Tisagenlecleucel

摘要:自然杀伤（NK）细胞是癌症免疫疗法的有力候选者，它们具有强大的先天细胞毒性，并且在嵌合抗原受体（CAR）治疗方面比T细胞具有独特优势。对病毒载体的安全性、成本和可扩展性的担忧激发了对非病毒基因传递替代品的研究。本综述全面分析了非病毒遗传修饰NK细胞在异体CAR-NK疗法中的最近进展和挑战。包括电穿孔和多功能纳米颗粒在内的非病毒替代品在CAR表达和转化反应方面受到检验。至关重要的是，NK细胞生物学与药物传递技术设计之间的联系被建立起来，这对于未来非病毒方法的发展至关重要。本综述为非病毒CAR-NK细胞工程的现状提供了宝贵的见解，旨在实现基于NK细胞的免疫疗法的全部潜力。 图形摘要:非病毒生产“现成的”CAR-NK细胞。 1.NK细胞可以从捐赠者血液中纯化，从干细胞分化，或在实验室中从永生化细胞系生产。 2.从CAR-T设计修改而来的NK特异性CAR设计，包括NK跨膜域（NKG2D、NKp44）、共刺激受体（例如，DAP10、2B4）和NK细胞受体（NKG2D）。 3.非病毒遗传修饰NK细胞可以包括通过DNA或mRNA传递CAR构建体，以及使用基因编辑工具（例如，CRISPR Cas9、转座子）敲入/敲出特定基因。这需要一种基因传递方法，可能包括电穿孔、脂质和多功能纳米颗粒和细胞。 1.引言 嵌合抗原受体（CAR）疗法是一种过继细胞疗法，其中T细胞、树突状细胞、巨噬细胞或自然杀伤（NK）细胞被遗传工程化以识别和消除癌细胞。CAR-T疗法是最成熟的形式，涉及修改患者的T细胞在体外表达一个CAR，该CAR能够识别癌细胞表面的肿瘤相关抗原（TAA），例如在许多B细胞淋巴瘤和白血病上表达的CD19。然后CAR-T细胞被扩增并重新输回患者体内，以靶向并杀死表达特定TAA抗原的肿瘤细胞。第一个CAR-T疗法于2017年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，到2022年又有五个产品获得批准；针对CD19+恶性肿瘤，包括白血病和淋巴瘤，或表达B细胞成熟抗原（BCMA）的多发性骨髓瘤（在表1中总结）。 基本CAR结构（图1）模仿T细胞受体激活，包括几个部分：一个识别癌细胞表面的特定抗原的细胞外域；一个对将信号发送到细胞内域至关重要的跨膜域，激活CAR-T细胞增殖和存活。CAR-T构建体设计已经经历了几代的发展，如图1所示。目前商业化的CAR-T细胞产品使用第二代CAR设计，增加了一个共刺激域（CD28或4-1BB）以增强T细胞增殖、持久性和细胞毒性（表1）。共刺激域的选择可以显著影响体内持久性；基于CD28的CAR T细胞持续约30天，而4-1BB CAR T细胞在某些患者中可能超过4年。 图1. CAR-T构建设计元素进展的详细示意图。第一代CAR由单链可变片段（scFv）抗原识别域、跨膜域和源自CD3ζ链（CD3ζ）的细胞内T细胞激活域组成，发展到第二代CAR设计，增加了额外的共刺激域（CD28或4-1BB），增强了T细胞的增殖和细胞毒性，被商业产品所采用。进一步的第三代CAR构建包含两个不同的共刺激域（例如，CD28和4-1BB）。“武装”的第四代CAR（也称为T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤（TRUCKs））包含可诱导表达的成分，如细胞因子（例如，IL-12），这可以增加CAR-T细胞的激活和肿瘤杀伤，第五代或称为“下一代”CAR包含一个截短的白细胞介素-2（IL-2）受体β链（IL-2Rβ），具有与转录因子STAT3的结合位点，以充分利用通过JAK-STAT3/5信号传导的CAR激活信号；增强T细胞的激活、增殖和持久性。此图使用BioRender.com创建。 血液系统恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤，迄今为止一直是CAR-T疗法的主要目标，治疗效果令人印象深刻。在2015年和2017年之间，针对tisagenlecleucel的第二阶段ELIANA临床试验，包括75名难治性或复发性B细胞急性淋巴细胞性白血病（ALL）的儿童患者，结果显示在三个月时的总体缓解率为81%。然而，73%的患者经历了严重的不良事件，其中47%发展为严重的细胞因子释放综合征（CRS）。CAR-T疗法的安全性问题是一个主要关注点，患者遭受的毒性包括CRS和肿瘤溶解综合征、神经毒性以及移植物抗宿主病（GVHD）的风险。此外，用CAR-T疗法治疗实体瘤已被证明更加困难，因为肿瘤异质性、炎症和肿瘤微环境中的免疫逃逸（TME）。与自体细胞疗法相关的成本也极高，CAR-T疗法的治疗费用从373,000美元到475,000美元不等，还有与白细胞分离、淋巴细胞清除疗法以及CAR-T免疫疗法的副作用相关的额外成本。例如，使用tisagenlecleucel治疗的患者的总治疗费用据报道，对于没有CRS的患者范围从478,777美元到对于有严重CRS的患者531,823美元，由于需要进一步的治疗和医院护理，包括在某些情况下的重症监护治疗。因此，有必要开发更安全的替代品，以减少患者的并发症风险，同时也有助于降低制造成本和与医院治疗相关的成本，以管理严重的副作用。这样的替代品之一是使用自然杀伤（NK）细胞进行CAR疗法，它们有潜力克服CAR-T疗法中的一些问题。 2.自然杀伤（NK）细胞 NK细胞是高度细胞毒性的免疫效应器，被定义为CD56+ CD3–淋巴细胞，能够发挥自然细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。它们在癌症监测中扮演重要角色，具有对癌细胞的自发细胞毒性的独特能力，无需事先暴露或由其他免疫细胞刺激，这归功于一系列激活受体。NK细胞可以通过下调通常在健康细胞上表达的人类白细胞抗原（HLA），与主要组织相容性复合体（MHC）同义，或上调应激诱导配体，如主要组织相容性复合体类1链相关蛋白A和B（MICA, MICB）来识别异常细胞。在识别目标细胞后，NK细胞通过涉及多种受体、共受体和细胞内蛋白的复杂信号传导途径被激活，包括自然细胞毒性受体（NCRs）、杀伤Ig样受体（KIRs）、NKG2D和DNAM-1。许多NK激活和抑制受体协同作用，提供一种自我调节机制，以防止对健康细胞的损害，如图2总结，更详细的内容在表2中。 图2. NK细胞常见的激活性A和抑制性B受体及其相应配体的简化示意图。NK受体协同作用，提供一种自我调节机制，以防止对健康细胞造成损害，并且可能通过下调人类白细胞抗原（HLA，与主要组织相容性复合体MHC同义）或上调应激诱导配体（如主要组织相容性复合体类1链相关蛋白A和B，MICA，MICB）来识别异常细胞。在识别靶细胞后，NK细胞通过涉及多种受体、共受体和细胞内蛋白的复杂信号传导途径被激活，包括自然细胞毒性受体（NCRs）、杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）、NKG2D和DNAM-1。此图使用BioRender.com创建。 抑制性受体识别HLA分子，使自然杀伤（NK）细胞能够区分正常细胞和异常细胞。当激活受体的平衡倾向于激活时，会释放含有穿孔素和颗粒酶B的细胞毒性颗粒，通过caspase介导的凋亡直接杀死目标细胞。NK细胞还表达死亡受体，如FasL、TRAIL和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）受体，以诱导表达相应受体的目标细胞凋亡。