛受体”活性，可能因为它结合的胞内浅袋位点在很大比例的class A受体中序列是保守的：约58%的class A受体在6.35位有精氨酸/赖氨酸，77%在6.39位为小疏水残基（A/V/I/L）。这些关键位点正是Atazanavir结合口袋的构成元件之一。这意味着Atazanavir的“锚定点”在许多受体中存在，从而赋予其跨受体的活性。实际上，作者还验证了Atazanavir可与β_1AR-G_s复合物形成稳定结合，其结合姿态与在GPR119中高度相似。综上，Atazanavir成为研究GPCR功能的新工具，有望应用于孤儿受体等缺乏配体的GPCR功能研究。 图2：Atazanavir作为广谱别构激动剂，可激活多种不同G蛋白偶联类别的classA受体。 (A) Atazanavir结合位点在class A受体中具有一定保守性（GPCRdb分析不同受体在该位点的序列保守性，高保守位以蓝色标示）。(B) Atazanavir激活Gs蛋白偶联受体β_1AR和β_2AR，引发cAMP积累（GloSensor荧光报告）。(C) Atazanavir激活Gi偶联受体μOR，引发适度的cAMP下降（Gi抑制效应，通过共表达Gα_s测定净效应）。(D) Atazanavir激活Gq偶联受体M_3R和α_1AAR（通过G_s/_q嵌合G蛋白将Gq信号转换为cAMP升高检测）。实验表明Atazanavir在上述受体上皆有一定内在活性，但在Gq、Gi耦联受体上效能相对较弱。(E) Atazanavir与β_1AR-G_s复合物的冷冻电镜结构（3.13Å），可见Atazanavir（天蓝色）与正交激动剂肾上腺素（印度红）同时存在于受体。（F）对比Atazanavir在β_1AR（蓝）和在GPR119（红）中的结合构象，二者位置总体相似，在β_1AR中略偏向TM7方向。(G, H) 野生型多巴胺D1受体（D1R）对Atazanavir无响应，但当将D1R的关键位点突变为β_1AR对应残基（L7.48F/F7.55R，即D1R-2mut）后，可恢复对Atazanavir的部分响应。(I) 比较D1R（浅绿色）与β_1AR（银色）Atazanavir结合口袋残基差异：D1R的F7.55位置（红色）对Atazanavir形成位阻，被认为是D1R不被Atazanavir激活的原因。上述结果确立了Atazanavir“广谱别构激活”GPCR的作用特点，也凸显了受体胞内6/7位点残基对这种调节机制的重要性。 “三元mega复合物”的形成及“钟摆式”β-arrestin结合模式 除了直接激活多种GPCR外，Atazanavir更具突破性的一点在于：它使classA受体首次能同时结合G蛋白和β-arrestin，形成稳定的三元信号复合物。研究团队注意到，Atazanavir对GPR119等受体产生了异常持久的激活效应：在细胞实验中，Atazanavir触发的cAMP信号可持续超过1小时，而正常情况下典型激动剂的GPCR信号会因受体内化/脱敏在数分钟内衰减。这提示Atazanavir可能在受体内化后仍保持其激活状态。进一步共定位分析证明，加入Atazanavir后受体不仅与G蛋白结合，也同时招募了β-arrestin，而且受体-β-arrestin复合物主要滞留于细胞内的早期内体而非被迅速分解。换言之，Atazanavir将传统上“此消彼长”的两条信号分子共聚到了同一个受体上，使其不再相互竞争，而是共存协同。这种由Atazanavir诱导的GPCR-G蛋白-β-arrestin“三元mega复合物”为class A GPCR持续传递信号提供了全新途径。 为了直接证实三元复合物的形成机制，作者利用Atazanavir稳定了受体-G蛋白-β-arrestin复合物并进行了冷冻电镜结构解析。他们以β_2肾上腺素受体（β_2AR）为模型受体进行实验（对β_2AR进行了3处突变以增强信号稳定性），在结合Atazanavir、Gs蛋白、β-arrestin 1等组分的条件下获得了分辨率约3.2Å的复合物结构。这是首个原生class A GPCR的三元复合物近原子分辨率结构。结构中可以清晰地看到：β-arrestin 1（蓝色）与受体胞内侧的结合模式非同寻常，并非经典结构中通过指环插入受体核心，而是主要通过其C末端C-域与受体靠近跨膜6和7（TM6/TM7）的位置接触。更具体地，β-arrestin上的一段称为“197环”（包含残基R188-L197）的区域紧贴受体第6、7跨膜的内侧，并插入了Atazanavir分子。Atazanavir（暗红色）恰好夹在受体（棕褐色）和β-arrestin（蓝色）的界面间，如同一块“分子胶水”将两者粘连在一起。在Atazanavir的稳定作用下，β-arrestin 1的C-域牢牢锚定在受体胞内口附近，而其N-域则远离受体核心、靠近G蛋白（Gs）的位置。这种β-arrestin相对于受体“一头连结、一头摇摆”的非常规构象，被作者形象地称为“钟摆式”（pendulum）结合模式。由于β-arrestin仅通过C-域少量界面附着受体，而未大量接触核心区，其N-域的指环区域在该结构中暴露在溶剂中、没有插入受体内部。