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点击上方蓝字 关注我们 这里是研之有理 专注医学核心期刊文献深度解析，为临床医师、医学生、科研工作者筛选前沿成果、拆解研究逻辑、提炼实用结论。每天5分钟，高效吸收期刊精华，助力学术积累与临床实践。 本期分享的文献是2025年10月发表在《Engineering》（IF=11.6）的研究，题目为“Machine Learning-Enabled Insights: Dihydromyricetin’s Novel Role in Inhibiting the TGF-β/ALK5 Signaling Cascade for the Treatment of Pulmonary Fibrosis”。 网址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095809925006496?via%3Dihub#f0020 一、研究背景 特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性、进展性、危及生命的肺部疾病。该疾病的特征是弥漫性肺泡炎、肺泡结构破坏和细胞外基质（ECM）过度沉积，最终导致不可逆的间质纤维化。IPF患者的临床预后不佳，中位生存期仅为3-5年。尽管全球老龄化导致发病率不断上升，但目前的药物疗法——吡非尼酮（PFD）和尼达尼布——只能适度延缓疾病进展，无法阻止或逆转纤维化。这一关键的未满足的医疗挑战，再加上缺乏治疗选择，突显了制定新的IPF治疗策略的紧迫性。 IPF的病理特征之一是ECM成分的过度积累，这是由肺成纤维细胞的非典型激活状态、它们分化为肌成纤维细胞以及上皮间质转化（EMT）推动的。总的来说，这些事件会导致肺组织逐渐瘢痕化，气体交换受损，最终导致呼吸衰竭。尽管IPF的确切机制尚未完全清楚，但转化生长因子β（TGF-β）被认为是肺纤维化过程的中枢调节因子。在TGF-β信号转导过程中，TGF-β1附着在II型TGF-β受体（TβR II）上，导致TβR I（在大多数细胞类型中也称为ALK5）激活，并使小母体磷酸化以对抗去脑停搏液2（SMAD2）和SMAD3。鉴于TGF-β在介导EMT、成纤维细胞转分化和过度ECM积累中的关键作用，作者假设靶向其下游信号级联（TGF-β/ALK5）可以减轻纤维化。因此，作者的研究重点是筛选该途径的抑制剂。 生物智能（BI）——生物体产生特殊生物活性化合物的适应能力——能够对环境挑战做出复杂的反应。特别是药用植物，会产生具有强大治疗潜力的次生代谢物。例如，传统中药制剂（如血府逐瘀汤、麦门冬汤和沙参脉冬汤）具有抗纤维化功效，沙参脉东通过抑制TGF-β/SMAD3通路抑制肺纤维化。这些发现强调了植物来源的天然产物的前景，具有多靶点机制和高生物相容性，是开发新型抗纤维化疗法的丰富来源。 人工智能（AI）和机器学习（ML）是药物研发领域的变革性工具。在过去的几十年里，他们通过高通量预测化合物的有效性、毒性和机制，彻底改变了药物发现。在IPF研究领域，机器学习方法在促进新型化合物的设计和药物再利用机会方面取得了显著进展。基于这些进展，作者开发了一种基于机器学习的分类模型，专门用于识别天然产物中典型TGF-β信号级联的抑制剂。结合双荧光素酶报告分析，二氢杨梅素（DHM）是一种来自蛇葡萄属物种的天然黄酮类化合物，是综合草药天然产物库中最有前景的候选者。随后的实验表明，DHM抑制了A549细胞中TGF-β1诱导的EMT、医学研究委员会细胞株5（MRC-5）中的成纤维细胞转分化以及博莱霉素（BLM）诱导的小鼠肺纤维化。机制研究表明，DHM直接与ALK5相互作用，抑制其激酶活性，降低细胞膜ALK5表达，从而破坏TGF-β/ALK5信号轴。 总的来说，这些发现首次表明，DHM通过抑制TGF-β/ALK5信号通路，可能通过竞争性激酶抑制和ALK5下调，减轻小鼠的肺纤维化，抑制EMT和成纤维细胞转分化。