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会议推荐 2026第三届中国医药企业项目管理大会 2026第二届中国AI项目管理大会 2026第十五届中国PMO大会 2026第五届中国项目经理大会 本 文 目 录 1、小分子药物靶点的发现策略 2、小分子药物的靶标识别方法总结 3、如何识别小分子药物的靶点(光亲和标记技术) 4、独家原创|谢恬教授、叶向阳研究员:以 G-四链体为靶标的小分子抗病毒药物的研究进展 一、小分子药物靶点的发现策略 （原创 爱谱蒂康 爱谱蒂康组学药学研究与创新诊断） 背景介绍 靶蛋白鉴定在药物研发领域中扮演着至关重要的角色，它对于理解小分子药物的作用机制、评估潜在副作用以及判断药物间的相似性具有决定性意义。传统的“探针标记”方法虽然在一定程度上有效，但其存在的周期长和可能影响药物构象的局限性促使科研人员探索更为高效、准确的方法。近年来，无标记靶点识别方法因其不涉及对小分子药物的化学修饰而备受瞩目。这类方法不仅简化了实验流程，还降低了因化学修饰可能带来的误差，从而提高了靶点鉴定的准确性和可靠性。其中，基于高分辨率质谱（MS）的方法更是为靶蛋白鉴定带来了新的突破。高分辨率质谱技术能够提供更丰富、更精确的信息，帮助科研人员深入解析药物与靶蛋白的相互作用，以及药物在复杂系统中的行为。限制性酶解-质谱分析（LiP-MS）和热稳定蛋白质组（TPP）是两种代表性的无标记靶点识别方法。LiP-MS通过酶解蛋白质并利用质谱技术检测药物结合前后蛋白质结构的变化，从而识别出药物的结合靶点。这种方法具有高通量、灵敏度高的特点，适用于大规模药物筛选和靶点鉴定。而TPP则利用蛋白质的热稳定性差异来识别药物的结合靶点。在药物作用后，某些蛋白质的热稳定性会发生变化，这种变化可以通过质谱技术进行量化分析。TPP方法同样具有高通量、准确性高的优点，并且在药物研发领域得到了广泛应用。这两种方法都无需对小分子药物进行化学修饰，从而避免了可能因化学修饰带来的干扰和误差。同时，它们的高通量特性也使得在药物研发过程中能够更快速、更准确地识别出药物的结合靶点，为药物的后续研发和临床应用提供了有力支持。综上所述，无标记靶点识别方法特别是基于高分辨率质谱的LiP-MS和TPP方法，在靶蛋白鉴定领域展现出了巨大的潜力和优势。随着技术的不断进步和应用领域的拓展，这些方法将在药物研发中发挥越来越重要的作用。 01 限制性酶解-质谱分析（Limited proteolysis mass spectrometry，LiP-MS）：以“蛋白质结构”之钥，开“药物”“靶点”互作之锁 LiP-MS是一种用于研究蛋白质与小分子相互作用的新型质谱技术。LiP-MS技术的核心在于利用蛋白质与小分子结合后构象稳定性的变化，这种变化会影响蛋白质对酶解的敏感性。在生理条件下，蛋白质具有多种空间构象，当小分子（如药物）与蛋白质结合时，可能会增加其结构的稳定性，使其抵抗酶解。通过使用广谱蛋白酶（如蛋白酶K）对蛋白质样品进行有限酶解，再利用胰酶进行二次酶解，并通过质谱检测不同处理条件下的肽段信号强度变化，从而分析蛋白质的构象变化。 02 热稳定蛋白质组（Thermal proteome profiling，TPP）：以“蛋白质稳定性”之钥，开“药物”“靶点”互作之锁    TPP是基于细胞热漂移测定(cellular thermal shift assay, CETSA) 的原理，使用多重定量质谱的蛋白质组学来监测数千种表达蛋白质的熔解曲线Tm。TPP的原理同CETSA原理，是基于蛋白质在加热过程中会发生热变性解折叠，而小分子（药物等）与靶蛋白结合后改变靶蛋白的热稳定性（通常情况下增强）。有小分子（药物等）结合的蛋白与无小分子（药物等）结合的蛋白质相比一般更稳定，Tm也更高，通过对比有无小分子（药物等）结合蛋白质的Tm和熔解曲线是否存在差异即可确定靶蛋白。         分析流程        01 LiP-MS分析流程 02 TPP分析流程  03 LiP-MS及TPP对比 二、小分子药物的靶标识别方法总结 （原创 TSS转化医学谱 TSS转化医学谱） 靶标识别是药物研究和研发过程的重要组成部分，特别是对天然活性分子的靶点机制研究和药物研发中的二级药理学研究。靶标发现分为两种主要方法：基于亲和力的pulldown方法和无标记方法。基于亲和力标记方法使用需要与标签偶联的小分子来选择性地分离鉴定靶蛋白，而无标记方法则利用自然状态下的小分子来识别靶标。本文概述了当前基于亲和力标记方法和无标记方法的靶点发现，及其优点和局限性。 1. 背景介绍 靶标识别是新药发现和开发的关键阶段，因为它使研究人员了解神秘药物的作用机制。过去两个世纪药物发现和开发取得的大部分进展都可以归功于靶标识别技术的进步。通过发现药物的精确靶点分子，研究人员可以更好地针对特定疾病或靶点优化药物。靶标识别对于优化药物选择性和减少其潜在副作用也很重要。 基于亲和力的pulldown方法需要用标签（例如生物素或荧光标签）标记小分子，然后用它从细胞裂解物或其他蛋白质混合物中亲和纯化其结合蛋白。在许多情况下，标记小分子可能很困难，限制了使用基于亲和力的pulldown方法的可能性。为了避免这种限制，已经开发了无标记方法来识别小分子的潜在靶标，而不需要用亲和标签对分子进行化学修饰。此外还有，在细胞水平上寻找新药物靶点的生物学方法，例如诱变和基因筛选等。 2. 基于亲和力的pulldown方法 亲和纯化是鉴定小分子靶标的常用方法。在此方法中，将测试的小分子与亲和标签（例如生物素）缀合或固定在树脂（例如琼脂糖珠）上。这种化学修饰的结构用作与细胞/细胞裂解物一起孵育的探针分子。孵育后，使用亲和标签纯化出结合的蛋白质，然后可以使用SDS-PAGE 和质谱法等分离和鉴定纯化的蛋白质。这种方法在药物发现和其他研究领域非常有用。此外，它还能够确定小分子与靶标蛋白的互作构效关系。 2.1 亲和基质方法 亲和基质方法是一种使用亲和基质来分离生物活性小分子的靶蛋白的方法。使用聚乙二醇（PEG）等连接子将小分子在特定位点共价连接至固相基质支持物（例如琼脂糖珠），而不改变小分子的原始活性（图1）。然后将小分子亲和基质暴露于含有靶蛋白的细胞裂解物。洗脱并收集与基质结合的任何蛋白质，然后使用质谱法鉴定靶标。该方法已被KL001、Aminopurvalanol、Diminutol、BRD0476和Encephalagen　等分子成功采用。 图1. A. 偶联beads上亲和基质探针、 B. 生物素标记探针、 C. 光亲和探针、D. 光反应基团及其反应中间体的示例。 2.2 生物素标记方法 生物素是一种小分子，由于其与亲和素/链霉亲和素具有很强的结合亲和力，因此常用于基于亲和力的技术。在此方法中，生物素分子通过化学键连接到感兴趣的小分子上，并将生物素标记的小分子与细胞裂解物或含有靶蛋白的活细胞一起孵育。然后，在链霉亲和素包被的固体支持物上捕获目标蛋白后，使用 SDS-PAGE 和质谱分析法来分析目标蛋白（图1 B）。采用生物素标记的方法成功鉴定了激活蛋白1（AP-1）作为PNRI-299的靶蛋白。 优点：低成本且简单的目标蛋白纯化和分离。缺点：需要采用苛刻的条件才能打破它们的相互作用并从树脂中释放结合的蛋白质。释放结合蛋白的一种常见方法是将基质暴露于变性缓冲液中，例如含有 SDS 的溶液和 95-100 °C 范围内的高温。此外，将生物素附着到小分子上也会影响细胞的渗透性和表型结果。 2.3  光亲和标记方法 在光亲和标记 (PAL，photoaffinity labelling) 方法中，化学探针在光照下与其靶标共价结合。在该方法中，探针设计涉及选择光反应基团（例如，将光反应基团连接到小分子的接头）和亲和标签（图1 C）。在这种情况下，光反应基团通过暴露在光下被激活，使探针与目标分子形成永久的共价键。这有助于研究目标分子的结构和功能，因为探针可用于标记目标内的特定位点或区域。PAL 中可使用多种类型的光反应基团，包括苯基叠氮化物、苯基二氮丙啶和二苯甲酮（图1 D）。当被光激活时，这些基团中的每一个都会产生不同类型的反应中间体，其具有不同的性质、并且可以以不同的方式使用。其他光反应基团包括重氮羰基、烯酮、重氮基团、硫自由基、卤化底物、重氮盐、硝基苯、以及二氮丙啶和叠氮化物的烷基衍生物等。 PAL 实验中光反应基团的选择取决于研究的具体目标蛋白或分子的特征。最近，芳基二氮丙啶已成为 PAL 中最常用的光反应基团。它们因其良好的化学稳定性和对各种变量的耐受性而受到青睐，例如温度、亲核试剂、酸性和碱性环境以及氧化剂和还原剂。芳基二氮丙啶的三氟甲基衍生物特别受欢迎，因为它的稳定性更高，并且在暴露于特定波长的光下时容易产生高反应性卡宾。然后卡宾中间体可以共价连接到目标蛋白质或分子。 PAL优点：高度特异性，允许以消除误报并提高结果精度的方式标记感兴趣的小分子。此外，它还具有很高的灵敏度，甚至能够检测低水平的蛋白质-配体相互作用。它还可用于识别与多种细胞和组织类型中的小分子结合的蛋白质。此外，它还能够识别蛋白质-配体相互作用，这对于了解小分子的作用机制和识别药物开发的潜在靶点非常有用。该方法已成功用于鉴定各种小分子的靶蛋白，并且已纳入各种功能手柄和光亲和接头以优化该方法的效率。 光亲和方法的一般实验工作流程如 图2 所示。 图2. 光亲和法的标准实验方案。1. 合成光亲和探针。2. 在细胞或细胞裂解物上使用光亲和探针并让它们与其靶标结合。3. 随后使用紫外线 (UV) 来激活探针与处理样品（细胞或细胞裂解物）中目标蛋白的共价交联（如果实验是在活细胞上进行的，则细胞在紫外线照射后会裂解蛋白质）。4. 使用链霉亲和素，提取复合物（靶标+探针）。5. 通过洗涤除去未结合的蛋白质。6. 可以使用 SDS-PAGE 分析目标蛋白，并通过蛋白消化和质谱进行鉴定。 2.4 基于亲和力方法的局限性和挑战  由于分子的性质和用于开发探针的接头所发挥的不可或缺的作用，这两个因素都对基于亲和力pulldown方法提出了挑战。例如，在采用这种技术时，重要的是要注意修饰探针的设计和合成。此步骤可能需要在不同附着点对不同探针进行频繁测试和评估，以构建构效关系 (SAR) 模型，从而产生既有效又特异的探针。SAR 研究至关重要，涉及对探针结构的系统修饰，以优化其对目标蛋白的结合亲和力和特异性，以及光反应性和其他特性。用于标记小分子的光反应基团也可能干扰其与靶蛋白的结合，这可能导致假阴性结果。另一个限制是需要用亲和标签修饰小分子，这对于某些化合物来说可能是不可能的，并且亲和标签有可能改变小分子的生物活性并导致意想不到的结果。最后，使用紫外线触发小分子与目标蛋白的共价连接可能对细胞有害，这可能导致错误的结果。尽管存在这些缺点，光亲和pulldown方法仍然是研究蛋白质-配体相互作用的重要工具，可用于深入了解小分子的作用机制并识别潜在的药物靶点。 另一方面，光亲和探针中的光亲和标记与生物素标记分子中的化学接头之间的接头或间隔基团对其性能具有显著影响。此外，如果接头太短，探针有可能与其自身交联，从而导致探针不稳定和缺乏特异性的问题。另一方面，如果接头太长，光反应基团可能离目标蛋白太远，无法有效地抓住它。一般来说，理想的接头长度由探针和目标蛋白的特性决定。因此，为了实现目标蛋白的可靠和精确标记，仔细选择接头并调整每个特定应用的条件可能很重要。 报告标签是旨在检测探针的存在并确定其与目标的结合位置。可用的识别标签有多种形式，包括荧光染料、放射性同位素以及生物素和亲和素等特定结合配偶体。研究人员可以使用不同的方法（例如荧光显微镜和免疫沉淀）来寻找和分离探针-蛋白质加合物。总而言之，由于与开发 SAR、连接子和标签以创建有效分子相关的挑战，基于亲和力的pulldown方法存在一些缺点，包括需要经验丰富的化学家来合成光亲和探针，这可能是耗费时间和资源。 3. 