产生多种细胞因子和趋化因子，如干扰素-γ（IFN-γ）和TNF-α，激活其他免疫细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，并促进炎症。此外，NK细胞能够通过识别被抗体包被的目标细胞进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。成熟的NK细胞表达CD16受体（也称为FcγRIIIA），该受体识别与目标细胞表面表位结合的免疫球蛋白G（IgG）的Fc片段。与IgG包被的细胞相互作用后，含有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）的CD16亚基将受体连接到细胞内信号传导途径，触发肌动蛋白和微管的重组以实现ADCC。这最终导致含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒的释放，FasL和TRAIL死亡受体的参与，以及促进进一步招募多种免疫细胞的细胞因子和趋化因子的释放。CD16的表达对于NK细胞的ADCC功能至关重要，并且表达在更成熟的NK细胞上。因此，CD16的表达在命名法中用于分类NK细胞的成熟状态。人类NK细胞通常被细分为两个主要亚群：CD56brightCD16dim/−和更成熟的CD56dimCD16+。CD56dim亚群在外围血液中更为常见，而CD56bright在组织中更丰富。CD56bright NK细胞被认为是不成熟的，表达NKG2A但不表达KIRs。它们的细胞溶解能力差，分泌细胞因子IFN-γ、GM-CSF，并对IL-2或IL-15产生反应而增殖。相反，CD56dim被认为是成熟的，表达NKG2A和/或KIR受体，并在激活时具有强大的细胞溶解活性和细胞因子分泌能力。最成熟的、终末分化的NK细胞被分类为CD56dim KIRpos CD57pos CD16bright（图3）。成熟的CD56dimCD16+亚群是癌症治疗的理想选择，因为它们具有强大的细胞溶解活性和ADCC能力。因此，采用NK细胞的过继免疫疗法已成为一种有希望的治疗选择，研究正集中在探索如何利用NK细胞的力量用于癌症免疫疗法，如CAR-NK细胞疗法。[图3]。 图3. NK细胞成熟度与其他免疫细胞的相互作用。A. NK细胞根据成熟状态改变受体状态，从未成熟的CD56bright/CD16−细胞到成熟的CD56dim/CD16+细胞，以及最终分化的NK细胞，这些细胞有时也被称为“记忆样”NK细胞。B. NK细胞在激活后与髓系细胞和靶细胞的信号传递和相互作用。NK细胞通过直接杀伤（激活受体包括NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、KIRs）、凋亡（TRAIL和FasL死亡受体）和/或ADCC（CD16）对靶细胞发挥细胞毒性，并产生炎症细胞因子和趋化因子，这些因子刺激并招募其他免疫细胞。此图使用BioRender.com创建。 2.1.CAR-NK疗法的优势 与T细胞相比，NK细胞在CAR疗法中具有几个潜在优势，包括增强的安全档案、异体疗法的潜力以及通过CAR依赖和非CAR依赖的癌细胞靶向实现更广泛的目标特异性。CAR-Ts分泌包括IL-1、IL-2、IL6、TNF-α、MCP1、IL8、IL10、IL-15在内的一系列细胞因子。这些细胞因子，特别是促炎性的TNF-α、IL-1和IL-6，被报道是与CAR-T疗法相关的严重副作用的原因，包括神经毒性和CRS。相比之下，CAR-NK与不同的细胞因子档案相关，它分泌IFN-γ和GM-CSF。事实上，在给药CD19+淋巴样肿瘤患者后，CAR-NK细胞的炎症细胞因子并未超过基线。这种细胞因子释放档案的差异被认为是NK细胞增强安全档案的原因之一，导致毒性较小，减少细胞因子风暴的发生。尽管重要的是要注意这些结论是基于有限数量的临床CAR-NK研究和有限的患者数量，与许多大型CAR-T临床研究相比，并且尚未在CAR-T和CAR-NK疗法之间进行直接比较。CAR-NK细胞的另一个潜在安全优势是降低了与CAR-T细胞相关的靶向内肿瘤毒性的风险。所有细胞，无论是恶性还是非恶性的，如表达CAR靶抗原的CD19+ B细胞，都可能被CAR-T细胞靶向。NK细胞上的抑制性受体可能在非恶性细胞被CAR抗原识别时充当安全开关。如果识别非恶性细胞，将启动NK抑制信号，防止靶向内肿瘤毒性。 NK细胞在异体应用中的潜力在于CAR-NK细胞治疗后GVHD（移植物抗宿主病）的低风险。在T细胞的情况下，由于它们的αβ T细胞受体（TCRs）高度多变，供体T细胞与受体组织细胞广泛表达的HLA I类分子结合。在供体T细胞输注后，TCR识别HLA为外来物，启动针对受体细胞的免疫反应，导致导致GVHD的异体反应。相比之下，NK细胞的活性不依赖于HLA I类识别，允许NK细胞针对经常丢失HLA I类受体作为免疫逃逸手段的恶性细胞。因此，NK细胞治疗的GVHD风险较低，并且NK细胞的研究在安全性方面取得了有希望的结果。 由于安全性档案的改善和GVHD风险较低，有可能开发出一种“现成的”CAR-NK产品，这可能对领域产生变革性影响。尽管正在研究自体NK细胞治疗，但异体NK细胞可能比自体NK治疗更有效，克服了来自免疫抑制患者的耗尽NK细胞的问题。异体供体NK细胞可以大规模培养，便于更有效的质量控制测试、转染和输注；允许从同一批次治疗多名患者，这可能消除了对专业中心的需求。相比之下，目前CAR治疗中使用的T细胞通常来源于患者自身的细胞，这可能既耗时又昂贵，并且难以收获和工程化。自体CAR-T治疗的费用可能高达每次治疗475,000美元，由于CAR-T治疗劳动密集、难以扩展且容易失败。相比之下，一个周期的异体“现成的”NK-92治疗的费用可能不到20,000美元，使其成为一个更具成本效益的选择。需要注意的是，只有在多个患者之间共享工程化的异体NK细胞产品时，才能实现这样的成本节省。此外，生产异体T细胞的努力也在进行中，也可能有助于克服自体T细胞工程化过程中遇到的问题。 CAR-NK疗法可能在实体瘤治疗中具有潜力。CAR-T疗法在实体瘤中产生了令人失望的治疗结果，原因是诸如肿瘤异质性、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）、不足的交通和渗透以及毒性等障碍。CAR-NK细胞已在多种实体瘤中进行了研究，如胶质母细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌，并且提出NK细胞的天然属性可能对治疗实体癌有益。与稳定过表达B细胞抗原的淋巴瘤相比，实体瘤通常具有可变的抗原表面表达水平和肿瘤内及原发与转移组织之间的异质性，使得用单一CAR目标成功治疗变得困难。除了任何CAR修饰外，NK细胞还有潜力通过多个激活和抑制受体识别异质性肿瘤细胞，尽管HLA-I分子的表达减少或缺失。激活信号的存在，如NKG2D，允许NK细胞直接对缺乏特定CAR抗原并可能被CAR-T细胞遗漏的转化细胞发挥其细胞毒性，这在异质性实体瘤环境中很常见。这是NK细胞相对于CAR-T细胞的一个明显优势，后者只对表达CAR抗原的细胞活跃，并允许NK细胞针对更广泛的癌细胞群体。实际上，即使没有CAR抗原的添加，未修饰的NK细胞已被用于针对癌细胞，并已在临床试验中显示出其有效性的早期迹象。