总体而言，通过基于ML的筛选鉴定并在萤光素酶报告检测中验证的DHM似乎是治疗IPF的有前景的候选药物。这项研究强调了整合计算和实验方法以发现复杂肺部疾病新疗法的潜力。 二、研究主要结果 2.1 建立了基于ML的TGF-β/SMAD信号通路抑制剂预测分类模型 本研究通过微调预训练模型Uni-Mol，开发了一种用于鉴定TGF-β/SMAD信号级联抑制剂的筛选模型。导入了靶向TGF-β1、SMAD2、TβR II、SMAD3和TβR I的化合物，其中包括来自BindingDB数据库的3226种化合物和6642组化合物活性数据，以及来自ChEMBL数据库的1623种化合物和2777组化合物活性信息（图1（a））。 使用BindingDB和ChEMBL数据集来评估模型的性能。ChEMBL数据集用于外部验证，使用与BindingDB中不同的分子。作者的最终模型表现出色，AUPRC为0.936，受试者工作特征曲线下面积（AUROC）为0.902，突显了其强大的辨别力（表1）。最佳分类阈值被确定为0.2648，准确率为0.787。为了发现TGF-β信号通路抑制剂并评估作者模型的泛化能力，应用该筛选标准筛选了一个包含TargetMol提供的16708种化合物的草药衍生天然产物库数据库，并预测408种阳性候选物是潜在的TGF-β信号通路抑制剂。通过分析这些阳性候选物的预测得分、理化性质、报告的生物活性和可用性，选择了20种化合物进行进一步鉴定（图1（b），附录A中的表S1）。 Fig.1：通过基于ML的分类模型发现TGF-β/SMAD信号通路抑制剂，并通过双荧光素酶报告分析进行确认。   2.2 DHM被发现是TGF-β/SMAD信号通路抑制剂 随后，这20种化合物的抑制作用通过双荧光素酶报告物测定得到证实，该测定基于含有促进荧光素酶报道基因luc2P转录的SMAD结合元件的质粒。该方法检测化合物对TGF-β/SMAD信号通路影响的可行性在附录A的图S1中得到了证明。最终，9种化合物显示出对萤光素酶活性的抑制作用（图1（c），黄色柱表示DHM，绿色柱表示其他8种化合物），其中一种命中化合物DHM（图2（A））对TGF-β/SMAD信号级联反应的抑制作用最强（附录A的表S2）。因此，作者进一步研究了DHM对IPF的治疗效果。 Fig.2：DHM抑制TGF-β1诱导的A549细胞迁移。  2.3 DHM抑制TGF-β1诱导的细胞迁移 基于DHM对各种细胞系的低细胞毒性作用（附录A中的图2（b）、图S2），A549细胞用10至40μmol·L-1的DHM预处理。在TGF-β1诱导后，A549的划痕宽度显著减小，而10至40μmol·L-1的DHM预处理在24和48小时显著抑制了TGF-β1促进的细胞迁移，其方式取决于浓度（图2（c），p<0.05）。此外，在transwell测定中也发现了类似的结果（图2（d））。综上所述，DHM抑制了TGF-β1引发的A549细胞迁移，表明其对EMT具有潜在的抑制作用。 2.4 DHM通过SMAD和非规范途径下调TGF-β信号级联，抑制TGF-β1诱导的EMT和成纤维细胞转分化 TGF-β1诱导上皮细胞获得间充质表型，细胞从鹅卵石状变为纺锤形形态。如附录A中的图S3所示，DHM处理使TGF-β1诱导的A549细胞的形态从纺锤形恢复到鹅卵石状。TGF-β1诱导后，促进细胞表现出侵袭和运动能力的间充质标志物的表达升高，如纤维连接蛋白、N-钙粘蛋白、MMPs和α-SMA（p<0.001）。用DHM预处理显著降低了A549细胞中这些蛋白质的水平（p<0.05）（图3（a））。此外，TGF-β1在MRC-5细胞中的诱导也显著促进了COL1A1的表达，COL1A1是重要的ECM成分和与肺纤维化病理过程相关的纤维化标志物（p<0.0001）。