Vorinostat

摘要 蛋白质在细胞内的空间排布几乎调控全部细胞功能，然而现有成像技术１次仅能观测数10种蛋白质，和单个人类细胞内数千种蛋白的数量存在数量级差距。本文提出深度生成模型ProtiCelli，仅依靠3种细胞标志性染色，即可模拟12,800种人类蛋白质的显微图像。该模型基于123万张人类蛋白质图谱（HPA）图像完成训练，在重建准确度与纹理保真度上优于现有方法，并且可以泛化到未见过的细胞类型与药物扰动条件。模拟图像保留层级化亚细胞组织特征，复现已知的蛋白‑蛋白相互作用图谱，并在单细胞分辨率下解析兼职蛋白（moonlighting proteins）在不同细胞器中的特异性功能。值得注意的是，该模型仅依靠细胞形态学就可以推断药物引发的蛋白质表达与定位改变，无需专用标志物即可预测细胞周期阶段，还能够实现亚细胞细胞器的无监督分割，将基因集在空间上分解为多个功能区域。本文利用ProtiCelli生成Proteome2Cell数据集，包含3,070万张模拟图像，覆盖12种人类细胞系的2,400个「虚拟细胞」，可构建层级化单细胞模型，区分保守与动态蛋白质空间架构。Proteome2Cell数据集已经整合进HPA，让广大科研人员可以便捷使用这些虚拟细胞。ProtiCelli通过计算手段填补实验技术的可扩展性短板，为空间虚拟细胞建模奠定基础。多尺度虚拟细胞×复杂生物学 emmalu@stanford.edu #生成式建模#空间蛋白质组学#机器学习#系统蛋白质组学#虚拟染色#虚拟细胞建模#生物图像信息学 正文 图1  ProtiCelli研究总览 ProtiCelli基于人类蛋白质图谱的单细胞裁剪近蛋白质组规模免疫荧光图像完成训练，依靠细胞地标（细胞核、内质网ER、微管MT）作为条件，模拟12,800种蛋白质的高分辨率荧光显微镜图像，可支持多项下游应用。 下游应用包含：蛋白质相互作用可视化、扰动预测、虚拟染色、细胞状态预测、空间分辨功能富集、单细胞层级图谱、超多重虚拟细胞、（3D）细胞器分割、实验‑计算闭环、查询蛋白集的空间可视化。 ProtiCelli基准测试 图2  ProtiCelli基准性能评测 (A) 测试所用细胞系：A‑431、HeLa、MCF‑7、U2OS、HEK293；展示各类亚细胞区室：核膜、线粒体、微管、核斑点、核仁、核质、过氧化物酶体、囊泡、肌动蛋白丝、质膜、内质网、内体、高尔基体、中间丝、脂滴、溶酶体。 (B) 示例蛋白的真实图像、ProtiCelli、CELL‑Diff、PUPS模型输出对比；不同蛋白分别取自SiHa、HeLa、A‑431、RPTEC/TERT1、HEK293、SK‑MEL‑30、U‑251MG、RT‑4细胞。 (C‑I) 定量评测指标，包含SRRM2、RBM33、MATN3、GOLGB1、PCK2、TOMM22、IFT74、CALD1、CALN1等蛋白的得分；数据集分为HPA‑testing、CM4AI‑MDA；处理条件：未给药、紫杉醇、伏立诺他。 模拟图像的学习表征复现亚细胞组织 图3  模拟图像的学习表征 复现亚细胞组织 (A) 6个HPA高染色蛋白细胞系的SubCell嵌入UMAP投影；每个点代表1种蛋白。对每个细胞系，将真实、模拟图像嵌入做均值中心化后联合投影。上行嵌入按图像来源着色；下行在同一投影空间将真实、模拟图像分开绘制，按主要亚细胞定位着色。利用完整1,536维嵌入计算分离度与纯度。 (B) 基于蛋白嵌入预测亚细胞定位的准确度；输入分别为真实图像、ProtiCelli模拟蛋白通道图像、仅保留形态（蛋白通道置空）的图像。上方为分类准确率；下方为宏平均F1分数。每个点代表1种细胞系（共12种），为3次模拟采样重复的均值。真实‑模拟组须状线代表多次重复的取值范围；箱体展示中位数与4分位区间。虚线代表多数类基线（0.30）与随机水平（24类：0.041）。 (C) 基于模拟图像嵌入，采用逐步升高分辨率的Leiden聚类构建亚细胞组织层级图谱，标注富集GO术语。节点大小代表聚类规模；颜色深浅代表富集显著性。 (D) U2OS细胞真实图谱与模拟图谱一致性。左侧：2‑4层级UMAP投影，在高维嵌入空间执行聚类；行代表真实、模拟图像嵌入；列代表层级与定义聚类颜色所用数据集。右侧：不同层级聚类结果的调整互信息AMI；蓝色曲线为真实‑模拟对比，绿色为2套独立真实图像对比。数据点与条带代表30次运行的均值±1倍标准差。 (E) 12种细胞系中，蛋白互作对与定位匹配非互作对的像素级皮尔逊相关系数分布差异。正值（红色）代表互作对相关系数更高；负值（蓝色）代表定位匹配非互作对相关系数更高。采用双侧曼‑惠特尼U检验统计显著性；*** p<0.005。右侧：U2OS细胞中，ProtiCelli模拟得到的代表性互作蛋白对、无关蛋白对图像，品红色与绿色分别标记2种蛋白；比例尺10 µm。 ProtiCelli捕捉蛋白互作背景、药物诱导表达变化以及细胞周期相关动态 图4  ProtiCelli捕捉蛋白互作背景、药物诱导表达差异以及细胞周期依赖的动态变化 (A) 空间互作重叠； (B‑F) 未给药、紫杉醇、伏立诺他处理条件下，模拟与真实图像对照； (G‑K) 细胞周期CDT1、GMNN标记，A‑549、MDA‑MB‑468细胞，M/G1/G2/G1/S各时期真实与模拟结果。 (A) 真实图像、模拟图像、空间互作重叠统计。 (B‑D) 不同药物处理条件下，模拟图像与真实图像对照。 (G) 预测与实验强度之间皮尔逊相关系数0.587（p<0.001）。 (H‑I) A‑549、MDA‑MB‑468细胞CDT1、GMNN的真实、模拟染色图像。 (J‑K) 基础模型与微调后模型，不同细胞周期阶段标记蛋白的强度变化趋势。 亚细胞无监督分割 图5  ProtiCelli实现亚细胞区室无监督分割，支持蛋白质组层面空间分析与可视化应用 (A) MCF‑7细胞，143个细胞器标记蛋白模拟图像做像素级聚类，划分亚细胞区室；不同颜色代表聚类类别。 (B) MDA‑MB‑468细胞3维图像栈，基于ProtiCelli做空间聚类的部分视图，展示部分聚类；比例尺5 µm。 (C) 紫杉醇、未给药、伏立诺他处理条件下，Cluster3（核仁）、细胞核、胞质、全细胞内SIRT2归一化强度；采用曼‑惠特尼U检验评估显著性。 (D) 各处理条件下代表性单细胞图像：细胞参考标记（微管红色；细胞核蓝色；内质网黄色）、SIRT2通道、细胞核/胞质掩码、Cluster3掩码；比例尺10 µm。 (E) Cluster7（高尔基体、线粒体、中间丝）、细胞核、胞质、全细胞中YWHAB的分区室强度。 (F) YWHAB以及ProtiCelli识别的3个区域的代表性图像，绘图设置同D；比例尺10 µm。 (G) Hep‑G2细胞脂质代谢Reactome基因集（R‑HSA556833）的空间分析。该基因集758个蛋白中566个可由ProtiCelli模拟。 左图：按聚类类别着色的空间聚类图，聚类来自(A)细胞器标记模拟图像像素聚类。 右图：各个细胞器聚类内部，Reactome子通路的空间富集。将每个模拟蛋白图像2值化占据情况在聚类掩码内统计，相对其余聚类归一化。圆点颜色代表通路‑聚类配对的蛋白平均log₂空间富集；圆点大小代表单侧威尔科克森符号秩检验得到的显著性；仅展示FDR校正后p<0.05的配对。y轴通路层级排布，R‑HSA‑556833的子通路加粗显示；x轴为空间聚类。 ProtiCelli实现蛋白质组规模空间分析、蛋白复合体可视化以及层级亚细胞图谱 图6  ProtiCelli实现蛋白质组规模空间分析、复合体可视化与层级亚细胞图谱 (A) 文献报道蛋白复合体的ProtiCelli模拟；5个代表性组分蛋白的模拟免疫荧光图像，附带全部复合体蛋白的一致性表达热图；比例尺10 µm。 (B) 由12,800重ProtiCelli模拟图像得到单细胞层级多尺度图谱。每个节点代表某一分辨率下的空间聚类；节点颜色为200张单细胞图谱的共聚类得分均值（定义：参考细胞中归为同一聚类的蛋白对，在该细胞中同样共聚类的细胞占比，上方色条）。热图展示参考细胞每个聚类内全部蛋白的一致性表达；亮度代表蛋白表达重叠度（下方色条）。彩色方框标记(C)展示的聚类。 (C) 参考细胞层级图谱选取聚类的热图，对比其他细胞中同一聚类蛋白的热图；包含高稳定性、低稳定性2组聚类。 详细总结 思维导图 研究背景 ProtiCelli模型架构 与SOTA模型对比 PUPS、CELL‑Diff ⚠️局限性 参考 Generative machine learning unlocks the first proteome-wide image of human cells https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.03.31.715748v3 注：AI辅助创作，如有不当欢迎指出。内容仅供参考，不构成任何建议。 End