此外，除了它们对癌细胞的直接细胞毒性效应外，NK细胞对于招募常规1型树突状细胞（cDC1）和随后的CD8+ T细胞也很重要，这将促进癌症免疫周期的激活，有潜力克服免疫抑制性TME。 3.CAR-NK 疗法的发展现状 目前市场上还没有获批的基于 NK 细胞的产品，但自 2016 年以来，研究 NK 细胞疗法的临床试验数量激增，截至 2023 年 5 月，已有近 60 项试验启动。该领域仍处于新兴阶段，大多数试验处于 I 期或 II 期，并且仍在进行中，因此结果尚未完全报告。然而，早期数据令人鼓舞，表明 CAR-NK 细胞疗法是安全的，并有潜力成为癌症的有效治疗方法，尽管尚未报告显著的临床效果。虽然针对多种抗原和恶性肿瘤，但相当数量的 CAR-NK 试验集中在针对 CD19 的血液癌症，这是 CAR-T 疗法成功的目标之一。一个针对 CD19 的 CAR-NK 细胞的例子是，一项 I/II 期临床试验，研究 CD19 靶向 CAR-NK 细胞在复发或难治性 CD19+ B 淋巴样恶性肿瘤患者中的安全性和有效性，包括急性淋巴细胞性白血病（ALL）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NCT03056339）。来源于脐带血的 HLA 不匹配 NK 细胞与 K562 饲养细胞共培养，并与 IL-2 一起在第 6 天通过逆转录病毒载体转导，表达抗 CD19 CAR、IL-15 以增强 CAR-NK 细胞在体内的扩增和持久性，以及诱导性 Cas9 作为安全开关，在不可接受的毒性效应情况下触发 CAR-NK 细胞的凋亡。扩增后，CAR-NK 细胞在第 15 天收获用于新鲜输注，并给与 37 名复发或难治性 CD19+ 癌症患者，包括非霍奇金淋巴瘤和 CLL。临床对疗法的反应基于 2018 年慢性淋巴细胞性白血病国际研讨会（iwCLL）的标准和 2014 年非霍奇金淋巴瘤的卢加诺分类。1 年总生存率为 68%，无进展生存率报告为 32%。重要的是，没有发生显著毒性，包括 CRS、神经毒性或 GVHD，炎症细胞因子水平也没有增加，包括 IL-6。这一有希望的临床结果和安全概况突出了 CAR-NK 疗法作为异体疗法的潜力，可以开发成“现成”产品。CAR-NK 细胞疗法治疗实体瘤的潜力推动了这一领域的研究，目前正在进行的几项临床试验涉及胶质母细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌。这些研究中的许多还处于非常早期阶段，仍在招募患者，因此结果尚未完全报告。最近，Burger 等人发表了第一项探索胶质母细胞瘤患者中 CAR-NK 细胞疗法的临床试验结果；一项 I 期试验，研究在复发手术期间颅内注射针对人表皮生长因子受体 2（HER2）的 CAR-NK 细胞在 9 名复发 HER2+ 胶质母细胞瘤患者中的疗效（NCT03383978）。这项研究调查了慢病毒转导的 NK-92 细胞表达 CAR，包括 HER2 特异性单链抗体、CD8α 铰链区和 CD28 及 CD3ζ 信号域。在手术期间将 CAR-NK 细胞注入手术腔边缘后，五名患者的病情稳定，持续了 7 至 37 周。四名患者病情进展，两名患者在注射部位出现假性进展，提示治疗诱导的免疫反应。对于所有患者，中位无进展生存期为 7 周，中位总生存期为 31 周。此外，没有剂量限制毒性，也没有患者发展为 CRS 或免疫效应细胞相关神经毒性综合征。这项研究表明 CAR-NK 细胞治疗胶质母细胞瘤的可行性和安全性。尽管这是一项非常侵入性的研究，需要在手术期间注射 CAR-NK 细胞，但需要进一步研究以评估 CAR-NK 细胞通过静脉输注靶向和渗透实体瘤的能力。希望这些有希望的结果也能在其他实体瘤类型中复制，早期阶段的临床试验正在进行中。 4.CAR-NK 生产考虑因素 尽管安全性和治疗结果令人鼓舞，但 CAR-NK 疗法仍处于起步阶段，在它们被批准用于临床之前还有很多工作要做。如果需要实现 CAR-NK 疗法的潜力，需要解决的一些考虑因素包括 NK 细胞的来源、CAR 结构设计以及 NK 细胞的遗传修饰方法。 4.1.异体 NK 细胞来源 异体 NK 细胞可从多种来源获得，包括外周血（PB）、脐带血（CB）、诱导多能干细胞（iPSCs）和永生化细胞系。这些来源在扩增和遗传修饰方面都有其独特的考虑因素，目前都在临床研究中。 从外周血（PB）和脐带血（CB）衍生的 NK 细胞 从 PB 或 CB 来源的 NK 细胞是获取 CAR 疗法 NK 细胞的主要方法，广泛用于 NK 细胞应用。然而，细胞增殖能力可能较低，细胞存活时间短。大约 85-95% 的 PB NK 细胞是 CD56dimCD16high，具有高度的细胞毒性，但与其产生细胞因子的 CD56bright 对应物（占 PB NK 的 5-15%）相比，增殖能力较低。相比之下，由于常规储存，CB 衍生的 NK 细胞可能更容易获得，并且比 PB NK 细胞更具增殖性，允许在体外轻松扩增。然而，CB NK 细胞在表型和功能上不成熟，可能不如其他来源的 NK 细胞具有细胞毒性。从 PB 或 CB 分离 NK 细胞后，需要扩增以创建异体剂量，由于治疗剂量所需的 NK 细胞数量大，这已被证明是具有挑战性的。扩增协议可分为基于饲养细胞的或无饲养细胞的系统。与饲养细胞（例如 Epstein-Barr 病毒转化的淋巴母细胞系（EBV-LCL））共培养，这些细胞向 NK 细胞呈现配体，刺激 NK 细胞的激活和扩增，相对快速地扩增到大量（几周内）。然而，使用饲养细胞与安全和监管问题相关，包括最终 NK 细胞产品中残留活性饲养细胞的潜力。因此，已开发了使用细胞因子和抗体刺激 NK 细胞的无饲养细胞扩增方法。包括 IL-2 和 IL-15 在内的细胞因子是强大的 NK 细胞刺激剂，但包括 IL-15、IL-21、IL-12、IL-18 和 IL-27 在内的一系列细胞因子组合已显示出扩增 NK 细胞的前景。虽然无饲养细胞系统避免了与饲养细胞相关的安全问题，但产生的 NK 细胞产量较低。将饲养细胞遗传修饰以表达刺激细胞因子的组合已产生高度细胞毒性和增殖性的 NK 细胞。例如，K562 饲养细胞遗传修饰以表达膜结合 IL-15 和 41BB 配体（K562mbIL12-41BBL）在培养 10 天内导致大量扩增 PB NK 细胞在透气静态细胞培养袋（G-REX）中。另一个可能影响 NK 细胞效力的因素是冷冻保存。从 PB 或 CB 来源的 NK 细胞可能在扩增前或在“现成”产品的情况下需要冷冻保存，这可能对 NK 细胞的增殖和细胞毒性功能产生不利影响。潜在的解决方案包括准备额外的细胞以弥补冷冻保存后的损失，或在解冻后立即用 IL-2 等细胞因子刺激，或用 IL-15 和 IL-18 预处理以提高冷冻保存后的活性。此外，在非病毒遗传工程方法的背景下，与 iPSCs 和细胞系相比，PB 和 CB NK 细胞仍然难以操纵。与 NK 细胞的培养和扩增相关的因素可能影响转染率，包括 NK 细胞的激活状态、扩增期间的转染时机、扩增方法（饲养或无饲养方法）和冷冻保存。病毒转导率在体外扩增（激活）的 NK 细胞中得到增强，而在静止的原代 NK 细胞中观察到较低的转导。大规模扩增 NK 细胞的标准协议需要在病毒转导前的初始扩增，然后是第二阶段的扩增。这种顺序的原代扩增、遗传编辑和次级扩增协议也适用于电穿孔，基于饲养细胞或无饲养系统的扩增方法和时机也可能影响转染率。饲养细胞可能通过诱导细胞分裂增强遗传编辑，饲养刺激可能支持 NK 细胞在体外操纵后的恢复。