同样，在MRC-5细胞中，DHM以浓度依赖的方式显著降低了TGF-β1增强的α-SMA、COL1A1、N-钙粘蛋白、MMP-2和纤维连接蛋白的表达（p<0.05，图3（b））。 western印迹法还测定了TGF-β/SMAD信号级联和TGF-β信号级联介体通过非规范途径的磷酸化。DHM的预处理或TGF-β1的诱导均不影响A549和MRC-5细胞中总SMAD2、SMAD3、Erk1/2、Akt、SAPK/JNK或p38 MAPK的表达（图4（a）和（b））。然而，TGF-β1显著上调了这些信号蛋白的磷酸化蛋白和总蛋白（磷酸化和非磷酸化蛋白）之间的比率（p<0.05），而40μM DHM预处理有效地逆转了这一比率（p>0.05），证实DHM通过SMAD和非规范途径下调TGF-β信号级联，有效抑制了EMT和成纤维细胞转分化（图4（c）和（d））。  Fig.3：DHM抑制TGF-β1诱导的EMT和成纤维细胞转分化。  Fig.4:DHM下调A549和MRC-5细胞中TGF-β信号级联。  2.5 DHM通过SMAD和非经典途径下调TGF-β信号级联，改善BLM诱导的小鼠肺纤维化 为了探索DHM对IPF的潜在影响，将雄性C57BL/6J小鼠气管内雾化吸入BLM（5 mg·kg-1），建立肺纤维化动物模型。将体重明显减轻的小鼠随机分组，每天一次灌胃给予50mg·kg-1 PFD、25mg·kg-1 DHM、50mg·kg-1 DHM或等体积的赋形剂治疗21天（图5（a））。如图5（b）所示，BLM模型小鼠的体重显著降低（p<0.0001）。DHM给药显著增加了BLM诱导的肺纤维化小鼠的体重（p<0.01），特别是25mg·kg-1 DHM治疗组的小鼠体重（23.25±1.18）g）恢复到对照组小鼠的水平（24.81±0.98）g。PFD治疗组（21.56±1.93）g）和DHM治疗组（50 mg·kg-1 DHM组（22.19±1.52）g）之间没有显著差异。此外，BLM诱导导致小鼠死亡，死亡率为22.7%（p=0.0188）。DHM给药（50 mg·kg−1）使BLM模型肺纤维化小鼠的死亡率从22.7%降低到0（p=0.0188），而PFD（50 mg•kg−l）给药对死亡率没有影响（图5（c））。 组织学上，给予DHM有效缓解了BLM诱导的炎症和肺组织胶原沉积。苏木精和伊红（HE）染色清楚地表明了这一点，显示炎症细胞浸润减少，Masson染色表明胶原纤维积聚减少（图5（d））。根据Masson染色结果，计算胶原面积与组织面积之比。DHM和PFD给药显著降低了小鼠肺组织中的胶原面积（图5（e），p<0.001）。PFD治疗组（（1.93±0.75）%）和DHM治疗组（25mg·kg-1 DHM组为（2.94±2.86）%，50mg·kg-1 DHT组为（1.38±0.13）%）之间没有观察到显著差异。此外，DHM和PFD给药显著地将小鼠的Ashcroft纤维化评分中位数恢复到与对照组动物相同的水平（图5（f），p=0.0131）。此外，羟脯氨酸测定表明，PFD和DHM给药均可显著降低纤维化小鼠肺组织中的羟脯氨酸含量（图5（g），p<0.0001），这与胶原面积计算的结果一致。DHM在降低羟脯氨酸含量方面的效果不如PFD（50mg·kg-1 PFD组为（0.55±0.15）μg·mg-1，50mg·kg-1 DHM组为（0.70±0.09）μg•mg-1）；p=0.0031）。在肺纤维化发展过程中，小鼠表现出明显更高的肺/体重比（附录a中的图S4（a），p 0.0001），DHM和PFD的给药显著降低了肺纤维化小鼠的肺重量与体重比，使其与对照组小鼠的水平相同。PFD治疗组（0.010±0.002）和DHM治疗组（25mg·kg-1 DHM组为0.011±0.002，50mg·kg-1 DHT组为0.010±002）之间没有观察到显著差异。 评估小鼠的呼吸功能，以反映DHM的治疗效果。如图5（h）所示，BLM治疗损害了呼吸功能（p<0.05）。