Basic Information 英文标题：Decrypting the molecular basis of cellular drug phenotypes by dose-resolved expression proteomics 中文标题：通过剂量解析的表达蛋白质组学揭示细胞药物表型的分子基础 发表日期：07 May 2024 文章类型：Article 所属期刊：Nature Biotechnology 文章作者：Stephan Eckert | Bernhard Kuster 文章链接：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02218-yAbstractPara_01 蛋白质组学在药物发现中发挥着重要作用，从靶点解卷积到作用机制（MoA）阐明以及药物反应生物标志物的鉴定。 在此，我们介绍 decryptE，这是一种全蛋白质组方法，用于测量药物诱导的蛋白质表达变化的完整剂量-反应特征，从而揭示细胞中的药物作用机制。 对144种临床药物和研究化合物进行检测，针对8,000种蛋白质进行了超过100万条剂量-反应曲线的分析，这些数据可以在ProteomicsDB和一个定制的Shiny应用程序中在线交互式探索。 集体数据分析为已知的药物表型效应提供了分子解释，并揭示了人类药物作用机制的新方面。 我们发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂强烈下调T细胞受体复合物，导致体外和离体人类T细胞激活受损。 这为组蛋白去乙酰化酶抑制剂在某些淋巴瘤和自身免疫疾病中的疗效提供了合理的解释，并解释了它们在治疗实体肿瘤中的不佳表现。MainPara_01 大多数药物作用于蛋白质，并且自帕拉塞尔苏斯时代以来，人们就知道药物的效果是剂量依赖性的。 导致药物诱导的细胞表型变化的分子过程可以大致分为（1）靶点结合，（2）通路参与和（3）细胞重新编程以达到新的可行状态或细胞死亡，这三者共同构成了药物的作用机制。 今天，定量质谱是全面表征药物在所有三个层面对蛋白质组影响的最全面方法，因为它能够在复杂的细胞背景下并行分析数千种蛋白质。 该技术不需要对药物可能作用的蛋白质、可能干扰的通路或新细胞状态的蛋白质组成有任何预设假设。 虽然表型剂量-反应测量在药理学中已经很常见几十年了，但缺乏考虑剂量作为药物最重要特征的蛋白质组学研究。Para_02 强效药物通常在几分钟内与其细胞靶点结合，如果它们具有特别慢的结合速率，则可能需要几小时。 在全蛋白质组目标解析中最成功的方法之一是基于活性和亲和力的蛋白质组分析。 这两种方法都旨在直接测量药物与其靶点的相互作用。 当以剂量依赖的方式进行时，它们还可以确定表观相互作用常数。 替代方法测量药物引起的蛋白质其他生物物理或生化性质的变化，例如在升高温度下的溶解度或在有机溶剂存在下的溶解度、对氧化试剂的敏感性或对部分酶促水解的敏感性。 尽管这些方法非常强大，但它们通常需要高水平的目标结合才能产生可测量的效果。 此外，观察到的效果往往不仅限于目标本身，从而使得区分直接和间接的药物效应变得复杂。Para_03 由于许多细胞通路受可逆的蛋白质翻译后修饰（PTMs）调控，质谱法也可用于测量药物是否作用于靶点下游的通路。 这个时间范围通常在几分钟到几小时之间。 已发表的研究经常报告大量可观察到的 PTM 变化，这些变化是由于应用了任意且通常是高剂量的单一药物，或者因为数据是在治疗数小时后收集的。 再次强调，这类数据的解释可能很困难，因为数据中既包含直接效应也包含间接效应。 最近才证明，以剂量和时间依赖的方式测量药物对 PTM 的影响是一种更强大的通路参与测量方法，因为它可以根据药物效力对数据进行优先排序。Para_04 细胞对药物的反应并适应新的功能状态是一个复杂的过程，通常涉及基因表达、信使RNA (mRNA) 和/或蛋白质的稳定或降解，这些变化可能持续数小时甚至数天。 L-1000连接图项目已经研究了药物扰动的转录角度，最近的一些研究已将此类调查扩展到蛋白质组水平。 这些数据是有用的，因为它们表征了药物处理下细胞终点（表型）背后的分子后果。 然而，据我们所知，尚未进行系统评估药物诱导的蛋白质组表达变化的剂量-反应特征的研究，这限制了对驱动和描述观察到的表型变化的分子基础的理解。 错误！！！ cannot unpack non-iterable NoneType objectResultsDecryptE for dose-resolved expression proteomics 用于剂量解析表达蛋白质组学的DecryptEPara_01 DecryptE方法（图1）使用Jurkat急性T细胞白血病细胞作为模型系统开发，并通过分析来自16类药物的144种药物进行了验证（补充表1）。 这些药物包括已批准的（53种）、三期临床试验中的（15种）以及一期/二期临床试验中的或常用的研究工具化合物（76种）。 简而言之，细胞在48孔板中培养，并用五个剂量的药物处理18小时，剂量范围从1到10,000纳摩尔，以10的对数等间距递增，同时设置二甲基亚砜（DMSO）作为对照。 代谢活性和细胞毒性以及细胞形态在同一剂量范围内对所有药物进行了平行测定，在实验的时间范围内仅受到轻微影响（补充表1和扩展数据图1a），而观察到的蛋白质组学药物效应最为显著（扩展数据图1b–d）。 蛋白质通过含有SDS的缓冲液提取，并在机器人平台上按照单锅固相增强样品制备协议（SP3）消化成肽段。 我们之前已经证明，微流体液相色谱与串联质谱（LC–MS/MS）能够实现高通量蛋白质组测量，并在此基础上通过引入离子迁移维度（高场非对称波形离子迁移谱，FAIMS）实现了每小时超过7,000种蛋白质的覆盖（扩展数据图1e–i）。 整个药物筛选过程需要768小时的仪器时间（相当于每种药物5.3小时），并使用MaxQuant和Prosit重新评分鉴定了8,892种蛋白质。 基于48个DMSO重复样本，测得该测定的中位定量精度为19%变异系数（CoV），并且数据具有高度一致性（扩展数据图2a和2b）。 剂量-反应曲线拟合到数据中，提供了药物效力（达到50%效应所需的浓度，EC50）和效应大小（曲线下面积或相对于DMSO的倍数变化）的信息。 剂量-反应数据的统计能力使得能够稳健分类1,133,847条剂量-反应曲线（是否受调控），这些曲线构成了进一步分析的基础。 DecryptE数据具有可重复性，69.5%的EC50值在药物浓度的半对数范围内（扩展数据图2c–e）。 此外，受调控蛋白质的变异系数始终高于未受调控蛋白质的变异系数（扩展数据图2f）。 Fig. 1: DecryptE workflow for the proteome-wide and dose-dependent characterization of drug-induced protein expression changes. - 图片说明 ◉ 详见文本和方法部分的详细信息（i，抑制剂；E3L，E3 连接酶；AUC，曲线下面积）。Para_02 为了便于社区使用这一资源，数据可以在 ProteomicsDB (https://proteomicsdb.org/decryptE) 以及一个自建的 Shiny App (https://decrypte.proteomics.ls.tum.de/) 中进行探索，在该应用程序中可以可视化和比较剂量-反应曲线。 此外，还提供了有关细胞形态、细胞代谢活性、细胞毒性、蛋白质半衰期以及化合物和药物靶标亲和力（如有）的信息，以帮助解释观察到的效果。High-level analysis of decryptE profiles 高级解密E配置文件分析Para_01 从对数据的全球分析中，可以立即得出几个观察结果。首先，在实验的时间范围内（18小时），大多数蛋白质的丰度没有因任何药物而发生变化（n = 982,824 剂量-反应曲线；87%）。 在73,299个案例中观察到剂量依赖性上调，在77,724个案例中观察到剂量依赖性下调。 其次，144种药物中每一种对Jurkat细胞蛋白质组的重塑程度差异巨大。一些药物调控了超过1,000种蛋白质的表达，而另一些则只影响了几种蛋白质。 类似地，一些药物表现出非常强烈的效果，而另一些则仅在高浓度下有效。