例如，Pomeroy 等人观察到在与 K562-mbIL-21-41BB 饲养细胞共培养的 PB NK 细胞电穿孔后第 4 天 TcBuster 的转位最高。根据协议阶段调整饲养细胞与 NK 细胞的比例（电穿孔前 2:1 饲养：NK，电穿孔后 48 小时 5:1 或所有随后扩增的 1:1）。同样，Gurney 等人使用 EBV-LCL（10:1 饲养：NK 比例）在 IL-2 和 IL-21 存在下激活 NK 细胞。NK 细胞在第 4 天电穿孔并在 IL-15 存在下休息 48 小时，然后重新刺激饲养细胞。进一步扩增进行到第 25 天，观察到不同捐赠者之间细胞扩增的变化。这突出了遗传工程和扩增 NK 细胞所需的优化的复杂性，并且一系列因素可能影响转导/转染率，尚未建立标准协议。需要进一步的研究来阐明最佳条件，并且可能需要根据基因传递方法定制条件。 iPSC 衍生的 NK 细胞 作为解决原始 PB 和 CB 衍生 NK 细胞问题的替代方案，iPSC 提供了无限的资源来生产同质 NK 细胞，并且可以在大规模上进行遗传修饰和扩增。从单一 iPSC 系生成的 iPSC 衍生 CAR-NK 细胞，然后进行分化和扩增，成为通用的细胞产品，有潜力成为“现成”疗法。2021年12月，Fate Therapeutics 的新闻稿详细介绍了一项 I 期研究的中期临床数据，该研究调查了表达 CD19 的“现成” iPSC 衍生 CAR-NK 细胞（称为 FT596），用于治疗复发/难治性 B 细胞淋巴瘤（NCT04245722）。FT596 iPSC CAR-NK 细胞被设计表达高亲和力不可切割的 CD16 变体，以增强 ADCC；一种膜结合 IL-15/IL-15R 融合蛋白，以支持体内持久性；以及针对 NK 细胞优化的抗 CD19 CAR，用于直接肿瘤靶向。据报道，接受第二个 FT596 周期治疗的 11 名患者中有 10 名持续反应，其中三名患者在≥6 个月的随访中持续完全反应。此外，FT596 治疗方案耐受性良好，没有剂量限制毒性，如神经毒性或 GVHD，尽管在 FT596 单剂量递增队列中有两例低级别不良事件的 CRS 报告，这些事件在未经重症监护治疗的情况下得到解决。这些早期数据突出了 iPSC CAR-NK 疗法的潜力，但在这种疗法在临床上更大规模推广之前，需要完成进一步的研究和优化。iPSC NK 细胞的一个问题是需要高度专业化的培养条件，其中 iPSC 被分化为 CD34+ 造血祖细胞，然后进一步分化为 NK 细胞。从 iPSC 生产 NK 细胞的成熟协议可能需要 4-5 个月，尽管最近开发了一种新方法，将处理时间缩短到大约 2 个月。控制 iPSC 的分化是一个劳动密集型的制造过程，需要遗传工程和细胞培养专业知识，这对于大规模生产财务上可行且能够被更广泛患者群体接受的“现成”产品可能是有问题的。此外，存在对 iPSC 遗传突变风险的主要关注，特别是当需要长时间的培养时。此外，还存在未分化 iPSC 潜在的肿瘤形成风险。因此，需要开发稳健的质量测试对 iPSC 衍生的细胞进行筛选，包括筛选在培养过程中可能发生的任何遗传改变。 NK 细胞系 迄今为止，已有 10 个永生化模型 NK 细胞系，包括 NK-92、KHYG-1、NKL 和 YT，它们是从 NK/T 淋巴瘤患者中建立的，并用于 CAR 疗法的临床前开发。NK 细胞系对恶性细胞具有高度的细胞毒性，并且比原始 PB 或 CB 来源的 NK 细胞更容易进行遗传修饰和扩增。尽管需要注意的是，与其他类型的细胞系相比，NK 细胞系更难培养，因为它们对培养条件的变化非常敏感，通常需要添加细胞因子 IL-2 或 IL-15 来支持增殖。由于 NK 细胞系的恶性特性，因此在转移给患者之前需要进行辐射处理，这可能对输注的 NK 细胞的存活和细胞毒性效应产生不利影响。尽管如此，NK-92 细胞已获得 FDA 批准用于临床使用，到 2021 年，它们是临床试验中最常用的工程化 NK 疗法来源（占试验的 43%），其次是 PB NK（21%）、iPSC（17%）和 CB NK（13%）。NK-92 细胞系源自 1994 年一名 50 岁男性非霍奇金淋巴瘤患者，由于表达 CD56 和许多主要 NK 激活受体，包括 NKp30、NKp46、2B4、NKG2D 和 CD28，被认为是类似 NK 的细胞系。相反，NK-92 细胞几乎缺乏所有的 KIR 受体，并且表达很少的抑制性受体（NKGA/B、低水平的 KIR2DL4、ILT-2），并且不表达负责 ADCC 的 CD16 受体。NK-92 细胞的强细胞毒性可以归因于这种受体表达谱，当激活时，它触发穿孔素-颗粒酶细胞毒性途径，以及由 FasL、TRAIL、肿瘤坏死因子样弱诱导凋亡因子（TWEAK）和 TNF-α 引导的死亡受体细胞毒性途径。为了克服 NK-92 细胞的局限性并朝着开发“现成” CAR-NK 细胞的方向迈进，已经开发了几个衍生细胞系。NK-92MI 被设计为产生 IL-2，从而不需要补充 IL-2。首个人体临床试验（NCT02944162）中，NK-92MI 表达 CD33 CAR 用于治疗复发和难治性急性髓系白血病（AML）患者，证明了这些细胞的临床安全谱。NK-92MI 细胞被慢病毒转导 CAR CD33.CD28.41BB.CD3z 构建体，扩增并在输注前共辐射（10 Gy）。在每个患者输注高达 5×10^9 个细胞后，未观察到显著的不良效应，尽管一名患者经历了 I 级 CRS。接受治疗的三名患者中，一名患者对治疗没有反应，而另外两名患者在 1 个月和 4 个月后复发。尽管这是一项小规模研究，患者数量有限，但它有助于证明 CAR-MI 细胞的积极安全谱，但治疗效果并不令人印象深刻。 NK-92细胞系的进一步优化产生了高亲和力NK-92（haNKs），这些细胞表达CD16受体，增加了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性。目标亲和力NK-92（taNK）经过改造，能够针对特定的肿瘤细胞配体，此外，t-haNKs结合了所有这些特性，表达高亲和力CD16，分泌IL-2，并识别特定的肿瘤配体，如PD-L1。在II期QUILT 88试验（NCT04390399）之后，t-haNKs治疗典型难以治疗的胰腺癌的潜力得到了突出，该试验调查了ImmunityBio的Nant癌症疫苗，包括PD-L1靶向t-haNK细胞与IL-15受体激动剂Anktiva（N-803）、阿霉素、白蛋白修饰剂以及低剂量化疗在胰腺癌治疗中的组合。在联合治疗后，第三、第四和第五线患者的总生存期为5.8个月，几乎是历史生存期3个月的两倍，严重副作用不常见，为8%。随着许多关于CAR表达NK-92细胞的试验正在进行，调查使用包括CD19、MUC-1、HER2、ROBO1和PD-L1在内的一系列癌症靶标治疗血液和实体肿瘤，这些早期积极的结果可能预示着利用NK-92细胞的CAR-NK疗法的未来潜力。 KHYG-1细胞系已被证明比NK-92细胞具有更强的细胞毒性。这表明这个细胞系也可以作为“现成的”CAR-NK疗法的治疗应用，如Stikvoort等人的概念验证研究中所报告的。KHYG-1细胞通过逆转录病毒转导了含有CD28共刺激域的CD38-CAR，并产生了针对CD38high多发性骨髓瘤（MM）细胞系（UM9和THP-1）和来自患者的原发性MM细胞的有效CD38依赖性细胞毒性。此外，CD38-CAR KHYG-1细胞显著减缓了UM9肿瘤在具有人骨髓样生态位的RAG2–/–γc–/–小鼠异种移植模型中的生长。