一方面，BLM诱导小鼠的吸气容量（IC）、呼吸系统顺应性（Crs）和准静态顺应性（K）值显著降低，50 mg·kg-1的PFD和25 mg·kg−1的DHM给药后恢复（p<0.05）。另一方面，BLM组的组织呼吸阻力（G）、呼吸系统弹性（Ers）和呼吸系统阻力值显著增加（p<0.01）。在50 mg·kg-1 PFD组和50 mg·kg-1 DHM组中，它们都有所减少（p<0.01）。值得注意的是，50 mg·kg-1 DHM组的IC（（0.74±0.05）mL）明显高于50 mg·kg-1 PFD组（（0.68±0.05）mL，p=0.0126）。服用50 mg·kg-1的PFD和相同剂量的PFD后，Crs（（0.034±0.004）vs（0.035±0.007）mL·cmH2O−1）、K（（0.115±0.005）vs（0.118±0.003）cmH2O−1）、G（5.82±0.36）vs（5.26±0.70）cmH2O·mL−1 DHM的差异不显著。 考虑到炎症反应在肺纤维化病理发展中的重要作用，对小鼠BALF中的炎性细胞进行了定量。如附录A中的图S4（b）-（g）所示，由于BLM的诱导，小鼠肺组织中的白细胞（WBC）、淋巴细胞（LYM）、单核细胞（MON）、中性粒细胞（NEU）、嗜酸性粒细胞（EOS）和嗜碱性粒细胞（BAS）的数量显著增加（p<0.001）。50 mg·kg−1剂量的DHM减少了作者检测到的所有炎症相关细胞（p<0.01），而50 mg·kg-1的PFD对减少MON和BAS没有影响（与BLM组相比，p>0.05）。50 mg·kg-1 PFD组的MON（（0.12±0.05）×106 vs（0.03±0.03）×106 mL-1，p=0.0015）和BAS（（0.013±0.005）×106 vs.（0.004±0.005）x 106·mL-1，p=0.0086）的数量明显高于50 mg·kg-1 DHM组。 为了阐明DHM给药对实验性肺纤维化的潜在治疗效果并揭示其潜在机制，检测了纤维连接蛋白表达和几种介质的磷酸化。如图5（i）和（j）所示，纤维连接蛋白（纤维化相关蛋白）在暴露于BLM的小鼠肺组织中显著增强（p<0.0001）。PFD和DHM的给药显著降低了其表达（p<0.0001）。一致地，BLM组SMAD2、Erk1/2、SMAD3和p38 MAPK的磷酸化增加（p<0.0001），表明BLM诱导导致小鼠肺纤维化的发展，这是通过SMAD和非规范途径激活TGF-β信号级联的结果。25 mg·kg-1的DHM和50 mg·kg−1的DHM给药均有效降低了通过SMAD和非规范途径介导TGF-β信号级联的蛋白质的磷酸化水平（p<0.05），而50 mg·kg-1的PFD给药对SMAD3的磷酸化没有影响。值得注意的是，根据统计分析，与PFD相比，DHM给药在抑制SMAD依赖性TGF-β信号通路方面显示出更好的疗效（图5（k），p<0.05）。50 mg·kg-1 PFD组的p-SMAD2/SMAD2比值（（1.52±0.29）vs（0.84±0.50））和p-SMAD3/SMAD3比值（（2.05±0.25）vs（1.69±0.36））明显高于50 mg·kg-1 DHM组。DHM给药显著降低了p-Erk1/2/Erk1/2和p-p38 MAPK与p38 MAPK的比值（图5（k），p<0.0001）。DHM和PFD处理对Erk1/2和p38 MAPK磷酸化的抑制作用没有显著差异。 在体内安全性评估中，用高剂量DHM（100-1000mg·kg-1）治疗的小鼠体重、存活率没有异常变化，肝肾功能也没有明显受损。相比之下，PFD（100-1000mg·kg-1）治疗减缓了小鼠的体重增加，这种影响在给药后24小时最为明显（附录a中的图S5（a）和（b），p<0.05）；在这些组中，1 g·kg-1 PFD组的小鼠存活率降至60%（附录A中的图S5（c）和（d），p=0.0033 vs 1 g·kg-1 DHM组）。