University of Michigan

在生物技术领域，CRISPR-Cas9 早已是家喻户晓的 “基因剪刀”——从遗传病治疗到作物育种，它的应用几乎贯穿整个生命科学研究。但很少有人知道，这个强大工具在细菌自己的 “免疫战场” 上，还藏着一套鲜为人知的 “调节技能”。 近日，密歇根大学团队在《Nature》发表重磅研究，首次揭示：CRISPR-Cas9 中的Cas9 蛋白，除了作为 RNA 引导的核酸酶切割 DNA，还能在没有crRNA（CRISPR RNA） 和tracrRNA（反式激活 CRISPR RNA） 陪伴时，像 “免疫哨兵” 一样感知细胞内 crRNA 的水平，动态调节细菌的 “免疫记忆” 深度——当记忆库空虚时加速补充，当记忆充足时及时 “刹车”，既帮细菌对抗病毒，又避免误伤自身。 细菌和病毒的 “军备竞赛” 从未停歇，而 CRISPR-Cas 系统是细菌最核心的 “免疫武器”：它会将入侵病毒的 DNA 片段（称为 “间隔序列”）整合到自身基因组的 CRISPR 数组中，形成 “免疫记忆”；后续再遇到同种病毒时，数组转录出的 crRNA 会引导 Cas9 精准切割病毒 DNA。据估计，全球约 50% 的细菌都携带 CRISPR-Cas 系统，在某些环境中这一比例甚至更高——足以见得它对细菌生存的重要性。但长期以来，科学家们只知道 Cas9 需要 crRNA/tracrRNA 才能发挥切割作用，却不清楚当这两种 RNA 缺失时，Cas9 是否还有其他功能，更不知道它如何调控 “免疫记忆” 的更新节奏。 为解开这个谜题，研究团队以脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）为研究模型——这种细菌携带 II-C 型 CRISPR-Cas 系统，且容易被MDAΦ 噬菌体感染（该噬菌体不会裂解细菌，但会整合到宿主基因组影响致病性）。 他们通过基因编辑构建了多种突变菌株：比如R26 菌株（仅保留 CRISPR 数组的一个重复序列，无法产生成熟 crRNA，相当于 “crRNA 缺失型”）、Δtracr 菌株（缺失 tracrRNA），以及 Cas9 结构突变体（如Cas9H1024A，破坏其 PAM 结合位点，无法识别病毒 DNA 的 PAM 序列）。同时，他们用转录组测序、Northern blot（检测 crRNA/tracrRNA 水平）、Western blot（验证 Cas9 蛋白表达）和高通量测序（分析新获取的间隔序列）等技术，全面追踪 Cas9 的功能。 超适应表型是由Δtracr或缺乏crRNA引起的 实验结果首先揭示了一个关键现象：当 crRNA 或 tracrRNA 缺失时，细菌会出现 “超适应（super-adaptation）” 表型——间隔序列的获取效率大幅提升。比如，在 Cas1-Cas2（负责整合间隔序列的酶）过表达条件下，正常菌株的间隔序列获取效率仅 6%，而 Δtracr 菌株直接飙升到 61%，甚至能同时获取 2-4 个新间隔序列；R26 菌株的获取效率也从 5% 提升到 44%。更重要的是，这种超适应完全依赖 Cas9——如果敲除 cas9，Δtracr 或 R26 菌株的获取效率会骤降到 2-3%，且新间隔序列不再有正确的 PAM（3’-N4GATT），证明是apoCas9（无 RNA 结合的 Cas9） 在驱动这一过程。 深入研究发现，Cas9 的 “调节技能” 核心是 “感知 crRNA 水平”：当细菌的 CRISPR 数组较短（比如仅 1 个重复序列）时，crRNA 产量极低，大量 Cas9 以 apoCas9 形式存在，它们会促进 Cas1-Cas2 整合新的病毒间隔序列，快速扩展 “免疫记忆库”——此时间隔序列获取效率高达 31%；随着 CRISPR 数组逐渐变长（比如含有 25 个间隔序列），crRNA 水平随之升高，它们会与 Cas9 结合形成复合物，使 apoCas9 减少，从而抑制间隔序列获取，效率降至 4-6%。这种调节能避免细菌过度获取间隔序列——如果无限制获取，可能会误将自身 DNA 当作病毒片段整合，引发 “自身免疫” 风险。 研究团队还在 “自然数组收缩” 的细菌中验证了这一机制：当细菌因基因重组丢失部分间隔序列（比如从 25 个减少到 9 个），crRNA 水平会随之下降，apoCas9 再次增多，间隔序列获取效率从 5% 提升到 9-15%，帮助细菌快速补充丢失的免疫记忆。更令人惊喜的是，这种功能在进化上高度保守——除了空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）的 CjeCas9 外，其他多种 II-C 型 Cas9（如流感嗜血杆菌的 HpaCas9、巴氏杆菌的 PmuCas9）都能通过 apoCas9 调节间隔序列获取，且新间隔序列的 PAM 偏好与各自的 CRISPR 系统一致，证明这是细菌普遍具备的 “免疫调节策略”。 这项研究彻底刷新了我们对 CRISPR-Cas9 的认知：它不仅是一把精准的 “基因剪刀”，还是细菌免疫记忆的 “智能调节器”。这一发现不仅填补了 CRISPR 系统 “适应机制” 的空白，还为生物技术应用提供了新方向——比如通过调控 apoCas9 活性，优化 CRISPR-based 分子记录工具（记录细胞内事件），或改造益生菌的 CRISPR 系统，增强其对抗有害病毒的能力。未来，当我们再谈论 CRISPR-Cas9 时，或许会多一个视角：它不仅是人类的科研工具，更是细菌在亿万年进化中锤炼出的 “免疫智慧” 结晶。 参考文献： Zhou, X., Diao, R., Li, X. et al. Cas9 senses CRISPR RNA abundance to regulate CRISPR spacer acquisition. Nature (2025). doi：10.1038/s41586-025-09577-9 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！ 点击下方「阅读原文」，前往生物谷官网查询更多生物相关资讯~

