Andecaliximab

点击蓝字 关注我们 传播科学知识 促进同行交流 推动产业发展 服务国家战略  推荐语       这项研究聚焦 ALPPS 手术诱导肝再生的免疫调控机制，针对临床中晚期肝癌患者剩余肝体积不足的治疗痛点，通过单细胞 RNA 测序、空间转录组结合临床队列、动物模型及类器官实验，系统揭示了 CD177 + 中性粒细胞的核心作用。研究发现，该细胞亚群通过 CXCL8-CXCR1/2 趋化轴和 CD177-PECAM1 相互作用浸润肝脏，分泌 MMP9 介导细胞外基质重塑并释放 HGF-α，进而驱动肝细胞增殖。其创新性在于明确了中性粒细胞亚群的功能异质性，首次阐明 CD177 + 亚型的促再生分子通路，为肝再生机制提供了全新视角。该成果不仅填补了 ALPPS 相关免疫微环境研究的空白，更可为肝衰竭患者提供靶向细胞治疗或因子干预的新策略，具有重要临床转化价值。 技术路线图 科学背景与研究现状 原发性肝癌（Primary Liver Cancer）是全球范围内极具挑战性的恶性肿瘤之一，在我国更是位列第四大常见恶性肿瘤，且是第二大癌症相关死亡原因，其高发病率和死亡率对公共卫生构成了严重威胁。与此同时，肝脏作为人体重要的代谢和解毒器官，也是全身肿瘤转移的常见靶器官，约 25% 的恶性肿瘤会发生肝转移，进一步加剧了临床治疗的复杂性。对于肝癌患者而言，手术切除是目前公认的根治性治疗手段，但临床实践中面临着一个关键瓶颈：多数患者确诊时已处于晚期，其未来肝脏剩余体积（Future Liver Remnant, FLR）—— 即手术中计划保留、用于维持术后肝脏功能的肝组织部分 —— 往往不足以耐受根治性切除，强行手术极易导致术后肝衰竭（Postoperative Liver Failure），这一并发症死亡率极高，严重限制了临床治疗的有效性。此外，即使是可手术患者，术后肝脏再生能力不足也会显著增加并发症风险，影响预后，因此，寻找能够有效诱导肝脏快速、安全再生的策略，并阐明其潜在机制，成为肝癌治疗领域亟待解决的关键科学问题。 在这一背景下，联合肝脏分隔和门静脉结扎分期肝切除术（Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy, ALPPS）应运而生。该手术通过分阶段实施门静脉结扎与肝脏实质分隔，能够在 1-2 周内诱导 FLR 体积快速增长 49%-84%，使原本因 FLR 不足而无法手术的患者获得根治性切除的机会，显著降低了术后肝衰竭风险，且已有临床研究证实，ALPPS 术后患者的长期生存率显著优于经导管动脉化疗栓塞术（Transarterial Chemoembolization, TACE）等姑息性治疗手段。ALPPS 的核心优势在于其诱导肝再生的高效性，这一过程与门静脉血流重分布、血管剪切应力增加、FLR 缺氧及全身性炎症反应等一系列生理变化密切相关，这些病理生理信号共同激活了肝脏的再生级联反应。然而，尽管 ALPPS 在临床应用中取得了显著成效，但其调控肝脏免疫微环境（Hepatic Immune Microenvironment）以促进再生的具体分子机制仍未被充分阐明，这一知识缺口严重限制了对该手术的优化改良，也阻碍了开发新的肝再生促进策略以应用于更广泛的肝疾病患者。 肝再生（Liver Regeneration）是一个高度复杂、精密调控的生物学过程，涉及实质细胞（如肝细胞、胆管细胞）与非实质细胞（如肝星状细胞、内皮细胞、免疫细胞）之间的复杂相互作用，以及多种细胞因子、生长因子的协同调控。其中，免疫微环境的动态变化被认为是启动和维持肝再生的关键环节，免疫细胞及其分泌的因子通过调控细胞增殖、炎症消退、组织修复等过程，深度参与再生级联反应。肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor, HGF）和白细胞介素 - 6（Interleukin-6, IL-6）是目前公认的肝再生关键介质，HGF 能够直接促进肝细胞增殖和存活，而 IL-6 则通过激活下游信号通路启动肝细胞的分裂周期。长期以来，肝再生的机制研究主要集中在部分肝切除术（Partial Hepatectomy, PHx）模型，该模型通过切除部分肝脏组织诱导再生，其病理生理过程相对单纯，相关研究已揭示了多种细胞和分子的作用。然而，ALPPS 与部分肝切除术存在本质区别：ALPPS 不仅涉及门静脉血流的结扎，还包括肝脏实质的物理分隔，这使得 FLR 面临的血流动力学改变、炎症刺激和组织损伤更为剧烈，其免疫微环境的变化也必然更为复杂。因此，基于部分肝切除术模型获得的研究结论难以直接套用于 ALPPS，这就导致了一个重要的研究空白 —— 针对 ALPPS 诱导肝再生的特异性免疫调控机制，目前缺乏系统、深入的探索。 中性粒细胞（Neutrophil）作为先天免疫系统的核心组成部分，是机体应对损伤和炎症时最先募集到病变部位的免疫细胞，其传统认知主要集中在抗感染、清除病原体及介导炎症反应等方面。但近年来的研究逐渐揭示，中性粒细胞在组织修复和再生过程中也扮演着不可或缺的双重角色：在肝脏相关疾病如缺血再灌注损伤（Ischemia-Reperfusion Injury, IRI）、肝纤维化（Liver Fibrosis）和肝硬化（Liver Cirrhosis）中，中性粒细胞既可以通过释放活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）、中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）等介导组织损伤，也能通过分泌生长因子、调节炎症微环境等促进组织修复。在肝再生领域，已有研究表明，中性粒细胞可以通过诱导单核细胞 / 巨噬细胞向修复表型转化、促进凋亡小体的清除、分泌 HGF 等机制促进肝脏再生。然而，这些研究同样主要基于部分肝切除术模型，且存在明显的局限性：一方面，中性粒细胞具有显著的功能异质性（Functional Heterogeneity），即不同亚群在形态、表型和功能上存在差异，能够对不同微环境信号做出特异性响应，但目前对于参与肝再生的中性粒细胞具体亚群及其表型特征仍不明确；另一方面，针对 ALPPS 这种特殊手术模式下，中性粒细胞是否参与、参与的亚群类型、及其发挥作用的分子通路，均缺乏相关研究支持，这成为肝再生机制研究中的又一关键空白。 从技术层面来看，传统的 bulk RNA 测序（批量 RNA 测序）等研究方法难以解析细胞群体中的异质性，无法精准识别特定细胞亚群的功能特征；而单纯的单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）虽然能够揭示细胞亚群的转录组特征，但无法明确细胞在组织中的空间定位及其与周围细胞的相互作用，这对于理解免疫细胞在肝组织微环境中的迁移、募集和功能发挥至关重要。此前的 ALPPS 相关研究，既缺乏结合 scRNA-seq 和空间转录组学（Spatial Transcriptomics）的系统分析，也没有针对手术两个阶段（第一阶段术后与第二阶段术前）肝组织免疫微环境的动态变化进行全面解析，导致对 ALPPS 诱导肝再生过程中免疫细胞的动态分布、亚型转换及细胞间通讯机制的认识极为有限。此外，临床队列研究的缺乏也使得基础研究结果与临床实际应用之间存在脱节，难以验证研究发现的临床相关性。 除了机制研究的空白，临床应用中也存在迫切需求。尽管 ALPPS 能够有效诱导 FLR 增生，但仍有部分患者出现再生不良，最终无法接受第二阶段手术，或术后发生肝衰竭，其原因尚未明确，推测与个体免疫微环境差异及再生调控通路异常密切相关。同时，对于肝衰竭患者而言，目前缺乏有效的促进肝再生的治疗手段，临床治疗主要依赖支持治疗，预后极差。