无标记目标识别 无标记方法利用自然状态的小分子，无需对其结构进行任何化学修饰，从而保留小分子的天然确认和功能特性。这种方法通常受到研究人员的青睐，因为它不需要对初级分子进行修饰或标记。这种方法避免了与化合物标记相关的任何潜在问题，它几乎没有任何限制，因为这种无标记分子可以与非预期的蛋白质结合并导致假阳性目标的识别。然而，该方法不适用于以低水平表达的蛋白质（图 3）。 3.1药物亲和力响应靶点稳定性  药物亲和力响应靶稳定性技术（DARTS，Drug affinity responsive target stability）是一种基于小分子可以结合并稳定其靶蛋白，从而增加其对蛋白水解（即通过蛋白酶分解）的抗性而开发的技术。DARTS 通过检测结合诱导的蛋白水解抗性增加来识别靶蛋白。为此，将小分子与细胞裂解物一起孵育，然后用蛋白酶处理。如果小分子可以与其靶蛋白结合，则蛋白酶将无法分解它，因为它会增加其稳定性，从而导致处理后剩余的蛋白质量增加。蛋白质稳定性的增加可以使用蛋白质印迹或质谱等技术来检测。 图3. 无标记目标识别方法的示意图。 A．药物亲和力响应靶标稳定性 (DARTS)。 3.2 根据氧化速率测定蛋白质的稳定性  变性蛋白质比其天然对应物更容易被氧化，基于氧化速率的蛋白质稳定性技术 (SPROX，Stability of Proteins from Rates of Oxidation) 方法利用了这一特性，通过测量存在和不存在小分子的情况下蛋白质表面上蛋氨酸残基的蛋白质氧化水平的速率，并检测可能由以下因素引起的任何变化：小分子结合并稳定其靶蛋白。在此方法中，小分子与细胞裂解液一起孵育，然后进行化学变性处理，然后氧化剂（H2O2）处理，随后使用质谱法对蛋白质氧化速率进行量化。SPROX技术用于评估他莫昔芬的靶点，发现MCF-7细胞中的YBX1，观察到该靶点因小分子的存在而稳定。 缺点：SPROX仅适用于含有氨基酸蛋氨酸的蛋白质。这是因为 SPROX 通过测量蛋白质中蛋氨酸残基的氧化水平来确定目标蛋白质。因此，SPROX 可能不适合鉴定缺乏蛋氨酸残基的靶蛋白。 此外，SPROX 和 DARTS方法都适用于细胞裂解物，而不适用于活体生物系统，能用于研究从细胞中分离的蛋白质，而不能用于研究细胞内的蛋白质。 图3. 无标记目标识别方法的示意图。B．氧化速率的蛋白质稳定性 (SPROX) 。 3.3细胞热位移测定 (CETSA) 细胞热位移测定（CETSA，Cellular thermal shift assay）是根据配体诱导的蛋白质靶标热力学稳定的概念而开发的，靶标结合配体后稳定性的增加可以通过测定蛋白质的热稳定性来评估。与SPROX和DARTS技术不同，它可以用于活细胞和细胞裂解液。为了进行 CETSA，首先用小分子或载体处理细胞/细胞裂解物，然后加热。然后使用蛋白质印迹法确定蛋白质是否以温度依赖性方式变性，以及与样品中小分子结合的某些蛋白质的熔解曲线是否发生了变化。通过比较含有和不含小分子的蛋白质的热稳定性，可以识别小分子是否与蛋白质相互作用并估计关联的亲和力。使用CETSA，证实2′-hydroxy cinnamaldehyde直接与STAT3结合，抑制STAT3活性。 缺点：这种方法需要蛋白质印迹，由于抗体的可及性，这限制了它的使用。 此外，目前已经开发出了许多用于识别蛋白质靶标的高通量热位移方法，例如 MS-CETSA、HCIF-CETSA 和 ITDR -MS-CETSA。 图3.  无标记目标识别方法的示意图。C. 细胞热位移测定 (CETSA)。 3.4诱变 诱变是一种很有前途的识别药物靶点的遗传工具，它涉及通过改变DNA或氨基酸的特定序列来操纵基因或蛋白质的表达或功能，并观察这种突变对药物反应的影响。mRNA敲除、定点突变和随机基因组诱变是药物靶标识别中使用的多种遗传筛选方法。其中，CRISPR-Cas9突变作为一种生成基因文库的方法越来越受欢迎，这些基因可用于识别细胞靶蛋白和小分子的分子相互作用位点候选药物。 最近，CRISPR 平铺介导的诱变（CRISPR-tiling–mediated mutagenesis）是一种理想的靶标发现方法，可将烟酰胺磷酸核糖基转移酶 (NAMPT) 识别为临床研究中的抗癌药物 KPT-9274 的主要分子靶点 [ Nat Commun, 2018,10.1038/s41467-017-02349-8]。该方法涉及系统设计大型sgRNA基因文库，以靶向和突变已知抗癌药物的特定基因，并开发可转导生成诱变细胞的慢病毒文库构建体。 诱变的优点是揭示药物与其靶标和其他细胞成分的直接和间接相互作用。此外，它可以通过改变先导化合物的结构或活性来促进其优化。此外，可以筛选由诱变产生的大量遗传变异，不仅可以检测药物敏感性，还可以了解耐药性。诱变可以帮助揭示药物作用模式中涉及的主要和次要靶点和途径。缺点: 包括耗时、劳动密集型和效率低，特别是对于复杂的基因组和由此产生的表型，这可能会引入不需要的或脱靶效应，从而混淆对结果的解释。诱变可能不准确或不完整，导致假阳性或阴性。多个目标、冗余目标或可能掩盖单个突变影响的补偿机制的存在可能会使诱变变得复杂。 3.5 基因筛选 基因筛选是细胞药物靶标识别的另一种独特、无偏倚的方法。在该方法中，设计了感兴趣的选择性靶标的敲除文库（RNAi 或 CRISPR-Cas9）并筛选可能的药物靶标的功能丧失。在最近的一项研究中，利用具有诱导自杀基因表达系统的基于 CRISPR 的靶标识别平台，对带有通过 gRNA 序列测序和功能丧失进行鉴定的被敲除靶标的细胞进行正向富集。利用该平台，作者确认 STING 和 CES1 分别是细胞中小分子 IFN-I 激活剂 BDW568 的主要靶标和关键代谢酶。与传统的基于CRISPR的靶标筛选依赖于药物的抗增殖作用相比，这种智能方法可以适用于任何具有非增殖活性的药物。 4.结论  蛋白质靶点识别研究是药物发现过程的重要组成部分，需要投入大量的时间和资源。通过仔细考虑基于亲和力pulldown方法、无标记方法、诱变和基因筛选方法的主要优点和局限性，研究人员能够在选择药物发现的靶点识别策略时做出明智的决定，以选择最合适的方法取决于研究项目的具体要求。 三、如何识别小分子药物的靶点(光亲和标记技术) （原创 都灵else 明日药物） 识别小分子药物的靶点 ——基于生物素的光亲和标记技术 编译/都灵 1. 背景知识 1.1 生物素与亲和素 生物素（biotin）又称维生素H、维生素B7，是一个含环脲基团的亲水小分子，少量存在于所有的活细胞中。亲和素（Avidin）是一个大小约67 kD的四聚体蛋白质，每一个单体可以结合一个生物素分子。生物素与亲和素的结合是已知的自然界最强的非共价键相互作用，其解离常数KD约为1×10-15 M。并且，这种结合一旦形成，其对有机溶剂、变性剂（如盐酸胍）、洗涤剂（如SDS、Triton X-100）、蛋白水解酶，以及在较高的温度和pH范围内都很稳定（解离通常使用pH = 1.5的8 M盐酸胍，或在SDS-PAGE缓冲液中煮沸进行）。因此，这种结合被用于亲和分离领域。 亲和素和生物素之间的强亲和力来源于：1）结合口袋与生物素的形状高度互补；2）在结合部分形成广泛的氢键网络，八个残基（包括Asn23、Ser27、Ser45、Tyr43、Asn49和Asp128等）直接与生物素形成第一层氢键，多个残基又与第一层的残基形成第二层氢键；3）结合口袋是疏水的，特别是其中存在多个色氨酸残基，与生物素有许多范德华力接触和疏水相互作用；4）最后，连接第3和第4 β链（L3/4）的柔性环在结合后也会稳定下来，该环就像一个结合口袋上的“盖子”，在结合后关闭，使得生物素解离非常缓慢。（PDB号1STP） 亲和素是糖基化的、带正电荷（等电点pL约为10）的，以及具有假催化活性（例如，亲和素会促进生物素-硝基苯酯的碱性水解过程），并且会产生较多的非特异性结合。因此，研究人员开发了去糖基化的亲和素用于分离领域，被称为中性亲和素（NeutrAvidin），能获得更好的专一性和适用性。亲和素最初从鸡蛋清中分离，与它相似的蛋白质还有来源于亲和链霉菌（Streptomyces avidinii）的链霉亲和素（Streptavidin），它们的区别如下表所示： 1.2 生物素化试剂 通常在生物素分子的戊酸侧链进行衍生化，加入各种活性基团，用于将生物素连接到其他分子上。这些生物素化试剂（biotinylation reagents）可针对各种官能团，例如伯胺、巯基、羧基和羧基。常见类型包括：1）用于修饰伯氨（赖氨酸）的生物素-NHS /Sulfo-NHS酯；2）用于与巯基（半胱氨酸）形成硫醚键的生物素-马来西酰亚胺、碘乙酰试剂；3）用于与巯基（半胱氨酸）形成二硫键的生物素-二硫代吡啶试剂；4）通过酸胺缩合反应，用于修饰羧基（谷氨酸、天冬氨酸）的生物素-伯胺试剂；5）能够与醛基反应的生物素-酰肼试剂，以及6）用于点击化学/光催化反应的生物素-叠氮试剂。 1.3. 基于亲和力的小分子靶点识别技术 靶点识别是新药开发的关键步骤，因为它能够让研究人员了解药物的作用模式，可以更好地优化药物，使药物达到更好的治疗效果。常见的生物大分子靶点包括酶、细胞受体、离子通道、转录因子和DNA等，由于它们种类繁多，确定一个药物的精确靶点十分困难。基于亲和力的靶点识别技术要求使用带标签的小分子探针（ABP, activity based probe），用它与细胞裂解液或蛋白质混合物孵育。然后，利用亲和标签纯化出伴侣蛋白，纯化后的蛋白可通过SDS-PAGE和MS进行分析鉴定。 ABP中常用的标签是生物素或荧光染料。生物素标记具有很多优点，例如成本低、纯化过程简单。但是，生物素-亲和素复合物需要在苛刻的条件下（例如在SDS-PAGE缓冲溶液中煮沸）才能打破它们之间的相互作用，使结合蛋白从树脂中释放出来。这种变性条件可能会改变所分离蛋白质的结构或活性。并且，生物素附着在小分子上还会影响细胞的通透性和表型结果，这在处理活细胞时可能是一个缺点。例如，用生物素化化合物处理细胞会减少 IL-2 的产生，限制免疫细胞的活化和增殖，从而可能影响它们对免疫刺激的响应。此外，生物素标签还可能改变活性分子在体内的性质及其与靶蛋白的作用模式，限制了探针分子在体内细胞的吸收与分布。因此，实验一般都是在体外进行的，而体外的功能蛋白质组学研究只能大致地揭示活细胞或动物体内组织中蛋白质的功能状态。 近年来，发展出了不带标签的探针分子，生物素或荧光染料标签是在探针分子共价标记了靶蛋白后，通过Huisgen 1,3偶极环加成反应（叠氮与炔基形成三氮唑）连接到探针分子上。无论是否带标签，运用基于亲和力的小分子靶点识别技术的前提是：活性小分子能够与靶蛋白不可逆共价结合。但是，在大多数情况下，活性小分子与靶点蛋白之间的作用是可逆的、不牢固的。此时，探针分子的设计就需要引入光反应性基团，其作用是在探针分子与靶蛋白（可逆）结合后，通过光解作用在探针分子与靶蛋白之间引入共价键；这一技术被称作光亲和标记（PAL，photoaffinity labeling）。 1.4 肽图法鉴定蛋白质 利用蛋白水解酶作用于特定的氨基酸残基将肽键断开，从而将蛋白质或大的多肽裂解成小的多肽片段（一般包含10个左右的氨基酸），然后用高效液相对肽段进行分析，得到的色谱图即为肽图；通过比较样品与标准品的肽图，能够得出蛋白质的纯度和表达准确性等信息。通过与质谱联用，可以获得每个片段或其碎片更精确的分子量信息，进而鉴定未知蛋白质的初级结构。 为获得理想的肽图谱，在进行特异性裂解之前，需要对待测蛋白质样品进行预处理。对于复杂的大分子蛋白，其高级结构形成的空间位阻可能阻碍裂解剂到达裂解位点发挥作用，需要进行必要的变性剂处理、二硫键还原以及随后的游离巯基烷基化保护等步骤。变性可在37 ℃下，6 M盐酸胍或8 M尿素溶液中进行；二硫键还原通常在变性过程中加入DTT等还原剂实现。