CAR-Treg工艺优化是商业化的关键

2022-08-28

免疫疗法细胞疗法

CAR-T在细胞治疗领域备受瞩目，通过将嵌合抗原受体（CAR）导入T细胞，极大地改善了临床对肿瘤的治疗效果。CAR-T的大获成功的同时也加速了CAR-Treg向临床转化的进展。通过CAR技术，CAR-Treg能够绕过MHC限制性和提高治疗靶向性，在自身免疫性疾病及抑制物抗宿主病（GVHD）中表现出很好的治疗潜力，目前已有多家公司参与开发。‍https://www.biopharmadive.com/news/treg-cell-therapy-biotech-startups/629634/然而，尽管CAR-T对肿瘤疗效非常好，但由于生产成本极高，所产生的昂贵治疗费用让普通患者只能望而止步，CAR-Treg自然绕不开这个难题。人们一直在积极寻找CAR-T工艺优化手段，以期改进疗效的同时减少生产成本，进而推动其市场化进程。工艺流程同样，CAR-Treg的生产也大致可以分为以下步骤：获取细胞，分选富集 → 活化 → 基因传递 → 扩增 → 质检、储存、运输、回输Blood Cancer Discov. 2021 Sep;2(5):408-422.工艺优化方向1. 采集，分选富集：CAR-Treg以单采和来自外周血单核细胞（PBMC）为原料，主要也是通过磁珠细胞分选(MACS)，获得维持免疫耐受的主要亚群：CD4+CD25highFoxp3+Treg。目前CAR技术细胞来源均为自体细胞，Treg细胞占外周血CD4+T细胞的5-10%，部分疾病患者Treg含量更低，甚至在之后表现出无法扩增。原材料无法标准化，细胞活力不可控，以及最主要的个性化定制均为造价昂贵的原因，因此细胞健康人的Treg细胞捐献是未来趋势。以及通过CAR-Foxp3共载体转染可以将CD4或CD3T细胞转化为Treg，这也可以解决外周Treg细胞数量少和内源性TregFoxp3表达不足的。推荐阅读：调节Treg的转录因子：FoxP3/RelA/c-Re/...Biomedicines. 2022 Jan 26;10(2):287.2. 基因导入：通过慢病毒转染，将CAR基因传递到Treg细胞中是目前最主要基因导入方式。该方法两个词总结：高效，昂贵。病毒载体生产耗时耗力，并且有引起炎症反应和基因插入的致癌风险。电穿孔技术是应用广泛的非病毒转染策略之一通过短的脉冲使细胞产生短暂通透性，允许目的基因DNA或mRNA进入。但是这种方法容易引起细胞应激。"sleeping beauty"转座子系统（SB）将CAR转基因插入转座子序列中，再将相应质粒和转座子酶（hsSB）一同导入细胞，hsSB会将序列切下来整合到T细胞基因组，该技术整合效率接近病毒。Nat Biotechnol. 2019 Dec;37(12):1502-1512.而且相较于病毒载体，SB系统在转染后质粒水平逐渐降低。而且质粒相对容易设计，在基因破坏方面也有很高的安全性。4. 扩增和产量：扩增在整个制备过程最为耗时、耗材、耗财。原料Treg获取量非常少，所需达到治疗标准的CAR-Treg量非常大，而且考虑储存运输过程的消耗，相较治疗量产品药甚至需要近100倍的数量。扩增所需培养基中必须加入胎牛血清或人血清，使用无血清培养基不但能够节省成本，并能降低外源物的污染。扩增过程包含多种需人工变异操作，需要考虑多种外接因素的影响。(如温度、湿度、气体张力、无菌性等)作为未来各行业的发展趋势，人工智能(半)自动化及封闭性系统在保证操作精细度的同时能确保环境参数稳定，在提高产量的同时大大降低批次间差异。5. 质量检测：用于CAR-Treg的QC检测标准化尚且未制定。常通过流式细胞术对CD4+CD25highFoxp3+Treg进行验证，并辅以Foxp3启动子区域的甲基化分析。常规观察Treg对Tconv的抑制作用非常耗时，而且对体内的预测价值不大。Foxp3对Treg在治疗过程维持表型而不会向Teff转化至关重要，添加雷帕霉素能够通过抑制mTOR通路维持Treg稳定性。或者基于CRISPR/Cas9的表观遗传编辑也可能是维持Treg表型的手段。6. 治疗：Treg细胞能通过分泌TGF-β、IL-10、IL-35能够将T细胞诱导转化成为Treg细胞，但也会在炎症因子IL-6和IL-1的协同刺激下，通过STAT-3依赖途径介导的Foxp3表达下调而转化成为为Teff细胞。以及外周CD25-Treg细胞也容易转化成Th17细胞，并且由于Teff细胞比Treg细胞具有更快的激活速度与增殖能力，从而成为自身免疫性疾病的致病因素或在治疗过程中加重病情。通过细胞工程技术增加“自杀开关”，在Foxp3表达缺失或炎症因子接触时激活Treg细胞“凋亡“以及CAR-T异位表达的Foxp3能够维持抑制功能和阻止细胞转化。在自身免疫性患者中长期使用CAR-Treg进行治疗，将有可能引起潜在的肿瘤免疫抑制和局部机会性感染，为此设计可调平台使CAR-Treg在症状严重时发挥作用，轻微症状时处于休眠状态。每个生产环节的工艺改进都是促进CAR-Treg平民化的关键一步。参考资料‍https://www.biopharmadive.com/news/treg-cell-therapy-biotech-startups/629634/Fritsche E et al. Toward an Optimized Process for Clinical Manufacturing of CAR-Treg Cell Therapy. Trends Biotechnol. 2020 Oct;38(10):1099-1112.Abou-El-Enein M et al. Scalable Manufacturing of CAR T cells for Cancer Immunotherapy. Blood Cancer Discov. 2021 Sep;2(5):408-422.Arjomandnejad M et al. CAR-T Regulatory (CAR-Treg) Cells: Engineering and Applications. Biomedicines. 2022 Jan 26;10(2):287.Querques I et al. A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion. Nat Biotechnol. 2019 Dec;37(12):1502-1512.Diaconu I et al. Inducible Caspase-9 Selectively Modulates the Toxicities of CD19-Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells. Mol Ther. 2017 Mar 1;25(3):580-592.近期热门视频更多精彩视频，尽在佰傲谷视频号，欢迎关注~本周好文推荐如需转载请联系佰傲谷并在醒目位置注明出处﹀点亮在看，传递信息♥