植入了表达荧光素酶的UM9 MM肿瘤的RAG2–/–γc–/–小鼠接受了多次静脉注射CD38-CAR KHYG-1细胞的治疗，治疗后20天，与未经治疗的对照组的24倍增长相比，CD38-CAR KHYG-1治疗小鼠的生物发光仅增加了四倍。这项研究突出了KHYG-1细胞被开发成类似于NK-92细胞的CAR-NK细胞的潜力，但需要进一步的研究来评估这在人类中的潜力，因为小鼠模型中的结果并不总是能够转化为人类。 从恶性来源衍生的NK细胞系在临床应用前需要进行辐射，这可能会影响其在体内的增殖和持久性。例如，NK-92细胞在体内的寿命很短，通常在初次输注后两天，这在减少副作用方面可能是有利的，与可以循环数月或数年的CAR-T疗法相比。然而，这种短暂的寿命可能导致较差的治疗结果和多次治疗的需求。已经对NK-92细胞进行了工程改造，以表达IL-2，增强体内扩增，但需要更复杂的工程来对抗TME中的NK耗竭，特别是对于实体肿瘤的治疗。KHYG-1细胞强烈表达抑制性受体NKG2A，当与MM细胞共培养时，发现其表达高水平的PD-1。这可能是CAR-NK疗法发展的一个主要障碍，需要在这些疗法成功之前加以解决。 4.2.NK细胞的CAR构建设计 最初的CAR-NK研究采用了旨在模仿T细胞受体的CAR-T骨干。然而，NK细胞毒性是由一组不同的激活和抑制受体调节的，这些受体可以并入CAR设计中，以激活天然NK受体并利用NK功能。CAR-NK细胞可以通过表达包含NK特异性跨膜信号域以及共刺激受体（例如，NKG2D、DNAM-1、2B4、CD28或4-1BB）的抗原特异性CAR分子来工程化，以优化NK细胞效应功能。这些设计旨在增强NK细胞在识别肿瘤抗原时的激活，并提高CAR-NK细胞的持久性、细胞毒性和细胞因子产生能力（图4）。 图4. 比较CAR-T和CAR-NK疗法中CAR构建设计元素的示意图。最初研究CAR-NK细胞时使用的构建与第三代CAR-T疗法中使用的构建相同，这些构建旨在模仿T细胞受体。此后，已开发出针对NK细胞的特定CAR构建，以纳入NK跨膜信号域以及共刺激受体（例如，DAP10、2B4、CD28或4-1BB），以增强NK细胞的效应功能。激活受体NKG2D也被纳入NK特异性CAR构建中；尽管NKG2D不是经典的“CAR”因为它不是单链可变片段（scFv），但在文献中它们被称为CAR。此图使用BioRender.com创建。 Li等人筛选了几种为NK细胞活动优化的CAR构建，包括各种跨膜和共刺激域的组合。比较了表达针对间皮素的CAR的iPSC-NK细胞（称为CAR-iPSC-NK），该CAR包含NKG2D跨膜域、2B4共刺激域和CD3ζ信号域，与基于T细胞的CAR包含两个CD28域与4-1BB（CD137）和CD3ζ（称为T-CAR-NK）在荧光素酶表达的A1847卵巢癌异种移植模型中的活性。与T-CAR-NK治疗组相比，CAR-iPSC-NK在生物发光成像后导致肿瘤负担显著减少并改善了生存期。此外，在与表达CAR的原代T细胞进行比较后，CAR-iPSC-NK组在70天时的生存期提高到80%，而T-CAR组为20%。重要的是，T-CAR组表现出严重副作用的证据，包括显著的体重减轻（>50%，在第23天和第39天各有2个n），严重的内脏出血和缺血，脾脏肿大以及对包括肝脏、肺、肾脏和肠道在内的内部器官的病理性损害的证据。相比之下，CAR-iPSC-NK治疗组没有观察到这样的效果。 我们知道NKG2D是一个主要的激活受体，负责在识别肿瘤细胞上表达的“杀伤我”压力信号，即MICA、MICB和UL16结合蛋白（ULBP-1和ULBP-6）后，引发caspase介导的凋亡。利用NKG2D可以增强NK细胞的抗肿瘤细胞毒性。Xiao等人报告了一项小型临床试验，研究PBMC衍生的NK细胞表达NKG2D与DAP12共刺激域融合，通过腹腔内（i.p.）输注给三名转移性结直肠癌患者（NCT03415100）。作者报告说，在两名患者中，腹水生成减少，腹水中的肿瘤细胞显著减少，而在第三名患者中，通过超声观察到肝脏区域的肿瘤迅速退缩，并通过PET-CT扫描确认完全的代谢反应。所有三名患者均报告病情稳定，重要的是，没有观察到剂量限制性毒性或GVHD。尽管这项研究中使用的CAR构建只有一种细胞内域的第一代设计，但它为进一步开发携带NKG2D受体的下一代CAR构建铺平了道路。这强调了精心设计的NK特异性CAR构建的重要性，以最大化CAR-NK治疗效应并减少与CAR-T构建相比的副作用，仍有相当数量的NK受体、共刺激域和每种组合需要探索。 4.3.CAR-NK制造的遗传改造方法 对于大规模生产“现成的”CAR-NK产品，用于遗传工程NK细胞的方法是一个重要的考虑因素，这可能影响生产时间、成本和可扩展性。理想情况下，用于创建CAR的转染方法应该是高效的、可扩展的，且非免疫原性的。目前，大多数CAR疗法是使用病毒载体工程化的，与非病毒方法相比，病毒载体产生稳定的基因表达和更高的转导率。NK细胞极难转导，特别是原发性PB和CB NK细胞，即使使用通常非常有效地转导广泛细胞的病毒载体；由于高表达免疫受体，如模式识别受体（PRRs），这些受体在病毒转导后触发NK细胞的凋亡。因此，通常用于CAR-T生产的遗传编辑的病毒载体，如水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）慢病毒，在NK细胞中的转导率降低（<10%转导效率）。在VSV-G的情况下，这据说是由于NK细胞上低密度脂蛋白受体的低表达，这是VSV-G细胞进入所需的。 狒狒包膜假型慢病毒载体（BaEV-LV），它结合钠依赖性中性氨基酸转运蛋白（ASCT1和ASCT2）进行细胞进入，已被报道在新鲜分离的人NK细胞中产生23%的增强转导，并至少持续21天的稳定转基因表达。对于体外遗传工程，慢病毒载体的稳定表达是一个重要考虑因素，因为细胞被工程化以永久表达转基因，然后扩增后再输注给患者。然而，病毒载体有显著的缺点，包括关于突变、毒性、免疫原性的安全问题；昂贵且耗时的生产，除此之外还有漫长的NK细胞扩增协议；以及有限的核酸载体能力，这在传递更大的第三代、第四代和第五代CAR构建时可能是有问题的。例如，用于慢病毒生产的第二代CAR构建可能在10 kbp左右，随着后续几代中添加更多组件，这个数字会增加到20 kbp。因此，需要开发更安全、更高效的非病毒遗传改造方法用于CAR-NK生产。 5.基因编辑工具用于CAR-NK细胞 遗传编辑工具的发展，如DNA转座子和规律成簇短回文重复序列（CRISPR）技术，提供了一种稳定的转基因表达的非病毒方法。转座子系统是一类具有从一个位置移动或“转座”到基因组内另一个位置能力的遗传元素，通过“剪切和粘贴”机制，使它们成为遗传工程的强大工具。最有希望用于基因治疗的转座子是源自睡美人（SB）和猪儿虫（PB）系统。转座子系统由两个组成部分构成，转座子包含感兴趣的基因，通常以质粒形式存在，以及相应的转座酶酶，可能以蛋白质或编码转座酶蛋白的mRNA形式存在。转座子由特定的DNA序列包围，称为反向末端重复序列（ITRs），被转座酶识别。一旦识别ITR，转座酶就会切出转座子，然后将其插入新的基因组位置。尽管转座子系统有稳定的基因传递潜力，但由于担心意外的基因组中断或插入性突变和免疫原性导致难以获得监管批准，还没有转座子系统进入临床。最近，为SB系统开发的迷你圈载体的生产改进，这些载体具有最小的表达盒，缺乏细菌质粒骨架，有助于克服与质粒DNA载体相关的变量转染效率和宿主细胞毒性问题，与mRNA转座酶配对使用，有助于将转座子推向临床。