如果还原后的半胱氨酸巯基保持游离状态，则可能以错误的方式重新形成二硫键，因此通常加入碘乙酸等试剂，使游离巯基烷基化。经过上述处理后，应当进行脱盐和缓冲溶液交换步骤，然后进入蛋白酶裂解过程。 根据待测蛋白质的结构特性选择特定裂解方法。几种通用的化学或酶裂解试剂见下表。 类型 试剂名称 特异性 蛋白酶 胰蛋白酶（Trypsin） Arg或Lys的C端 糜蛋白酶（Chymotrypsin） 疏水性残基（如Leu、Phe）的C端 赖氨酰内肽酶（Lys-C） Lys的C端 谷氨酰内肽酶（Glu-C） Glu或Asp的C端 天门冬氨酸-N内肽酶（Asp-N） Asp的N端 化学试剂 溴化氰 Met的C端 2-硝基-5-硫氰苯甲酸（NTCB） Cys的N端 邻碘苯甲酸（IBA） Try或Trp的C端 粪臭素（BNPS） Trp 影响蛋白质裂解效率和重现性的因素包括反应体系pH、缓冲液类型、反应温度、反应时间以及裂解剂用量等。应当根据经验或者预实验确定最佳的反应条件。有许多商品化的蛋白质裂解试剂盒，可以得到较好的结果。 对于多肽分离，首选的色谱柱孔径范围为100 Å至120 Å，而固定相通常选择C18填料。肽谱分析中最常用的溶剂为水（磷酸盐缓冲溶液）和乙腈（用作有机改性剂），某些情况下，会加入丙醇或异丙醇用以溶解酶解成分。还需要加入必要的离子对试剂（不超过0.1%），一般为TFA，这种成分可与多肽的带电基团形成离子对，增加多肽的疏水性，从而增加保留、改善分离。UV检测波长则通常为210~220 nm和/或280 nm。 多肽的质谱分析可用于结构鉴定。一般情况下，质谱分析类型包括电喷雾（ESI）和MALDI-TOF-MS，以及快速原子轰击（FAB）。使用ESI或MALDI时，蛋白质水解多肽可完整电离为气相，并可测量它们的精确质量。因为易于与液相色谱连接，大多数多肽质谱分析在ESI-MS仪器上进行。在质谱中被识别的肽段，可选中用于二级质谱检测。被选中的肽段在高能惰性气体撞击下断裂成若干个碎片，这些碎片的离子峰谱图与分子离子峰谱图构成MS/MS谱图，能够为蛋白质鉴定提供更为丰富的信息。 单个肽段的断裂是随机的，一次断裂产生一对离子峰；常见的断裂方式为β断裂，即在肽键的C-N键处断裂，产生一系列b离子和对应的y离子。MS/MS谱图创建完成后，需要对二级谱图中的离子峰进行仔细辨别，这一过程过去是手动完成的，需要剔除干扰峰，需要计算各个峰之间的差值，耗时费力。如今已经有非常多的质谱图处理软件，并且能够检索离子峰数据库，可以大大简化这一过程。Comet是一款常用的基于SEQUEST算法的开源软件；SEQUEST HT在蛋白组学（Proteome）研究和TMT（Tandem Mass Tag）分析中更有用；整合在MassQC中的Andromeda程序可用于SILAC（细胞培养氨基酸稳定同位素标记）样品。Byonic程序则适合不严格的氨基酸翻译后修饰（PTM）研究。每种软件都有各自的特点和缺点，但它们在鉴定多肽方面遵循相似的逻辑。 2. 光亲和标记技术 2.1 光亲和标记探针的设计 光亲和标记探针分子应具有适当的生物活性，与靶点的作用机制应与其母体化合物（parent compound）保持一致。光亲和标记探针分子的活性越高，就越容易对其受体进行特异性标记。但是当探针分子活性过高时，它与受体的结合是静态的，所得到的受体活性部位的结构信息通常是局部的、不完整的。探针分子活性适中时，它与受体的结合是动态的，所得到的受体活性部位的结构信息通常是比较丰富的、完整的。 通常，光亲和标记探针包含四个组成部分：活性部位（activity site）、光反应性基团（photoreactive group）、报告基团（reporter tag）以及连接子（linker）。活性部位即活性小分子，负责与靶点蛋白可逆结合；光反应性基团负责与靶点蛋白形成共价结合；报告基团用于探针-靶点蛋白复合物的检测与分离；各部分通过连接子连接到一起。连接子应具有合适的长度，太短可能发生探针自身的交联，太长则可能导致光反应性基团与靶点蛋白距离不够而损失标记效率。光反应基团可以位于在连接子上（下图A），也可以插入到活性部位（下图B）；具体方案取决于构效关系（SAR）研究。如果活性小分子的结构来源于SAR研究，那么连接子可以附着在那些对活性影响较小的位点，在此基础上，往往需要合成10~50个不同取代位置和连接子长度的类似物用于筛选。需要注意的是，具有较长连接子的完整光亲和标记探针很少能够穿透细胞，因此基于细胞的活性评估往往是不充分的。 针对靶点已知的小分子化合物，在设计寻找其它靶点的探针时，可以将已知靶点蛋白作为结合专一性的替代对照（surrogate control）。针对有明显体外细胞活性甚至体内活性，但是作用靶点不明的小分子化合物，设计探针分子时，必须在标记实验中加入相对于探针分子的大大过量的母体化合物（一般相当于探针分子的100~1000倍），考察其是否与母体化合物竞争同一活性位点，以确证其与母体化合物具有相同的作用机制。 细胞穿透型探针在捕获活细胞靶点时非常有用。但是，由于包含光反应性基团和报告基团，以及连接子往往含有较长的PEG链，较大的光亲和标记探针分子很难穿透细胞。为克服这一局限，可以设计较小的（截短的，truncated）光亲和标记探针，在其进入细胞后，通过点击化学方法，再引入报告基团（如上图C）。如前所述，通常使用铜（I）催化的Huisgen 1,3偶极环加成反应，叠氮基手柄与炔基手柄的所属单元可以互换。 2.2 光亲和基团/光反应性基团 理想的光亲合基团具有以下特点：1）具有一定的化学稳定性，能耐受普通的化学反应；2）在自然光中合理的稳定性；3）在黑暗中稳定，在不对生物样品造成损伤（>300 nm）的紫外光照下很容易光解；4）光解后的活性中间体既能与亲核的X-H（X=N, S, O）官能团反应，也能与C-H 键反应；5）得到的产物比较稳定，能够耐受分离分析处理过程。 常用的光亲和基团包括叠氮苯类、（苯基）双吖丙啶类和二苯甲酮类（下图A），分别在特定波长光照下产生氮宾（nitrene）、卡宾（carbene）和双自由基（diradical）活性中间体。其他可用于光亲和标记的基团有重氮基团、重氮羰基、烯酮、硫自由基和硝基苯类等。 叠氮苯基的引入相对方便，因此这类光亲和基团最常用。但是必需考虑到它存在一些缺点：1）一般的叠氮苯基有效光解时需要较短波长的光照，这样的波长将对活性大分子造成严重损伤；2）产生的氮卡宾通常也不如卡宾活泼；3）高活性的苯基氮卡宾将迅速重排生成比较稳定的烯亚胺（ketenimine）结构，这种结构只能与亲核性X-H官能团反应（X=O, N, S等），如果活性位点部分没有亲核性官能团，那就可能迁移到离活性位点较远区域标记，产生非特异性标记；4）光解产生的氮卡宾与受体作用时形成不太稳定的C-N键，或很不稳定的N-杂原子键。 据报道，多氟取代的叠氮苯由于提高了反应能垒，可以阻止单线态氮卡宾中间体向烯亚胺结构转变。而且邻位被氟取代的叠氮苯，可以大大延长活性中间体氮卡宾的存在时间，保证有充分的时间使其与受体发生分子间反应。多氟取代叠氮苯比较容易制备，而且表现出较高的热稳定性。叠氮苯基光亲和基团的标记效率通常不高（约30%）。 二苯甲酮类光亲和基团光解时形成的三线态双自由基分子不发生重排反应，主要与蛋白质分子中的C-H键反应，在质子性溶剂中稳定，几乎不与水反应，使得其激发态只能与靶蛋白作用，通常其标记效率较高。然而，由于其双自由基分子不能被缓冲液萃灭，也可能导致一些非特异性标记，其光解时需要长时间紫外光照，这可能导致蛋白质损伤或实验细胞死亡。 三氟甲基苯基双吖丙啶是最接近理想的光亲和基团。它具有以下优点：1）很好的化学稳定性，能耐酸碱；2）光解波长约360 nm，大于蛋白质的紫外吸收波长，因此对蛋白质的损伤很小；3）光解后产生卡宾活性中间体，不仅能与X-H（X=O, N, S等）反应，也能以较高效率完成对C-H键进行插入反应；4）卡宾与受体形成的产物比氮宾的产物更稳定。5）卡宾中间体十分活泼，因此会很快被水淬灭，这对于标记产率来说是不利的，但是另一方面，由于其半衰期很短，能够最大程度减少非特异性标记。在光照下，双吖丙啶可以转化成单线态卡宾，也有约30%转化为重氮化合物。主要形成的加成产物如下图所示： 2.3 报告基团 放射性同位素、亲和性标签以及荧光染料都可以作为报告基团。其中生物素是最常见的亲和性标签，抗体（抗原）表位也可以作为亲和性标签。后者的优势是，抗原表位标签很容易从对应抗体固定树脂上系脱下来，这对于生物素-亲和素系统来说是困难的。亲和性标签通常不利于探针穿透细胞，而且由于空间位阻可能影响探针对靶点的亲和力，其处在探针上的位置十分关键。 荧光染料标签通常用于基于活性的蛋白组学分析（ABPP，activity based proteomics profiling）。而且是成员种类最为丰富的一类标签。常用的包括荧光素、常用的包括荧光素、BODIPY（二吡咯烷酮二氟化硼）、罗丹明、氰蓝染料（Cy-5和Cy-3）和 NBD（硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑）。每一类染料都有自己的优缺点；总的优点是标签具有疏水性，通常可以穿透细胞膜。与其他替代品相比，荧光素和罗丹明价格低廉，但它们存在光漂白现象。BODIPY和氰基染料具有吸收系数高、吸收峰窄、量子产率高等特点，可提供更清晰的检测和识别。 2.4 光亲和标记技术工作流 在大多数操作规程中，细胞或细胞裂解液都要经过光亲和探针处理，并留出时间让探针与受体结合。然后用特定波长的光照射样品，激活光亲和探针与临近的生物分子共价交联。如果在活细胞上进行，则需要裂解细胞后，样品与报告标签进行点击化学偶联。通过亲和标签对应的亲和纯化系统，将被标记的蛋白质从的混合物物中分离。通过SDS-PAGE分析，使用针对报告标签的专用设备和试剂，对标记蛋白质的范围进行可视化。蛋白质从凝胶中分离出来，经过多种蛋白酶消化，产生多肽片段。这些片段可通过MS测序来确定分离蛋白质的特征。还可以得出与光亲和探针反应的氨基酸序列，这可能会提供有关结合位点的额外信息。PAL技术的一个局限是可能的非特异性标记。由于样品蛋白质分子不易获得，在光亲和标记实验中，人们倾向于加入大大过量的探针分子（相对于蛋白质分子），导致在标记实验中产生大量的非特异性标记。此外，光亲和探针通常会与含量较高的或“粘性”蛋白质发生交联。为了区分本底标记和特异性标记，可以进行一些对照实验。例如，评估在没有光亲和探针和没有紫外线辐射的情况下产生的标记量。此外，进行竞争实验也特别有用，它可以突出蛋白质的特异性交联。通常情况下，未修饰的母体化合物比光亲和性探针对受体的亲和力更大。竞争实验的方法是用过量的母体化合物或另一种光稳定性类似物，一起对样品进行孵育，蛋白质的特异性标记可通过报告标签信号的剂量依赖性下降来识别。 3. 基于生物素的光亲和标记实例 3.1 分子靶点的识别 通常来说，靶点识别技术可分为两类：基于亲和力的和基于表达克隆的。不过，所有这些方法的一个基础是小分子与其靶蛋白的亲和力。若配体与其靶蛋白可逆结合，则结合的强度决定了这种相互作用是否会在靶蛋白检测和/或分离的过程中持续存在。光亲和探针通过形成共价连接克服了这一问题。探针对靶点的亲和力越高，识别特异性靶点的可信度也越高。如果探针的亲和力较低，那么在疏水效应等作用下，小分子与其他蛋白质之间发生非特异性结合的可能性也会增加。 最近，一种有效的光亲和标记探针被用于鉴定齐墩果酸（Oleanolic acid）的靶蛋白。齐墩果酸在癌症、艾滋病和高血糖症等领域具有多种生物活性。Zhang等人成功合成了两种光亲和探针：一种含有生物素标签、二苯甲酮光反应基团和齐墩果酸；另一种是“无标签”探针，其末端的叠氮基团可与含炔基手柄的生物素反应。根据以前的SAR研究，齐墩果酸羟基的修饰对其活性影响很小，因此被认为是探针的合适附着点。