Epigenic Therapeutics has raised a $60 million Series B financing to ramp up clinical tests of what it hopes could be a cure for chronic hepatitis B, using a version of CRISPR gene editing that silences disease-causing genes without altering the underlying genetic code. The Shanghai-based biotech is one of at least three startups developing epigenetic editing therapies to quash the activity of stowaway genes that the hepatitis B virus (HBV) stubbornly implants in liver cells. “The painful clinical bottleneck for treatment of hepatitis patients is the eradication of this DNA,” Epigenic co-founder and CEO Bob Zhang told Endpoints News in an interview. Epigenic is already testing the experimental therapy in a Phase 1 study. The first patient was dosed in New Zealand in November 2024, Zhang said. The new funding will help the company complete a Phase 2 study, which will include trial sites in China and the US by the end of 2027, he added. The 70-person company has not attracted much attention since it was founded in 2021, but that could start to change. Over the past year, US and European drugmakers have increasingly turned their gaze toward Chinese biotechs as a cheaper and faster way to fill their pipelines. Epigenic is among a growing crop of young Chinese companies developing cutting-edge genetic technologies at a pace similar, or even quicker , than better-funded competitors in the US. In epigenetic editing, Epigenic appears to be near the front alongside Tune Therapeutics. Tune, based in Durham, NC, and Seattle, WA, got clearance to test its own HBV therapy in New Zealand in November 2024 and went on to raise a $175 million Series B in January, bringing its total funding to $225 million. Tune expects to share its first clinical data this year. A third epigenetic editing company, Boston-based nChroma Bio, has raised at least $335 million across three rounds but has not said when it plans to begin clinical trials of its HBV therapy. Zhang said that Epigenic has now raised $122 million total. The new round was led by Beijing-based Lapam Capital. Prior investors Qiming Venture Partners and OrbiMed participated too. Epigenic is also running clinical tests of an epigenetic editing therapy to lower cholesterol, targeting the PCSK9 gene. Zhang said that the company has also been working in the increasingly hot space of in vivo CAR-T cell therapy and plans to begin a clinical test in autoimmune disease next year. (That program doesn’t use the company’s editing technology.) “They can advance a larger number of programs than their US counterparts because of the low-cost advantage of a China trial. That’s what we are excited about,” Kan Chen, a partner at Qiming, told Endpoints. “We are also excited about epigenetics. It’s not just one product, it’s a platform company, so it could have the potential to become a big biopharma one day.” Like many biotech executives in China, Zhang got his start in the US, first through a biological