这两个方面对于将观察到的表型（如形态、代谢活性和细胞毒性）和分子（如蛋白质表达）反应归因于特定化合物的作用机制非常重要。 正如预期的那样，针对基本细胞过程的药物引起了许多变化。例如，HDAC抑制剂如伏立诺他或帕比诺司他改变了转录程序，从而导致许多蛋白质的表达变化。 蛋白酶体抑制剂卡非佐米也表现出显著效果，因为它抑制了细胞中主要的蛋白质降解机器。 HSP90抑制剂格尔达霉素也观察到了许多变化，因为它使蛋白质折叠机制中的关键成员失活。更具体地说，格尔达霉素强烈上调了参与未折叠蛋白质反应的蛋白质（高达50倍），例如DNAJB1和HSPA1B，这可能是由于细胞试图抵消药物引起的蛋白质折叠能力丧失。 与此形成鲜明对比的是，一些药物仅诱导了微小的蛋白质组变化。其中包括组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂利拉美托斯塔或双重c-MET和ALK激酶抑制剂克唑替尼。前者表明，在实验的时间范围内，干扰培养的Jurkat细胞中动态的组蛋白赖氨酸甲基化并未产生任何后果，后者暗示Jurkat细胞的存活不依赖于ALK和MET的活性。 Fig. 2: Summary of drug-induced expression changes. - 图片说明 ◉ a, 剂量-反应曲线类别的绝对数量和相对分布的饼图。◉ b, 柱状图显示每种药物上调或下调的蛋白质数量（inh.，抑制剂；Methyltr.，甲基转移酶）。◉ c, 饼图显示导致至少一种指定目标蛋白质表达变化的药物比例。◉ d, 雷达图显示改变蛋白质 TYMS 表达的药物数量。每条线的长度表示观察到的调节作用的 pEC50（-log10 EC50）。MTX 和培美曲塞被突出显示，因为 TYMS 是这两种药物的指定靶点。◉ e, 与 d 相同，但显示的是由药物 Tanespimycin 调节的所有蛋白质。被突出显示的蛋白质是这种药物的靶点。◉ f, 柱状图显示调节特定目标蛋白质的药物数量（y 轴）。特定蛋白质作为指定靶点的药物比例以粉红色突出显示。Para_02 经常有说法认为药物诱导的蛋白质组表达变化可以用于解析药物靶点。 从全球 decryptE 数据分析中得出的一个重要结论是，通常情况下这并不是如此。 首先，虽然检测到的 8,892 种蛋白质中有 66% 是所研究药物的指定靶点（无论其表达是否被调控，扩展数据图 3c），但大约 34% 的药物的已知靶点缺失，模拟显示随着蛋白质组覆盖度的降低，这一数字迅速增加（补充图 1）。 其次，只有大约 25% 的药物改变了其指定蛋白质靶点的表达水平（图 2c）。 第三，即使发生了这种情况，特定的药物靶点在数据中通常也不会因为效力或效应大小而显得突出，例如胸苷酸合成酶（TYMS）。 尽管该蛋白被其直接结合物甲氨蝶呤（MTX）和培美曲塞上调（扩展数据图 3d），但 TYMS 水平也受到其他 63 种未报告以 TYMS 为靶点的化合物的调控（图 2d）。 另一个例子是 HSP90 抑制剂坦斯匹霉素。HSP90 的水平被该药物调控（扩展数据图 3e），但数百种其他蛋白质也被调控，且许多蛋白质的调控效力更强、效应更大（图 2e）。 当将此分析推广时，绝大多数情况下，蛋白质表现出药物诱导的表达变化，即使它不是该药物的靶点（图 2f）。 因此，仅凭药物诱导的蛋白质表达变化来明确界定药物靶点似乎不太可能。Multi-omics analysis of drug-induced cellular remodeling 药物诱导的细胞重塑的多组学分析Para_01 为了了解药物诱导的蛋白质表达变化是否源于转录程序的改变或翻译前、共翻译和/或翻译后机制，我们对七种选定药物在同一细胞系和相同的药物处理条件下进行了剂量依赖的RNA测序（RNA-seq）实验。 如图3a所示，观察到了一些一致和不一致的影响。 例如，组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他处理后，HDAC1的蛋白质和mRNA水平保持不变。 相反，细胞周期调节蛋白RRM2的蛋白质和mRNA水平在CDK4/6抑制剂帕博西利处理下均显著降低。 这可能是因为随着药物剂量的增加，细胞在RRM2水平较低的细胞周期阶段停滞的数量增加。 相反，蛋白酶体抑制剂卡非佐米以相似的效力上调了共伴侣蛋白BAG3的转录和蛋白质水平，但效应大小非常不同，表明药物处理后BAG3蛋白质水平仅适度增加。 另一种情况是DNA甲基转移酶DNMT1，其蛋白质水平在地西他滨处理后减少，而转录水平没有变化。 这与文献报道一致，即地西他滨整合到DNA中后，共价捕获DNA甲基转移酶，导致其降解。 类似的行为也在分子胶如泊马度胺中观察到，这些药物导致IKZF1蛋白质水平强烈且剂量依赖性减少，而其mRNA水平没有变化（扩展数据图4a）。 上述药物MTX导致其直接靶标DHFR的蛋白质水平强烈且剂量依赖性增加，而mRNA水平保持不变（图3a）。 这清楚地表明是一个翻译后事件。 之前的体外实验显示，DHFR与其自身的mRNA结合以抑制其翻译，而添加MTX则消除了这种抑制。 这一机制可以很好地解释为什么MTX在与DHFR结合时也会诱导非常强的热稳定性或溶剂稳定性变化。 Fig. 3: Molecular mechanisms underlying drug-induced protein expression changes measured by decryptE profiling. - 图片说明 ◉ a，药物诱导的蛋白质（蓝色）和 mRNA（粉色）丰度变化的示例剂量-反应曲线。◉ b，从左到右，Brigatinib 处理后 CLK1–4 的剂量-反应曲线。通过激酶珠实验测定的 Brigatinib 和 CLK1,2,4 的结合亲和力（pKd = -log10 Kd）。CLK 蛋白的两种主要转录本的示意图，以及在 CLK 抑制时两个结构域之间的比例如何变为 1:1。三角形表示 N 端结构域；点表示蛋白的激酶结构域。条形图显示了 Brigatinib 剂量对 CLK1–4 的 N 端和激酶结构域转录本（通过 RT-qPCR 测定）的比例。◉ c，比较七种药物诱导的 mRNA 和蛋白质表达变化。中间面板的条形图显示了上调、下调或未调节的蛋白质（左侧条形图）和 mRNA（右侧条形图）的比例。上方面板的维恩图显示了上调的蛋白质与 mRNA 的数量及其重叠（数据仅限于同时检测到相应蛋白质的 mRNA）。下面板显示了相同的内容，但针对下调的情况。Para_02 另一种情况是由双特异性蛋白激酶 CLK1–4 呈现的，这些激酶在用激酶抑制剂 brigatinib、abemaciclib 和 milciclib 处理后，mRNA 和蛋白质水平都显著上调（图 3b 和扩展数据图 4b–e）。 已发表的目标解卷积数据显示，这些蛋白质是所有三种药物的直接靶点。 除了全长蛋白质外，CLK1 还存在两种较短的版本，这些版本包含 N 端但缺乏激酶域，这可能是由于第 4 内含子保留或第 4 外显子跳跃所致。 这些蛋白质的不同形式源于 CLK1 通过磷酸化某些剪接因子来调节自身剪接的能力。 这里收集的 CLK1–4 的定量 PCR 与逆转录（RT–qPCR）数据显示，在较高药物浓度下，N 端转录本与全长转录本的比例偏向于全长转录本，从而导致全长蛋白质水平升高。 虽然这是一个有趣的观察结果，但尚不清楚这在细胞中是否有任何功能后果，因为这些药物同时阻断了激酶活性。 这些选定的案例突显了药物调控的转录组和蛋白质组变化之间的几个差异，这些差异源于不同的细胞机制。 数据中还有许多其他案例，通常在绝对和相对方面都有非常大的药物特异性差异（图 3c）。 从这些数据中还可以看出，mRNA 和蛋白质水平上的调控方向并不总是协调一致（扩展数据图 5a）。 对于大多数研究的药物来说，相反的调控事件很少见。 然而，卡非佐米处理在 mRNA 水平上上调了细胞折叠机器的成员，而下调了相应的蛋白质（扩展数据图 5b–d），这可能是为了维持蛋白质稳态。Drug response phenotypes group drugs by function 药物反应表型根据功能对药物进行分组Para_01 虽然个别药物可能有不同的靶点，但它们可能导致相似的细胞和分子药物表型。 为了探索 decryptE 轮廓是否可以将药物分组，我们对每种化合物分别进行了基因本体论（GO）富集分析，针对上调或下调的蛋白质，随后对所有 144 种药物的结果进行了层次聚类（图 4a 和补充表 2）。 确实，导致细胞周期停滞的化合物形成了两个镜像簇（C1 和 C2），这些簇分别以上调或下调与姐妹染色单体分离、有丝分裂和/或减数分裂或胞质分裂相关的富集 GO 术语为特征。 