有趣的是，β-arrestin 1在此结构中的构象与其绑定不同核苷酸状态Gs蛋白时均相容，这意味着只要Atazanavir在位，β-arrestin的存在并不妨碍G蛋白反复激活受体。这正解释了为何Atazanavir能支持GPCR长效的G蛋白信号输出。 此外，结构解析和功能实验一致表明：Atazanavir诱导的三元复合物不依赖受体的磷酸化尾巴。传统情况下，classA受体需经GRK磷酸化尾部招募β-arrestin并形成稳定复合物；然而在本研究中，无论是GPR119还是β_2AR，截断其C末端尾巴后仍能在Atazanavir存在下形成三元复合物，而常规正激动剂则无法在无尾巴的受体上招募β-arrestin。同时质谱检测表明，Atazanavir并不妨碍受体正常的尾部磷酸化及β-arrestin对尾部磷酸基序的识别——它只是先行一步将β-arrestin锚定在受体附近，从而为尾部与β-arrestin的结合创造条件。换句话说，Atazanavir稳定的“胶水”作用使β-arrestin即便未抓住受体尾巴也能与受体同处一复合物中，这不仅延长了G蛋白的结合时间，也可能间接促进了尾部磷酸信号与β-arrestin的结合。作者将Atazanavir诱导的这一新型三元复合物称为class A GPCR信号调控的“非典型途径”，与传统偏向性激动剂回避β-arrestin的做法完全不同。 值得一提的是，通过对比分析其他已报道的GPCR-β-arrestin复合物结构（例如神经降压素受体NTSR1、M_2胆碱受体、5-HT2B受体等），研究者发现Atazanavir诱导的β-arrestin构象与此前所有“核心结合型”结构都截然不同。反而，在某种程度上，它更类似于此前β_2V_2R嵌合体结构中的“尾部结合型”模式，只是如今不需要尾巴也能实现这一点。这提示“钟摆式”的β-arrestin结合模式可能代表了一种此前未被认识的普遍机制：即β-arrestin可以预先以一种松散姿态停留在受体附近，等待其他因子的稳定（比如此处的变构分子），从而进一步诱导下游信号。虽然目前尚不清楚细胞内是否存在类似Atazanavir的内源性分子来介导该过程，但这一发现无疑为GPCR信号调控提供了全新视角。 通讯作者简介 本项研究的通讯作者为清华大学药学院的刘翔宇副教授和其博士生、现为加州大学旧金山分校（UCSF）博士后的许心宇博士。刘翔宇本科和博士毕业于北京大学，曾在丹麦奥胡斯大学交流，并先后在北大和清华大学从事博士后研究。2019年起加入清华药学院任青年研究员（现为副教授），建立了独立课题组，研究方向聚焦于GPCR的结构生物学和基于结构的药物设计。刘翔宇实验室近年在Science、Nature、Cell等期刊发表多项成果，包括解析β2受体别构调节机制、提出GPCR-G蛋白复合物形成的动态模型、开发新的GPCR融合蛋白稳定技术等，在GPCR信号传导与药物发现领域成绩斐然。共同通讯作者许心宇2015–2020年于清华大学攻读博士，在刘翔宇课题组参与了多项GPCR结构研究工作，包括揭示肾上腺素能受体配体选择性机制等。目前她在美国UCSF从事博士后研究，继续深耕GPCR信号转导的分子机制研究。 启示与展望 刘翔宇团队的这项工作为GPCR信号调控提出了一种范式转变式的新思路。传统偏向性药物研发旨在避免或减少β-arrestin路径，以便专注触发有益的G蛋白信号；而Atazanavir策略恰恰相反，它并不试图减少β-arrestin的结合，而是鼓励β-arrestin与G蛋白共存，通过充当“分子胶水”让受体同时牵手两种信号分子。这种共聚并不导致信号互相干扰，反而因为阻止了β-arrestin将受体隔离内化，使受体能够在更长时间内持续激活G蛋白。对于需要长期激活而又避免脱敏耐受的病理情况，例如慢性疼痛用药中的阿片受体、支气管哮喘治疗中的β_2受体等，传统偏向性激动剂虽有益处但难以完全杜绝耐受。Atazanavir提供了另一种思路：通过辅助分子稳定受体的“三元状态”，让受体一边“牵着”G蛋白不断传递主信号，一边“牵着”β-arrestin避免过度激活并维持受体准备状态，从而达到更精细的信号调控。这一策略有望减少因β-arrestin引发的受体降解和敏感性丧失，在维持疗效的同时降低耐受发生。 当然，将Atazanavir本身发展为药物可能受限于其原有适应症和作用广谱性带来的副作用。但这一发现的重要意义在于，它为设计新型GPCR调节剂打开了大门。未来可以设想开发类似“胶水”作用的变构分子，特异地作用于某些GPCR，使之诱导有利的“三元复合物”信号。对于某些疾病相关受体（如本文的GPR119在代谢调节中的作用）、以及迄今缺乏有效配体的孤儿GPCR，这类分子都将是宝贵的研究和治疗工具。此外，本研究证明了通过改造筛选体系（如酵母SPS）来发现别构活性分子的可行性，为GPCR药物筛选提供了新范式。总而言之，GPCR-G蛋白-β-arrestin三元mega复合物的成功构建及结构解析，突破了长期以来对class A受体信号互斥性的认知，为GPCR生物学和药物研发带来了全新的启发。我们可以期待，在这一思路指引下，未来会有更多“第三类”GPCR调节剂问世，实现对受体信号更长效、更精准的控制，造福慢性疾病等领域的治疗需求。