chemistry postdoc at the University of Michigan in 1999, and then at a small biotech in San Diego, before returning to China a decade later. The country’s drug industry was growing up, and Zhang wanted to be part of it. He was a director at Sanofi’s research site in Shanghai and a leader at two contract research organizations that both got acquired before he met two scientists at the Chinese Academy of Sciences, whose work would inspire the founding of Epigenic in September 2021. Although other academic scientists had published papers on epigenetic editing, the technologies had yet to make a big splash at biotech startups. The apparent lack of investor interest worried Zhang at first. “We felt pretty lonely at the time,” he said. “If this is so great, why are we the only ones doing it?” he recalls asking his cofounders. That loneliness didn’t last long. Chroma Medicine launched with $125 million that November, and Tune launched with $40 million two weeks later. Both startups were backed by a heavy-hitting team of scientific founders, including the Broad Institute’s David Liu at Chroma and UC Berkeley’s Fyodor Urnov at Tune. (Chroma later merged with Liu’s company Nvelop to form nChroma.) Epigenic has not disclosed the names of its two scientific co-founders, and Zhang said they did not wish to be identified. The early research on which the company was based has also not been disclosed, but the preclinical work on the PCSK9 program will be published in a peer-reviewed journal soon, he said. The company is testing the PCSK9 program in a China-based investigator-initiated trial, or IIT. IITs are an increasingly popular way to quickly assess cell or gene therapies in small studies overseen by local hospitals, rather than national drug regulators. The company has tested small and medium doses and is just beginning to test a larger dose. If the results are promising, Zhang hopes to find a pharma partner to continue developing the program in bigger studies. According to Zhang, the company’s founders developed a version of CRISPR gene editing that could control how genes are turned on and off without changing or cutting the DNA itself. Like other CRISPR treatments, the therapy relies on a Cas enzyme — the molecular scissors — to guide the therapy to the right part of the genome. But with an epigenetic therapy, the scissors are blunted and unable to cut the DNA. The action instead comes from two additional proteins that are tethered to Cas. For Epigenic’s technology, one of those proteins is a DNA methyltransferase that lays down chemical markers atop the PCSK9 gene or HBV infection to silence it. The second protein helps recruit enzymes that make additional chemical modifications to cellular spools called histones, which wrap the DNA up, making it