BioTechne的TcBuster转座子系统是一个例子，它专门为CAR-T和CAR-NK生产而开发。它由一个含有基因表达盒的纳米质粒组成，与编码转座酶酶的mRNA配对。TcBuster成功地向原代人PB NK和T细胞传递了CD19-CAR构建，也表达了EGFP，产生的CAR表达NK和T细胞产生的细胞因子（IFNγ、TNFα和CD107a脱颗粒标记）显著多于CAR阴性对照，并且有效地杀死了目标CD19表达的Raji细胞。截至2023年11月，clinicaltrials.gov上注册了七项使用转座子系统的CAR-T细胞的临床试验，表明这项技术有可能应用于CAR-NK生产。 CRISPR是一类重复的DNA序列，与CRISPR相关（Cas）基因协同作用。CRISPR技术包括三个主要组成部分：crispr-RNA，与目标基因互补；Cas核酸酶蛋白，这是一种由crispr-RNA引导到DNA上特定位置的酶，像分子剪刀一样切割DNA；tracer-RNA有助于处理和绑定crispr-RNA和Cas核酸酶。CRISPR技术已被用来增强与原代NK细胞相比免疫功能较弱的NK-92细胞系的细胞毒性。使用针对CD96和KLRC1（编码NKG2A）的Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物通过核糖体电穿孔成功敲除抑制性CD96和NKG2A受体，结果只有2.8%的编辑NK-92细胞表达这些受体，而未编辑的亲本细胞为92.5%。此外，作者敲入了一个荧光mCherry基因，并替换了一个沉默的启动子，重新激活内源性CD16和DNAM-1。由此产生的CRISPR工程化NK-92细胞与未编辑的NK-92细胞相比显示出显著增强的细胞毒性，并且可以通过CD16介导的ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性）对抗包括MDA-MB-231和BT-474乳腺癌细胞在内的一系列癌细胞。这项研究突出了CRISPR在工程化中利用各种NK激活和抑制受体以获得治疗效益的潜力。 转座子和CRISPR技术也可以同时使用，结合强大的遗传编辑活动。实际上，转座子工程和CRISPR/Cas9基因组编辑的结合被用来产生在PB NK细胞中表达髓样相关抗原CLL-1的强大CAR-NK细胞。TcBuster转座子系统传递了CLL-1 CAR构建，而CRISPR/Cas9载体被用来敲除NK细胞细胞因子检查点细胞因子诱导的含有SH2的蛋白（CIS，CISH基因的产物）。在CLL-1 CAR-NK细胞中同时敲除CISH与DNAM-1的减少和CD69表达的增加，NKG2D、NKp30、NKG2A、PD-1和TIGIT表达的减少有关。对控制和CLL-1 CAR-NK细胞都观察到增强的原发性AML芽细胞毒性，表明这些技术有潜力增强细胞毒性和改变NK细胞表型。同样，这种CISH敲除方法已在人类iPSC衍生的NK细胞和CB衍生的NK细胞中使用；导致增强的体内持久性、代谢健康和抗肿瘤活性。这些研究作为非病毒遗传编辑潜力的例子，但是NK激活和抑制受体之间平衡的复杂性需要进一步研究，以优化和利用这种治疗。 同样重要的是要承认围绕基因编辑工具存在安全性和伦理问题，包括转座子和CRISPR技术的风险，即插入性突变的风险。转座子基因组整合可能会激活潜在的原癌基因或中断肿瘤抑制基因，这可能导致恶性转化。尽管到目前为止SB转座子系统已经显示出良好的安全档案，但一项使用PB工程供体衍生的CD19 CAR-T细胞的临床试验导致10名患者中有2名发展出源自CD19-CAR-T细胞的T细胞淋巴瘤。尽管这项技术具有潜力，但在向临床进展之前，需要进一步的研究以确保转座子系统的安全性。包括避免可能增加原癌基因激活风险的强病毒增强子、使用“安全港”位点和位点特异性DNA结合域以实现位点特异性转座等策略，是克服转座子问题的潜在解决方案。在CRISPR的情况下，“非目标”DNA切割可能会引入不需要的突变，并可能加剧逆转录转位。减少非目标效应的方法包括优化CRISPR-Cas9系统的不同组成部分，开发主要编辑器和RNA编辑。尽管如此，在2023年11月，英国药品和保健产品监管机构（MHRA）成为第一个批准CRISPR-Cas9基因编辑疗法Casgevy（exagomglogene autotemcel）用于治疗输血依赖性β-地中海贫血和镰状细胞病的机构。这一里程碑式的批准在12月由FDA对Casgevy和Lyfgenia（lovotibeglogene autotemcel）以及欧洲药品管理局（EMA）对Casgevy的批准跟进。尽管接受Casgevy和Lyfgenia治疗的患者仍在进行这些治疗的安全性和有效性的长期评估，但这一批准无疑将为CRISPR基因组编辑技术的进一步使用和批准打开大门。 图5. 非病毒基因工程化“现成”CAR-NK细胞需要高效转染和CAR转基因的稳定表达。 1.引入编码DNA和/或mRNA中的CAR结构的CAR构建，或使用CRISPR Cas9或DNA转座子技术如PiggyBac和Sleeping Beauty进行基因编辑，以实现稳定的基因表达。2. 编码CAR构建的核酸可以通过多种非病毒递送策略传递给NK细胞，包括电穿孔、脂质纳米颗粒、细胞穿透肽或多功能纳米颗粒。3. 转染后，表达CAR构建的NK细胞在体外扩增，以生产可用于治疗多个患者的“现成”CAR-NK产品。 6.向NK细胞的非病毒基因传递 尽管非病毒基因组编辑方法具有巨大的潜力，但一个主要障碍是细胞内传递的方法。总的来说，转座子和CRISPR技术由核酸组成，无论是DNA还是RNA形式，因此需要一种细胞进入的方法。一般来说，最常用的非病毒传递方法通过物理电穿孔裸核酸，或涉及与脂质体、阳离子聚合物、蛋白质或细胞穿透肽（CPPs）的复合物的化学方法，这些复合物包装核酸并促进细胞内传递，在图5中总结。尽管在其他细胞类型中取得了成功，但与病毒转导相比，NK细胞更难转染，非病毒转染率令人失望。对于体外基因传递，基因传递的主要障碍是细胞膜、内体陷困，在DNA的情况下，是进入细胞核，为了成功的基因传递，理想的传递载体必须克服这些障碍，同时无毒。电穿孔（包括核糖体电穿孔）是用于NK细胞非病毒传递的最广泛使用的方法，转染效率高达90%，但由于对细胞施加的强电场可能导致问题，可能会增加制造时间表和成本。在电穿孔传递质粒编码报告基因绿色荧光蛋白（GFP）时，原代NK细胞的细胞存活率报告低至2%，尽管通过仔细优化提高到50%，一些电穿孔器制造商引用的存活率为80-90%。尽管如此，这些方法需要仔细优化，使用细胞因子刺激或与饲养细胞一起扩增以获得足够的转染效率和存活率。少数研究使用非病毒传递系统作为NK细胞基因传递的方法（在表3中总结），取得了不同程度的成功。 6.1.基于脂质的NK细胞递送 脂质在脂质体和脂质纳米颗粒（LNP）中被用来递送核酸，用于多种应用，包括最重要的，使用脂质纳米颗粒递送mRNA新冠疫苗，由BioNTech和Moderna两家公司开发。这些基于LNP的疫苗的批准代表了非病毒递送系统领域的一个重大突破，并为后续产品铺平了道路。脂质是含有极性头基团与疏水尾部相连的两亲分子，具有一系列属性的脂质已被用于基因递送。阳离子脂质，如1,2-二-O-十八烷基-3-三甲基铵丙烷（DOTMA）及其衍生物1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）允许包装遗传货物并通过静电相互作用和膜融合进行细胞内递送。