因此，阐明 ALPPS 诱导肝再生的免疫机制，尤其是关键免疫细胞亚群的作用，不仅能够填补相关领域的知识空白，还能为开发新的肝再生促进策略提供靶点，有望优化 ALPPS 手术方案、提高手术成功率，同时为肝衰竭患者提供新的治疗思路，具有重要的科学价值和临床转化意义。 综上所述，当前肝再生研究领域面临着多重挑战与空白：临床层面，ALPPS 手术的高效肝再生机制不明，限制了其进一步优化和临床应用；基础研究层面，中性粒细胞的功能异质性及其在 ALPPS 诱导肝再生中的作用尚未被揭示，且缺乏结合单细胞和空间转录组学的系统分析；技术层面，此前的研究手段难以同时解析细胞亚群特征与空间分布，无法全面阐明细胞间通讯网络。这些空白共同指向了一个关键的科学问题：ALPPS 诱导肝再生过程中，免疫微环境发生了怎样的动态变化？是否存在特定的中性粒细胞亚群主导这一再生过程？其通过何种分子机制调控肝细胞增殖和 FLR 增长？针对这些问题的探索，不仅能够填补相关领域的研究空白，深化对肝再生免疫调控网络的理解，还能为临床提供新的治疗靶点和策略，具有重要的研究必要性和实践意义，这也正是本研究开展的核心出发点。 实验技术方法 （一）三维肝脏类器官构建与功能验证技术 该研究采用基于核酸纳米结构（Nucleic Acid Nanostructure, NAC）修饰的三维肝脏类器官模型，精准模拟体内肝脏微环境，用于解析 CD177⁺中性粒细胞介导肝再生的分子机制，具体流程与检测方法如下：1. 类器官分离与构建细胞来源与筛选 ：核心细胞组分包括三类原代人肝细胞：①原代人肝细胞（Primary Human Hepatocytes, PHHs），确保肝功能核心表型；②肝血窦内皮细胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs），模拟肝脏血管屏障功能；③原代人肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs），提供细胞外基质（ECM）支持与调控信号。所有原代细胞均经流式细胞术验证纯度（PHHs 以 ALB⁺为标记，LSECs 以 PECAM1⁺为标记，HSCs 以 COL1A1⁺为标记），排除杂细胞污染。NAC 修饰与球体形成 ：采用自主设计的 NAC 材料对细胞进行表面修饰，NAC 通过特异性核酸互补配对形成稳定的纳米骨架，可增强细胞间黏附与信号传导，避免传统类器官培养中细胞离散或功能丢失问题。将三类细胞按 1:1:1 比例混合，接种于低吸附培养皿，加入含肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）及基质胶（Matrigel）的专用培养基，置于 37℃、5% CO₂培养箱中，自然聚合形成直径 50-100μm 的类器官球体。培养体系优化 ：培养基中添加胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒（ITS）、地塞米松及抗生素混合物，维持肝细胞活性与功能；每 2 天更换一次培养基，避免代谢废物积累，确保类器官连续培养 6 天以上仍保持稳定表型。2. 干预处理与检测流程实验分组设计 ：设置对照组（无中性粒细胞添加）、CD177⁺中性粒细胞处理组、CD177⁺中性粒细胞 + 抑制剂组（MMP9 抑制剂 Andecaliximab 或 CD177 中和抗体），每组设置 6 个复孔，确保实验重复性。干预试剂与时间节点 ：①CD177⁺中性粒细胞：从 ALPPS 患者外周血中通过磁珠分选（CD177⁺磁珠试剂盒）获得，纯度≥95%，于培养第 0 天和第 2 天分别加入 5000 个 / 孔，模拟体内中性粒细胞浸润过程；②Andecaliximab（抗 MMP9 单克隆抗体）：浓度为 10μg/mL 或 50μg/mL，于培养第 - 1 天（预处理）、0 天、2 天、4 天加入，特异性阻断 MMP9 活性；③抗 CD177 中和抗体：浓度为 10μg/mL，给药时间同 Andecaliximab，阻断 CD177-PECAM1 相互作用。多维度检测指标与方法 ： 形态学分析：第 3 天和第 6 天收集类器官，4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行 H&E 染色，通过 ImageJ 软件定量分析最大横截面积，评估类器官增殖能力； 功能活性检测：第 6 天采用 ATP 检测试剂盒（Luciferase 法）测定类器官 ATP 水平，反映肝细胞代谢活性，试剂盒中荧光素酶与 ATP 特异性结合产生荧光，荧光强度与 ATP 浓度呈正相关； 蛋白表达定位：第 3 天进行多重免疫荧光染色，一抗包括 CD66b（中性粒细胞标记）、MMP9（基质金属蛋白酶 9）、HGF（肝细胞生长因子），二抗为荧光素偶联抗体（FITC/TRITC/Cy5），通过激光共聚焦显微镜观察中性粒细胞浸润、MMP9 分泌及 HGF 分布； 分子分泌检测：收集第 3 天培养上清，采用 ELISA 试剂盒检测 HGF 浓度，同时通过羟脯氨酸（Hydroxyproline, HYP）检测试剂盒测定 HYP 含量（反映胶原蛋白水解程度）； ECM 成分分析：第 3 天裂解类器官，采用 BCA 法测定总蛋白浓度，通过可溶性胶原蛋白检测试剂盒（Sircol 法）定量可溶性胶原蛋白含量，评估 ECM 重塑程度。（二）其他核心实验技术（按重要性排序）1. 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术技术流程 ：①样本制备：收集 ALPPS 患者第一阶段术前、术后的 FLR 组织，采用胶原酶 Ⅳ 消化法制备单细胞悬液，通过 40μm 细胞筛过滤去除组织碎片，台盼蓝染色验证细胞活性≥85%；②文库构建：使用 10x Genomics Chromium 平台，将单细胞悬液与凝胶珠、逆转录试剂混合形成油包水微滴，进行逆转录合成 cDNA，随后进行 cDNA 扩增、片段化、接头连接及测序文库构建；③测序与分析：采用 Illumina NovaSeq 6000 测序平台，测序深度为每个细胞 50,000-100,000 reads，原始数据经 Cell Ranger 软件过滤、比对（参考基因组为 hg38），获得高质量单细胞转录组数据；通过 Seurat 软件进行无监督聚类分析、差异基因表达分析及细胞类型注释，使用 Monocle 软件进行拟时序轨迹分析，解析中性粒细胞亚群分化路径。关键试剂与目的 ：胶原酶 Ⅳ（浓度 1mg/mL）用于温和消化肝组织，避免细胞损伤；10x Genomics 凝胶珠含独特的细胞条形码（Cell Barcode），可区分不同细胞的 cDNA；拟时序分析旨在明确 CD177⁺中性粒细胞的分化状态（祖细胞样或成熟表型）。科普知识 ：scRNA-seq 技术打破了传统批量测序（bulk RNA-seq）无法区分细胞异质性的局限，通过对单个细胞的转录组进行测序，能够精准识别组织中的稀有细胞亚群（如 CD177⁺中性粒细胞），并揭示不同细胞亚群的基因表达特征，是解析复杂组织微环境中细胞功能异质性的核心工具。2. 空间转录组学（Stereo-seq，SpaTial Enhanced REsolution Omics-sequencing）技术技术流程 ：①样本处理：收集 ALPPS 患者 FLR 组织，快速冷冻后制备 10μm 厚的冰冻切片，贴附于含空间条形码（Spatial Barcode）的 Stereo-seq 芯片上；②原位逆转录：芯片上的空间条形码与组织切片中 RNA 结合，进行原位逆转录合成 cDNA，随后进行 cDNA 扩增、文库构建；③测序与空间定位：通过 Illumina 测序平台获得基因表达数据，结合芯片上空间条形码的位置信息，利用 Stereo-seq 数据分析软件将基因表达信号映射回组织切片的原始位置，生成空间转录组图谱；④共定位分析：将 scRNA-seq 鉴定的细胞亚群（如 CD177⁺中性粒细胞、CXCL8⁺肝星状细胞）与空间转录组数据整合，分析细胞亚群在组织中的空间分布及相互作用。