给药后24小时，不同组小鼠的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酐（Cre）和尿素氮（尿素）的血清水平没有显著差异（附录A中的图S5（e）-（h））。然而，在给药后7天，用0.5-1 g·kg-1 PFD治疗的小鼠的血清ALT和AST水平显著高于DHM治疗组（附录A中的图S5（i）和（j），p<0.0001）。给药后7天，不同组小鼠的血清Cre和尿素没有显著差异（附录A中的图S5（k）和（l））。 Fig.5：DHM通过SMAD和非规范途径下调TGF-β信号级联，改善了BLM诱导的小鼠肺纤维化。   2.6 DHM通过ALK5下调TGF-β信号级联 WB-CETSA量化了配体结合时靶蛋白热稳定性的变化，因此反映了配体和蛋白质之间的结合。如图6（a）所示，ALK5在DHM存在下更稳定，表明ALK5蛋白是DHM的结合靶标。进行分子对接分析以预测DHM和ALK5催化结构域之间可能的相互作用（预测结合能=-9.60 kcal·mol-1）（蛋白质数据库（PDB）ID:6B8Y）。然后使用分子动力学模拟来进一步评估结合稳定性和相互作用能。根据MM/PBSA计算，DHM和ALK5相互作用的结合自由能为（-35.20±0.17）kcal·mol-1。DHM与His283和Lys232形成氢键，与Leu340形成π-烷基，与Ile211、Ala230形成π-孤对，与Ser280形成π-孤独对（图6（b）和（c））。随后，MST测定证实了DHM与ALK5细胞内区域之间的直接结合亲和力，Kd值为（5.09±0.20）μmol·L−1（图6（d））。最后，DHM在不同ATP浓度（2.5、5.0和10.0μmol·L-1）下对ALK5激酶活性表现出剂量依赖性抑制作用，ATP是该激酶的生理底物。计算的IC50值显示出显著的ATP浓度依赖性增加（2.5μmol·L-1 ATP为（34.00±4.91）μmol·L-1，5μmol·L-1 ATP为（53.31±10.43）μmol•L-1，10μmol·L-1 ATP为（112.83±2.05）μmol；图6（e））。ATP浓度和IC50值之间的这种特征性正相关关系确立了DHM是ALK5激酶的竞争性抑制剂（附录a中的图S6）。此外，DHM的预处理对细胞膜上ALK5蛋白的表达显示出抑制作用（p<0.05，图6（f））。使用外源质粒实现了ALK5中Lys232和His283的定点突变（图6（g））。WB-CETSA揭示，DHM与WT ALK5结合，而Lys232Ala或His283Ala的突变消除了这种相互作用（图6（h））。ALK5的过表达逆转了DHM对TGF-β1诱导的EMT的抑制作用，如生物标志物纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白表达的增加所示（图6（i））。 Fig.6：DHM通过ALK5下调TGF-β信号级联。  三、研究结论 总之，通过结合ML支持的分类框架和双荧光素酶报告分析，作者的研究将DHM描述为TGF-β/ALK5信号轴的新型抑制剂。从机制上讲，作者首次报道了DHM降低了细胞膜上ALK5的表达，并竞争性地阻碍了其激酶功能。因此，TGF-β/ALK5信号级联被抑制，导致小鼠实验性肺纤维化的减弱。此外，DHM有效抑制TGF-β1引发的上皮细胞迁移、EMT和成纤维细胞转分化，突出了其作为治疗IPF的潜力。与现有的ALK5抑制剂相比，DHM表现出更高程度的结构创新，大大拓宽了ALK5缓蚀剂的化学空间。此外，DHM来源于天然产物，具有低毒性和良好的水溶性等优点，使其成为研究和开发新型抗IPF药物的更有前景的候选者，有可能增强IPF的医疗效果。 Fig.7：DHM治疗肺纤维化的分子机制。由Figdraw支持和制作。