在生理pH值下呈中性的可电离脂质，在内体的低pH值下变得质子化，促进内体释放货物。其他脂质，如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DSPC）和胆固醇类似物已被用来帮助稳定LNP结构。LNPs可能通过各种内吞途径被内化，如巨胞饮作用、网格蛋白介导的和洞穴蛋白介导的内吞作用，这在不同细胞类型之间有所不同。内化后，LNPs通常进入内体隔室，需要一种逃逸机制来释放货物。因此，通常使用具有不同属性的脂质组合来优化LNP功能。Nakamura等人开发了一种多功能信封型纳米装置（MEND），其中包含一种可电离-阳离子脂质，以促进内体逃逸，称为YSK12-C4脂质（YSK12-MEND），用于递送siRNA到免疫细胞系。作者证明了YSK12-MEND在一系列人类免疫细胞中递送编码GAPDH的siRNA的转染能力。在NK-92细胞中的基因沉默为75%，远高于商业上可用的Lipofectamine RNAiMAX的19%沉默。然而，YSK12-MEND LNP在NK-92细胞中引起了细胞毒性（在30 nM siRNA剂量下60%的细胞存活率）。该团队最近生产了由pH敏感阳离子脂质CL1H6组成的LNP，用于siRNA递送到NK细胞系。CL1H6具有与YSK12-MEND相同的亲水头基团和油酸结构作为疏水尾部，用氨基取代了甲基基团，这促进了NK-92细胞通过膜融合的细胞摄取和内体逃逸。CL1H6与LNP中的胆固醇的比例被优化为25/75，以获得更好的基因沉默效果（在递送针对GAPDH的siRNA后，GAPDH的基因沉默为90%），同时保持NK-92细胞中的良好细胞存活率（90%存活率）。对于KHYG-1细胞也报告了类似的结果。作者将这种改善的细胞存活率归因于内体逃逸期间的膜融合活性。YSK12-MEND以高度的膜融合从内体逃逸，而CL1H6-LNP仅以轻微的膜融合从内体逃逸。同样，Doukas等人最近优化了LNP配方，用于mRNA递送到NK细胞，使用可电离脂质。优化的LNP由可电离的“Lipid 5”，DSPC，β-谷甾醇和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2K）组成，在KHYG-1细胞系中产生了>80%的转染效率，在CB衍生的NK细胞中为75%，每种细胞类型的细胞存活率都>95%。Wilk等人提出了使用电荷改变可释放转运体（CARTs）将基因递送到NK细胞。CARTs是由≥1个脂质块和为mRNA递送设计的电荷改变块组成的多块寡聚体。CARTs最初是阳离子，可以与阴离子核酸复合，但在生理条件下（pH7.4）生物降解为中性二酮哌嗪小分子，促进阴离子货物的释放。在用CART递送31 ng mRNA编码GFP到PB NK细胞后，32%的细胞表达了GFP，细胞存活率为78%，这明显优于Lipofectamine 2000（0% GFP+细胞，90%存活率）和电穿孔（2% GFP+细胞，40%存活率）（注：当通过电穿孔递送的mRNA质量增加到10 μg时，转染效率提高到28% GFP+细胞，存活率为40%）。此外，CART成功产生了CD19-CAR-NK细胞，这些细胞对CD19+ Nalm6细胞具有强大的细胞毒性，死亡目标细胞比例为10%，而原始NK细胞为5%。这表明CARTs作为一种非病毒系统用于CAR-NK生成的潜力，但瞬时mRNA递送可能对体内CAR-NK细胞的扩增和效力构成问题。需要进一步的研究来扩大这种方法用于更大的体内研究，评估体内CART产生的CAR-NK细胞的寿命，并与病毒转导的CAR-NK细胞的效力进行比较。 6.2.多功能纳米颗粒用于NK细胞递送 Kim等人描述了一种由磁性Zn/Fe核、咖啡酸封顶以及表面涂覆阳离子多巴胺聚合物组成的多功能纳米颗粒（MFNPs），这些纳米颗粒与阴离子核酸形成复合物，用于向NK-92MI细胞递送CAR。磁性核使NK细胞的磁共振成像成为可能，并促进体内细胞追踪。通过MF-NPs向NK-92MI细胞递送编码表皮生长因子受体（EGFR）CAR结构的质粒，转染效率为60%，细胞存活率为98%。将EGFR-CAR-NK-92MI细胞通过尾静脉注射到无NK细胞的NOG小鼠（NOD/Shi-scid/IL2Rγnull）体内，这些小鼠携带MDA-MB-231异种移植物，与接受原始NK-92MI和PBS对照处理的小鼠相比，CAR-NK-92MI组的肿瘤生长明显减少（与原始NK-92MI和PBS对照相比，肿瘤大小分别减少了两倍和3.5倍）。进一步的工作将需要评估基于磁性NPs的生物相容性和降解特性，并确保MF-NP编辑的CAR-NK细胞在临床应用中有足够的扩增和持久性。 6.3.基于肽的NK细胞递送 基于肽的载体因生物相容性、灵活性和低毒性等优势而受到基因递送的关注。从病毒中衍生或设计模仿病毒载体序列的肽具有广泛的特定功能，使基因递送成为可能并得到增强，通常根据功能分类；DNA凝聚肽、细胞穿透肽（CPPs）、内体溶肽和核定位序列（NLS）。CPPs是短肽（5-30个氨基酸），它们有效地携带大分子货物穿过细胞膜，无需受体或其他载体。开发了一种肽辅助基因组编辑（PAGE）CRISPR-Cas系统，该系统利用CPP和内体逃逸肽在髓系细胞、原代T细胞和NK-92细胞中进行基因组编辑。设计了一种细胞穿透Cas9，由N端融合HIV TAT（GRKKRRQRRR）和4×Myc NLS，C端融合2×SV40 NLS和GFP。然后，这种细胞穿透Cas9与一个“辅助肽”共递送；融合肽（称为TAT-HA2（RRRQRRKKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG））由源自HIV-1的CPP TAT肽和流感A病毒血凝素（HA2）蛋白的内体逃逸肽组成。TAT-HA2辅助肽在mCherry+ EL4 T淋巴母细胞报告细胞中增强了Cas9编辑，效率从无法检测提高到85%，细胞存活率超过80%。此外，PAGE系统在NK-92细胞系中实现了78%的基因编辑，突出了CPPs在NK细胞基因编辑中的潜力。然而，这是一种复杂的工程策略，如果要递送CAR结构，将需要更多的开发。 7.NK细胞基因递送的特定挑战 目前非病毒转染NK细胞的困难因对这些高度专业化细胞中特定生物学障碍的理解不足而更加复杂，设计针对NK细胞治疗的非病毒递送系统时必须考虑NK细胞特有的元素。细胞摄取是基因递送的第一个生物学障碍，而具有专门激活和抑制受体的NK细胞比大多数细胞类型更为复杂。在细胞内摄取之后，内体逃逸是成功基因递送的第一个障碍。考虑NK细胞的特殊溶解机制很重要，以避免遗传货物在内体/溶酶体隔室中降解。此外，NK细胞通过模式识别受体（PRR）信号传导的先天免疫活性，促进了NK细胞的抗病毒活性，被认为是NK细胞对病毒载体的抵抗力，非病毒载体必须设计得避免同样的命运。克服这些NK特定的基因递送障碍对于非病毒基因递送系统在NK细胞治疗中取得成功至关重要。 7.1.NK细胞的细胞内递送 内吞作用被认为是大多数非病毒基因递送系统的主要摄取途径，可以分为网格蛋白介导、洞穴蛋白介导或微囊泡形成。摄取可能受到递送系统的性质和细胞类型等因素影响。在NK细胞的情况下，激活和抑制受体的平衡由受体的内吞作用和再循环到细胞表面来调节。例如，抑制性受体CD94/NKG2在细胞表面和细胞内隔室之间不断循环，这一过程类似于巨胞饮作用。