Aminopterin

*仅供医学专业人士阅读参考胃癌是全球致死率较高的癌症之一，尤其在亚洲地区，由于高盐高油的饮食习惯和高压生活方式，胃癌的发病率逐年增加，并逐渐呈现年轻化趋势。尽管近年来胃癌的诊断和治疗方法取得了一些进展，但化疗耐药性仍然局限着治疗效果。在胃癌中，Hippo-YAP1通路的过度激活已被证明是诱发肿瘤细胞侵袭性特征的关键，YAP1可以进入细胞核对基因表达进行调控，从而促进细胞增殖和抑制凋亡。同时有研究表明，YAP1的异常激活参与形成化疗耐药性。因此，通过揭示转录因子YAP1的调控靶基因，我们或许可以寻找到胃癌治疗的突破口。香港中文大学康伟团队发表在Molecular Cancer期刊的最新论文，锁定了YAP1的最新下游靶点，STK3。在胃癌患者中，STK3与YAP1在胃癌细胞中表达水平呈正相关，较高水平与较差生存相关。机制上，STK3通过激活Wnt/β-catenin信号通路，增强DNA修复能力和肿瘤细胞的干性特征。更重要的是，研究者们发现针对STK3进行抑制可以增强胃癌小鼠对化疗的敏感性，并筛选出氨基蝶呤（aminopterin）可作为STK3的潜在抑制剂，与化疗药物在胃癌小鼠治疗中发挥协同作用。YAP1，已被认定为促进胃癌进展的关键因子。找到YAP1的“下线”，有助于研究团队首先通过RNA-seq技术分析YAP1缺失的胃癌细胞，试图识别YAP1的下游靶基因。结果显示，STK3是唯一一个在YAP1缺失的条件下显著下调的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。然而，在Hippo-YAP1通路中，STK3是YAP1的上游因子。而这一发现令研究者们意识到，两者之间并非单纯的”单箭头“关系，STK3的身份更是存疑。接下来，研究人员通过使用不同的YAP1抑制剂以及YAP1基因敲除小鼠模型，验证表明YAP1的缺失确实会导致STK3表达的显著降低。而在YAP1过表达的细胞中，STK3的表达则显著上调。另外，结果提示STK3编码基因的启动子区域存在YAP1/TEAD4结合位点。众多证据都指向一个结论，即STK3是YAP1的转录调控靶基因，YAP1可以上调STK3的基因表达。紧接着，研究人员又找到了STK3参与胃癌进展的临床依据。根据原发胃癌队列以及CPTAC、TCGA、ACRG等多个数据库，分析结果显示STK3与YAP1在胃癌肿瘤细胞共表达，水平升高与较差的临床预后显著相关；YAP1主要定位于细胞核，而STK3则集中在细胞质。特别是在微卫星不稳定型（MSI）、基因组稳定型（GS）和染色体不稳定型（CIN）的胃癌亚型中，STK3水平升高较为显著。为了深入探讨STK3在胃癌中的作用，研究者们进行了STK3敲除和过表达的小鼠实验。研究发现，STK3敲除会显著抑制胃癌细胞的增殖、侵袭以及球形体的形成，且这一抑制作用与化疗药物5-FU具有协同作用。相反，STK3的过表达则能够促进胃癌细胞的增殖和侵袭，并增强胃癌细胞的干性特征，提高胃癌细胞的DNA修复能力。在机制层面，研究者发现，STK3通过直接与GSK-3β相互作用并促进其泛素化降解，导致Wnt/β-catenin信号通路被激活，从而上调一系列与细胞增殖、存活和干性维持相关的基因表达。为探索STK3的靶向治疗潜力，研究者们进行了结构基础的虚拟筛选，筛选出氨基蝶呤（aminopterin）作为STK3的潜在抑制剂。体外实验中，氨基蝶呤能够有效结合STK3并抑制其激酶活性，对胃癌细胞表现出显著的抗肿瘤作用，能够有效抑制胃癌细胞的增殖和干细胞特性。类器官模型和小鼠模型实验中，氨基蝶呤与5-FU联合使用时，能够增强5-FU的抗肿瘤效果，提高胃癌细胞对化疗的敏感性，抑制肿瘤生长，且未对主要器官造成严重的组织病理性改变。