关键试剂与目的 ：冰冻切片需在 - 80℃快速冷冻，避免 RNA 降解；Stereo-seq 芯片的空间条形码可精确定位每个 RNA 分子在组织中的位置（分辨率达 500nm）；共定位分析旨在验证 CD177⁺中性粒细胞与内皮细胞、肝星状细胞的近距离相互作用，为细胞间通讯机制提供空间证据。科普知识 ：空间转录组学弥补了 scRNA-seq 无法获取细胞空间位置信息的缺陷，通过将基因表达数据与组织形态学结合，能够直观呈现不同细胞亚群在组织中的分布规律及相互作用关系，相当于为细胞绘制 “组织定位地图”，帮助研究者理解细胞功能与微环境的关联性。3. CRISPR/Cas9 介导的 Cd177 基因敲除小鼠模型构建技术技术流程 ：①靶点设计：针对小鼠 Cd177 基因的外显子 3-17 设计 2 条特异性单引导 RNA（sgRNA），sgRNA 序列通过 NCBI 基因数据库（Gene ID: 100044253）验证，确保靶向特异性；②载体构建：将 sgRNA 克隆至 pX330 载体（含 Cas9 蛋白编码基因），通过测序验证载体构建正确性；③胚胎注射：收集 C57BL/6 小鼠的受精卵，采用显微注射技术将 pX330-sgRNA 载体（浓度 50ng/μL）注入受精卵细胞质中，随后将注射后的受精卵移植至假孕母鼠的输卵管内；④阳性小鼠筛选：子代小鼠出生后，提取尾尖组织基因组 DNA，采用 PCR 扩增 Cd177 基因的靶区域，通过 Sanger 测序验证基因敲除效率（外显子 3-17 缺失），获得纯合子 Cd177⁻/⁻小鼠；⑤模型验证：通过流式细胞术检测 Cd177⁻/⁻小鼠外周血中 CD177⁺中性粒细胞的比例（应为 0），确认基因敲除成功。关键试剂与目的 ：pX330 载体同时表达 Cas9 蛋白和 sgRNA，Cas9 蛋白为核酸内切酶，可在 sgRNA 引导下切割 Cd177 基因的靶区域，导致基因片段缺失；假孕母鼠需经激素处理同步发情周期，确保受精卵着床成功；纯合子小鼠用于验证 Cd177 基因缺失对肝再生的影响。科普知识 ：CRISPR/Cas9 技术是目前最常用的基因编辑技术，其原理模拟细菌的免疫系统，sgRNA 识别靶基因序列，Cas9 蛋白切割 DNA 双链，引发 DNA 修复机制（非同源末端连接或同源重组），从而实现基因敲除、插入或突变，该技术具有高效、精准、操作简便的特点，是构建基因缺陷动物模型的核心工具。4. 体内中性粒细胞耗竭与细胞输注功能验证技术技术流程（中性粒细胞耗竭） ：①动物模型：C57BL/6 小鼠构建 10% FLR 的 ALPPS 模型（模拟临床肝再生负荷）；②耗竭处理：术前 1 天、术中及术后每日通过尾静脉注射抗 Ly6G 抗体（50μg / 只，术前；100μg/25g 体重，术后），对照组注射同型对照抗体（rat IgG2a）；③检测指标：术后第 3 天收集 FLR 组织，通过免疫组化（Ly6G 染色）检测中性粒细胞浸润情况，Ki67 染色评估肝细胞增殖率；术后第 7 天计算 FLR / 体重比，评估肝再生效率；通过 ELISA 检测 FLR 组织中 MMP9 和 HGF 的浓度。技术流程（CD177⁺中性粒细胞输注） ：①细胞制备：从野生型小鼠外周血中磁珠分选 CD177⁺中性粒细胞（纯度≥90%）；②输注处理：Cd177⁻/⁻小鼠构建 ALPPS 模型后，术中及术后每日通过尾静脉输注 CD177⁺中性粒细胞（1×10⁵个 / 25g 体重）；③检测指标：同中性粒细胞耗竭实验，验证 CD177⁺中性粒细胞对 Cd177⁻/⁻小鼠肝再生的挽救作用。关键试剂与目的 ：抗 Ly6G 抗体（克隆号 1A8）特异性识别小鼠中性粒细胞表面的 Ly6G 抗原，可高效耗竭中性粒细胞（耗竭效率≥90%）；磁珠分选试剂盒（CD177⁺磁珠）用于获取高纯度的 CD177⁺中性粒细胞，避免其他细胞干扰；细胞输注实验旨在直接验证 CD177⁺中性粒细胞的促肝再生功能。5. 临床队列验证技术（流式细胞术、免疫组化、免疫荧光）技术流程 ：①临床样本收集：纳入 75 例 ALPPS 患者，收集第一阶段术前、术后的外周血样本（450 份）和 FLR 组织样本（150 份 FFPE 组织块）；②流式细胞术：外周血经红细胞裂解液处理后，加入荧光标记抗体（CD177-PE、Ly6G-FITC、CD45-APC），通过流式细胞仪检测中性粒细胞及 CD177⁺中性粒细胞的比例变化；③免疫组化（IHC）：FFPE 组织切片经脱蜡、抗原修复（柠檬酸盐缓冲液，pH6.0）后，加入一抗（MPO、MMP9、Ki67），孵育后加入二抗（HRP 标记），DAB 显色，苏木素复染，定量分析阳性细胞数（每高倍视野，HPF）；④免疫荧光（IF）：FFPE 组织切片经脱蜡、抗原修复后，加入一抗（MPO、MMP9、CD177、CD31），孵育后加入荧光素偶联二抗，DAPI 染核，激光共聚焦显微镜观察并定量分析 CD177⁺MMP9⁺细胞的浸润情况。关键试剂与目的 ：红细胞裂解液（NH₄Cl 缓冲液）用于去除外周血中红细胞，避免干扰免疫细胞检测；抗原修复采用柠檬酸盐缓冲液（95℃加热 20 分钟），旨在恢复 FFPE 组织中抗原的免疫活性；MPO（髓过氧化物酶）为中性粒细胞特异性标记物，用于验证中性粒细胞浸润。注意事项 ：流式细胞术检测需在样本采集后 24 小时内完成，避免细胞活性下降；IHC 染色的 DAB 显色时间需严格控制（3-5 分钟），避免非特异性染色。总结 该研究整合了类器官模型、单细胞与空间转录组学、基因编辑动物模型及临床队列验证等多维度技术，其中三维肝脏类器官模型通过模拟体内微环境，为解析 MMP9-ECM-HGF-α 轴的分子机制提供了体外验证体系；scRNA-seq 与 Stereo-seq 技术的结合实现了 “细胞亚群识别 - 空间定位 - 功能解析” 的闭环；CRISPR/Cas9 基因敲除与体内功能验证则直接证实了 CD177⁺中性粒细胞的核心作用，各项技术相互补充，为研究结论提供了坚实的实验支撑。 关键结果图表 一、研究问题、猜想与研究思路 研究问题：联合肝脏分隔和门静脉结扎分期肝切除术（ALPPS）可高效诱导未来肝脏剩余体积（FLR）快速增生，但调控该过程的免疫微环境变化及关键免疫细胞亚群的作用机制尚未明确，中性粒细胞的功能异质性及其在 ALPPS 诱导肝再生中的具体作用亟待解析。猜想：ALPPS 术后肝组织中存在特定中性粒细胞亚群，通过分泌关键分子调控细胞外基质（ECM）重塑与肝细胞生长因子 α（HGF-α）释放，进而驱动肝再生，且该亚群的募集与功能发挥依赖特定细胞间信号通路。研究思路：采用 “临床队列 - 单细胞多组学 - 体外类器官 - 体内动物模型” 的多维度验证体系，首先通过单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和空间转录组学（Stereo-seq）解析 ALPPS 患者 FLR 组织的免疫细胞亚群特征；随后利用三维肝脏类器官模型验证关键细胞亚群的功能及分子机制；再通过基因敲除小鼠、中性粒细胞耗竭与输注实验进行体内功能确认；最后结合临床队列样本的流式细胞术、免疫组化等技术验证研究发现的临床相关性，形成 “发现 - 验证 - 机制 - 临床转化” 的完整研究链条。二、核心研究结果详细阐述（一）scRNA-seq 与空间转录组学揭示 ALPPS 术后中性粒细胞显著浸润且存在功能异质性 研究对 3 例 ALPPS 患者术前、术后的 FLR 组织进行 scRNA-seq 分析，共获得 24647 个高质量细胞，鉴定出 9 类细胞类型，其中中性粒细胞在术后免疫细胞亚群中扩张最为显著（图 1D）。