进一步检查发现，这种分析可以区分在 G1/S 或 G2/M 期停滞细胞的化合物（图 4b）。 驱动这种聚类的蛋白质的例子是细胞周期调节蛋白 PLK1 的强烈上调和 ANLN 的强烈下调。 当总结所有三种药物的所有上调或下调蛋白质的信息时，它们显示出一致的 pEC50 值分布（图 4c–f）。 基于此，并根据内疚关联论证，可以将有丝分裂功能分配给尚未在此过程中注释的蛋白质，这一概念可能适用于其他簇中的其他分子功能。 pEC50 图还根据效力对药物进行了排序，确定紫杉醇是该集合中最有效的有丝分裂抑制剂。 Fig. 4: Groups of drugs with similar cellular MoA. - 图片说明 ◉ a，药物和富集的GO术语的聚类热图，这些GO术语由药物处理后上调或下调的蛋白质富集。◉ b，分析a中C1和C2簇中的药物，显示每个簇中的药物在细胞周期的不同阶段对蛋白质表达有相似的影响。◉ c，PLK1和三种影响G2/M检查点蛋白质表达的药物的剂量-反应曲线示例（簇C1）。◉ d，每种药物对蛋白质表达影响的效力分布，表示为pEC50（-log10 EC50）。◉ e，与c相同，但针对ANLN表达和影响G1检查点的药物（簇C2）。◉ f，与d相同，但针对影响G1检查点蛋白质表达的药物。Para_02 上述两种 HSP90 抑制剂形成了一个由与未折叠蛋白反应上调相关的 GO 术语驱动的小而独特的聚类（C3）。 PI3K/mTOR 抑制剂 GSK-1059615、DNA 交联剂奥沙利铂和 p53 激活剂瑟德马坦形成了一个紧密的聚类，表明核糖体生物发生下调（C4）。 三种含铂药物奥沙利铂、卡铂和顺铂并未形成聚类。 事实上，它们的 decryptE 谱型相当不同，例如奥沙利铂下调了核糖体蛋白，而其他药物则没有，这暗示了不同的细胞作用机制。HDAC inhibitors impair T cell activation HDAC抑制剂损害T细胞活化Para_01 意外的是，HDAC抑制剂形成了一个与T细胞增殖和激活有强关联的簇（C5）（图4a）。 例如，帕比司他以低纳摩尔效力下调了许多T细胞受体（TCR）关键成分的表达（图5a），特别是TCR本身及其共受体（图5b）。 在实验的时间范围内，细胞活力仅受到轻微影响（扩展数据图7a和补充表1）。 其他HDAC抑制剂也表现出相同的定性效应（扩展数据图7b），并且为伏立诺他收集的剂量依赖性RNA-seq数据显示这是一种协调的转录机制，而不是蛋白质降解（扩展数据图7c）。 这些结果表明，TCR成分的减少可以直接归因于HDAC活性的丧失。 这也导致了在基因工程改造的Jurkat TCR和/或CD3效应细胞中，抗CD3和/或CD28抗体介导的T细胞激活减少，这些细胞在T细胞激活时表达荧光素酶（图5c）。 Fig. 5: HDAC inhibitors compromise the function of human T cells. - 图片说明 ◉ TCR信号传导及其细胞结果的示意图。◉ 帕比诺司他处理后，Jurkat细胞中TCR组分表达的剂量依赖性减少。◉ HDAC抑制剂处理后，Jurkat细胞激活的剂量依赖性减少。◉ 人原代T细胞在体外用HDAC抑制剂处理的示意图。◉ 上图显示了固定化的抗CD3和/或CD28激活的人原代CD4阳性T细胞，在有或无帕比诺司他处理下的显微照片（n = 1）。下图显示了聚集物平均大小（如上图所示）随所用HDAC抑制剂剂量的变化。误差棒表示来自5张图片的标准偏差。P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，与DMSO处理相比。显著性检验采用单因素方差分析使用F统计量，随后进行Tukey诚实显著差异事后检验，置信区间为95%，并进行多重比较校正。比例尺为400微米。◉ 人原代T细胞在体外用HDAC抑制剂处理后，蛋白质表达变化的剂量依赖性。Para_02 为了测试 HDAC 抑制是否也会降低原代人 T 细胞中 TCR 成分的蛋白质表达，我们从健康供体中分离了 CD4 和 CD8 阳性 T 细胞，并将未处理（称为‘初始’）和抗 CD3/CD28 激活的细胞暴露于多种 HDAC 抑制剂（图 5d）。 活细胞成像显示，药物处理的原代细胞表现出与携带抗 CD3/CD28 抗体的微珠结合的能力减弱（图 5e 和扩展数据图 7d）。 此外，所有测试的 HDAC 抑制剂在所有四个外周血细胞群体中重现了体外 Jurkat 细胞系实验的结果，表现为 CD247、CD3D 和 CD3E 的剂量依赖性减少（图 5f）。 在许多其他蛋白质中，初始细胞在 HDAC 抑制剂处理后观察到转录因子 TCF7 的剂量依赖性减少，TCF7 是初始 T 细胞分化的主要调控因子。 在激活的细胞中，我们观察到颗粒酶 B 水平的降低，颗粒酶 B 是 T 细胞激活和增殖的重要调控因子（扩展数据图 7e,f）。 这些结果清楚地表明，HDAC 抑制影响 T 细胞的激活和分化，尽管其功能后果尚不清楚，但可能对使用 HDAC 抑制剂作为抗癌药物或研究 T 细胞生物学的工具具有重要意义。DiscussionPara_01 DecryptE 特别关注细胞对药物（或其他生物活性剂）的长期剂量依赖性反应，类似于许多表型分析。 不同之处在于，DecryptE 产生了数千个分子读数，而不仅仅是单一的读数（例如，细胞活力或形态变化）。 因此，这种方法不应与旨在阐明药物靶点或揭示导致细胞终点的信号通路的蛋白质组学技术混淆。 这些重要的药物作用机制方面可能包含在 DecryptE 谱型中，但如果没有大量的先前知识，从数据中可能并不明显。 相反，DecryptE 谱型反映了细胞药物作用机制中的第三个要素，即蛋白质组成向药物适应的（新的）细胞状态的转变，这一点在引言中有所提及。 当前工作的两个主要新技术方面如下： 首先，展示了微流-LC 和 FAIMS 的结合可以实现深度蛋白质组覆盖和定量信息（剂量-反应曲线），在一个多小时的分析时间内，针对一种药物和约 8,000 种蛋白质。 其次，证明了剂量-反应测量提供了单剂量无法获得的信息。 因此，DecryptE 方法为大规模蛋白质组范围的药物扰动筛选铺平了道路，通过结合比这里使用的更快、更灵敏的质谱仪以及数据非依赖采集或串联质量标签的稳定同位素多重标记，可以进一步增强这一方法。 我们的数据已经提供了超过 100 万个剂量-反应曲线，为科学界提供了一个丰富的资源，可以通过许多未在此涵盖的方式进行分析。 例如，我们严格只考虑了 S 型剂量-反应特性，因为这些被认为是理解最透彻的药物-蛋白质相互作用。 然而，数据中也可能包含非 S 型的药物诱导行为，这可能代表细胞中的药理开关。Para_02 虽然蛋白质表达谱能够忠实地反映药物引起的蛋白质表达变化，但这些变化可能由多种机制引起，从而为药物的作用机制提供了重要信息。 鉴于此处对 mRNA 和蛋白质-药物谱型的比较，我们建议在未来系统地测量转录组和蛋白质组，以剂量依赖的方式平行进行，以便更好地理解转录本身或剪接事件在其中所起的作用。 同样，通过添加测量蛋白质合成和降解的蛋白质组学方法，例如使用稳定同位素进行脉冲标记，将提供额外的重要见解。 后者尤为重要，因为当前药物研发中对化学降解分子（如蛋白酶体靶向嵌合体或分子胶）的高度关注。Para_03 即使未在此处进行研究，我们注意到药物引起的蛋白质水平变化可能是细胞类型特异的。 DecryptE 对免疫调节酰亚胺类药物（IMiDs）如沙利度胺、泊马度胺、来那度胺和伊伯度胺的分析显示，E3 泛素连接酶复合体本身的成员（CRBN、DDB1、CUL4a）的蛋白质水平没有发生变化。 这表明泛素化复合体作为经典酶，在泛素转移后释放其新底物，并且分子胶起到催化作用。 内源性 CRBN 底物（GLUL、ORAI1）在 IMiD 处理下未受影响。 DecryptE 分析进一步显示，四种 IMiDs 中的三种在 Jurkat 细胞中以剂量依赖的方式降解了新底物 IKZF1。 然而，其他报道的新底物如 IKZF2、IKZF4 和 PATZ1 并未受到影响。 RAB28 被鉴定为伊伯度胺在 Jurkat 细胞中的一个新底物。 这些与文献中的明显差异可能源于特定生物模型系统中泛素化机制的分子差异。Para_04 我们注意到，观察到的药物效应不仅依赖于所使用的模型系统，还依赖于时间，这可能因每种化合物而异。 这一观点得到了支持，即在比较 decryptE 画像与已发表的单剂量数据时，绝对调控数量以及显示药物反应的蛋白质存在巨大差异（补充图 2 和存放在 MassIVE 上的数据）。