综上所述，本研究揭示了STK3在胃癌中的非典型促癌作用，STK3的激活通过调控DNA修复和维持癌细胞干性，推动了胃癌细胞的增殖和耐药性。STK3与YAP1的相互调控，展现了Hippo信号通路和Wnt信号通路之间的关键交叉点，进一步深化了我们对胃癌信号通路复杂性的理解，对STK3的靶向抑制为胃癌化疗耐药性提供了新的解决方案。参考文献：[1]Xie, F., Lyu, Y., Chen, B. et al. STK3 is a transcriptional target of YAP1 and a hub component in the crosstalk between Hippo and Wnt signaling pathways during gastric carcinogenesis. Mol Cancer 24, 186 (2025). https://doi.org/10.1186/s12943-025-02391-x本文作者丨张艾迪

2025年6月4日，中国科学院上海药物研究所郑明月/张素林团队联合盐城市第一人民医院耿炜团队，在Science Translational Medicine杂志在线发表了题为“Methotrexate exerts antitumor immune activity and improves the clinical efficacy of immunotherapy in patients with solid tumors”的研究论文。该研究揭示经典免疫抑制药物甲氨蝶呤（MTX）可以通过选择性诱导肿瘤细胞中cGAMP生成，同时抑制ENPP1介导的cGAMP水解，发挥抗肿瘤免疫作用。低剂量MTX治疗不仅在小鼠模型中显著增强了免疫疗法与放射疗法的抗肿瘤效果，在初步临床试验中也观察到了类似的增效作用。本研究揭示了MTX此前未被报道的免疫激活功能，并为在临床实践中将其与肿瘤免疫治疗及放疗联合应用提供了理论基础。1.背景近年来，尽管肿瘤免疫治疗取得了重大进展，但原发性与获得性耐药问题仍然存在。cGAS-STING通路激活可以诱导肿瘤微环境中免疫细胞浸润和抗原呈递，增强免疫疗法的敏感性。然而，由于STING蛋白在全身组织中广泛表达，直接使用STING激动剂可能导致全身性免疫毒性。ENPP1通过水解cGAMP负向调控STING信号，且在多种肿瘤组织中高表达，因此选择性抑制ENPP1有望实现肿瘤微环境特异性STING信号激活，避免全身性免疫毒性。在前期工作中，蒋华良/郑明月团队开发了一种利用微扰转录组数据预测药物-靶标相互作用的孪生谱图卷积网络（SSGCN）模型，并且利用该模型预测甲氨蝶呤（MTX）具有ENPP1抑制作用（人工智能助力药物研发：基于基因表达谱和孪生谱图卷积网络的药物靶标预测算法）。MTX最初作为二氢叶酸还原酶抑制剂被发现，通过抑制核酸合成来发挥抑制肿瘤生长作用。目前，MTX还被用作免疫抑制剂，是治疗类风湿性关节炎的临床一线用药。本研究发现，MTX在肿瘤微环境中表现出此前未被报道的免疫激活特性：既能选择性诱导肿瘤细胞生成cGAMP，又可抑制ENPP1介导的cGAMP水解，从而在体内发挥抗肿瘤免疫作用。针对不可切除或转移性实体瘤患者的初步临床试验显示，低剂量MTX作为免疫治疗和放疗的辅助手段展现出良好的疗效与安全性。这些发现为MTX作为免疫调节剂应用于肿瘤临床治疗提供了新的研究方向。2.结果与讨论2.1 叶酸拮抗剂作为ENPP1抑制剂的发现与鉴定鉴于MTX属于叶酸拮抗剂，研究人员也评价了其他叶酸类似物是否也同样具有ENPP1抑制活性。结果显示，这些叶酸类似物对人源ENPP1（hENPP1）和鼠源ENPP1（mENPP1）表现出不同程度的抑制活性，其中MTX的抑制活性最强，IC50分别为0.16 μM和0.57 μM（图1B-F）。