如图 1E 所示，中性粒细胞在髓系细胞中的占比从术前的 44.4% 升至术后的 71.1%（p<0.01），免疫组化（MPO 染色）和外周血血常规分析进一步验证了这一发现，术后 1 天中性粒细胞与白细胞比值从 60.4% 升至 83.5%（图 1F-G）。对中性粒细胞进行亚群聚类分析，鉴定出 4 个功能亚型（G4、G5b、G5c、G5b_c），其中G4 亚型（CD177⁺中性粒细胞）在术后显著富集，占髓系细胞比例从 11.5% 升至 19.3%（p<0.01）（图 3C），且该亚群高表达基质金属蛋白酶 9（MMP9）、S100A12 等促再生分子，代谢活性增强（糖酵解、脂肪酸合成等通路富集），并具有增强的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成能力（图 3F-G）。空间转录组学（Stereo-seq）结果显示，CD177⁺中性粒细胞主要富集于内皮细胞周围，25μm 直径范围内的共定位比例达 0.27%，显著高于其他中性粒细胞亚型（图 5K-M），提示其可能通过与内皮细胞相互作用参与肝再生。（二）三维肝脏类器官验证 CD177⁺中性粒细胞通过 MMP9 介导 ECM 重塑与 HGF-α 释放促进肝再生 基于核酸纳米结构（NAC）修饰的三维肝脏类器官（含原代人肝细胞、肝血窦内皮细胞、肝星状细胞）实验显示，添加 CD177⁺中性粒细胞后，类器官的最大横截面积从 7177.8μm² 增至 11098.3μm²（p<0.01），ATP 水平显著升高（p<0.05）（图 4G-H），表明其可促进类器官增殖与代谢活性。进一步机制验证发现，CD177⁺中性粒细胞分泌的 MMP9 是核心功能分子：ELISA 检测显示，CD177⁺中性粒细胞分泌的 MMP9 水平显著高于 CD177⁻中性粒细胞（图 4C）；使用 MMP9 抑制剂 Andecaliximab 处理后，类器官的胶原蛋白水解（羟脯氨酸含量）、HGF-α 释放及细胞增殖均被显著抑制（图 5C-E），且这一效应可通过外源性 HGF-α 补充得以挽救（图 5F-H）。上述结果证实，CD177⁺中性粒细胞通过分泌 MMP9 促进 ECM 降解与 HGF-α 释放，进而驱动肝细胞增殖，这一机制在体外类器官模型中得到明确验证。（三）体内动物实验证实 CD177⁺中性粒细胞是 ALPPS 诱导肝再生的关键驱动因素 在 10% FLR 的 ALPPS 小鼠模型中，流式细胞术检测显示，术后 2 天中性粒细胞占免疫细胞比例从 1.4% 升至 7.3%（p<0.001），其中 CD177⁺中性粒细胞占比达 62.7%（图 2E-F）。中性粒细胞耗竭实验（抗 Ly6G 抗体处理）显示，耗竭组 7 天生存率从 87.1% 降至 57.2%（p<0.01），术后 3 天肝细胞 Ki67⁺增殖率从 71.4% 降至 13.4%（p<0.001），FLR / 体重比显著降低（图 2H-J）。CRISPR/Cas9 介导的 Cd177 敲除小鼠实验进一步证实，Cd177⁻/⁻小鼠术后 3 天肝细胞增殖率从 81.6% 降至 32.4%（p<0.001），FLR / 体重比从 2.2% 降至 1.6%（p<0.01）（图 7K-L），而输注 CD177⁺中性粒细胞可显著挽救这一表型，使 FLR / 体重比恢复至 2.0%（p<0.05），MMP9 分泌与 HGF-α 释放也同步恢复（图 7J、7L）。此外，MMP9 抑制剂（MMP9-IN-1）处理可模拟中性粒细胞耗竭的表型，显著降低肝细胞增殖率与 FLR 增长（图 4J-K），直接证实 CD177⁺中性粒细胞通过 MMP9-HGF-α 轴调控肝再生。（四）CD177⁺中性粒细胞的肝脏募集依赖 CD177-PECAM1 相互作用与 CXCL8-CXCR1/2 趋化轴 CellPhoneDB 分析显示，CD177⁺中性粒细胞与内皮细胞间存在 61 种显著配体 - 受体相互作用，其中 CD177 与 PECAM1（CD31）的相互作用最为显著（图 5I）。Transwell 实验证实，CXCL8（肝星状细胞分泌）可促进 CD177⁺中性粒细胞穿过肝血窦内皮细胞迁移（p<0.001），而阻断 CD177 或 PECAM1 可显著抑制该迁移过程（p<0.001），联合阻断效果更显著（图 5J）。空间转录组学与免疫荧光共定位分析显示，CD177⁺中性粒细胞与 CXCL8⁺肝星状细胞（C3 亚群）、PECAM1⁺内皮细胞呈近距离分布（图 6G-H、图 7M），提示这两条通路协同调控 CD177⁺中性粒细胞的肝脏浸润。临床样本验证显示，ALPPS 术后 FLR 组织中 CXCL8 表达水平显著升高，CD177⁺CD66B⁺中性粒细胞在 endothelial 细胞周围的富集程度显著高于术前（图 7N），证实 CD177-PECAM1 相互作用与 CXCL8-CXCR1/2 趋化轴共同介导了 CD177⁺中性粒细胞的肝脏募集。（五）临床队列验证 CD177⁺MMP9⁺中性粒细胞浸润与肝再生效率正相关 对 75 例 ALPPS 患者的 150 份 FLR 组织样本进行免疫荧光染色，结果显示，术后 CD177⁺MMP9⁺双阳性细胞浸润量较术前增加 66.4%（p<0.001）（图 3H），且该细胞数量与 FLR 体积增长百分比呈正相关（r=0.62，p<0.001）。外周血流式细胞术分析显示，术后 CD177⁺中性粒细胞占比与 FLR 增生速率显著相关（p<0.01），提示 CD177⁺中性粒细胞可作为评估 ALPPS 术后肝再生效率的潜在生物标志物。三、总结与结论 本研究通过多维度实验体系，明确了CD177⁺中性粒细胞是 ALPPS 诱导肝再生的核心驱动亚群，其作用机制为：肝星状细胞分泌的 CXCL8 通过 CXCR1/2 轴趋化 CD177⁺中性粒细胞，后者通过 CD177-PECAM1 相互作用与内皮细胞结合并浸润肝脏；随后 CD177⁺中性粒细胞分泌 MMP9，介导 ECM 降解与胶原蛋白水解，释放被 ECM 结合的 HGF-α；游离的 HGF-α 进一步促进肝细胞增殖，最终实现 FLR 快速增生（图 8）。这一发现首次揭示了中性粒细胞亚群的功能异质性在 ALPPS 肝再生中的关键作用，填补了 ALPPS 相关免疫微环境研究的空白，明确了 CD177⁺中性粒细胞及 MMP9-HGF-α 轴作为肝再生调控靶点的潜在价值，为优化 ALPPS 手术方案、开发肝衰竭治疗新策略提供了坚实的实验依据。四、新延伸问题与下一步实验方向 基于本研究结果，仍存在若干值得深入探索的问题：一是 CD177⁺中性粒细胞的 “促炎 - 促再生” 表型转换机制尚未完全阐明，其在肝再生不同阶段（早期炎症期、增殖期、修复期）的功能变化及调控信号需进一步解析；二是临床中部分患者 ALPPS 术后肝再生不良是否与 CD177⁺中性粒细胞浸润不足或功能异常相关，需扩大临床队列进行验证；三是 CD177⁺中性粒细胞输注或 MMP9/HGF-α 靶向治疗的临床转化可行性，需开展大动物模型实验评估其安全性与有效性；四是不同肝疾病背景（如肝硬化、脂肪肝）下，CD177⁺中性粒细胞的功能是否存在差异，其调控机制是否具有通用性。下一步实验可围绕上述问题，结合单细胞染色质可及性测序、蛋白质组学及临床多中心队列研究，进一步完善 CD177⁺中性粒细胞介导肝再生的调控网络，推动相关研究成果向临床转化。 图 1 ALPPS 患者肝再生前后未来肝脏剩余组织（FLR）的单细胞转录组分析 (A) 研究设计概述。(B) 基于 ALPPS 患者 FLR 组织单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据的 t 分布随机邻域嵌入（t-SNE）图，显示细胞聚类及细胞类型注释（发现队列）。(C) 气泡图展示各鉴定细胞类型中经典标记基因的表达水平及表达细胞比例。(D) 柱状图显示两阶段 FLR 组织样本中各细胞类型的标准化占比。