齐墩果酸的一个已知靶点是磷酸化酶RMGPa，因此为了确定探针是否仍具有活性，进行了针对RMGPa的酶抑制试验。意外的是，尺寸较小的“无标签”探针的活性最差（比齐墩果酸低五倍），而完整探针的活性仅低两倍。随后，完整探针在HepG2细胞的可溶性裂解液中孵育，两个40~50 kDa的蛋白质被标记并捕获，但是未被作为靶点报道。 Sample: HepG2 liver cancer cell lysate PAG: benzophenone Target: n.a. Ref: Zhang L et al Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 1036–1039 (2012). Pladienolides是一种天然产物，在多种体内和体外模型中表现出抗肿瘤活性，但其靶点到目前仍不确定。Kotake等人制备了三种基于Pladienolide B的探针，分别使用了氚（3H）标记、荧光标记（BODIPY-FL）和生物素标记。用3H探针处理HeLa细胞，评估放射性信号的亚细胞分布。结果表明，细胞核部分的放射性最高，说明了Pladienolides对细胞核蛋白质具有很高的亲和力。为了收缩可能的靶标范围，使用针对一系列核蛋白的特异性抗体对经过3H探针处理的HeLa细胞的核部分进行了免疫共沉淀实验。在六种共沉淀物中检测到了放射性，其中五种是使用能识别核糖核蛋白U2 snRNP成分（与mRNA的3′位剪接密切相关）的抗体形成的。用光亲和探针处理裂解的HeLa细胞后，确定了这类化合物的主要靶标。使用抗SAP155抗体对细胞核部分进行免疫沉淀，然后用紫外线激活光亲和探针，使探针与其靶标之间形成共价键。使用链霉亲和素辣根过氧化物进行Western印迹，发现了一条约140 kDa的重要条带。通过LC-MS/MS肽测序，确定这是一种剪接体相关蛋白。总之，研究结果表明，Pladienolides化合物与SF3b复合物的SAP130具有亲和力，因此可以抑制mRNA的剪接，从而发挥抗增殖作用。 Sample: HeLa cervical cancer cells PAG: benzophenone Target: SAP130 of SF3b Ref: Kotake Y e al. Nat. Chem. Biol. 3, 570–575 (2007). HDAC抑制剂是一种对亨廷顿氏症、弗里德里希共济失调症（FRDA）和癌症等疾病具有治疗潜力的药物。Xu等人发现了一种庚二酰胺，它在FRDA小鼠模型中表现出良好的活性。作者在该化合物基础上开发了使用二苯甲酮光反应基团的光亲和探针，然后通过点击化学反应附着上生物素标签。研究表明，HDAC3是的主要分子靶标，随后的工作揭示了它在 FRDA基因沉默中的作用。对先导化合物的修饰使其特异性从HDAC3转向了HDAC1和2，然而，在抑制HDAC1或HDAC2 时并没有看到所需的活性。这支持了HDAC3抑制是导致所观察到的表型的原因。 Sample: Nuclear extracts from a cell line derived from a FRDA patient PAG: phenyldiazirine Target: HDAC3 Ref: Xu C et al. Chem. Biol. 16, 980–989 (2009). Kotoku等人通过对一系列天然产物和类似物进行细胞筛选，发现了一种新型生物活性化合物Furospinosulin-1。这种小分子是从印度尼西亚海洋海绵Dactylospongia elegans中分离出来的，研究发现它是一种剂量依赖性、缺氧选择性的DU145前列腺癌细胞生长抑制剂。与许多缺氧选择抑制剂不同的是，Furospinosulin-1并不干扰HIF1α的积累，但却消耗了IGF-2的表达，作者因此假设该化合物是通过一种新的作用模式发挥作用的。为了弄清作用机制，作者合成了四种光亲和探针，活性单元和二苯甲酮基团之间的连接子长度各不相同，但均采用生物素都作为报告标签。研究发现，连接子较短的探针保持了最佳活性，并且表现出对缺氧条件的选择性。使用电泳迁移率实验对这些探针进行了评估，结果表明这些探针能破坏核蛋白与DNA的结合，Furospinosulin-1能够破坏可能参与转录的核蛋白复合物形成，尽管还没有确认其直接靶点。 Sample: Nuclear fraction of DU145 prostate cancercells PAG: benzophenone Target: n.a. Ref: Kotoku N et al. Bioorg. Med. Chem. 22, 2102–2112 (2014). 3.2 识别细胞中的非靶点（off-target）相互作用 大多数小分子非靶点相互作用都是通过体外筛选试验发现的。例如，在药物发现的早期阶段，GPCR、离子通道、激酶、核受体和转运体的生化测定都经常用于检测非靶点相互作用。这些方法的效率依赖于小分子的体外活性和蛋白质的体外功能。其主要局限是，筛选面板的组成限制了脱靶相互作用的可检测范围。 PAL为鉴定细胞中的分子靶标提供了机会，无需事先选择待筛选的靶标，蛋白质处于天然相对丰度，并存在内源配体和辅助因子。这可以作为上述体外筛选的补充，并为将体外相互作用转化为细胞种的作用提供信息。需要注意的是，连接子与活性单元的连接位点可能影响靶点识别的范围。保留与特定蛋白质结构家族相互作用的已知药效团，就可以检测同类的其他蛋白质，例如下文所述的激酶。如果附着位点破坏了相互作用所必需的结构，那么检测该家族以外的其他靶标的能力就会受到影响。由具有不同连接位点的同一亲和单元构建的多个PAL探针组合可能有助于探测到所有可能的相互作用。 许多蛋白激酶抑制剂的特异性并不高，因此了解被抑制的激酶或其他靶点的范围如何影响生物活性非常重要。为了更全面地了解达沙替尼（Src/Abl双重抑制剂，IC50 Src 3.6 nM，IC50 Abl 8.8 nM）在体内的非靶点相互作用，Shi等人开发了达沙替尼的细胞渗透性光亲和探针。在达沙替尼的药效结构中直接加入了重氮基团，以取代羟乙基哌嗪基，后者已被验证被取代不会导致活性的显著降低。利用点击化学方法，添加了一个炔基手柄与报告标签偶联，得到的探针其活性与母体化合物相似。在活细胞和细胞裂解液中进行了“Pull-down”和靶点鉴定实验。除了已知的达沙替尼与Abl和Src家族酪氨酸激酶的相互作用外，还发现并验证了一些丝氨酸/苏氨酸激酶的相互作用，其中最显著的是PKA（IC50为4.8 μM）、PIM-3（IC50为8.2 μM）和PKN2（IC50为11.5 μM），尽管与靶激酶活性相比效力大大降低。 Sample: K562 leukemia cells and cell lysate; HepG2 live cancer cells and cell lysate PAG: diazirine Target: PKA, PIM-3, PKN2 Ref: Shi H, Zhang et al. J. Am. Chem. Soc. 134, 3001–3014 (2012). 3.3 确定结合位点的位置与结构 酶、多功能蛋白质和受体可能有多个配体结合位点，其中许多位点的特征已经确定，而另一些位点虽已知晓，但其位置和排列方式尚不清楚。配体结合位点通常存在于多亚基蛋白质复合物中。正如GABAAR和nAChR复合物中的结合位点所证明的那样，位于亚基界面上的结合位点可能很难定位和表征，而PAL可以应用于这些位点，前提是这些复合物能够通过裂解协议或使用细胞渗透探针在完整细胞中进行实验。还可以检测到两个亚基在界面上形成的结合点。一旦复合物中的特定亚基被确定为PAL探针及其同源可逆结合配体的目标，竞争实验就能发现其他类别的抑制剂在复合物中使用相同或不同的结合位点。PAL用于阐明结合位点已有近30年的历史，许多新的结合位点仍在利用这种技术不断被发现。 过氧物酶体是一种膜封闭的亚细胞器，含有大量氧化酶，在各种生物合成途径中发挥着关键作用。Kashiwayama 等人合成了棕榈酸的重氮类似物，并用它来探测纯化的大鼠肝脏过氧物酶体的潜在结合位点。一种80 kDa蛋白被重复标记，在竞争条件下标记效率降低。该蛋白质被发现是MFE2，一种 β-氧化过氧化物酶。质谱分析表明，Arg251和Trp249两个残基被探针标记，根据MFE2的晶体结构，作者推断这两个残基位于通向催化位点的疏水口袋的顶部，并提出这个疏水区域对于底物相互作用和向活性位点定向非常重要。 Sample: Rat liver peroxisomes PAG: phenyldiazirine Target: MFE2 Ref: Kashiwayama Y et al. J. Biol. Chem. 285, 26315–26325 (2010). Kisspeptins 是人类蛋白质，是 GPCR GPR54 的内源性配体。Kisspeptin-GPR54 信号轴与激素 GnRH 的分泌密切相关，因此 GPR54 激动剂具有治疗激素分泌疾病的潜力。为了更好地利用这一治疗机会，需要进一步了解GPR54 配体的结合残基。因此 Misu 等人开发了吻肽（kisspeptin）多肽光亲和探针。已知 C 端区域对 GPR54 的结合至关重要，因此在N 端连接了生物素报告标签。根据 Kp-54 肽序列合成了16个光亲和素探针，每个探针上只有一个残基被半胱氨酸取代，半胱氨酸随后被修饰以加入叠氮光基。只有六种探针与GPR54 共价结合，而且所有探针都在相同的18个氨基酸序列中修饰了氨基酸，这表明这一短序列在吻肽与GPR54 的相互作用中起着关键作用。 Sample: HEK293 embryonic kidney cells PAG: phenylazide Target: GPR54 Ref: Misu R et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 2628–2631 (2013). Ras信号转导级联是与人体细胞增殖相关的重要细胞通路。该信号轴的异常与癌症密切相关。蛋白酶Rce1p直接与Ras及其他CAAX（C：半胱氨酸，A：脂肪族氨基酸，X：任意一个氨基酸）蛋白相互作用，并通过内切蛋白水解酶对其进行修饰。Rce1p本身定位于ER膜，但该酶催化残基的拓扑结构尚不清楚。Kyro等人根据K-Ras4b 的部分C端序列合成了一系列光亲和肽。并通过严格筛选确定了标记Rce1p的最佳探针设计。探针含有2-氨基苯甲酰基荧光团、二硝基苯基淬灭剂和二苯甲酮改性异戊烯基（可被Rce1p识别）。此外，还合成了将光敏基团作为独立分子添加到异戊烯基团和报告标签上的探针。当光敏基团位于肽链而不是异戊烯基链时，标记效果最佳。作者发现，不属于Rce1p识别的氨基酸序列的肽也能对Rce1p进行标记，未来设计选择性抑制剂时可能需要考虑这个问题。 Sample:Membrane fraction from Saccharomyces cerevisiae PAG: benzophenone Target: Rce1p Ref: Kyro K et al. Bioorg. Med. Chem. 19, 7559–7569 (2011). Aβ（β淀粉样蛋白）的过量产生和沉积被认为是阿尔茨海默病的根本原因。γ-分泌酶是一种膜内天冬氨酰蛋白酶，可裂解跨膜蛋白，其主要底物是淀粉样前体蛋白。淀粉样前体蛋白被β-和γ-分泌酶蛋白水解后会产生短肽链（17~42个氨基酸），其中Aβ40和Aβ42被认为具有最强的神经毒性。γ-分泌酶是一种多亚基蛋白复合物，其活性取决于四个独立蛋白的正确组装：PS1或PS2、PEN-2、NCT 和APH-1。γ-分泌酶调节剂（GSMs）已被开发为治疗阿尔茨海默病的潜在药物，可减少致病性Aβ42的产生，但不抑制Aβ的形成总量。