以商品化的ENPP1抑制剂ENPP1-IN-1（E1）作为阳性对照。蛋白热迁移实验显示，MTX、氨基蝶呤（AP）、雷替曲塞（RTD）和E1也能增强hENPP1和mENPP1的热稳定性（图1G）。相比之下，培美曲塞（PTD）或叶酸（FA）对ENPP1热稳定性影响较小（图1G）。此外，核磁共振显示，MTX和RTD与hENPP1存在剂量依赖性结合（图1H）。这些结果表明包括MTX、AP和RTD在内的叶酸拮抗剂可直接结合ENPP1并抑制其催化活性，而PTD既不抑制ENPP1活性也不与其相互作用，因此后续研究选择PTD作为阴性对照。图1.叶酸拮抗剂作为ENPP1抑制剂的发现与鉴定2.2 MTX与RTD通过占据底物结合口袋竞争性抑制ENPP1催化活性研究人员采用等温滴定量热实验进一步证明了MTX和RTD能特异性结合hENPP，解离常数（KD）分别为0.27μM和0.38μM（图2A-C），而PTD无结合活性（图2D）。酶动力学实验分析表明，MTX和RTD通过与底物竞争结合发挥作用，提示结合于ENPP1的底物结合口袋（图2E）。通过氢氘交换质谱（HDX-MS）技术，研究人员发现MTX和RTD结合显著降低了hENPP1底物结合口袋（肽段289-300和320-326）的氢氘交换速率（图2F）。分子对接模拟显示，MTX的嘧啶环与Phe257/Tyr340形成π-π堆积，并通过多个氢键网络与活性中心结合（图2G）。关键位点突变实验证实，Lys295、Asp326和Phe257/Tyr340对MTX结合至关重要（图2H-J）。值得注意的是，MTX和RTD对同源蛋白ENPP2/3无抑制活性（图2K），表明其对ENPP1具有高度选择性。这些结果从分子水平阐明了MTX通过特异性占据ENPP1底物结合口袋发挥竞争性抑制作用的机制。 图2.MTX与RTD通过占据底物结合口袋竞争性抑制ENPP1催化活性2.3 MTX通过抑制细胞外cGAMP水解增强STING通路信号在免疫细胞上，MTX能有效抑制ENPP1介导的细胞外cGAMP水解，显著提升细胞内cGAMP浓度（图3A-B），这一作用依赖于外源性cGAMP的存在（图3C-D）。深入研究发现，MTX通过特异性阻断ENPP1活性来维持细胞外cGAMP水平，从而显著增强cGAMP诱导的STING通路活化，表现为STING信号关键蛋白磷酸化水平升高、IFNB1和CXCL10等基因表达上调（图3E-G）。并且转录组学分析显示，MTX可增强干扰素相关信号通路的显著激活（图3H-I）。ENPP1敲低实验进一步证实，MTX对cGAMP代谢的调控依赖于ENPP1的抑制作用（图3J-K）。这些结果表明：MTX通过特异性抑制ENPP1催化活性，减缓细胞外cGAMP水解，促进更多cGAMP进入细胞，从而增强STING信号通路激活。 图3.MTX通过抑制细胞外cGAMP水解增强STING通路信号2.4 叶酸拮抗剂通过诱导肿瘤细胞cGAMP生成激活免疫细胞中STING信号通路研究人员发现MTX、RTD和PTD均能剂量依赖性地上调肿瘤细胞中Ifnb1、Cxcl10和Il6的mRNA表达（图4A-B）。值得注意的是，这种激活作用并非完全依赖ENPP1抑制，因为不抑制ENPP1的PTD同样表现出激活效应。机制研究表明，叶酸拮抗剂通过诱导DNA损伤（表现为γH2A.X水平升高和胞质dsDNA积累）来激活肿瘤细胞中cGAS-STING通路（图4C-E）。转录组分析进一步证实，这些药物能显著上调干扰素和炎症相关基因的表达（图4F）。而在cGAS、STING缺失或TBK1抑制的肿瘤细胞内，叶酸拮抗剂诱导的炎症因子上调表型完全消失（图4G-I），这证明了是通过cGAS-STING通路发挥作用。