(E) 箱线图展示两阶段 FLR 样本髓系细胞中中性粒细胞的数量。(F) 验证队列 1（n=150）中两阶段 FLR 组织髓过氧化物酶（MPO）免疫组化（IHC）染色代表性图像及定量分析（放大倍数：400×）。(G) 验证队列 1（n=75，分组）中 ALPPS 第一阶段术后外周血中性粒细胞绝对计数及中性粒细胞与白细胞（WBC）比值的时间变化。**p<0.01，***p<0.001。缩写说明：ALPPS，联合肝脏分隔和门静脉结扎分期肝切除术；DL，去门静脉供血肝叶；FLR，未来肝脏剩余体积；HGF-α，肝细胞生长因子 α；HSC，肝星状细胞；IF，免疫荧光；IHC，免疫组化；LML，左中叶；MMP9，基质金属蛋白酶 9；MPO，髓过氧化物酶；POD，术后天数；scRNA-seq，单细胞 RNA 测序；t-SNE，t 分布随机邻域嵌入；WBC，白细胞。 图 2 小鼠 ALPPS（10% FLR）模型中中性粒细胞动态变化促进体内 ALPPS 诱导的肝再生 (A) 小鼠 ALPPS（10% FLR）模型构建示意图。(B–D) 不同术后天数（POD）的肝脏大体图像代表性图（B）、FLR 与体重（BW）比值变化折线图（C）及 Ki67⁺肝细胞比例箱线图（D）。* 和 #分别代表假手术组与 10% ALPPS 组的统计分析结果。(E–F) 小鼠 ALPPS 模型中（每组 n=5）不同 POD（0、2、3、4 天）FLR 中总中性粒细胞及 CD177⁺中性粒细胞的代表性流式细胞术图（E）及定量分析（F）。(G) 采用抗 Ly6G 抗体或同型对照抗体（大鼠 IgG2a）在小鼠 ALPPS 模型中进行中性粒细胞耗竭的实验设计。(H) 中性粒细胞耗竭组（n=29）与对照组（n=26）ALPPS 术后 7 天 Kaplan-Meier 生存曲线比较。(I) 中性粒细胞耗竭对 FLR 再生影响的代表性 HE 染色、Ly6G 及 Ki67 免疫组化染色图像，以及肝脏大体图像。(J) 抗 Ly6G 抗体处理后，POD3 FLR 组织中每高倍视野（HPF，400×）Ly6G⁺细胞数及 Ki67⁺肝细胞比例的箱线图。(K) 中性粒细胞耗竭组与对照组小鼠 POD7 FLR 与体重比值的箱线图。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；#p<0.05，###p<0.001。缩写说明：ALPPS，联合肝脏分隔和门静脉结扎分期肝切除术；BW，体重；CL，尾状叶；FLR，未来肝脏剩余体积；HPF，高倍视野；IHC，免疫组化；ivt，血管内输注；LLL，左外侧叶；LML，左中叶；POD，术后天数；RL，右叶；RML，右中叶；SSC-A，侧向散射面积。 图 3 ALPPS 患者 FLR 组织中中性粒细胞亚型及功能特征 (A) 基于 scRNA-seq 数据的 t-SNE 图，展示中性粒细胞聚类、亚型注释及两阶段间的动态分布。(B) 气泡图展示 FLR 中鉴定的中性粒细胞亚型间标记基因的表达水平及表达频率。(C) 两阶段 ALPPS 髓系细胞中中性粒细胞亚型数量的箱线图。(D) 密度图（左）及拟时序轨迹分析（右），展示 FLR 组织中中性粒细胞亚型的分化状态。(E) 基于 scRNA-seq 数据的火山图，展示 G4 中性粒细胞与其他中性粒细胞亚型间的差异表达基因；红色和绿色圆点分别代表在 G4 中性粒细胞和其他亚型中显著上调的基因。(F–G) 热图展示各中性粒细胞亚型中高表达基因相关的代谢通路（F）及再生与信号通路（G）的富集情况。(H) 验证队列 1（n=75，配对）中两阶段 FLR 组织每高倍视野 MPO 和 MMP9 阳性细胞的代表性 IF 染色图像（400×）及定量分析。**p<0.01，***p<0.001。缩写说明：ALPPS，联合肝脏分隔和门静脉结扎分期肝切除术；DAPI，4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚；FLR，未来肝脏剩余体积；HPF，高倍视野；IF，免疫荧光；MMP9，基质金属蛋白酶 9；MPO，髓过氧化物酶；scRNA-seq，单细胞 RNA 测序；t-SNE，t 分布随机邻域嵌入；VEGF，血管内皮生长因子。 图 4 G4 中性粒细胞高表达 MMP9 并促进 ALPPS 诱导的肝再生 (A–B) 基于 ALPPS 患者 scRNA-seq 数据的气泡图，分别展示各中性粒细胞亚型中高表达的分泌蛋白（A）及特异性基质金属蛋白酶（MMP）家族蛋白（B）。(C) ALPPS 患者（n=3，第二阶段）血液及 FLR 组织中 CD177⁻和 CD177⁺中性粒细胞 MMP9 分泌水平的 ELISA 检测结果。(D) 三维肝脏类器官构建及 MMP9 阻断实验流程示意图。(E) 补充中性粒细胞（约 5000 个细胞）及不同浓度 Andecaliximab（0、10 或 50 μg/mL）处理后，3 天和 6 天三维类器官最大横截面的代表性 HE 染色图像。(F) 补充中性粒细胞及 10 μg/mL Andecaliximab 处理后 3 天，三维类器官中 DAPI、CD66b、MMP9、HGF 的多重 IF 染色图像，显示 MMP9⁺中性粒细胞浸润及 HGF 表达。(G–H) 6 天三维类器官最大横截面积（G）及 ATP 水平（H）的柱状图。(I) 小鼠 ALPPS 模型中采用 MMP9 抑制剂（MMP9-IN-1，0.125 mg/25 g 体重）与溶媒对照进行体内 MMP9 抑制的实验设计。(J) MMP9-IN-1 处理后，小鼠 POD3 FLR 代表性 HE 及 Ki67 免疫组化染色图像，以及 POD3 和 POD7 肝脏大体图像。(K–M) 小鼠 ALPPS 模型中 MMP9-IN-1 处理后，POD3 FLR Ki67⁺肝细胞比例箱线图（K）、POD3 和 POD7 FLR 与体重比值折线图（L）及 POD3 FLR 组织 HGF 浓度柱状图（M）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。缩写说明：ALPPS，联合肝脏分隔和门静脉结扎分期肝切除术；BW，体重；DAPI，4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚；DMSO，二甲基亚砜；FLR，未来肝脏剩余体积；HGF，肝细胞生长因子；IF，免疫荧光；IHC，免疫组化；i.v.，静脉内；ivt，血管内输注；MMP，基质金属蛋白酶；POD，术后天数；scRNA-seq，单细胞 RNA 测序。 图 5 ALPPS 诱导肝再生过程中 MMP9 介导的 ECM 降解促进 FLR 中 HGF-α 释放 (A) 10% FLR 小鼠 ALPPS 模型中，采用抗 Ly6G 抗体或同型对照进行中性粒细胞耗竭后，POD3 FLR 组织 HGF 浓度的柱状图。(B) 抗 Ly6G 处理与未处理的 10% FLR 小鼠 ALPPS 模型 POD3 FLR 组织中，不同亚细胞组分（细胞质、细胞核、ECM、细胞膜）HGF-α 表达的 Western blot 分析。(C) 三维肝脏类器官 MMP9 阻断实验设计示意图。(D–E) 补充中性粒细胞及 Andecaliximab（50 μg/mL）处理后 3 天，肝脏类器官培养上清中羟脯氨酸（HYP）浓度（D）及类器官中 HGF-α 免疫组化表达面积百分比（E）的柱状图。(F) 小鼠 ALPPS 模型中抗 Ly6G 中性粒细胞耗竭联合 HGF-α 挽救实验的示意图。(G) 抗 Ly6G 中性粒细胞耗竭联合 HGF-α 挽救后，小鼠 POD3 FLR Ki67⁺肝细胞比例的箱线图。(H) MMP9 抑制联合 HGF-α 挽救后，小鼠 POD3 FLR Ki67⁺肝细胞比例的箱线图。(I) 基于 scRNA-seq 数据的 CellPhoneDB 分析，展示中性粒细胞亚型与内皮细胞间显著的配体 - 受体相互作用气泡图。