Para_05 未来 decryptE 的扩展应包括翻译后修饰（PTMs），尽管长期药物反应可能导致复杂的 PTM 数据集，这些数据集可能难以解释。 当前工作的特殊案例说明了这一需求，例如 pemrametostat 和 onametostat。 这两种药物都是蛋白质精氨酸甲基转移酶 PRMT5 的抑制剂，导致目标蛋白质的甲基化水平降低。 通过在标准蛋白质鉴定数据库搜索中将甲基化作为可变修饰包含进来，可以测量两种药物对 PRMT5 底物 SNRPB 甲基化位点的细胞内酶活性抑制，其抑制效力低至纳摩尔级别（扩展数据图 8f）。 如果未考虑 PTM 水平，这种抑制作用可能会被忽视。Para_06 本研究最令人兴奋的药理学结果是观察到组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDAC抑制剂）导致TCR的强烈且有效的下调，伴随T细胞反应能力的降低。 这可能解释了HDAC抑制剂在治疗由TCR信号驱动的T细胞淋巴瘤或在某些自身免疫疾病动物模型中观察到的TCR信号减弱的有效性。 同时，由于TCR活性对T细胞谱系选择、抗原特异性、效应功能和存活至关重要，TCR复合体成分的抑制表达可能对所谓的‘热’肿瘤的治疗不利，这些肿瘤以免疫细胞浸润为特征，通常对免疫检查点抑制疗法有反应。 在这种情况下，结合免疫检查点抑制与HDAC抑制剂的临床试验设计可能会受到质疑。 然而，也可能存在有益的情况。持续的高抗原刺激可能导致T细胞耗竭，削弱免疫系统对抗肿瘤的能力。 在这种情况下，取决于肿瘤的免疫状态，TCR复合体成分在HDAC抑制下的抑制表达可能会将TCR刺激的绝对水平降低到足以重新激活耗竭的T细胞反应的程度。 显然，需要进一步的功能研究来更好地理解这种可能的HDAC抑制剂相关效应在患者中的表现，以及HDAC抑制剂作为研究工具在研究T细胞耗竭方面的潜力。Para_07 综合本研究获得的结果表明，药物诱导的蛋白质表达变化的剂量依赖性和全蛋白质组测量应成为剂量依赖性靶标解析和通路参与研究的标准工具。 这些综合信息对于基础研究以及临床前和临床药物发现都具有极高的价值，因为它能更好地理解生物活性化合物的分子能力，从化学探针到人类药物。MethodsCell culture 细胞培养Para_01 人源 Jurkat 细胞克隆 E6.1 (ATCC TIB-152) 在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 RPMI-1640 培养基中于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养。 每 2-3 天更换一次培养基，细胞密度保持在每毫升 0.5 × 10^6 至 2 × 10^6 个细胞，直到裂解或药物处理。Para_02 细胞系鉴定通过单核苷酸多态性分析（Multiplexion）完成。Compound information 化合物信息Para_01 本研究中包含的144种化合物的目标空间信息来源于DrugBank在线（截至2023年7月）和供应商规格。 这些化合物在研究进行时所处的临床阶段信息从ChemBL获取（截至2023年7月）。Compound treatment 复合治疗Para_01 化合物预先在DMSO中稀释，然后在48孔深板中的培养基中进一步稀释。每个48孔深板加入三个DMSO对照。 处理时，每孔加入4 × 10^6个细胞，细胞悬浮于含10% FBS的RPMI-1640培养基中，最终体积为2毫升，处理浓度从10 µM到1 nM，以全对数步骤递减，每种药物共有五个剂量（10 µM、1 µM、100 nM、10 nM、1 nM）。 细胞在37°C、5% CO2和240 rpm条件下孵育18小时，除非另有说明。 次日，对细胞进行活力评估和裂解。Confluency, viability and metabolic activity assessment 汇合度、活力和代谢活性评估Para_01 为了测定化合物处理后细胞的活力和代谢活性，每孔加入100微升细胞悬浮液至含有50微升IncuCyte Cytotox染料（最终浓度250 nM，Sartorius）和alamarBlue细胞活力试剂（最终浓度10% v/v，Invitrogen）的96孔板中。 将平板放入IncuCyte活细胞分析系统（37°C和5% CO2）中，并在3小时内对细胞进行细胞毒性分析（10倍放大，扫描类型为标准，每孔采集五张图像，通道选择为相位对比和荧光（300毫秒采集时间），扫描间隔为每小时一次）。 使用IncuCyte集成软件（Basic Analyzer）进行汇合度和细胞毒性分析。 在3.5小时后，通过荧光测量AlamarBlue试剂的荧光强度，使用FluoStar Omega微孔板读数器（激发波长544 nm，发射波长584 nm，BMG Labtech）测定代谢活性。 错误！！！ cannot unpack non-iterable NoneType objectPara_03 论文中或其他地方显示的任何显微图片均直接从 IncuCyte 软件导出，未进行进一步修改。Cell lysis for protein extraction 细胞裂解以提取蛋白质Para_01 为了获得未处理细胞的裂解液（用于优化目的），将细胞悬浮液在室温下以172g离心5分钟，用PBS（磷酸盐缓冲盐水，不含钙或镁）洗涤并收集沉淀，然后再悬浮于裂解缓冲液中（2% SDS，40 mM Tris/HCl，pH 8，95°C）。Para_02 处理过的细胞在96深孔板中进行裂解。因此，在处理18小时后，48深孔板以172g离心10分钟，温度为4°C，弃去上清液，细胞沉淀用PBS重悬并转移到96深孔板中。细胞沉淀再用PBS洗涤两次，并在裂解前通过离心弃去上清液，最后在100微升裂解缓冲液中裂解。Para_03 为了水解 DNA，将裂解物加热到 95 °C 并在 172g 的摇动下保持 10 分钟，然后加入三氟乙酸至最终浓度为 1%（体积比），并在摇动下孵育 1 分钟。 随后，加入 N-甲基吗啉 (NMM) 至热裂解物中以中和 pH 至最终浓度为 2%（体积比）。 裂解物在 −20 °C 下保存，直至进一步使用。Tissue and bacteria sample preparation 组织和细菌样本制备Para_01 小鼠（Mus musculus）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的组织样本在液氮中快速冷冻，然后使用 TissueLyser II（Qiagen，5分钟，30 Hz，使用一个5毫米直径的不锈钢珠）进行均质化。 移除钢珠后，加入裂解缓冲液（4% SDS，40 mM Tris/HCl，pH 8），然后使用 Bioruptor Pico（Diagenode，25个循环，每次30秒开/关）进行超声处理。 DNA 水解按照上述方法进行，最终浓度分别为2%三氟乙酸和4% N-甲基吗啉。 裂解物通过离心（60分钟，4°C，21,000g）清除，上清液裂解物储存在−20°C直至进一步使用。Para_02 大肠杆菌（E. coli）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）在37°C、300转/分钟的摇床中于LB培养基中培养。 当分别达到0.5和0.6的光学密度时，通过离心（172g，60分钟，4°C）收获培养物，并用PBS洗涤两次。 向沉淀中加入裂解缓冲液，随后按照上述方法进行DNA水解。 使用Bioruptor Pico对裂解物进行超声处理，然后通过离心（21,000g，60分钟，4°C）清除。 清除后的裂解物储存在−20°C直至进一步使用。Isolation and sorting of T cells from healthy donors 从健康供者中分离和分选T细胞Para_01 从两名健康的自愿人类捐赠者（男性，26岁）那里获取了去血小板的血液样本，他们在提供书面和知情同意后进行了捐赠。这项研究得到了慕尼黑工业大学医院伦理委员会的批准。 样本被转移到50毫升的Falcon管中，每个管子大约含有15毫升的血液。 然后用PBS将Falcon管填充至总体积为37.5毫升，并充分混合血液。 为了分离外周血单核细胞（PBMCs），使用24毫升注射器和长针（G 20 × 2 3/4’；直径0.9 × 70毫米）小心地在管底铺设12毫升的Pancoll层。 随后，血液样本在室温下以编程梯度离心（加速7，减速1，2,7g，20分钟）。 梯度离心后，弃去血浆部分，小心收集含PBMC的白细胞层。 