研究人员还发现MTX可以激活共培养系统中免疫细胞的STING信号通路。在4T1肿瘤细胞与BMDCs免疫细胞的共培养实验中，MTX显著增强BMDCs中Ifnb1、Cxcl10等细胞因子的表达（图4J-L），而RTD和PTD无此效应。深入研究表明，MTX一方面选择性诱导肿瘤细胞DNA损伤促进cGAMP生成，另一方面通过抑制ENPP1减少cGAMP水解，从而促进其在微环境中的积累（图4M）。当BMDCs与cGAS缺失的4T1肿瘤细胞共培养时，MTX的免疫激活作用完全消失（图4N-P），说明肿瘤细胞来源的cGAMP是激活免疫细胞STING信号的关键介质。由于ENPP1在肿瘤细胞中高表达，这些机制促使MTX能够选择性激活肿瘤微环境中的STING信号，同时避免对正常组织的非特异性激活。 图4.抗叶酸药物可选择性激活多种癌细胞中的cGAS-STING通路2.5 MTX通过抑制胞外腺苷生成抑制肿瘤转移目前，低剂量甲氨蝶呤（MTX）作为经典的免疫抑制剂，是类风湿性关节炎的一线治疗药物。其作用机制之一是通过抑制腺苷脱氨酶（ADA）活性，导致腺苷蓄积。而本研究发现MTX还具有另一个重要特性：作为ENPP1抑制剂，它可以阻断cGAMP和ATP水解生成AMP的过程，从而从源头上减少细胞外腺苷的生成。在肿瘤微环境中，当存在cGAMP和ATP时，MTX预处理能够显著降低由此引发的腺苷浓度升高（图5A-C）。通过构建ADA缺陷、ENPP1缺陷及双缺陷的4T1细胞模型，研究人员进一步证实了MTX主要通过抑制ENPP1而非ADA来调控肿瘤微环境中的腺苷代谢（图5D-F）。腺苷能够通过与肿瘤细胞表面的A2B受体结合促进肿瘤转移。而MTX处理可以有效阻断cGAMP和ATP诱导的肿瘤细胞迁移（图5G）。在B16.F10小鼠肺转移模型中，低剂量MTX治疗显著减少了肺部转移灶的形成，同时表现出良好的安全性，未观察到明显的毒性反应（图5H-I）。 图5.MTX通过抑制胞外腺苷生成抑制肿瘤转移2.6 MTX增强肿瘤对放射疗法的敏感性鉴于MTX能通过抑制cGAMP水解提高其胞外浓度并降低腺苷水平，研究人员在4T1原位乳腺肿瘤模型中评估了MTX联合放疗（IR）的抗肿瘤免疫效果。IR可诱导肿瘤细胞DNA损伤并激活cGAS-STING信号通路，促进cGAMP生成，而MTX可以进一步强化该效应（图6A-D）。而PTD因无法抑制ENPP1活性，不能增强IR诱导的cGAMP积累或细胞因子上调。在4T1原位肿瘤模型中，MTX与IR联用显著抑制肿瘤生长并大幅延长生存期，75%的小鼠肿瘤完全消退且存活至第80天，其他组小鼠则在58天内全部死亡（图6E-G）。流式细胞术分析显示，MTX与IR联用显著增加了肿瘤微环境中CD3+ T细胞、CD8+ T细胞、活性的CD8+ T细胞（CD25+CD8+）以及CD11c+CD45+的树突状细胞（DCs）的比例（图6H-K）。而IR与PTD联用未见上述免疫细胞群变化。这些数据表明，低剂量MTX通过抑制ENPP1增强IR诱导的cGAMP积累，进而激活抗肿瘤免疫应答，最终实现肿瘤消退。 图6.MTX增强肿瘤对放射疗法的敏感性2.7 MTX增强免疫疗法的抗肿瘤效果为探究低剂量MTX是否能改善免疫检查点阻断（ICB）治疗效果，研究人员首先采用对ICB治疗敏感的MC38皮下肿瘤模型进行研究。实验结果显示，单独使用低剂量MTX或抗PD-1抗体可使肿瘤体积缩小约40%，而联合治疗则显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期（图7A-B）。流式细胞术分析发现，联合治疗组中CD45+ T细胞和CD8+ T细胞数量显著增加（图7C-D），同时Gzm B+ CD8+ T细胞中比例升高而PD-1+ CD8+ T细胞比例降低（图7F-G），表明联合治疗促进了活性CD8+ T细胞的增殖。