(J) 左：中性粒细胞迁移实验示意图；右：CXCL8（400 ng/mL）刺激下，加入或不加入抗 CD177（20 μg/mL）或抗 CD31（20 μg/mL）抗体阻断时，迁移至下室的 CD177⁺中性粒细胞比例柱状图。(K) 基于 Stereo-seq 数据的细胞邻域分析示意图。(L) 验证队列 3 中两阶段（如 AP3-1、AP3-2，配对）ALPPS 患者 FLR 组织中中性粒细胞亚型与内皮细胞的空间转录组定位图。(M) 验证队列 3 中两对 ALPPS 患者两阶段 FLR 组织中，中性粒细胞亚型与内皮细胞不同距离下的细胞邻域分析折线图。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。缩写说明：ALPPS，联合肝脏分隔和门静脉结扎分期肝切除术；ECM，细胞外基质；FLR，未来肝脏剩余体积；HGF-α，肝细胞生长因子 α；HYP，羟脯氨酸；IHC，免疫组化；ivt，血管内输注；MMP9，基质金属蛋白酶 9；POD，术后天数；scRNA-seq，单细胞 RNA 测序；Stereo-seq，空间增强分辨率组学测序；WT，野生型。 图 6 ALPPS 期间肝星状细胞（HSCs）分泌的 CXCL8 通过 CXCL8–CXCR1/2 轴介导中性粒细胞募集 (A) 基于 QuSAGE 分析的肝脏驻留细胞免疫细胞迁移相关基因集活性气泡图。(B) 基于 scRNA-seq 数据的气泡图，展示第二阶段肝脏驻留细胞与中性粒细胞亚型间显著的配体 - 受体相互作用。(C) 气泡图展示 scRNA-seq 数据中两阶段 FLR 样本关键趋化因子的表达水平。(D) 小提琴图展示两阶段 FLR 组织主要细胞类型中 CXCL8 的表达水平。(E) 左：中性粒细胞迁移 Transwell 趋化实验示意图；右：CXCL1（300 ng/mL）或 CXCL8（100 ng/mL）刺激下，加入或不加入 CXCR1 抑制剂（1 μM）或 CXCR2 抑制剂（400 nM）时，迁移至下室的 CD177⁺中性粒细胞比例柱状图。(F) UMAP 图展示 HSC 亚型聚类及各亚群中 CXCL8 的表达水平。(G) 某 ALPPS 患者两阶段（如 AP3-1、AP3-2，配对）FLR 组织中中性粒细胞亚型与 CXCL8⁺ HSC 亚群（C3）的空间转录组定位图。(H) 验证队列 3 中两对 ALPPS 患者 FLR 组织中，中性粒细胞亚型与 C3 HSC 亚型不同距离下的空间邻域分析折线图。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。缩写说明：ALPPS，联合肝脏分隔和门静脉结扎分期肝切除术；FDR，假发现率；FLR，未来肝脏剩余体积；HSC，肝星状细胞；NK，自然杀伤细胞；QuSAGE，基因表达定量集合分析；scRNA-seq，单细胞 RNA 测序；Stereo-seq，空间增强分辨率组学测序；UMAP，均匀流形近似和投影 图 7 CD177 在 ALPPS 诱导肝再生中作用的验证 (A) 三维肝脏类器官构建及抗 CD177 抗体干预实验示意图。(B–E) 补充中性粒细胞（约 5000 个细胞）及抗 CD177 抗体（10 μg/mL）处理后，POD3 肝脏类器官培养上清中 HYP 水平（B）、裂解液中总胶原蛋白含量（C）、上清中 HGF 浓度（D）及 HGF-α 免疫组化表达面积百分比（E）的柱状图。(F–G) CD177 阻断后，POD6 三维肝脏类器官 ATP 产量（F）及最大横截面积（G）的柱状图。(H) 基于 CRISPR/Cas9 技术在 C57BL/6 背景小鼠中构建 Cd177 基因敲除（Cd177⁻/⁻）小鼠的策略示意图。(I) WT 小鼠、Cd177⁻/⁻小鼠及经尾静脉输注 CD177⁺中性粒细胞的 Cd177⁻/⁻小鼠 ALPPS（10% FLR）模型构建示意图。(J) WT 小鼠、Cd177⁻/⁻小鼠及输注 CD177⁺中性粒细胞的 Cd177⁻/⁻小鼠 POD3 FLR 代表性 HE、MMP9 及 Ki67 免疫组化染色图像，以及 POD3 和 POD7 肝脏大体图像。(K–L) 上述三组小鼠 ALPPS 模型 POD3 FLR Ki67⁺肝细胞比例（K）及 POD7 FLR 与体重比值（L）的箱线图。(M) 人类第二阶段 FLR 组织多重 IF 染色（DAPI、ARG1、CD31、CD66b、CD177、MMP9）图像，显示 CD177⁺中性粒细胞浸润至肝血窦；空间定位将 CD177⁺中性粒细胞分为距 CD31⁺内皮细胞近端（<100 μm，红色）和远端（>100 μm，酸橙绿）两类。(N) 左：验证队列 1（n=75，配对）FLR 组织中每高倍视野（400×）CD177⁺CD66b⁺中性粒细胞数量的箱线图；右：验证队列 1 中 FLR 组织中 CD177⁺CD66b⁺中性粒细胞与内皮细胞不同距离下的细胞邻域分析折线图。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。缩写说明：ALPPS，联合肝脏分隔和门静脉结扎分期肝切除术；BW，体重；DAPI，4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚；FFPE，福尔马林固定石蜡包埋；FLR，未来肝脏剩余体积；HGF-α，肝细胞生长因子 α；HPF，高倍视野；HYP，羟脯氨酸；IF，免疫荧光；IHC，免疫组化；ivt，血管内输注；MMP9，基质金属蛋白酶 9；POD，术后天数；sgRNA，单引导 RNA；WT，野生型。 特色与创新之处 1. 技术方法的整合创新：首次实现 ALPPS 肝再生的多维度转录组解析 该研究创新性地将单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）与空间转录组（Stereo-seq）技术相结合，针对 ALPPS 手术 1 期和 2 期的肝残余组织（FLR）进行系统分析，填补了该领域缺乏 “单细胞分辨率 + 空间定位” 综合研究的空白。同时，研究依托世界最大规模的 ALPPS 临床队列（含 150 例 FFPE 组织、450 份全血样本），并结合小鼠模型、三维肝脏类器官等多平台验证，构建了 “临床样本 - 动物模型 - 体外类器官” 的三重验证体系。这种技术整合的优势在于，既精准鉴定了再生相关的细胞亚群，又明确了细胞间的空间互作关系，解决了传统研究难以区分细胞异质性和定位功能的局限，为解析肝再生的免疫调控网络提供了更全面的技术支撑。2. 细胞亚群的功能创新：揭示 CD177 + 中性粒细胞的特异性促再生作用 研究突破了中性粒细胞 “功能均一化” 的传统认知，通过聚类分析鉴定出以 CD177 为标志的 G4 中性粒细胞亚型，明确其为 ALPPS 诱导肝再生的核心驱动细胞。该亚型的创新特征体现在三方面：一是代谢活性特异性增强， glycolysis、脂肪酸合成等通路激活，为再生提供能量和生物合成前体；二是功能表型动态转换，早期表达促炎因子（IL1B、CCL5）启动免疫应答，后期切换为促再生因子（MMP9、OSM）调控组织修复；三是增强中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成，参与微环境重塑。这一发现填补了 “中性粒细胞异质性在 ALPPS 肝再生中作用” 的研究空白，首次明确了特异性中性粒细胞亚型的促再生功能，为靶向免疫细胞调控再生提供了精准靶点。3. 