然后用50毫升PBS洗涤PBMCs，离心（441g，5分钟，室温）进行处理。Para_02 为了细胞分离，将 107 个 PBMC 重悬于 40 微升 MACS 缓冲液（PBS，1% FCS，2 毫摩尔 EDTA）中，并在 4°C 下与 10 微升抗人 CD4 磁珠孵育 15 分钟。 随后，用 15 毫升 MACS 缓冲液洗涤 PBMC，并进行离心。 使用 autoMACS Pro Separator 正向富集 CD4 T 细胞。 收集流穿液并根据 CD4 T 细胞分离方案用于 CD8 T 细胞的分离。 分离的原代 T 细胞在含有 10% FBS 和 1% 青霉素和链霉素的 RPMI-1640 培养基中培养（37°C，5% CO2），并立即进行 HDACi 处理或按照以下描述进行激活。HDACi treatment of peripheral T cells from healthy donors 健康供者的外周T细胞经HDACi处理Para_01 对于每个细胞群体（CD4+/CD8+），一部分细胞使用 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 进行激活，该试剂用于 T 细胞扩增和激活（Invitrogen），并在 HDAC 抑制剂（HDACi）处理前孵育 48 小时（37°C，5% CO2）。 幼稚 T 细胞在分离和分选后立即进行处理。 无论是否激活，细胞均用不同浓度的 HDACi（每种药物五个剂量：10 µM、1 µM、100 nM、10 nM 和 1 nM）处理 18 小时，随后按照上述方法评估细胞活力、汇合度和细胞毒性。 细胞裂解、蛋白质提取以及后续的蛋白质组学工作流程和 LC–FAIMS–MS/MS 测量按照各自部分的描述进行。 对于可用材料有限的样本，调整了蛋白输入以进行胰蛋白酶消化，并将获得的肽加载到 Evotips 上，在 Evosep-FAIMS-Exploris 平台上进行分析，如前所述。Transcriptome sample preparation and analysis 转录组样本制备与分析Para_01 为了进行转录组分析，Jurkat 细胞按照上述描述的方案进行了处理。 18 小时后，细胞被裂解，总 RNA 使用 ReliaPrep RNA 细胞小量制备系统（Promega）提取，按照制造商的协议操作，并在 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies）上进行评估。 RNA 文库制备使用了带有唯一双指数的 3' mRNA-Seq 文库制备试剂盒 FWD（Lexogen），并送往 Lexogen 进行基因表达谱分析。 获得的读段比对使用制造商提供的数据处理管道进行，采用 QuantSeq FWD 管道和智人（H. sapiens）基因组注释。 获得的比对结果进行了修剪，读段被计数并归一化。 剂量-反应曲线根据以下‘曲线拟合’部分描述的方法拟合到数据上。SP3 sample preparation and tryptic digestion SP3 样品制备和胰蛋白酶消化Para_01 蛋白质产量通过 Thermo Pierce BCA（双缩脲酸）蛋白测定法确定。所有步骤均按照制造商的协议进行。Para_02 在进行胰蛋白酶消化之前，通过单锅 SP3 净化方法去除了去垢剂，该方法基于 Hughes 等人首次描述的协议，并适应于 Agilent Bravo 液体处理平台。 简而言之，含有 200 微克蛋白质的裂解液与 1 毫克 SP3 磁珠（A 型和 B 型 Sera-Mag 羧酸修饰磁珠 50:50 混合物 (Cytiva Europe)）在 96 孔深孔板中混合，蛋白质在 70% 乙醇（双蒸水）中沉淀到磁珠上。Para_03 珠子用80%的乙醇在ddH2O中洗涤三次，用100%的乙腈洗涤一次。 二硫键在37°C下用10 mM二硫苏糖醇还原45分钟，随后在室温下用55 mM氯乙酰胺（CAA）对半胱氨酸进行烷基化处理30分钟，反应体系为100 µl消化缓冲液（40 mM Tris-HCl，pH 7.8，含2 mM CaCl2）。 加入胰蛋白酶（酶与蛋白质重量比为1:50），在37°C和1,200 rpm的条件下过夜消化珠子上的蛋白质。 为了回收肽段，珠子在磁铁上沉淀，上清液转移到新的96孔板中。 珠子用100 µl 2%甲酸在ddH2O中洗涤，上清液转移到收集板中。 随后，样品按照以下描述进行脱盐处理。Desalting and drying of peptides 肽的脱盐和干燥Para_01 在进行液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析之前，样品使用亲水-疏水平衡的96孔板（含有10毫克N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯多孔颗粒，粒径30微米，Macherey-Nagel）通过7g离心1分钟进行脱盐处理，除非另有说明。 为此，亲水-疏水平衡材料首先用500微升异丙醇、乙腈和溶剂B（70%乙腈中的0.1%甲酸，ddH2O）预处理，并用1,000微升溶剂A（ddH2O中的0.1%甲酸）平衡5分钟后加载样品（重力作用，5分钟）。 样品流过液重新应用于板上，结合的肽段用1,000微升溶剂A洗涤。 肽段用250微升溶剂B洗脱（3分钟，7g；1分钟，172g）。 样品在−80°C冷冻，真空离心干燥后存储于−20°C，直至进行LC–MS/MS测量。High pH reversed-phase fractionation 高pH反相分级Para_01 在这里，50微克的肽（拟南芥用于扩展数据图1i，Jurkat细胞用于图3b和扩展数据图4d–e）通过碱性pH反相材料（反相磺酸柱尖；5微升聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）树脂，安捷伦）分为六个组分，使用安捷伦AssayMAP Bravo移液系统进行分离。 根据制造商的协议，反相磺酸柱进行了预处理、洗涤和平衡。 肽在100微升25毫摩尔甲酸铵（pH 10）中重新溶解并加载到柱上。 通过增加乙腈浓度（5%，10%，15%，20%，25%，30%，80%）对肽进行分级。 七个洗脱步骤要么合并为六个组分，将5%和80%的组分合并，要么合并为四个组分。 对于四个组分，5%和25%、10%和30%、15%和80%以及20%的乙腈组分和流穿液分别合并。 所有组分用甲酸酸化至最终浓度为1%。 样品在−80°C冷冻，通过真空离心干燥，并在−20°C储存，直到进行LC–MS/MS测量。Microflow-LC–(FAIMS)–MS/MS measurements 微流控液相色谱–（FAIMS）–串联质谱测量Para_01 所有样品（另有说明的除外）均在微流LC–MS/MS系统上进行分析，该系统使用了Vanquish Neo超高效液相色谱系统（赛默飞世尔科技）与Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪（赛默飞世尔科技）联用，配有或不配有FAIMS Pro接口（赛默飞世尔科技）。 所用仪器软件的完整列表见补充材料表3。Para_02 测量前，样品在0.1%甲酸和2%乙腈中复溶。 为了系统优化，使用纳升滴定系统（赛默飞世尔科技）确定肽浓度，并根据每次运行所需的肽量进行注射。 对于药物谱型样品，每次运行注射一半的样品（50微克）。 对于分馏样品，则全部注射。Para_03 色谱分离通过直接注射在15厘米的Acclaim PepMap 100 C18柱（2微米，1毫米内径×15厘米，赛默飞世尔科技）上进行，流速为每分钟50微升。 柱温设置为55摄氏度。 溶剂A为ddH2O中的0.1%甲酸和3%二甲基亚砜，溶剂B为ACN中的0.1%甲酸和3%二甲基亚砜。 不同长度的梯度可以在补充表3，LC梯度中找到。Incorporation of FAIMS into microflow-LC–MS/MS 将FAIMS整合到微流LC–MS/MS中Para_01 由于微流液相色谱（micro-LC）分离产生的峰比纳升液相色谱（nano-LC）更尖锐，因此需要从头评估将FAIMS整合到微流液相色谱-质谱联用系统（microflow-LC–MS/MS）中的效果。 我们首先使用胰蛋白酶消化物在不同补偿电压（CV）值下表征了肽段的传输性能。 基于这些数据，我们接下来模拟了应结合多少个以及哪些CV值以获得最佳的蛋白质组覆盖度。 