γ-分泌酶蛋白复合物是一个具有挑战性的药物靶点，为了进一步了解GSMs的结合位点，人们进行了各种PAL研究。Pozdnyakov等人合成了一种光亲和探针（E2012-BPyne），该探针基于咪唑类GSM E2012设计，含有二苯甲酮和炔基手柄，减少Aβ40和Aβ42肽的功效与母体化合物相似。探针在母体GSM存在或不存在的情况下，在活的HeLa细胞中孵育，通过紫外线照射交联到目标物上，通过点击化学与生物素-叠氮化物标记，并通过亲和纯化分离。分离出的蛋白质通过Western blot分析来区分γ-分泌酶的各种成分。作者确定PS1-NTF（N-末端片段）是E2012的靶标。在E2012大量过量存在的情况下，没有观察到PS1-NTF的标记，也没有观察到其他亚基的标记，这表明这是一种高度特异性的相互作用。 Sample: HeLa cervical cancer cell membrane fractions PAG: benzophenone Target: PS1 in the γ-secretase protein complex Ref:Pozdnyakov N et al. J. Biol. Chem.288, 9710–9720 (2013). 普那布林（Plinabulin）是一种微管解聚剂。Yamazaki等人合成了一种光亲和探针，以确定普那布林在微管上的结合位点。作者发现，当报告标签和药效单元之间的连接子很长时可以提高检测效果。药物结合在α-和β-微管蛋白之间的区域，因为这两个亚基都被共价标记。该结合部位与微管抑制剂秋水仙碱的结合部位不同，最初该药物被认为是与秋水仙碱结构域结合的。 Sample: HT1080 fibrosarcoma cell lysate PAG: benzophenone Target: α-tubulin and β-tubulin Ref: Yamazaki et al.Bioorg. Med. Chem. 18, 3169–3174 (2010). 四、独家原创|谢恬教授、叶向阳研究员:以 G-四链体为靶标的小分子抗病毒药物的研究进展 （原创 药学进展 药学进展） 以 G-四链体为靶标的小分子抗病毒药物的研究进展 PPS  何兴瑞 #，刘梦婷 #，王子桉，贾译程，叶向阳 *，谢恬 ** （杭州师范大学药学院，浙江省榄香烯类抗癌中药重点实验室，浙产中药材资源开发与应用浙江省工程实验室，浙江省浙八味等浙产中药材综合利用开发 2011 协同创新中心，浙江 杭州 311121） 摘要：G-四链体（ G-quadruplexes，G4s）是由富含串联重复鸟嘌呤（Guanine，G）的 DNA 或 RNA 折叠形成的核酸二级结构，广泛存在于所有生物的基因组中，参与调控基因的复制、转录和翻译等多种过程。G4s 因其关键的生物学作用而引起人们的兴趣，前期人们主要关注于 G4s 在癌症中的研究并将其作为抗肿瘤药物的靶点。最近，对病毒基因组学的研究发现许多 G4s 出现在病毒基因组的调节区，对调节病毒生命周期发挥关键作用。随着新病毒的出现和现有病毒的快速突变，需要开发新的抗病毒靶标和药物。目前现有的大多数抗病毒药物是以病毒的蛋白质为靶标，直接靶向病毒核酸的研究较少。以 G4s 为靶标的小分子配体的开发有助于帮助理解 G4s 介导的机制在病毒生命周期中的重要作用，也是一种新的抗病毒药物开发策略。通过对以G4s为靶标的小分子配体在抗病毒中的应用进行总结，旨在为基于 G4s 的抗病毒药物研发提供参考。 四链体（G-quadruplexes，G4s）是一种在富含鸟嘌呤（Guanine，G）的 DNA 或 RNA 链上形成的核酸二级结构 [1]，通常由两个或更多的 G-四分体（G-quartet）通过 π-π 堆积而成。G-四分体是由Hoogsteen 氢键连接4个G形成的环状平面结构，并由一价或二价阳离子（通常是 K+）参与中心配位（见图 1A）[2]。G4s 可以折叠成不同的拓扑结构，可根据链的方向区分不同的拓扑结构。拓扑结构由环性质、序列长度、序列中的位置和链化学计量等因素决定 [3]。DNA G4s 具有平行、反平行或混合拓扑结构，而 RNA G4s 因其核糖中的 2'-羟基引起的空间位阻和糖苷键的反式构象通常形成平行拓扑结构。此外，G4s 可以在一条富含 G 的 DNA 链或RNA 链中形成分子内 G4s，也可以通过数条富含 G的核酸链形成分子间 G4s[4]。  随着生物信息学和高通量测序等技术的发展，目前已经可以分析并鉴定基因组或转录组中的 G4s可 形 成 序 列（putative quadruplex-forming sequence，PQS）。根据目前已有的技术，已发现数千个 G4s 广泛存在于各种生物的基因组调节区和 RNA 中，如DNA 端粒的末端、原癌基因的启动子区、信使RNA的5'端非翻译区（5'-untranslated region，5'-UTR）等 [5]，这些基序在 DNA 复制、转录、重组、表观遗传调控和维持端粒稳定性等生物学过程中发挥着重要作用。 近几年，G4s 作为一种新的抗肿瘤治疗靶点，被广泛地用于癌症的研究。现已经开发了数千个G4s 配体 [6]。虽然目前还没有 G4s 配体通过美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）的上市批准，但是已有两个 G4s 配体（CX-3543和 CX-5461）进入了癌症治疗的临床试验阶段 [7-8]。这些研究促进了对哺乳动物 [9]、酵母菌 [10]、细菌 [11]、病毒 [12] 等生物的 G4s 探索，尤其是病毒。成熟完整的病毒一般由蛋白质外壳和核酸组成，少数病毒可能存在包膜。虽然病毒基因组表现出多样性，但PQS 在单个病毒物种中表现出显著的保守性。这说明 G4s 在病毒进化中起着至关重要的作用，可能会随着时间的推移影响病毒生命周期 [13]。相关研究表明，G4s 参与调节病毒的复制、转录、组装等关键过程，也可以与病毒共同进化 [14]。因此，G4s 是一个潜在的抗病毒靶标，具有开发广谱抗病毒药物的潜力。随着严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎的流行，抗病毒药物研究被广泛关注。现有的抗病毒药物治疗靶点较少，主要针对病毒或宿主的蛋白质，由于病毒的高度变异性，开发广谱的抗病毒药物比较困难，而G4s 结构相对固定，以 G4s 为靶标发展的抗病毒药物具有一定的普适性。目前已有几种 G4s 配体在多种病毒中被证实具有抗病毒活性[15]，包括丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）[16]、埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）[17] 和 SARS-CoV-2等 [18]。本文旨在对以 G4s 为靶标的小分子配体在抗病毒中的应用进行总结，以期为靶向 G4s 的新型抗病毒药物的研发提供参考。 1 G4s 配体 截至目前，研究者已经开发了几个类别的靶向G4s 结构的化合物，主要用于抗肿瘤领域。这些 G4s配体的特征是带有可质子化侧链的多环平面芳香支架，G4s 配体通常通过与末端 G-四分体的 π-π 堆积产生与 G4s 的相互作用，配体侧链的正电荷部分则与环状和沟槽中的磷酸基团相互作用（见图 1B 和图1C）[19]。目前的 G4s 配体可分为几个具有代表性的化学类别，也有一些 G4s 配体进入了临床试验阶段。这些对 G4s 配体的前期探索性研究为 G4s 配体在抗病毒领域的应用提供了经验。鉴于近期 G4s 配体在抗病毒领域的大量的报道，本文将对 G4s 配体在抗病毒研究中的应用进行了汇总和梳理，分别讨论几种代表性 G4s 配体在抗病毒领域的研究，并对配体的结构特征以及与 G4s 结合的特点进行概述，重点讨论配体的抗病毒作用。 1.1 卟啉类化合物TMPyP4 TMPyP4（1）是研究较广泛的 G4s 结合分子之一。它的物理化学特性（如分子结构的大小、平面的核心、带正电荷的取代基以及疏水性）使其非常适合堆叠在 G4s 支架上，因此常被用作 G4s 特定的稳定剂。它的同分异构体——TMPyP2（2）的 2位是 N-甲基基团，空间位阻的效应使 TMPyP2 无法与 G4s 结合，从而使其成为理想的阴性对照分子，可用于假阳性结果的排除，两者的组合促进了TMPyP4 作为 G4s 配体的研究 [20]。该化合物能明显地抑制端粒酶活性 [21]，并可以通过靶向 c-myc[22] 和Bcl-2[23] 等原癌基因启动子序列中的 G4s 区域，降低这些原癌基因的表达 [24]。TMPyP4 的主要缺点是对G4s 的选择性不强，它也会结合双链 DNA 结构 [25]。 TMPyP4 可以通过靶向G4s产生抗病毒活性。由于该化合物细胞毒性较低，目前已被应用于多种病毒的研究，包括人类疱疹病毒（human herpes virus，HHV）、人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）、ZIKV以及SARS-CoV-2 等。 HHV 在人群中广泛传播，可引起终身感染，导致口腔和生殖器疱疹以及癌症等一系列疾病。该类病毒均含有一个大的双链 DNA（double-stranded DNA，dsDNA）基因组，并具有丰富的 GC 含量和 PQS [26]。HHV 包括 α 亚家族：单纯疱疹病毒 1 型（herpes simplex viruses 1，HSV-1）、HSV-2；β亚家族：人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）、HHV-6、HHV-7 以及可诱发肿瘤的γ亚家族：EB病毒（epstein-barr virus，EBV）、人卡波西肉瘤疱疹病毒（Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）。 在被 HSV-1 感染的细胞中，TMPyP4 可以与HSV-1 基因组中的 G4s 序列相互作用并使其稳定。这种化合物不影响 HSV-1 的进入和复制，但可以使组装好的 HSV-1 颗粒困在细胞质中，阻断病毒从细胞中释放 [27]。Ravichandran 等 [28] 报道了 TMPyP4可以在 HCMV 中增加 G4s 的形成，并发挥稳定G4s的作用。由于病毒的微RNA（microRNA，miRNA）能抑制病毒调控因子以及宿主基因的表达，因此对病毒毒力的维持非常重要，目前 KSHV和 HCMV 的 miR-K12-1-9,11 簇和 miR-US33 启动子的上游区域都发现了 G4s[29-30]。Kumar 等 [31] 报道了TMPyP4 可以破坏 miRNA 中 G4s 的稳定性，这种破坏效应会导致KSHV miR-K12启动子活性被抑制，并使 HCMV miR-US33 启动子活性增强。这表明，在 HHVs miRNAs 调节区域中的 G4s 可能在感染调制中发挥不同的作用。  在 KSHV 中，TMPyP4 还稳定了潜伏相关核抗原（latency-associated nuclear antigen，LANA）的信使RNA（messenger RNA，mRNA）中的 G4s 结构 [32]。LANA 是潜伏期表达最多的蛋白质，也是病毒传播和逃避宿主免疫监视的基础 [33]。用 TMPyP4 处理24 h 后，在 KSHV 感染的细胞中观察到LANA水平的减少，证明LANA mRNA 中 G4s 的稳定会抑制该mRNA 的翻译 [32]。 HPV 是导致上皮结构增生病变的 DNA 病毒，高危型 HPV 会诱发宫颈癌和口咽癌。