分子机制的通路创新：阐明 “双轴募集 - 酶解释放” 的级联调控网络 研究首次揭示了 CD177 + 中性粒细胞参与肝再生的双重调控通路及核心分子机制：一方面，通过 “CXCL8-CXCR1/2” 趋化轴（肝星状细胞分泌 CXCL8）和 “CD177-PECAM1” 黏附轴（与内皮细胞互作）协同作用，实现中性粒细胞向肝组织的精准募集和跨内皮迁移，明确了细胞浸润的特异性调控逻辑；另一方面，CD177 + 中性粒细胞分泌的基质金属蛋白酶 9（MMP9）通过水解细胞外基质（ECM）中的胶原纤维，释放结合态的肝细胞生长因子 α（HGF-α），进而启动肝细胞增殖。这一 “募集 - 酶解 - 因子释放” 的级联机制，首次将中性粒细胞的迁移、ECM 重塑与生长因子激活串联起来，完整解释了 ALPPS 手术快速诱导肝肥大的分子基础，突破了以往对肝再生中免疫细胞与基质微环境互作的模糊认知。4. 功能验证的体系创新：构建 “基因编辑 - 干预 - 挽救” 的闭环证据链 研究通过系统性功能验证明确了关键分子的必要性和充分性：在体内，CD177 基因敲除小鼠的肝再生能力显著下降，而输注 CD177 + 中性粒细胞可恢复再生表型；在体外，阻断 CD177 或 MMP9 可抑制肝脏类器官的增殖和 ATP 生成，而补充 HGF-α 或 MMP9 能挽救该表型。这种 “基因敲除（失活）- 抗体 / 抑制剂阻断（干预）- 细胞 / 因子输注（挽救）” 的闭环验证，严格证实了 “CD177 + 中性粒细胞 - MMP9-ECM-HGF-α” 轴的核心调控作用，避免了单一实验的局限性，使机制结论更具可靠性和说服力。5. 临床转化的应用创新：提出中性粒细胞靶向的再生治疗新策略 研究基于基础机制发现，首次提出 “CD177 + 中性粒细胞输注” 或 “MMP9/CXCL8 等因子补充” 的治疗思路，为肝功能衰竭、肝再生障碍患者提供了新的治疗方向。与传统治疗相比，该策略的创新点在于以 “免疫细胞亚型” 为靶向对象，兼具特异性和安全性：CD177 + 中性粒细胞的促再生功能具有组织特异性，且研究证实其输注可在不引发过度炎症的前提下恢复肝再生，为解决临床中 ALPPS 术后再生不良、肝移植后功能恢复等问题提供了潜在方案，实现了基础研究向临床应用的有效衔接。 可以改进的地方[AI基于大数据总结，仅供参考] 一、研究不足之处1. scRNA-seq 样本量有限，细胞亚群分析代表性不足 研究的发现队列仅包含 3 例 ALPPS 患者的 6 份配对 FLR 组织样本，获得 24647 个高质量细胞，导致稀有细胞亚群（如特定功能状态的肝细胞、基质细胞亚型）可能未被有效捕获。同时，由于 FLR 组织解离后 viable 单细胞产量低，无法扩大样本量，使得单细胞层面的结论缺乏大样本验证支撑。此外，研究虽用空间转录组和临床大队列补充，但空间转录组仅纳入 2 例患者的 3 份配对样本，仍难以覆盖临床人群的异质性。2. 肝细胞异质性分析受限，核心功能细胞研究不充分 scRNA-seq 过程中，肝细胞因解离诱导的细胞死亡导致存活率低，无法深入分析肝细胞的亚型分化（如增殖型、代谢型肝细胞亚群）、区域特异性功能（如肝小叶不同区域肝细胞的再生响应差异）。而肝细胞作为肝再生的核心效应细胞，其与 CD177 + 中性粒细胞、ECM 的互作机制尚未被充分解析，导致再生调控网络的完整性不足。3. ECM 降解的功能验证较片面，缺乏全面机制解析 研究仅通过可溶性胶原、羟脯氨酸（HYP）和 MMP9 水平评估 ECM 降解，未深入分析 ECM 的复杂成分动态变化（如非胶原蛋白、糖胺聚糖的降解规律）。同时，ECM 降解过程中 “CD177 + 中性粒细胞 - MMP9” 与其他 ECM 调控通路（如肝星状细胞的胶原合成、基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）的调控作用）的相互作用未被探讨，导致对 ECM 重塑的整体调控机制理解不全面。4. CD177 + 中性粒细胞的双重功能平衡未明确，临床转化安全性存疑 研究证实 CD177 + 中性粒细胞可通过 NET 形成参与微环境重塑，但未深入分析 NET 的双重作用：NET 既可能促进 ECM 重塑，也可能引发过度炎症、肝窦微血栓形成，进而导致肝损伤。此外，研究未评估 CD177 + 中性粒细胞输注后 NET 相关分子（如瓜氨酸化组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶）的表达变化，无法明确其临床应用的安全性风险（如是否加重术后肝损伤）。5. 临床相关性分析不足，基础机制与临床结局脱节 研究未将核心实验发现（如 CD177 + 中性粒细胞比例、MMP9 水平、HGF-α 释放量）与患者的临床结局指标（如 FLR 体积增长速率、术后肝功能恢复时间、并发症发生率、长期生存率）进行关联分析。导致无法验证这些分子 / 细胞指标是否可作为 ALPPS 术后肝再生不良的预后标志物，也难以明确基础机制对临床治疗的直接指导价值。6. 治疗策略的优化探索不足，临床转化可行性待验证 研究提出 “CD177 + 中性粒细胞输注” 的治疗思路，但未探索关键应用参数：如输注时机（术前预处理 vs 术后即时输注 vs 再生高峰期输注）、输注剂量（细胞数量阈值）、输注频次对再生效果的影响。同时，未评估输注后可能的不良反应（如全身性炎症反应综合征、血栓形成），也未明确不同基础肝病（如乙肝相关肝癌、脂肪肝、肝硬化）患者对该治疗的应答差异，导致临床转化缺乏具体方案支撑。二、改进建议（切实可行，符合科学研究逻辑与临床需求）1. 扩大多组学样本量，强化细胞亚群分析的代表性 优化 FLR 组织单细胞解离方案（如采用温和解离酶组合、缩短解离时间、添加细胞保护剂），提高肝细胞及稀有细胞的存活率，扩大 scRNA-seq 发现队列至 10-15 例患者的配对样本，确保细胞亚群鉴定的稳定性。 整合单细胞 ATAC-seq（表观组学）与 scRNA-seq 数据，解析 CD177 + 中性粒细胞、肝细胞的表观遗传调控机制，补充转录组层面未覆盖的功能差异。 增加空间转录组样本量（至少 5 例患者的配对样本），结合空间原位杂交（RNAscope）验证，精准定位 CD177 + 中性粒细胞与内皮细胞、肝星状细胞的空间互作关系。2. 优化肝细胞研究方法，解析其异质性与再生互作机制 采用 “非解离式” 空间转录组联合激光捕获显微切割（LCM）技术，分离肝小叶不同区域（门管区、中央静脉区）的肝细胞，分析其区域特异性基因表达谱，明确 CD177 + 中性粒细胞分泌的 MMP9、HGF-α 对不同区域肝细胞增殖的调控差异。 构建肝细胞特异性报告基因小鼠模型（如 Ki67-GFP 小鼠），结合 ALPPS 模型，实时追踪肝细胞增殖动态，观察 CD177 + 中性粒细胞输注对肝细胞增殖的时空影响。3. 深化 ECM 重塑机制研究，完善调控网络解析 采用 ECM 蛋白质组学技术（如质谱分析），全面鉴定 ALPPS 术后 FLR 组织中 ECM 成分（胶原蛋白、非胶原蛋白、糖胺聚糖）的动态变化，明确 CD177 + 中性粒细胞 - MMP9 通路对 ECM 整体组成的调控作用。 补充 TIMP（MMPs 天然抑制剂）的表达分析，通过体外共培养（CD177 + 中性粒细胞 + 肝星状细胞 + 肝细胞）和体内 TIMP 沉默 / 过表达实验，探索 “MMP9-TIMP” 平衡在 ECM 重塑与肝再生中的调控作用。4. 解析 CD177 + 中性粒细胞的双重功能，评估临床应用安全性 在 ALPPS 小鼠模型中，通过 NET 形成抑制剂（如 DNase I、氯膦酸盐脂质体）阻断 NET 形成，对比分析肝再生速率（FLR/BW 比值、Ki67 + 肝细胞比例）与肝损伤指标（ALT、AST、肝组织炎症浸润），明确 NET 在肝再生与肝损伤中的平衡作用。 检测患者术后外周血中 NET 相关分子（瓜氨酸化组蛋白 H3、游离 DNA）的水平，关联 CD177 + 中性粒细胞比例与术后肝损伤程度，筛选安全应用的生物标志物阈值。5. 