流感病毒通过网格蛋白和洞穴蛋白依赖性内吞作用直接感染PBMC-NK细胞。感染是通过病毒HA蛋白与NK细胞表面存在的α-2,3和/或α-2,6连接的末端唾液酸的结合而发生的，特别是在激活性受体NKp46上。NKp46与病毒感染细胞表面的HA的相互作用是NK细胞识别和杀死感染靶细胞的已知机制，但看来病毒本身也可以通过与NKp46的相互作用感染NK细胞，这导致感染的NK细胞凋亡增加，NK细胞毒性活性降低。这些关于病毒感染方法的知识可能被利用来设计非病毒递送系统，就目标或避免特定摄取途径以增强基因递送而言，而不会引起不希望的激活导致NK细胞内表型变化。 阳离子递送系统，特别是富含精氨酸的肽，已知会通过静电作用结合细胞膜外表面存在的阴离子物种（例如脂质头基、肝素硫酸蛋白聚糖（HSPGs）和细胞膜上的syndecans），启动细胞摄取。Letoha等人报告称，syndecans促进阳离子CPPs（例如，TAT）的摄取。该研究表明，syndecan-4特别结合并介导阳离子CPPs通过质膜进入K562红细胞白血病细胞，更高的syndecan-4水平与更高的转染效率相关。根据细胞分化的不同阶段和细胞类型，syndecans上存在的肝素硫酸链的数量和大小各不相同。因此，不同细胞表达的syndecans可能导致不同的转染结果。HSPGs和syndecans由NK细胞表达，并已报告与激活性NCRs（NKp30、NKp44和NKp46）和KIR2DL4（抑制性受体）相互作用并调节其功能。这些受体可以识别并结合HSPG，这些HSPG通常在靶细胞（例如癌细胞）中上调，但它们也可能与NK细胞表面的HSPG结合；通过掩盖与靶细胞的相互作用或可能影响NCRs的内吞作用、降解和再循环途径，影响NK受体的功能。如果递送系统结合HSPG或syndecans进行内吞作用，可能会触发不希望的NCRs激活；影响NK细胞的激活状态或触发凋亡。因此，需要仔细设计以获得最佳的转染效率，而不扰乱NK受体状态。 受体介导的内吞作用通常被用来增强基因递送系统的转染，而主动靶向策略可能有助于克服与HSPG相关内吞作用的问题。同样，从病毒载体中获取灵感，当确定适合受体介导的内吞作用的靶标时。例如，BaEV慢病毒转导是通过与新鲜分离的人类NK细胞中的ASCT1和ASCT2结合来介导的，这可能被非病毒递送系统所针对。 7.2.NK细胞的内体逃逸 非病毒递送系统被设计为通过“质子海绵”效应或对内体中低pH值的融合活性来促进内体逃逸。然而，内体隔室的确切pH值可能因细胞类型而异，细胞系和原代细胞之间存在差异，内体中的具体功能或货物内容也会影响。在设计基因递送系统方面，关于NK细胞内体pH的文献资料很少。我们可以比较其他免疫效应细胞，如T细胞和巨噬细胞，以了解免疫细胞内体的特性，但这不能代替对NK细胞的专门评估。内体酸化在人类Jurkat T细胞中被报道比常用的评估阳离子聚合物基因递送的HeLa人类细胞系慢且不如其稳健（在摄取后240分钟内从pH 6缓慢下降至pH 5.2），而HeLa细胞系在摄取后120分钟内pH值下降至5.0，原代T细胞显示出更高的内体pH（>pH 6）。也有报道称巨噬细胞的早期内体和循环内体具有中性pH，这促进了瞬时受体电位muclipin 2（TRPML2）的活性；TRPML2是位于溶酶体隔室的钙通透阳离子通道，参与质膜蛋白的循环。TRPML2也在CD57+ NKG2C+ NK细胞中表达，被推测涉及调节激活NK细胞中的趋化因子分泌。因此，可以推断NK细胞中的内体也可能在早期内体隔室中具有更高的pH（pH>6），但需要研究来确认这一点。考虑到NK细胞的细胞毒性主要通过含有穿孔素和颗粒酶的专门分泌溶酶体或溶解颗粒来执行，因此这种溶酶体机制的存在可能会影响转染后的内体运输和逃逸。如果NK细胞的内体pH接近中性，如T细胞和巨噬细胞一样，那么这可能对需要更低pH值来触发内体逃逸的递送系统构成问题，需要进一步调查以优化针对NK细胞的递送系统设计。 7.3.避免NK细胞中的模式识别受体（PRR）激活 在感染期间，NK细胞通过PRR检测病毒或细菌病原体相关分子模式（PAMPs）的存在，PRR是NK细胞介导的先天免疫反应的重要组成部分。NK细胞表达多种PRR，包括Toll样受体（TLR）1-10、RIG1、NOD2和MDA5，这些在激活时参与诱导细胞毒性。TLR3、7、8在内体中表达并检测双链RNA（TLR3）、单链RNA（TLR7和8）和CpG DNA（TLR9）。这种核酸感应有助于病毒检测和抗病毒免疫反应。这样的PRR被认为是NK对基于病毒的转导产生抵抗力的原因之一。实际上，抑制PRR活性可以增加NK细胞中VSV-G假型慢病毒载体的转导效率。作者用BX795，一种TBK1/IKKe复合体的抑制剂，该复合体作用于PRRs RIG-I、MDA5和TLR3的下游，预处理新鲜分离的PB NK细胞，结果使慢病毒转导效率增加了3.8倍。在NK-92细胞系中也观察到在BX795存在下转导显著增强。 因此，PRR的核酸感应是NK细胞基因递送的一个障碍。mRNA或DNA货物的递送可能会激活PRRs，触发抗病毒NK过程，导致转染NK细胞的存活率差。可能可以利用修饰的mRNA来避免NK细胞中的PRR识别。核苷替换已被证明在减少PRR检测和改善mRNA翻译方面具有显著意义。常见的修饰包括用类似核苷如假尿嘧啶（ψ）或N-1-甲基-假尿嘧啶（m1ψ）替换尿嘧啶，以及用5-甲基胞嘧啶替换胞嘧啶。在“基于脂质的NK细胞递送”一节中讨论的研究包括两个使用修饰mRNA递送到NK细胞的例子。Doukas等人用LNPs递送了5-甲氧基尿嘧啶（5moU）修饰的mRNA，而McKinlay等人递送了5-甲基胞嘧啶修饰的mRNA。两项研究都没有评论他们选择使用修饰mRNA的决定或选择特定修饰的原因。在mRNA疫苗领域，尤其是假尿嘧啶修饰的mRNA产生了更好的翻译，归因于减少了与RNA依赖蛋白激酶的结合。然而，需要进一步的研究来确定CAR递送到NK细胞的最佳核苷修饰。 如果要递送基于DNA的货物，例如在转座子系统中，那么应该考虑限制CpG含量。在CAR结构递送的背景下，这一点尤其重要，考虑到要递送的CAR构建物的较大尺寸。DNA迷你圈技术已被用于SB转座子系统，以帮助减小货物大小并提高转染效率。TcBuster系统使用了专门针对T和NK细胞CAR结构递送设计的“纳米质粒”技术。 8.结论和未来方向 总之，这篇综述详细分析了当前CAR-NK疗法和非病毒工程化NK细胞的状态，强调了CAR-NK作为一种有前景的癌症免疫治疗方法的潜力，以及实现这一潜力需要克服的挑战。CAR-NK疗法的使用仍处于早期阶段，但在多种癌症类型的前临床和早期临床试验中已显示出强大的抗肿瘤活性。增强的安全档案和更可扩展、成本效益更高的“现成”CAR-NK疗法的潜力将增加患者的可及性；改善患者的治疗结果和生活质量。需要开发针对NK细胞的高效非病毒工程策略，以改善CAR-NK疗法的制造过程，以支持对先进疗法日益增长的需求。到目前为止，理想的非病毒递送系统尚未开发出来，该系统能够高效地将CAR转基因递送到NK细胞中，而不会影响细胞的活性或受体状态；考虑到受体状态对NK细胞功能的重要性。有必要进一步研究新的递送系统和临床试验，以充分释放CAR-NK细胞的治疗潜力，并将这些发现转化为常规临床实践。 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摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。