模拟结果通过使用15到180分钟的液相色谱梯度进行了实验测试，我们系统地比较了有和没有FAIMS时的性能差异。 对于15、30和60分钟的梯度时间，由于CV切换需要大量时间，因此只能有意义地使用一个CV设置。 无论液相色谱时间如何，与相同LC设置但不使用FAIMS相比，FAIMS在给定时间内增加了识别的蛋白质组数量，或将获得相同分析深度所需的质谱时间减半。Measurement without FAIMS installed 未安装FAIMS的测量Para_01 使用配备加热电喷雾离子化探针的 OptaMax NG 离子源（赛默飞世尔科技）获取数据。喷雾器位于 x 轴（从左到右）的中间位置，y 轴（从前到后）的 1 位置，以及 z 轴（探针高度）的 M 和 L 位置之间。Para_02 质谱仪在数据依赖的 MS/MS 模式下运行，采用正离子模式，喷雾电压为 3.5 kV，漏斗射频透镜值为 40，离子传输管温度为 325 °C，蒸发器温度为 125 °C。鞘气、辅助气和扫气的流速分别设置为 32、5 和 0 L/min。Para_03 在 Orbitrap 中以轮廓模式记录了从 360 到 1,300 m/z 的全扫描（MS1），分辨率为 120,000。 MS1 的 AGC 目标设置为 100%，最大注入时间 (maxIT) 设置为 50 毫秒。 根据全扫描结果，如果同位素包络是肽类（单同位素前体选择），电荷在 2 到 6 之间且强度超过 1 × 10^4，则将前体靶向 MS/MS 扫描（MS2）。 MS2 四极杆隔离窗口设置为 0.4 m/z。 肽片段化在离子路由多极中通过 HCD 进行，采用固定碰撞能量模式，碰撞能量根据前体 m/z 和电荷归一化为 28%。 MS2 扫描在离子阱中以快速扫描速率在质心模式下进行，定义的第一个质量为 100 m/z。 不同梯度长度的特定 MS2 属性和循环时间可以在补充表 3 的 MS 设置中找到。Measurement with FAIMS installed 安装FAIMS后的测量Para_01 使用了与上述相同的离子源和探针，应用相同的位置设置。 质谱仪在数据依赖的 MS/MS 模式下运行，采用正离子模式，喷雾电压为 4 kV，漏斗射频透镜值为 40，离子传输管温度为 325 °C，蒸发器温度为 300 °C。 鞘气和辅助气的流速分别设置为 40 和 5 升/分钟。 FAIMS 在标准分辨率下运行（内外电极温度为 100 °C），静态载气流速为 3.5 升/分钟。 测量参数保持不变，相应的 FAIMS 补偿电压设置为所需值。 对于药物扰动样品的测量，使用了 60 分钟的梯度，并将补偿电压设置为 -30 V。Para_02 如果使用了多个内部交叉验证（系统优化），则在 Tune 方法中为不同的交叉验证指定了独立的实验，这些实验的设置完全相同，除了不同的 CV 值（使用的 CV 值可以直接从图表或原始文件名中读取）。 这导致 MS 在方法中循环通过指定的实验，在每个 MS 循环后切换（MS1 扫描 + MS2 扫描）。 为了保持数据点和定量质量的稳定性，上述循环时间除以使用的内部交叉验证数量，结果是 60 分钟（两个 CV）时为 0.75 秒，120 和 180 分钟（两个 CV）时为 1.4 秒，120 和 180 分钟（三个 CV）时为 0.8 秒。Database searching 数据库搜索Para_01 原始 MS 数据文件使用集成的 Andromeda 搜索引擎和 MaxQuant v.1.6.2.10 处理，并针对相应的参考数据库进行搜索（人类：从 UniProt 下载，包含标准序列和同工型，下载日期为 2020 年 8 月 24 日；75,776 条目，大肠杆菌：从 UniProt 下载，包含标准序列和同工型，下载日期为 2021 年 7 月 1 日；4,713 条目，铜绿假单胞菌：从 UniProt 下载，包含标准序列和同工型，下载日期为 2021 年 7 月 1 日；5,563 条目，小鼠：从 UniProt 下载，包含标准序列和同工型，下载日期为 2021 年 7 月 1 日；25,381 条目，拟南芥：从 Arabidopsis.org 下载 Araport11 基因组版本，包含标准序列和同工型，下载日期为 2020 年 6 月 16 日；48,359 条目）。Para_02 来自多次内部FAIMS CV运行的原始文件必须根据CV值拆分成单独的文件，然后进行MaxQuant搜索。 这些单独的文件在MaxQuant中被指定为不同的分数，就像基本的反相分数一样，属于同一实验的不同部分。 同一样品的多次进样被指定为同一实验。 使用标准的MaxQuant搜索参数。 指定Trypsin/P为蛋白酶，允许最多两次未切割的情况。 胱氨酸的羧甲基化被指定为固定修饰，而甲硫氨酸的氧化和蛋白质N端乙酰化被视为可变修饰。 如需指定，精氨酸和赖氨酸的单甲基化和二甲基化也被启用为可变修饰。 无标签定量（LFQ）算法被启用，其标准LFQ最小比率计数设置为1；同时，基于强度的绝对定量（iBAQ）算法也根据需要启用，并使用对数拟合。 当使用时，Match-Between-Runs算法以默认设置（匹配窗口0.7分钟和保留时间对齐窗口5分钟）被启用。 假发现率（FDR）在蛋白质和肽谱匹配水平上设置为1%。 对于Prosit重新打分，FDR在蛋白质和肽谱匹配水平上设置为100%。 相应的MaxQuant msms .txt和.raw文件由Prosit重新打分。 q值≤0.01的肽被保留，蛋白质根据选择的FDR方法进行分组。 对于MaxQuant输出，未找到唯一肽的蛋白质被聚合到蛋白质组中，因此无法区分。 对于选择的FDR蛋白质组输出，蛋白质在基因水平上分组，仅考虑唯一肽。 为了便于阅读，我们在图中统称为蛋白质。 数据分析和可视化使用R（v.4.1.0）在RStudio中进行（详见补充表3，材料中列出了所有使用的软件包），并使用Microsoft Excel 365进行进一步编辑。 图的进一步编辑在Adobe Illustrator CS6中完成。 是否对数据集进行了重新打分的信息可以在MassIVE（数据可用性部分）中找到。Data processing and analysis 数据处理与分析Curve fitting 曲线拟合Para_01 对于每种蛋白质-药物组合，计算了所有药物浓度下相对于DMSO对照组平均蛋白质强度的LFQ强度。 同样地，对于转录组数据中的每种转录本-药物组合，使用读取计数进行了类似的计算。 对于不同的存活率指标，数据准备如上所述。 对这些归一化数据，使用剂量-反应曲线R包（v.3.0-1）拟合了一个四参数对数逻辑模型（公式（1）），其中x是药物浓度的log10值，pEC50是曲线拐点的负对数（表示为有效浓度50；EC50），t是高剂量平台期的顶部或低剂量平台期的底部，b是低剂量平台期的底部或高剂量平台期的顶部，s是平台之间的曲线斜率，Y(x)是在浓度x下相对于载体对照观察到的蛋白质比例。Para_02 对于每个生成的模型，提取并报告了描述性参数。这些参数包括优化后的斜率（s）、顶点（t）、底点（b）和拐点（EC50），以及曲线下面积、决定系数（R2）、平均绝对偏差、最高浓度处拟合曲线的预测 y 值（曲线末端，倍数变化）和数据拟合线性模型的斜率。Curve classification 曲线分类Para_01 为了避免手动标注超过100万条剂量-反应曲线，使用ranger R包（版本0.14.1）训练了一个随机森林分类器。 作为真实数据集，两种化合物的曲线被手动标注为上调、下调和非调控。 数据集按80:20的比例分为训练集和验证集（训练集11,562条，验证集2,883条，总计14,409条）。 输入特征包括上述描述的值，以及所有浓度下的相对LFQ强度和唯一肽段数量，以及相应蛋白质在DMSO对照中的丰度百分位数。 经过超参数调优后，最终模型使用1,200棵树进行训练，每次分裂随机选择15个独立变量，并且仅对节点大小至少为3的节点进行分裂。 变量重要性模式设置为不纯度，应用了Gini分裂规则。 使用验证数据集测试了模型的性能和质量，计算了精确度、混淆矩阵和ROC曲线。 生成的分类器用作预筛选工具，根据预测类别将曲线分别绘制到单独的PDF文件中，并将信息写入单独的.txt文件，从而便于所有药物数据集的手动检查。 相同的分类器还用于药物扰动转录组数据集的剂量-反应曲线。 这些调控蛋白质进一步分析以探索药物的作用机制。Further filtering 进一步过滤Para_01 为了进一步分析，如果蛋白质被分类为上调或下调，并且其变化倍数分别超过1.5和0.7，则认为该蛋白质是上调或下调的。