inaccessible. “The sustainable biological response relies on both,” Zhang said. The entire epigenetic editing machine is encoded in mRNA molecules that are packaged inside the lipid nanoparticles developed by Epigenic. The approach means that therapy won’t stick around long after it’s done its job. “This is kind of a hit-and-run approach,” Zhang said. But he expects the epigenetic silencing to be durable. A single treatment of the PCSK9 therapy in monkeys has lasted almost two years so far in the company’s experiments, Zhang said, and he hopes the HBV therapy will similarly keep the viral infection locked away for good. “We’re predicting this lasting the whole life in humans, hopefully,” he added. Zhang said Epigenic may share more about the hepatitis B trial design and some of the early safety data from the first patients treated at a medical conference this fall. “It’s not going to be a complete story. It’s only the first cohort,” he said. “But we want to let the field know the progress. We’re not going to hide that.”

编辑丨王多鱼 排版丨水成文 CRISPR-Cas 系统是细菌和古菌中广泛存在的一类获得性免疫机制，其核心功能在于通过“分子记忆”和“精准切割”抵御外源噬菌体和核酸的入侵。该系统由两大关键组成部分构成：一是 CRISPR 阵列，作为免疫记忆库，存储着既往入侵噬菌体、质粒或其他外源核酸的片段（记忆称为 spacer）；二是 Cas 蛋白，作为效应分子，负责识别并切割与 spacer 匹配的外源入侵者。典型的单效应核酸酶包括 Cas9、Cas12 以及 Cas13，其系统结构相对简单，分子机制被充分解析，并被开发为突破性的基因编辑、表达调控以及疾病治疗的工具，极大推动了生命科学与医学的发展。 重要的是，Cas9 的已知效应功能均依赖两条小 RNA——crRNA 与 tracrRNA——共同形成靶向复合物；不携带 RNA 的 apoCas9 被认为处于惰性、不具备内源生物学功能。 CRISPR-Cas 介导的免疫过程可分为三个阶段：1）适应阶段（Adaptation），‌当噬菌体或质粒首次入侵时，Cas1-Cas2 复合物会把外源 DNA 中的特定序列整合到宿主 CRISPR 阵列的前导区（leader）与重复序列之间；2）表达阶段（Expression），‌CRISPR 阵列被转录为长链 pre-crRNA 后，通过宿主 RNase 酶或 Cas 蛋白加工成成熟的 crRNA；3）干扰阶段（Interference）‌，Cas 蛋白（例如 Cas9）与 guide RNA 组装成效应复合物，其通过 crRNA 的 spacer 序列识别互补的外源 DNA 并启动切割清除。 关于适应阶段，外源核酸前体片段（prespacer）如何由 Cas1–Cas2 复合物整合到 CRISPR 阵列中，成为新的 spacer，已在大肠杆菌的 I-E 型 CRISPR-Cas 中得到深入解析。中国科学院生物物理研究所王艳丽团队报道了 I-E 型 Cas1–Cas2 如何通过 PAM 识别实现 prespacer 的选择(Cell, 2015, 163(4):840-53)；加州大学柏克莱分校 Jennifer Doudna教授与耶鲁大学可爱龙教授团队则分别报道了 Cas1–Cas2–prespacer–target DNA 复合物结构 (Nature, 2017, 550(7674):137-14; Science, 2017, 357(6356):1113-1118)。在很多其他 CRISPR-Cas 系统中，spacer 的选择与整合还需要额外因子的协同作用。例如，可爱龙教授团队结构上阐明了 Cas4 如何识别 PAM，并协助 Cas1–Cas2 实现 spacer 的单方向性整合(Nature, 2021, 598(7881):515-520)。对于 CRISPR-Cas9 系统如何产生免疫记忆，细菌分子遗传学揭示了在 II-A 型系统中，Cas9 与 tracrRNA 协同，通过 PAM 识别参与 prespacer 的筛选(Nature, 2015, 519(7542):199-202)。然而，Cas9、tracrRNA 以及 CRISPR RNA 在适应过程中的具体分子机制，目前仍不清楚。 此外，除 II-A 型外，CRISPR-Cas9 系统适应阶段的研究整体仍相对匮乏。多种 Cas9 亚型中，II-C 类接近一半且架构最简单，并被视为比 II-A 更古老的 Cas9 分支。仅保留 cas1、cas2、cas9 和 tracrRNA 基因，而缺乏 csn2、cas4 等辅助因子，其精简的遗传架构提示该系统的适应性免疫阶段的分子机制可能有别于 II-A 亚型，为探索 spacer 获取机制提供重要切入点(Nat Rev Microbiol, 2017, 15(3):169-182)。 2025 年 9 月 3 日，密歇根大学医学院张燕教授和侯仲刚教授领导的研究团队在国际顶尖学术期刊 Nature 上发表了题为：Cas9 senses CRISPR RNA abundance to regulate CRISPR spacer acquisition 的研究论文。 