将 TMPyP4 与7种HPV病毒（HPV9、HPV16、HPV18、HPV32、HPV52、HPV57 和 HPV58）的 PQS 进行孵育，经荧光共振能量传递（fluorescence resonance energy transfer，FRET）和 圆 二 色 谱（circular dichroism，CD）进行熔解实验测定，发现所有的测试序列中都具有高的 G4s 稳定性 [34]。 ZIKV 是一种通过节肢动物传播的病毒，在2016 年造成了一次大流行，并演变成了一场公共卫生紧急事件，该病毒感染后可能会在婴儿和成人中引发严重的神经系统并发症。该病毒的正义 RNA基因组中包含多个PQS[35]。TMPyP4 可以作为 ZIKV中 G4s 结构的稳定剂。体内试验显示，该化合物可以以剂量依赖性的方式抑制该病毒的复制，是一种新的对抗 ZIKV 感染的策略 [50]。 Qin 等 [36] 发现 TMPyP4 可以通过靶向 G4s 而在细胞层面显著抑制 SARS-CoV-2 的感染，在两种动物模型中 TMPyP4 可以有效抑制 SARS-CoV-2 的复制并缓解肺部病变，同时该化合物展示了比瑞德西韦更强的抗 SARS-CoV-2 的活性，而化合物 TMPyP2没有表现出显著的活性，这提示 TMPyP4 抗 SARSCoV-2的活性可能与对 G4s 的靶向性有关 [37]。在该化合物的有效抗病毒浓度下，短时间内没有观察到明显的体内毒性 [36]。这显示了该化合物有作为临床抗 SARS-CoV-2 药物的潜力。TMPyP4 也被证明能明显抑制包含 G4s 序列的绿色荧光蛋白基因的表达 [38]。跨膜丝氨酸蛋白酶2（transmembrane serine protease 2，TMPRSS2）因广泛参与了包括流感、SARS 等在内的多种病毒的细胞入侵而“臭名昭著”。TMPRSS2 参与病毒入侵的方式是通过其丝氨酸蛋白酶活性激活病毒的刺突蛋白，从而促进膜融合。TMPRSS2 启动子包含一个能够折叠成 G4s 的富 G 序列，该序列的稳定可以抑制 TMPRSS2 的表达。Liu 等 [39] 报道了 TMPyP4 稳定宿主 TMPRSS2的 mRNA G4s 以抑制 TMPRSS2 的 表 达， 从 而 抑制 SARS-CoV-2 感染。表明其抗 SARS-CoV-2 的作用可能也与靶向 TMPRSS2 RNA 的 G4s 导致的TMPRSS2 的表达量下降有关。 TMPyP4 在多种病毒中均显示了较好的效果，但是该化合物对 G4s 和 dsDNA 的选择性较低 [40]，在用该化合物进行抗病毒试验时，必须认真评估是否存在独立于 G4s 的作用机制。 1.2 PhenDC3及双喹啉家族的化合物 PhenDC3（3）是双喹啉家族中最具代表性的化合物，该化合物可以与 G4s 形成广泛的 π-π 堆积作用 [41]。由于该化合物对 G4s 的选择性要高于对dsDNA 的选择性，因此具有较高的 G4s 亲和力。该化合物的独特特性是它能够通过一种分子内的氢键使分子保持 syn-syn 构象（见图 2），这是它能与 G4s 结合的关键因素。该化合物能影响端粒酶的功能而被应用于抗肿瘤的研究 [42]，目前也有其在抗HCV、HPV 和 EBV 等病毒研究的报道。 HCV 是肝癌的主要病因之一。它有一个独特的开放阅读框的负链 RNA 基因组，能产生病毒的结构及非结构蛋白质。已有几种 PQS 在该基因组中被鉴定，其中最稳定的 G4s 位于核心基因 [43]。Jaubert等 [44] 发现在 HCV 中，PhenDC3 能够结合并稳定位于HCV 基因组 3' 端茎环 IIy' 处的高度保守的G4s倾向序列（HCV110-131）。PhenDC3 能通过稳定该G4s 而使其解链温度 Tm 升高 7.5℃。同时该化合物可以在体外阻碍该病毒 RNA 的合成，并且能够在不影响细胞活力的情况下减少该病毒的复制。  在对 HPV 的研究中，PhenDC3 被证明是大多数 HPV G4s 的强体外稳定剂。尽管该化合物有很好的体外结合能力，但在器官型筏式培养中却未能表现出降低病毒复制及蛋白表达的效果 [34]。 PhenDC3 在病毒学中的研究大多数都是在 EBV上进行的。EBV 关键蛋白 EBNA1 的 mRNA 富含G4s，该G4s可被细胞核仁素蛋白（nucleolin，NCL）识别，两者结合会导致 EBNA1 表达的下调。由于 PhenDC3 对 EBNA1 mRNA 的 G4s 表现出的较高亲和力，PhenDC3 可抑制NCL对 EBNA1 mRNA G4s 的结合，从而增加 EBNA1的表达，激活抗原肽的产生 [45]。因此，PhenDC3 常被用作为模板来设计新的G4s 配体。Reznichenko 等 [46] 最近开发了20个PhenDC3 的衍生物，并在体外和体内的EBV相关模型中测试了这些化合物对 EBNA1 mRNA G4s 的结合活性。其中 PyDH2（4）和 PhenDH2（5）被认为是最有前途的化合物，因为它们能够结合 EBNA1 mRNA G4s，并以 G4s 依赖的方式增强 EBNA1 的表达，阻止 EBNA1 G4s 与 NCL的相互作用，并从整体上阻碍EBV的免疫逃避。化合物 PyDH2 和PhenDH2 的毒性明显低于母体化合物 PhenDC3，因此在 G4s 介导的抗病毒治疗中具有很好的应用前景。 SARS-CoV-2 非结构蛋白3（nonstructural protein 3，Nsp3）蛋白的 SUD 结构域可以与宿主的 G4s 进行结合，两者的结合对SARS-CoV-2 的复制起到非常重要的作用，开发阻断两者结合的小分子是一种潜在的抗 SARS-CoV-2 药物开发策略。PhenDC3 和 PhenDH2 被证实具有抑制 SARS-CoV-2 SUD 与宿主细胞 DNA 或 RNA G4s 结合的作用，因此具有抗 SARS-CoV-2 病毒的潜力 [47]。 1.3 N-甲基中卟啉IX N-甲基中卟啉 IX（N-methyl mesoporphyrin IX，NMM，6）是间卟啉 IX 的 N-甲基化的非平面衍生物。最初鉴定为铁螯合酶的抑制剂，可阻断Fe2+ 与原卟啉 IX 发生螯合从而中断血红素的生物合成 [48]。NMM 是最早被报道能够结合 G4s 的小分子之一。NMM 能特异性地结合 G4s 而不是 dsDNA，同时也对平行的 G4s 表现出比反平行 G4s 更强的亲和力 [49]。NMM 与 G4s 结合后，突出平面的 N-甲基基团可以与 G-四分体的中心空腔很好地匹配，并与钾离子对齐，产生了一个有效的 π-π 堆积作用，能很好地稳定 G4s[50]。NMM 具有作为荧光分子的特性（激发波长为 393 nm，发射波长为 610 nm），当它选择性地结合到 G4s，能大大放大其信号（与平行 G4s 结合后，能将其荧光信号放大 60 倍）。由于 NMM 能优先结合到平行的 G4s 拓扑结构并增强荧光信号，因此可以基于 NMM 引发的荧光增强程度来区分不同的 G4s 结构 [51]，并作为一种简单、高灵敏度且特异性的G4s结构的化学探针[52-55]。在细胞中，NMM 被证明具有调节基因表达，影响表观遗传景观，并通过 G4s 介导的机制影响细胞生长的作用 [56]。  Ravichandran 等 [28] 对 HCMV 的 20 个基因中的36 个 PQS 进行了分析，发现 HCMV 基因调控区的大多数 PQS 实际上被折叠成稳定的 G4s，而 NMM可以稳定 G4s 并增强 G4s 的形成。在细胞试验中发现，NMM 可以通过稳定位于基因启动子内的 G4s，抑制相关基因的转录。  甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）是大多数流感发生的原因，它可以影响家禽、人类和其他哺乳动物。其负链 RNA 基因组由编码病毒蛋白的 8 个片段组成，该病毒具有较高的变异性，这也是 IAV 的关键生存机制。Tomaszewska 等 [57] 利用 NMM 对 IAV 基因组中的 RNA PQS 进行了生物物理分析。他们发现了几个保守的 G4s 基序，并用NMM 与 PQS 基序孵育证实了存在 G4s 折叠。 1.4 萘二酰亚胺 萘二酰亚胺（naphthalene diimide，NDI）是最通用的 G4s 配体之一，广泛应用于生物医学领域。它们有一个大而扁平的芳香母核，可以通过 π-π 堆积与 G4s 相互作用；它能连接 4 个可质子化的侧链官能团，这有利于该结构与 G4 凹槽中的磷酸基团形成氢键，由此产生的 G4-NDI 复合体非常稳定，并使 NDI 成为诊断和治疗研究的有力工具。通过对NDI 骨架的药物化学研究，相关研究人员研发了几种对 G4s 具有高亲和性和选择性的衍生物，由于这些衍生物能够紧密结合位于端粒和癌基因启动子的G4s 而被广泛用于抗癌研究 [58]。在 NDI 衍生物中，c-exNDIs 在水中的溶解度非常高 [59]，该化合物在对HIV-1 和 HSV-1 的测试中，显示出显著的抗病毒效果，该化合物对病毒 G4s 有着比对细胞 G4s 更高的亲和性，也是首个被证实可通过靶向 G4s 实现抗病毒作用的化合物 [59-60]。  最近，化合物 c-exNDI 2（7）被用于分析所有逆转录病毒（retrovirus，RV）整合基因组的长端重复序列（long terminal repeated，LTR）区域的PQS[61]。其中最具代表性的是 HIV-1 病毒 [12]，通过CD 以及 Taq 聚合酶终止试验发现 c-exNDI 2 能稳定所有的测试序列 [61]。Tassinari 等 [62] 将 NDI 与一组肽核酸（PNA）序列进行偶联，偶联物中的 PNA 能与目标 G4s 旁边的 DNA 序列互补，通过该方法实现 NDI 对 G4s 识别的特异性。通过实验他们发现NDI-PNA 偶联物能够特异性识别 HIV-1 LTR 区域内选择的 G4s。这种方法表明：可以通过将 G4s 配体与 PNA 偶联来实现对特定 G4s 的靶向，通过对PNA 的设计与合成，很容易实现对特定 G4s 的靶向。 1.5 吖啶衍生物BRACO-19（B19） BRACO-19（B19）吖啶衍生物 BRACO-19（B19，8) 有明显的端粒酶抑制活性和对 G4s 的高选择性，由于其对 G4s的选择性要远高于 dsDNA 并且具有较低的细胞毒性而被广泛用于 G4s 研究。该化合物可以利用吖啶环与 G4s 形成 π-π 相互作用，两个叔胺侧链在生理 pH下会质子化，有助于对 G4s 凹槽的识别，这些特点增强了该化合物对 G4s 的特异性 [63]。该化合物最早被应用于肿瘤治疗，也是首个在动物模型中被证明具有抗肿瘤活性的 G4s 配体 [64-65]。  近几年，该化合物被广泛应用于抗病毒的研究并且常作为研究病毒 G4s 的首选工具。目前，化合物 B19 已被用于 DNA 病毒 [ 如HHV、人腺病毒（human adenovirus，HAdV）、HPV等]、细小病毒以及 RNA 病毒（如RV和ZIKV）。  在 α-HHV 中，B19 被用于研究位于即刻早期（immediate early，IE）基因启动子中的 PQS。生物物理相关试验证明了所选序列被折叠成稳定的 G4s。与 B19 孵育可以提高该 G4s 的 Tm，证实了该配体的稳定作用。为了评估 G4s 在 α-HHVs IE 基因转录中的生物学作用，Frasson 等 [66] 在 HSV-1 的两个代表性IE 基因的启动子序列下游克隆了萤火虫萤光素酶基因，发现 B19 会通过稳定 G4s 来降低 IE 基因转录，并以剂量依赖的方式影响两种启动子的活性。病毒转录因子 ICP4 可以与 HSV-1 IE 基因启动子（包括 ICP4基因启动子）中的 G4s 结构相互作用并使其展开，促进病毒转录。