同样适用于所有转录本，同时仅保留所有浓度下读数计数超过50的观察结果。GO term enrichments GO 术语富集Para_01 为了对具有相似效果的药物进行热图聚类，使用 clusterProfiler R 包（版本 4.2.2）对每种药物分别进行了 GO 术语富集分析。 每个药物数据集在上调和下调蛋白质中都测试了 GO 术语在所有层次（细胞区室、分子功能和生物过程）上的富集情况，以整个药物数据集为背景。 P 值使用 FDR 方法进行校正，q 值的截止值设置为 1。 上调和下调的富集结果被合并，保留重复项中更显著的条目。 在合并所有药物的富集结果后，q 值进行了对数转换，对于在下调中富集的 GO 术语乘以 -1，并对每个 GO 术语单独进行了 z 分数标准化。 热图展示了在使用皮尔逊相关性作为距离度量和加权组平均法作为凝聚方法进行层次聚类后的行和列的综合预处理 GO 术语富集结果。 扩展数据图 6a 中显示的 GO 术语富集结果来自上述全局 GO 术语富集分析。 对于扩展数据图 5d，进行了新的 GO 术语富集分析（P 值截止值为 0.05；P 值校正方法为 FDR；亚本体为分子功能；以整个 H. sapiens 数据库为背景）。Dose-dependent methylation 剂量依赖性甲基化Para_01 赖氨酸和精氨酸甲基化的搜索结果按照上述蛋白质和转录本描述的过程进行剂量-反应曲线拟合准备。然而，对于每个肽-浓度-抑制剂组合，计算了甲基化与未甲基化版本的强度比值。所得值接着归一化到相应的 DMSO 对照，然后再按照上述步骤继续（‘曲线拟合’部分）。Simulation of target coverage in relation to proteomic depth 与蛋白质组学深度相关的靶标覆盖模拟Para_01 为了模拟目标覆盖与捕获的蛋白质组深度，我们根据所有 DMSO 对照组中每个蛋白质的平均 iBAQ 值，对本研究中鉴定出的 8000 多种蛋白质进行了降序排列。 为了模拟不同的蛋白质组深度，该列表在指定的排名处截断（即鉴定出的蛋白质数量）。 对于每种药物，我们依次检查其目标蛋白中有多少被包含在截断后的列表中，并计算检测到的目标蛋白的比例。Replicate analysis 重复分析Para_01 为了评估定量可重复性，扩展数据图2b中的火山图显示，48个DMSO对照被随机分成两个等大小的组。 在对选定的FDR基因组输出的LFQ强度进行中位数中心归一化并过滤数据集中的完整性后，对所有4,694个蛋白质进行了双侧Student’s t检验。 P值使用R包fdrtool（版本1.2.17）中的FDR方法校正多重假设检验。Para_02 为了比较未调控和调控蛋白质在定量可重复性方面的差异，使用每种抑制剂的五个单独剂量作为重复，对选定的 FDR 基因组输出的 LFQ 强度进行了中位数中心化归一化。 对于每种药物，计算了每个被分类为上调、下调或未调控的蛋白质在五个剂量中的变异系数。Para_03 为了评估 EC50 测定的可重复性，按照上述方法对每种药物每个蛋白的重复曲线进行了拟合。 对于在四种药物重复中有三种被分类为上调或下调的蛋白质，计算了 pEC50 的标准偏差。Real-time RT–qPCR 实时逆转录定量聚合酶链反应Para_01 对于实时定量 PCR (RT-qPCR) 分析，细胞按照上述描述的协议进行处理。 18 小时后，细胞被裂解，使用 Monarch 总 RNA 快速提取试剂盒 (New England Biolabs) 按照制造商的说明提取总 RNA。 使用 Qubit 荧光计 (Thermo Fisher Scientific) 测定 RNA 的产量。 使用 LunaScript RT SuperMix Kit (New England Biolabs) 从每个样本的 2 µg RNA 中生成互补 DNA (cDNA)，并按照制造商的协议进行操作。 此外，在逆转录步骤中为每个样本生成了无逆转录酶对照。 逆转录后，cDNA 用无核酸酶的 ddH2O 稀释约 66 倍。 qPCR 在 CFX384 Touch 实时 PCR 检测系统 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) 上以三重复的方式进行，每个样本使用 10 ng cDNA，Luna Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs) 和补充表 3 中列出的引物对。 无逆转录酶对照在每个板上所有样本的混合物中测量。 每个实验使用无核酸酶的 ddH2O 作为非模板对照。 循环参数设置为 95 °C (1 分钟)，40 个循环，每个循环包括 95 °C (15 秒) 和 60 °C (30 秒，SYBR 通道读板)，最后记录从 60 到 95 °C 的熔解曲线，每次增加 0.5 °C，每 5 秒读一次 SYBR 通道。 所有用相同药物处理的样本以及 DMSO 对照都在同一块板上测量。Analysis of RT–qPCR results RT-qPCR 结果分析Para_01 量化周期 (Cq) 和熔解温度 (Tm) 值在 CFX Manager v.3.1 软件 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) 中确定。 软件使用回归方法进行 Cq 评估，基线校正和曲线拟合已开启。 处理后的表达量变化倍数以及截短转录本与全长转录本的比例是通过 Microsoft Excel 365 从每个样本的平均 Cq 值使用 2-ΔΔCq 方法计算得出的。T cell activation assay T细胞活化实验Para_01 使用 T 细胞活化生物测定法（Promega）分析了经过 HDACi 处理的 Jurkat 细胞的活化潜力，该方法使用 TCR 和/或 CD3 效应细胞（活化的 T 细胞核因子或 NFAT），并对制造商的协议进行了轻微修改。 简而言之，TCR/CD3 效应细胞（NFAT）与 HDACi（每种药物五个剂量：10 µM、1 µM、100 nM、10 nM 和 1 nM）孵育 16 小时，随后通过 Human Anti-CD3/CD28 T 细胞活化试剂盒（Cell Signaling Technology）进行非特异性激活，激活途径为 CD3 和/或 CD28。 5 小时后，通过微孔板读数器 FluoStar Omega（BMG Labtech）测量荧光素酶活性，以读取受体介导的信号传导。 由此，荧光信号的强度对应于受体介导的信号传导的强度。 为了确定 T 细胞活化的强度，荧光信号被归一化到 DMSO 对照组。 剂量-反应曲线根据‘曲线拟合’部分描述的方法拟合到数据上。T cell aggregation analysis T细胞聚集分析Para_01 使用上述描述的 IncuCyte 活细胞分析系统获取的活化人 T 细胞的亮场图像，对细胞聚集体进行分配和量化（计数和面积，单位为平方微米）。 为此，图像通过 ilastik 进行处理，这是一种监督学习图像分析工具包。 通过将检测到的聚集体面积相加并除以每张图像中的聚集体数量，计算每个图像的平均聚集体大小，将每个孔获取的五张图像视为重复样本。 为了评估 HDACi 诱导的平均聚集体大小减少的统计显著性，对每种抑制剂分别进行了方差分析，随后进行了 Tukey 真实显著差异事后检验。Reporting summary 报告摘要Data availabilityPara_01 质谱蛋白质组学原始数据、UniProt参考数据库（fasta文件）、MaxQuant搜索结果、Prosit输出、转录组学原始数据和结果、剂量-反应曲线拟合输出（.pdf和.txt文件）以及与其他研究的比较已通过MassIVE合作库提交至ProteomeXchange联盟，数据集标识符为MSV000093659（PXD047799）。 本文所有剂量-反应曲线均可在ProteomicsDB网站上在线查看（www.proteomicsdb.org/decryptE）。 此外，剂量-反应曲线可以在自建的Shiny应用程序中可视化和比较（https://decrypte.proteomics.ls.tum.de/）。 还提供了有关细胞形态、细胞代谢活性、细胞毒性、蛋白质半衰期以及化合物和药物靶标亲和力（如有可用）的附加信息，以帮助解释观察到的效果。Code availabilityPara_01 所有用于数据整理、分析和可视化的代码均基于各自部分中所标明的公开可用的 R 包，并将在请求时无访问限制地提供。