强化临床相关性分析，搭建基础机制与临床结局的桥梁 扩大临床队列的随访数据，将患者术前 / 术后 CD177 + 中性粒细胞比例、FLR 组织中 MMP9/HGF-α 水平，与 FLR 体积增长速率、术后肝功能恢复时间（ALT/AST 恢复正常时间）、并发症发生率（如术后肝衰竭、感染）、长期生存率进行相关性分析，验证这些指标作为预后标志物的潜力。 针对不同基础肝病（乙肝、丙肝、脂肪肝、肝硬化）的 ALPPS 患者，分层分析 CD177 + 中性粒细胞的浸润特征与再生效果差异，明确治疗策略的适用人群。6. 优化治疗方案，推进临床转化可行性 在 ALPPS 小鼠模型中，探索不同输注策略：设置术前 1 天、术后即时、术后 3 天（再生高峰期）三个输注时机，以及 1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶ cells/25g BW 三个剂量梯度，通过 FLR 再生指标和肝损伤指标筛选最佳方案。 监测输注后小鼠外周血炎症因子（IL-6、TNF-α、CXCL8）、血栓标志物（D - 二聚体）水平，评估全身性不良反应；结合肝组织病理切片，观察是否存在肝窦淤血、微血栓形成，明确治疗的安全性边界。 开发 CD177 + 中性粒细胞体外扩增技术（如通过 CXCL8、G-CSF 诱导外周血中性粒细胞分化扩增），解决临床应用中细胞来源不足的问题，同时保证扩增后细胞的促再生功能与安全性。 该研究首次通过单细胞 RNA 测序结合空间转录组技术，揭示 CD177 + 中性粒细胞是 ALPPS 诱导肝再生的关键驱动细胞，阐明其通过 CD177-PECAM1 黏附轴、CXCL8-CXCR1/2 趋化轴募集，分泌 MMP9 降解 ECM 释放 HGF-α 的核心机制。科学上填补了 ALPPS 肝再生免疫调控的空白，深化中性粒细胞异质性认知；临床中为肝衰竭、术后再生不良提供新治疗靶点，CD177 + 中性粒细胞输注等策略具转化潜力，为改善肝癌患者手术预后奠定基础。 如果你想在此显示您的广告信息，请联系我们。 MATSCA /  科学技术普及新媒体矩阵  肠道类器官（Organoid Bulletin） 本公众号由AI智能体ORGANOID AGENT驱动赋能，您可以直接与公众号对话，获得最专业的类器官知识指导与信息。      我们致力于发布本领域优质资讯与评述，推送国内外类器官及干细胞相关领域最新研究论文、综述与技术进展。发布科普文章、专家观点评论、行业分析、招聘信息和会议通知。您可以在微信、小红书、百家号、企鹅号、今日头条、知乎和Bilibili关注我们。秉承类器官创新计划组织愿景，我们积极传播科学知识，促进同行交流，推动产业发展，服务国家战略，积极为类器官与干细胞技术发展提供助力。欢迎各位关注、分享、转载、投稿！原创内容欢迎转载，直接私信即可，完全免费授权。内容多来自学术论文或网络公开资源，如有侵权还请联系删除。 编辑部联系邮箱：zj@organoid.ac.cn 合作品牌 2025年度 欢迎找到组织 类器官创新计划组织（Innovations in organoids organization）是由来自中国科学院、北京大学、清华大学、复旦大学和浙江大学等多个顶级研究机构的头部研究团队组织发起的，完全公益的，学术与研究技术交流合作组织，成员主要由来自类器官行业内的企业高管、技术经理、高级PI等构成。加入“类器官创新计划”后，您将以极低的成本实现类器官资源的互换与共享，基于肠道类器官和类器官创新计划组织微信公众号平台，您将获得来自全行业的赋能与指导，进行标准化的类器官制备与检测，保证您的研究顺利且高质量开展。我们会将你纳入本组织“技术研发”、“开源公益”和“产品服务”等多个微信群，这样您能够与所有参与计划的成员及时沟通，您所有的类器官问题都能最及时的得到解答和帮助，互换类器官品系和干细胞研究工具资源，解决技术难题，获得技术支持。我们已有上万个来自全国顶级类器官研究机构、大学和企业的注册认证会员，大家一起为类器官事业发展点燃星星之火，推动类器官产业发展壮大。我们还建立了AI知识问答和开源类器官分析工具等多个公益项目为类器官研究提供帮助，构建开放包容的领域生态。在这里,我们敢为人先，始终积极寻求更新类器官更优的解决方案，勇于突破经验与预想的界限，致力打造科学卓越的行业新标准。 官方网站：www.organoid.ac.cn 联系邮箱：info@isco.ac.cn   组织愿景 1.共建开放协作生态：搭建行业资源共享平台，促进技术互通与经验共享，降低类器官研究门槛。 2.引领行业标准与规范：推动制定行业与国家工程标准，实现类器官培养与应用的规范化、全流程标准化。 3.打造国际学术资源枢纽：推动建设全球认可的类器官库与智库平台，加速技术向精准医学与药物研发转化。 4.驱动技术融合创新：推动整合生物材料、智能装备等工程技术创新，突破类器官规模化制备与功能重建瓶颈。 5.强化技术自主可控：推进国产化试剂、仪器研发与技术体系替代，保障核心研发链安全与战略主动权。 加入我们       本组织面向类器官全领域同行提供交流平台和会员身份认证服务，可以加入“技术研发”、“开源公益”、“产品服务”和“专属领域”等多个类型的交流群，涵盖科学研究技术、开源工具和公益、销售产品与服务、细分领域如类器官芯片、生物材料等专属群等平台，参与讨论。高级研究员或独立PI可以申请成为荣誉发起人，成为类器官创新计划贡献者与受益者。本公益组织目前已有10000+会员，期待您加入讨论分享，让我们共同促进类器官产业发展。      现在，您只需添加发起人微信，备注自己的真实姓名与单位和必要信息，例如“张三-中国科学院大学”，说明申请加入类器官创新计划，提供有效身份证件如学生证、身份证、工作证或其他任何可以证明身份的真实性的证件，即可加入对应社群。而这一切都是公益的，免费的，不收取任何费用。 扫描添加微信以进群交流 加入知识星球 面向专业科研需求和企业级资源共享，现在扫描二维码加入“肠道类器官”知识星球，就能获得来自顶级研究机构分享的类器官培养基配方和方案，类器官创新计划组织发布的官方标准指南、AI类器官分析工具等更加专业的资料。与1000+位行业精英共同交换类器官技术资料和资源，向行业专家提问，免费参与国内领先的类器官品牌产品内测试用，获得类器官工程师认证等。全行业最专业的类器官知识社区和公益平台，让您的类器官研究少走弯路！ #为什么要加入知识星球？ 1.最新最专业的培养基配方和技术资料即时获取。 2.标准类器官培养方案和技术标准材料发布唯一渠道。 3.最强AI智能体和类器官分析软件和工具解析和下载。 4.类器官领域TOP专家一对一沟通，权威资料触手可及。 5.类器官企业新产品评测和免费试用特权通道。 6.定期发放免费会议入场券和资料，提供演讲机会。  更多福利，请移步知识星球内部了解。 扫二维码｜获取资源 标准类器官培养基配方 高级类器官AI分析软件 高水平类器官文章资料 ...... 注册会员 注册会员是面向所有人的公益身份识别项目。如需以组织会员身份获取各种资源与免费福利。您只需访问www.organoid.ac.cn注册会员，并补充个人真实有效身份信息，经人工审核后，即可获得注册会员认证。通过“类器官创新计划组织”和“肠道类器官公众号”的“身份认证”菜单就能找到查询入口。也可以下载专属的身份二维码用于各种需要出示本组织身份的场合如学术会议、合作商提供的免费产品申请。由PI或课题组长及以上级别提供实名信息可注册为“注册会员”，加入“注册认证会员群”优先享受本组织提供的学术界与产业界资源。特别的，您所有的信息仅用于身份识别，不会被进行任何形式的商业用途，     欢迎监督举报（邮箱：isco@organoid.ac.cn）。未进行注册的，不被认为是我组织正式会员，合作方有权拒绝提供任何服务和或产品。 具体注册方式点击下列文章了解： 如何注册成为注册会员？ 扫码获取您的电子会员证 访问www.organoid.ac.cn注册账号， 填写必要信息即可资格认证。 求点赞 求分享 求推荐