Frasson 等 [67] 发现 B19 能在 ICP4 启动子区域与 ICP4 进行竞争，从而降低 ICP4 启动子的活性。由于 ICP4 对病毒复制至关重要，这种干扰ICP4-G4 相互作用的方式可能是一种新的治疗方法。Artusi 等 [68] 发现 B19 能与 HSV-1 基因组非编码区的G4s 结合，导致病毒 DNA 和病毒后期蛋白合成减少，证实了 G4s 在调节 α-HHV 生命周期中的关键作用。 B19 也被用于表征 G4s 在 HAdV 基因组中的存在。HAdV 是一种无包膜的 dsDNA 病毒，可引起严重的眼科、呼吸系统及神经系统疾病。HAdV 全基因组的生物信息学研究揭示了几个保守的 PQS。Majee 等 [69] 通过生物物理研究证实了它们的存在，并发现 B19 能大大提高 HAdV G4s 的稳定性；此外，在经重组腺病毒载体（含有绿色荧光蛋白报告基因）转染的 HEK293 细胞中，用 B19 处理会使荧光发射降低并抑制病毒粒子产生。 Carvalho 等 [34] 报道了 B19 及其吖啶衍生物C8（9）通过靶向 G4s 而产生抗 HPV 的 作 用。通过荧光嵌插剂置换实验（fluorescent intercalator displacement，FID）发现这两种化合物以高亲和力与 G4s 结合。在感染 HPV16 或 HPV18 的器官型培养模型中，用 C8 治疗 20 d 后，可成功减少病毒的复制。由于目前还没有根治潜伏 HPV 病毒的方法，所以通过靶向 HPV 中 G4s 的方法可以同时实现对复制与潜伏病毒的靶向。 Bua 等 [70] 报道了化合物 B19 对 DNA 病毒——人细小病毒 B19（Parvovirus B19，B19V）的作用。生物信息学工具预测 B19V 基因组中复制起点附近存在潜在的 PQS，但无论是生物物理和生化分析，还是药物治疗，都不支持 G4s 折叠。此外，B19 对感染 B19V 的红系前体细胞（erythroid progenitor cell，EPC）没有显示出任何抗病毒活性，这表明 PQS 的生物信息学预测并不总是反映 G4s 的实际存在。 在 RNA 病毒中，RV 的长末端重复序列 U3 区域存在 G4s。Ruggiero 等 [61] 报道了 B19 对该区域的作用。CD 光谱表明，在 B19 存在的情况下，所有 RV 的亚家族的几个序列都形成了稳定的 G4s 结构。B19 的加入稳定了 G4s，并使 Taq 聚合酶停滞，最终使全长扩增产物减少。在 RVs 中，G4s 因其在HIV-1 调节中的作用而被广泛研究。B19 被证明对HIV-1 生命周期的整合前和整合后都有抑制作用。这可能与 RNA 基因组及前病毒 DNA 的 U3 区域均存在 G4s 有关。B19 可以在整合前抑制 DNA 合成，也可以在整合后阻止 DNA 模板上的聚合酶对病毒的转录和复制，从两个方面有效地抑制 HIV-1的进展 [71]。HIV-1 G4s 可以与病毒核壳体蛋白 7（nucleocapsid protein 7，NCp7）结合，该蛋白发挥G4s 去折叠活性。凝胶迁移实验和 CD 分析显示，NCp7 能结合 RNA G4s，促进逆转录进程中的 DNA/RNA 中间体的形成。B19 能够部分抵消 NCp7 对G4s 的展开活性。因此，由 B19 介导的 G4s 在 RNA水平上对 HIV-1 的抑制是由对逆转录酶的阻滞以及对 NCp7 伴侣蛋白活性的抑制双重原因导致的 [72]。  在感染 MR766 ZIKV 的 Vero 细胞中，B19 能够减少病毒蛋白表达和基因组复制，总体抗病毒效果可能与该化合物可以稳定病毒 RNA 上的 PQS 有关 [16]。同时，B19 能明显抑制包含 G4s 序列的绿色荧光蛋白基因的表达，而在 SARS-CoV-2 的基因组中，发现了多个保守的G4s序列，这提示 B19 对 SARSCoV-2复制具有抑制作用 [38]。 1.6 Pyridostatin及其衍生物 Pyridostatin（PDS，10) 是一个根据多种已知的G4s 配体分子的结构，理性设计出的新 G4s 配体，该化合物对 G4s 具有较高的选择性，是 G4s 研究的代表性配体 [73]。该化合物结构的富电子平面结构、芳香性的表面以及参与氢键的能力都使其能与 G4s有效结合。PDS 可以通过稳定端粒的 G4s 而发挥抗肿瘤作用 [74]。PDS 及其衍生物对 G4s 的特异性识别已通过核磁共振波谱法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）进行了阐明 [75]。目前已有多种以 PDS 为母体的类似物被报道，并表征了它们在G4s 介导抗肿瘤中的作用 [74]。  目前，PDS 及其类似物已被广泛用于对抗几种病毒如 HHV、HPV、HCV 以 及 SARS-CoV-2。在KSHV 和 HCMV 中，Kumar 等 [31] 研究了 PDS 对miRNA 近端启动子中的 PQS 的作用（KSHV 中的miR-K12，HCMV 中的 miR-US33）。CD 光谱显示，两个序列都形成了稳定的平行 G4s，形成的 G4s 能进一步被 PDS 稳定。与化合物 TMPyP4 相反，通过稳定 G4s，PDS 可导致 KSHV miR-K12 启动子活性增强，并使 HCMV miR-US33 启动子活性被抑制，对两个启动子产生相反的作用，这种结果的产生可能是由与 G4s 无关的因素导致的。  在 EBV 中，NCL 可以与位于 EBNA1 mRNA中 GAr（glycine-alanine repeat）结构域的 G4s 结合。Prado 等 [45] 研究了 PDS 在阻止两者互作中的作用，通过邻近连接分析发现 PDS 不能减弱 NCL和 EBNA1 mRNA 之间的相互作用。此外，在牵出试验中，PDS 也不能抑制包被 EBNA1 G4s 的磁珠对 NCL 的成功下拉，导致这种结果的原因可能与PDS 对该特定 G4s 结构的亲和力较弱或形成了 PDS/NCL/ENBA1 三元复合物有关。 PDS 可以与来自 7 种不同 HPV 基因型的 PQS结合，但却表现出比其他测试的 G4s 配体更弱的亲和力，PDS在体内对HPV的作用仍需进一步研究[34]。  在 HCV 中，Bian 等 [76] 报道了 PDS 类似物PDP（11）具有抑制 NCL 与病毒 RNA G4s 相互作用的能力。通过牵出试验和在 Huh-7.5.1 细胞中进行的免疫荧光实验证实 PDP 可竞争结合 G4s。 最近，PDS 对 ZIKV 的抗病毒作用也有报道。PDS 能够结合并稳定 3 个富含 G 的 ZIKV RNA 序列。在用最稳定的 RNA G4s 转染的 Vero 细胞中，通过免疫荧光分析发现 PDS 的加入可导致 RNA G4s信号的增强。PDS 能够降低 ZIKV 导致的细胞病变效应并降低 mRNA 合成，显示出在 ZIKV 感染治疗中的抑制作用。但也发现了 PDS 可以影响 ZIKV NS2B-NS3 蛋白酶活性，这对病毒蛋白的生产至关重要。总之，由于存在多靶点抑制作用，这些结果使 PDS 在抗 ZIKV 中具有较好的潜力。 PDS 及其衍生物 cPDS 能通过靶向 G4s 使TMPRSS2 的表达降低，从而在细胞层面抑制 SARSCoV-2假病毒的感染，同时没有明显的细胞毒性 [39]。PDS 的另一个衍生物 PDP 也被用于 SARS-CoV-2的 G4s 研究。PDP 可以稳定 SARS-CoV-2 基因组中RG-1 从而降低了 SARS-CoV-2 N 蛋白的表达 [77]。该蛋白在病毒的复制与组装中发挥着关键作用。尽管 PDS 及其衍生物在细胞短期用药中的毒性较低，该化合物是否有望被推广还需要经过生物利用度、成药性以及临床试验的检验。 1.7 其他 G4s 配体化合物 目前也有其他一些 G4s 的配体被证实可以通过靶向G4s产生抗病毒的作用，包括CX-5461（12）、CX-3543（13）、利巴韦林（ribavirin，14）以及苯并硒杂蒽类似物（化合物 15 和 16）等。  CX-5461 最初是被作为 Pol I 转录的选择性抑制剂 [78]，这种化合物能诱导衰老和自噬，最终导致癌细胞的死亡 [78-79]，后来证实 CX-5461 的抗癌活性是G4s 介导的 [8]。在近期对 HCMV 的测试中，该化合物被证实可以在人成纤维细胞中抑制 HCMV 病毒的复制和 pre-RNA 的合成。用该化合物处理 48 h 后，能显著降低病毒的复制，干扰病毒 DNA 和后期蛋白质的合成。该化合物的抗 HCMV 活性可能与激活细胞免疫反应有关，据相关报道，该化合物激活了细胞应激反应，并抑制病毒的生长 [80]。 Shen 等 [81] 开发了一系列苯并硒杂蒽衍生物，这类化合物可以稳定 G4s，并以剂量依赖的方式降低了 Calu3 细胞中 TMPRSS2 的表达和 IAV 复制。 CX-3543 是首个被用于临床试验的靶向 G4s 的小分子 [7]，最初被用于作为抗肿瘤的化合物，近期的实验表明，CX-3543 可以与包含 G4s 结构的 SARS-CoV-2 RG-1 RNA 序列结合 [82]，暗示了 CX-3543 在抗 SARS-CoV-2 中的潜力。利巴韦林是一种知名的新型冠状病毒肺炎治疗药物 [83]，具有多种作用机制，最近一项研究表明，利巴韦林能够调节 TMPRSS2 启动子上的 G4s，介导 TMPRSS2 表达的降低 [84]，说明了在病毒感染过程中病毒和宿主的G4s 都发挥了重要的作用。 Tong 等 [85] 通过药物重定位策略，从已知的 G4s配体库中筛选出 5 种用于临床研究并且无严重心肺毒性的化合物。通过分子对接，筛选了两个能够与经典 RNA G-四链体（RNA G-quadruplexes，RG4s）结构结合的 G4s 稳定剂拓扑替康（topotecan，TPT，17）和小檗胺（berbamine，BBM，18），利用微量热涌动实验，证实了 TPT 和 BBM 能够与宿主因子mRNA 的 RG4 结构稳定结合。研究团队在新型冠状病毒肺炎易感细胞 H1299 中外源性表达了 ACE2、AXL、FURIN、TMPRSS2 等多种宿主因子，发现TPT 和 BBM 显著抑制宿主因子蛋白表达；突变的RG4 结构形成关键位点能显著促进相应宿主因子蛋白表达，并导致 TPT 和 BBM 的抑制作用失效。此外，用 TPT、BBM 处理 SARS-CoV-2 易感细胞 H1299、Vero-E6 均显著下调内源性 ACE2、AXL、FURIN、TMPRSS2 等蛋白的表达。上述研究证实 TPT 和BBM 能够通过稳定 RG4 结构，抑制关键宿主因子表达，具有潜在的抵抗 SARS-CoV-2 感染的作用。研究团队利用 SARS-CoV-2 假病毒系统分别在细胞和动物水平检测了 TPT、BBM 对 SARS-CoV-2 感染的调控作用。他们发现，TPT 和 BBM 显著抑制 SARSCoV-2原始株、突变株 P.1 和突变株 B.1.617.2 感染宿主细胞，并在低浓度时表现出比 PDS（RG4 经典稳定剂）更高的病毒感染抑制效率。 2 结语与展望 近年来病毒基因组学的研究发现许多 G4s 或PQS 出现在病毒基因组的调节区，对调节病毒生命周期发挥关键作用。通过利用小分子 G4s 配体靶向病毒 G4s 或宿主 G4s 实现对病毒感染的抗性，被证明是一种新的抗病毒策略。开发抗病毒 G4s 结合剂的最艰巨的任务是赋予它们区分病毒和细胞 G4s 的能力。如上所述，目前的 G4s 配体具有共同的化学特征，它们通过与 G4s 的堆积作用识别 G4s，这种识别方法无法提升对不同 G4s 的选择性，使配体的成药性较差，也成为它们进入临床试验的障碍。