机制研究表明，MTX的抗肿瘤免疫效应主要依赖于CD8+ T细胞而非CD4+ T细胞（图7J-K）。在Rag1基因敲除的免疫缺陷小鼠中，MTX单药或联合治疗的抗肿瘤效果几乎完全消失（图7L）。此外，CD11c+细胞（DCs）的耗竭会逆转MTX与PD-1单抗联合治疗的抗肿瘤效果（图7M），证实DCs在这一过程中起关键作用。值得注意的是，MTX治疗还能降低Foxp3+ CD4+调节性T细胞（Tregs）的比例（图7I），这些细胞通过产生腺苷促进肿瘤免疫抑制。综上，低剂量MTX通过多重机制增强抗肿瘤免疫：激活CD8+ T细胞应答、增加DCs浸润以及减轻Tregs介导的免疫抑制。为进一步验证MTX能否克服ICB治疗耐药，研究人员选用对ICB治疗高度抵抗的4T1原位乳腺癌模型。结果显示，虽然单药治疗效果有限，但MTX与PD-1单抗联合治疗可实现80%的肿瘤生长抑制率，并显著延长荷瘤小鼠生存期（图7N）。在Cgas或Sting基因敲除的4T1肿瘤模型中，MTX联合PD-1单抗的治疗效果显著降低（图7O），表明MTX的抗肿瘤免疫活性依赖于肿瘤细胞内cGAS-STING通路的激活。图7.MTX增强免疫疗法的抗肿瘤效果2.8 MTX联合免疫治疗与放疗的临床转化研究基于MTX在动物模型中展现的抗肿瘤免疫活性，研究人员开展了一项单臂II期临床试验（NCT05522582），旨在评估MTX联合PD-1单抗及放疗治疗晚期实体瘤的疗效（图8A）。研究纳入了38例转移性食管鳞癌患者，35例完成疗效评估，其中27例患者达到部分缓解（PR），8例疾病稳定（SD），客观缓解率（ORR）达77.1%，显著优于历史对照组的41.2%（图8B-E）。机制研究表明，PR患者外周血中IFNα/β/γ等免疫刺激因子显著升高（图8F-G）。蛋白质组学分析发现，PR组肿瘤组织干扰素反应相关通路显著激活（图8H），且cGAS和ENPP1高表达患者疗效更佳（图8I-J），提示这两个分子可能作为疗效预测标志物。安全性方面，联合治疗未加重放疗/免疫治疗的已知毒性，且CD8+ T细胞在治疗后3周呈现上升趋势，证实了低剂量MTX治疗的安全性。 图8. MTX增强了临床试验中免疫治疗联合放疗的抗肿瘤疗效3.结论本研究揭示了甲氨蝶呤（MTX）在肿瘤微环境中此前未被认识到的免疫激活作用（图7P）：首先通过选择性诱导肿瘤细胞DNA损伤、cGAS-STING通路激活以及cGAMP生成，同时抑制ENPP1介导的胞外cGAMP水解和腺苷生成，从而显著增强树突状细胞浸润并促进CD8+ T细胞活化。这一发现不仅为MTX联合放疗或免疫治疗提供了理论依据，更开拓了靶向ENPP1/DNA损伤双重通路的新型抗肿瘤药物研发思路，具有重要的临床转化价值。国科大杭州高等研究院副研究员杨瑞瑞、上海药物研究所和南京中医药大学联合培养研究生王蓓博士为本文的共同第一作者。上海药物研究所郑明月研究员、张素林副研究员、以及盐城市第一人民医院放疗科耿炜主任为论文通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、中国科学院战略性先导科技专项、中科院青年创新促进会会员项目、上海市自然科学基金、上海药物研究所与上海中医药大学中医药创新团队联合研究项目、中国科协青年人才托举工程项目以及江苏省卫健委科技项目的资助。参考文献https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.adn6921本文转自【人工智能药物设计】公众号--------- End ---------感兴趣的读者，可以添加小邦微信加入读者实名讨论微信群。添加时请主动注明姓名-企业-职位/岗位或姓名-学校-职务/研究方向。