该研究揭示了 II-C 型系统在免疫适应阶段的独特分子调控机制，拓展了对 Cas9 生物学功能的理解：首次发现了 apoCas9（未结合 RNA 状态）在适应阶段能显著提高 spacer 获取效率，推翻了长期以来认为 apoCas9 无功能的传统认知；apoCas9 与 holoCas9（结合 RNA 状态）代表 Cas9 的两种不同分子状态，二者分工明确。apoCas9 促进 spacer 的高效获取，而 holoCas9 主要执行干扰功能；apoCas9 通过感知细胞内 crRNA 丰度，进行自我反馈调节获取 spacer 的效率——Cas9 既是 CRISPR RNA 感应器，又是 spacer 获取效率调节器。 这一发现不仅修正了对 Cas9 功能的传统理解，也确立了“游离态” apoCas9 在调节 CRISPR 免疫记忆形成中的核心地位，在 CRISPR 适应性这块，填补了重要空白。 该研究由课题组周旭飞博士主导，历时六年，以天然宿主脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis, Nme）为研究对象，借助强有力的分子遗传工具，先后构建上千株突变体，创建了 II-C 型 CRISPR-Cas 的适应性免疫记忆检测体系。在读博士生李鑫则建立了脑膜炎奈瑟菌的天然丝状噬菌体的制备和宿主侵染平台，并完善了通过高通量测序解析免疫记忆的发生特征。周旭飞博士主导将上述平台进行有机整合，并在合作者 Lydia Freddolino 教授实验组的生物信息学支持下，系统性解析了 apoCas9 的全新功能。 当 tracrRNA 或 crRNA 单独缺失，或二者同时缺失时，NmeCas9 处于“apo”游离态，会触发“超级适应”。此时获取新 spacer 的效率较野生型显著大幅提高。进一步的遗传互补实验表明，在双 RNA 同时缺失的背景下，只有同时补回 tracrRNA 和 crRNA，才能完全逆转该表型，而单独补回任一 RNA 组分均不足以恢复。值得注意的是，这一“超级适应”现象的发生既不依赖于 Cas9 的核酸内切酶活性，也并非源于 Cas9 或 Cas1 在蛋白表达水平的变化，而是反映了 apoCas9 的内在调节激活作用。 NmeCas9 由识别叶（REC lobe）和核酸内切酶叶（NUC lobe）两部分构成。REC lobe 包括 REC1、REC2 结构域和桥螺旋（bridge helix），主要负责 RNA 的结合以及 RNA-DNA 杂交体的装载。NUC lobe 包含 RuvC、HNH 切割结构域和 C 端 PAM 识别结构域（WED/PI domain）。通过对 apoCas9 的结构域进行系统性删除分析发现：如果仅保留 NUC 叶，仍能推动“超级适应”来高效促进 spacer 获取，但已失去对 tracrRNA–crRNA 调低的响应。相反，当删除到 NUC 叶内的 RuvC、HNH 或 WED/PI 结构域时，Cas9 则完全丧失驱动“超级获取”的能力。这表明 NUC 叶是驱动 spacer 高效获取的核心因素，而两个 RNA 则通过 REC 叶来约束并从而精准调控 spacer 获取效率。值得注意的是，靶向切割外源核酸时则不同，Cas9 干扰依赖于所有结构域的同时存在。 张燕团队进而一步展示了三类生理情境，揭示 apoCas9 通过感知 crRNA 的丰度，并自我反馈来调节 spacer 获取效率。例如，在 CRISPR array 新生早期进化阶段，长度较短，crRNA 产量低，宿主体内 Cas9 多以“apo” 游离状态存在，促使宿主高效获取记忆，从而帮宿主快速丰富免疫记忆库。随记忆持续积累，CRISPR array 增长，crRNA 丰度也随之升高，Cas9 蛋白逐渐转向 RNA 介导的 “holo” 状态，进而导致 apoCas9 减少，spacer 获取效率下降。由此实现免疫的闭环平衡调节，防止在 CRISPR 够长时维持高水平 spacer 获取，进而产生源于自身 DNA 的自免疫记忆。除此之外，CRISPR array 的稳定性和长度还会受其他自然因素的影响，例如自免疫或者重复序列之间同源重组都可能诱发 array 塌缩和 crRNA 丰度骤降，使 Cas9 变到“apo” 游离状态，短期启动高效的 spacer 获取能力，来维护免疫的深度。 Cas9 守护免疫记忆深度 综上，该研究不仅突破了以往对 apoCas9 “功能空白”的传统认知，还将其确立为免疫记忆深度的“捍卫者”：既作为感应器来感知 crRNA 丰度，又作为效应器在 crRNA 稀缺时促进高效获取免疫记忆，缩短宿主易感窗口期。这一动态调控机制不仅解释了寄主如何在 CRISPR 列阵塌缩后迅速回补，为理解宿主-噬菌体分子博弈提供了新视角，也凸显了 Cas9 主要亚型间适应机制多样性。同时也为未来基于 CRISPR 免疫适应机器的分子记录，谱系追踪，抗噬菌体工程等应用和优化，奠定了理论基础。 张燕博士现任密歇根大学安娜堡分校长聘副教授，医学院 RNA 设计与合成核心平台联合负责人，长期深耕 CRISPR-Cas 领域。以通讯作者在 Nature、Science、Molecular Cell 等期刊发表论文十余篇。她在密歇根大学的团队曾阐明 II-C 型 NmeCas9 靶向 RNA 的分子机理，并聚焦于 apoCas9 在细菌获得性免疫记忆形成和调节中的关键作用。近年也致力于推动 I 型 CRISPR-Cas 基因编辑工具的系统性开发应用，包括建立 Cas3 介导的人细胞大片段基因敲除法，鉴定 I-C 型 CRISPRC-Cas 隐藏的 Cas11 组分，开发迷你 I 型基因敲除和调控工具，并引入 anti-CRISPR 作为可控安全开关。此外，还通过与可爱龙教授团队合作阐明了 Cas3 的活化与抑制的结构基础。 张燕教授实验室正在招聘 1-2 位博士后研究员，欢迎有以下方向背景的优秀人才加入，共同开展创新性研究：生物信息与人工智能，细菌天然免疫，或基因编辑疾病治疗。有兴趣者请联系：yzhangbc@med.umich.edu。 论文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-025-09577-9 设置星标，不错过精彩推文 开放转载 欢迎转发到朋友圈和微信群  微信加群  为促进前沿研究的传播和交流，我们组建了多个专业交流群，长按下方二维码，即可添加小编微信进群，由于申请人数较多，添加微信时请备注：学校/专业/姓名，如果是PI/教授，还请注明。 点在看，传递你的品味