基于病毒 G4s 的高分辨率结构设计新的分子可以提高选择性，由于 G4s 主要在环和沟槽区域不同，这些G4s 局部结构的表征将为设计更具选择性的配体提供基础。G4s 配体最终发挥抗病毒作用往往归因于病毒-宿主相互作用的多种机制，在具体的试验中需要在分子水平上更深层次地表征 G4s 介导的病毒机制，而这些详细机制的阐明也会有利于开发基于G4s 的抗病毒药物。以 G4s 为基础的靶向策略的另一个突出的优点是可以同时影响复制和潜伏的病毒，这种特点在针对感染的人类宿主的 HHV、 HPV 和HIV-1 等病毒中具有明显优势。总而言之，关于病毒中 G4s 的所有数据都表明，G4s 配体是控制病毒感染的一种新的方法，以 G4s 为靶标的小分子配体研究会为抗病毒药物的开发提供新的视角。 参考文献： [1]  Varshney D, Spiegel J, Zyner K, et al. 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周一例会，投资人焦虑追问：“管线何时申报美国 IND？现在的估值全靠 Global 故事支撑。” 周三研发会，老板雄心勃勃：“CDE 政策红利这么多，能不能抢个首发，先由国内现金流造血？” 这是当下许多 Biotech 企业的典型心态：“我在中国先批了，赚了钱再拿着数据去美国，岂不是美滋滋”。醒醒吧，这个逻辑在 2026 年已经行不通了。面对 FDA 对“回顾性桥接”的极度挑剔，你以为的“抢跑”，实则是在为未来的全球化埋雷。 01 “甜蜜陷阱”：政策红利下的路径依赖 必须承认，国内的政策红利极具诱惑力。突破性治疗药物（BTD）、附条件批准……只要是“全球新”且“中国首发”，CDE 的大门常开。加之近年的医保谈判规则明显向“首发创新药”倾斜——不进医保无放量，不首发无高价。 这种环境下为了抢国内速度，研发团队倾向于设计“小快灵”的临床试验——样本量刚好够、入排标准贴合中国国情、对照药选国内标准治疗。这看似高效，实则短视。 02  出海实录：遍地荆棘的三年 这套“小快灵”的数据，在 FDA 面前往往不堪一击。复盘过去三年，无论是商业化成功的“明星”，还是曾被寄予厚望的“独角兽”，在冲击 Global 市场时大多折戟沉沙。（注：以下分类基于公开监管动态，旨在探讨注册策略，不代表否定药物本身的临床价值） 第一类：CDE 批了，FDA 拒了 (数据不互认)信迪利单抗 (Sintilimab)中国状态：医保大单品，销售额数十亿。全球遭遇：2022 年 FDA ODAC 投票 14:1 拒绝批准。核心教训：单一国家数据(China-only)不被 FDA 认可，且对照药（化疗）不符合美国标准治疗（SOC）。索凡替尼 (Surufatinib)中国状态：早已获批上市。全球遭遇：2022 年收到 FDA 拒信 (CRL)。核心教训：FDA 认为不需要中国数据的“桥接”，而需要全新的美国多中心临床（MRCT）来证明在非中国人群中的疗效。罗沙司他 (Roxadustat)中国状态：全球首发(First-in-Class)，国内重磅药物。全球遭遇：2021 年 FDA 拒绝批准。核心教训：获益/风险比 (Benefit-Risk Profile)的评估标准中美差异巨大，FDA 对安全性的担忧压倒了对疗效的认可。 第二类：起了大早，赶了晚集（监管时差）特瑞普利单抗 (Toripalimab)中国状态：国内最早获批的 PD-1 之一。全球遭遇：虽然最终于 2023 年底获批 FDA，但过程经历了 CRL（完全回应函） 和漫长的现场核查（BIMO）延误。核心教训：质量管理体系(CMC/GMP)的中美双重标准对接，消耗了极其宝贵的时间窗口，错过了最佳上市时机。替雷利珠单抗 (Tislelizumab)中国状态：大适应症广泛获批。全球遭遇：因疫情和地缘政治导致FDA 现场核查无法成行，审批被无限期推迟，直到 2024 年才艰难获批部分适应症。核心教训：地缘政治风险是 Global 策略中不可控的黑天鹅。卡瑞利珠单抗 (Camrelizumab) +     阿帕替尼中国状态：肝癌一线治疗的重磅组合。全球遭遇：2024 年 5 月收到 FDA CRL。核心教训：问题出在 CMC和临床核查（BIMO）上。即使数据再好，生产环节的合规性如果不符合 cGMP，一样会被挡在门外。 第三类：主动撤回与权益退回 (知难而退)舒格利单抗 (Sugemalimab)中国状态：已获批，疗效优异。全球遭遇：2023 年合作伙伴 EQRx 将权益退回给基石药业。核心教训：EQRx 坦言，FDA 不再支持“低价+单一国家数据”的策略。商业逻辑变了，注册策略必须染随之崩塌。派安普利单抗 (Penpulimab)中国状态：已上市。全球遭遇：合作伙伴自愿撤回 FDA 的 BLA 申请。核心教训：随着 FDA 对 PD-1 审评标准的收紧，继续推进上市的投入产出比 (ROI)已经不划算。普那布林 (Plinabulin)中国状态：曾在中国和美国同步推进。全球遭遇：FDA 拒绝批准，要求做第二项确证性试验。核心教训：“单项注册临床试验” (Single Pivotal Trial)即使 P 值显著，如果缺乏稳健性，FDA 依然不买账。莫博赛替尼 (Mobocertinib)中国状态：曾获附条件批准。全球遭遇：2023/2024 年全球退市（包括中国）。核心教训：“附条件批准”不是免死金牌。如果上市后的确证性临床试验（Confirmatory Trial）失败，中美都会毫不留情地将其撤市。 03 为何“中国首发”反成出海掣肘？ 很多老板不理解：“我在中国批了，说明药是好药，为什么 FDA 还要刁难我？这难道不是双标吗？” 这还真不是简单的“双标”，而是深层的科学与伦理冲突。 1. “伦理困境”：上市即锁死 这是最致命的逻辑陷阱。CDE 的要求：为了满足中国患者急需，允许你做单臂试验或非劣效试验，快速上市。后果：一旦药物在中国上市（即中国患者可以买到了），你在中国开展任何“安慰剂对照”或 “阳性药对照（老疗法）”的MRCT就面临巨大的伦理问题。为什么？因为伦理委员会（EC）会问：“市面上已经有这款好药了，你为什么还要让中国受试者去吃安慰剂或效果更差的老药？”结局：你失去了中国这个最大的患者池，无法支持全球 MRCT 的入组，导致全球开发计划瘫痪。 2. “标准治疗（SOC）”的时空错位中国现状：在很多二三线城市，价格便宜的化疗药依然是标准治疗。CDE 允许你跟化疗比，只要赢了化疗，就算优效。美国现状：免疫治疗（IO）早已普及。FDA 的要求是：“你必须赢过现在的冠军（最好的药），而不是去赢一个 10 年前的亚军。”结局：拿着“赢了化疗”的中国数据去 FDA，FDA 根本不看，因为这在他们眼里是 “过时的数据”。 3. “单臂试验”的幻灭CDE 曾鼓励：对于二线以上治疗，单臂 Phase 2 疗效好就能附条件批准。FDA 新政 (Project Optimus)：反感单臂试验申请上市。FDA 现在要求 “随机对照”哪怕是在早期阶段，也要看剂量探索。（Guidance for Industry - Optimizing the Dosage of Human Prescription Drugs and Biological Products for the Treatment of Oncologic Diseases）结局：以前那套“做个几十例单臂数据就去美国谈 BTD”的套路，彻底失灵了。 04 破局之道：出海只有“九死一生”？ 当然不是。中国创新药其实已经摸索出了一套多元化的“通关秘籍”。 “自杀式”冲锋：康方生物 · 依沃西单抗 依沃西单抗令我震惊的不是它的分子结构，而是它的临床胆量。 回溯 2018-2020 年，PD-1 赛道已是红海，恒瑞、信达、百济、君实四小龙盘踞。绝境之下，康方生物选择了一条看似“自杀式”的突围之路——启动与 K 药（Keytruda）的头对头临床。 2024 年 WCLC 大会上，HARMONi-2 研究数据震撼全球：依沃西单抗组 PFS 达到 11.14 个月（vs K药 5.82 个月），HR 低至 0.51。 这是碾压级的数据。有了硬核数据，康方无需卑微地恳求 FDA 审评了。资本的嗅觉是最灵敏的，Summit Therapeutics 随即以 5 亿美元首付（总交易额高达 50 亿美元）获得美、欧、日等地区的权益。这证明了：唯有头对头的胜利，才是通往 Global 的入场券。“曲线救国”：百济神州 · 泽布替尼 (Brukinsa) 泽布替尼的成功同样是通过头对头临床试验（ALPINE 研究） 正面超越全球首款同类药物伊布替尼，在客观缓解率（ORR）、无进展生存期（PFS）及心脏安全性上均展现出更优表现，因此2019 年11 月获 FDA 加速批准，用于治疗既往接受过至少一项疗法的套细胞淋巴瘤（MCL）患者，成为首个完全由中国企业自主研发并在美获批上市的抗癌新药，2020 年6月获 NMPA 批准上市，2021年~2024年分别出海至加拿大、澳洲、欧盟，沙特和阿联酋等地区，截至 2025 年，泽布替尼已在超过 70 个国家和地区获批上市。 那是不是除了正面硬刚，就没有办法出海了？也不是。“借力流”：传奇生物 · 西达基奥仑赛 (Carvykti) 传奇生物的成功，是中国 Biotech（生物科技公司）与跨国药企优势互补的典型案例。其 CAR-T 疗法（Carvykti）虽拥有 97% 客观缓解率（ORR）的亮眼数据，但受限于细胞治疗领域生产、物流、商业化的高复杂度，难以独自开拓美国市场。 2017 年，传奇生物采取关键策略 —— 以3.5 亿美元首付款 + 里程碑付款的模式，将产品海外权益授权给强生（J&J）；双方分工明确，传奇生物专注技术迭代，强生负责攻克 FDA 生产核查、搭建销售网络等难题。 该合作成效显著，Carvykti 现已成为全球增长最快的 CAR-T 产品，2024 年销售额接近 10 亿美元。这一案例为细胞与基因治疗（CGT）这类重资产、重运营领域的出海提供启示：与具备生产工艺（CMC）和商业化能力的跨国药企（MNC）合作，比企业单干更具可行性。“机智流”：君实生物 · 特瑞普利单抗 (Loqtorzi) 君实生物的 PD-1 出海之路颇具波折，在PD-1大适应症（如肺癌）上，FDA已经关上了大门（参考信迪利单抗的案例）。君实怎么做？换赛道！去攻占美国人不在乎、但又无药可用的“孤儿药”市场。 鼻咽癌在美国是罕见病（每年发病率低），大药企不屑于做。但患者确实无药可用。君实生物抓住这个Unmet Need，凭借优异的临床试验数据成功获得 FDA 批准，不仅让产品拿到进入美国市场的 “入场券”，更成为中国 PD-1 药物在美上市的破冰之作，具有重要的象征意义。 当主流适应症赛道难以突破时，瞄准监管机构关注的小适应症实现 “曲线救国”，先获取国际市场准入资格，再谋求后续发展，是一种高效的出海路径。“退场流”：亘喜生物 (Gracell) 2024年初，AstraZeneca宣布以 12亿美元 全资收购亘喜生物。 这是中国Biotech历史上，第一家被MNC全资收购的案例。阿斯利康看中的不是它卖了多少药，而是它能把CAR-T制备时间缩短到一天的技术潜力——FasTCAR次日生产平台。 M&A（并购）是最高级的认可。在资本寒冬下，并不一定非要追求独立IPO。如果能被MNC整体收购，对于创始团队和投资人来说，不仅是巨大的财务成功，也是技术价值的终极变现。 05 结语：别用战术上的勤奋，掩盖战略上的懒惰 从依沃西单抗和泽布替尼的“正面硬刚”，到传奇生物的“强强联合”； 从君实生物的“巧辟蹊径” 再到亘喜生物的“华丽退场”，当中国创新药不再满足于“做中国的平替”，而是敢于“做全球的首选”时，出海的难题自会有新的解法。 在生物医药的世界里，政治或许会干扰一时，但科学与数据是永恒的硬通货。2026 年的 Biotech，最忌讳的就是：拿着中国地图，想走全球的路。