Neomycin Sulfate

流感病毒是一种具有包膜的单链 RNA 病毒，能够引发流感。季节性流感病毒主要有三种血清型，分别是 A、B 和 C 型。其中，A 型流感病毒可感染人类和非人类，B 型仅感染人类，而 C 型则极为罕见，对人类的感染也很少见。在这三种类型中，A 型病毒的致病性最强，会给人类带来最为严重的疾病。流感疫苗的抗原靶点 这些流感病毒类型的差异是由两种内部结构蛋白，即核衣壳蛋白（NP）和基质蛋白（M）的抗原差异所决定的，并且这三种类型的病毒之间不存在交叉反应。而病毒的亚型划分则依据其表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原变异。到目前为止，从鸟类和包括人类在内的哺乳动物身上，已经发现了大约 14 种 HA 亚型（H1 - H14）和 9 种 NA 亚型（N1 - N9）的不同组合。其中，人类感染的 HA 亚型有三种（H1 - H3），NA 亚型有两种（N1、N2）。 血凝素（HA，分子量约 77 kDa）是位于病毒包膜表面的一种具有免疫原性的蛋白。神经氨酸酶（NA，分子量约 220 kDa）是一种表面酶蛋白。这些蛋白是确定流感病毒特定毒株的抗原，在介导病毒进入靶细胞的过程中发挥着关键作用。HA 蛋白参与了病毒在被感染细胞内体中的附着和膜融合过程。其抗原结构域位于表面，并且可以发生改变，这样病毒就能在避免引发免疫反应的同时，依然保持与受体结合的能力。 流感病毒经常会发生一些微小的基因突变，这种现象被称为 “抗原漂移”。它指的是病毒表面抗原蛋白发生细微变化，使得病毒能够逃避宿主的免疫防御，即便宿主之前已经感染过或者接种过疫苗，依然可能感染发病。而 A 型病毒抗原大约每十年会发生一次较大的抗原转变，从而引发大规模的流行甚至是全球大流行。季节性流感疫苗通常是三价的，而近年来出现的四价疫苗以及大流行疫苗则是单价的。 疫苗制造商每年研发和生产季节性流感疫苗通常需要数月时间。流感疫苗的生产可以采用多种方法，包括基于鸡蛋的生产方法和基于细胞培养的生产方法。基于细胞培养的流感疫苗与基于鸡蛋的流感疫苗生产对比 目前，大多数流感疫苗都是基于鸡蛋生产的。然而，每年获取鸡蛋需要较长的前置时间。而采用基于细胞培养的流感疫苗生产方法，不仅消除了这一生产瓶颈，还降低了可能因鸡蛋携带禽流感病毒而造成污染的风险。 基于细胞培养的生产工艺具有更高的可重复性，因为不同的流感毒株在鸡蛋中的生长速度各不相同，这会导致产量出现波动。此外，细胞培养衍生的病毒初始纯度更高，并且由于不含鸡蛋蛋白（胶原蛋白和白蛋白），在对灭活收获物进行纯化时具有一定优势。1. 基于细胞培养的流感疫苗生产工艺 目前，基于细胞培养的流感疫苗生产并没有一个统一的标准流程，不同的制造商遵循不同的生产方法，并根据自身的工艺理念选择各种技术。图 1 展示了一个典型的基于细胞培养的流感疫苗生产流程。 典型的商业生物反应器规模在 2500 - 5000 升之间。总的工艺产率大约为 35%，并且高度依赖于病毒毒株。基于这一产率和回收率，每升细胞培养物大约可以生产 50 - 100 剂疫苗。流感病毒的细胞培养与增殖 成功的感染需要在培养基中添加蛋白酶，通常优选胰蛋白酶或类似的丝氨酸蛋白酶。这些蛋白酶在细胞外将血凝素前体蛋白（HA0）切割成具有活性的血凝素（HA1 和 HA2）。只有经过切割的血凝素才能使流感病毒吸附到细胞上，并随后进入细胞内进行复制。MDCK 细胞的传代需要用胰蛋白酶进行消化，然后用等体积的胰蛋白酶抑制剂溶液终止消化过程。从滚瓶中取出的细胞用于接种 3 升生物反应器和一次性生物反应器（SUBs）。 MDCK 细胞培养在感染并培养 3 - 5 天后，每毫升可产生高达 1x10^9 pfu 的流感病毒。对于每种细胞系和每种病毒毒株，都需要对感染复数（MOI）、培养时间和温度等参数进行优化。假设每剂疫苗需要 45 µg 的 HA（0.5 mL），那么一个 1000 - 2000 升的生物反应器（采用基于微载体的 MDCK 悬浮培养）每个季节大约可以生产 2000 万剂疫苗。据估计，使用固体微载体和 MDCK 细胞的优化 1000 升生物反应器的产量，大约相当于 31000 个鸡蛋的产量。澄清 在澄清过程中，需要去除细胞或细胞碎片。根据所使用的澄清技术，像宿主细胞蛋白（HCP）和 DNA 等较小的杂质也可能会被部分去除。由于病毒疫苗收获物中的固体含量通常较低，因此单级（初级）澄清通常就足够了。 常用于病毒疫苗初级澄清的技术包括离心、微滤切向流过滤（MF - TFF）和深层过滤。 对于大规模生产（≥2000 升生物反应器规模），离心可能是一种更经济的解决方案。然而，离心机的放大和操作可能会比较麻烦，而且购置离心机的资本支出较高。一些制造商在澄清过程中采用 MF - TFF（使用 0.45 µm 或 0.65 µm 的非筛网膜），并在低剪切条件下进行。但 MF - TFF 的实施和操作对于工艺开发和生产规模的操作人员来说都相当繁琐，而且产率通常较低，约为 50%。深层过滤通常是首选的方法。在使用深层过滤器时，需要注意这些过滤器通常带有正电荷。由于流感病毒和宿主细胞 DNA 都带负电荷，正电荷过滤器有时会在有效去除 DNA 的同时，对病毒产生较高的吸附。因此，必须通过优化过滤通量和仔细选择缓冲液条件（盐浓度、pH 等）来平衡这种吸附问题。通过适当的优化，回收率可以达到 90% 以上。 在二级澄清步骤中，通常更倾向于使用 0.22 µm 的无菌过滤，而不是 0.45 µm 的生物负荷减少过滤。病毒灭活 病毒灭活可以使用甲醛或紫外线辐射。 甲醛是疫苗生产中最常用的灭活剂。甲醛通过将表面蛋白中的伯胺基团与 DNA 或蛋白质中相邻的氮基团不可逆地交联，从而使病毒失活。这些交联键可能会与非病毒蛋白结合，因此需要对活的感染性病毒进行初步的部分纯化，以防止病毒蛋白与杂质之间发生不可逆的化学桥接。灭活过程通常在 32°C 下进行 24 小时，福尔马林浓度为 0.1%。 波长为 254 nm 的紫外线辐射也可用于病毒灭活。有效剂量取决于多种因素，如紫外线灯的尺寸和直径、紫外线源与含病毒培养基之间的距离、紫外线强度以及含病毒培养基的暴露时间等。一般剂量为 5 - 200 mJ/cm²。超滤 / 渗滤（UF/DF） 在这个阶段，需要对完整的病毒颗粒进行浓缩，以减少下游工艺的体积。UF/DF 用于去除低分子量杂质和进行缓冲液交换。在基于细胞培养的流感疫苗生产过程中，会有多个 UF/DF 步骤。UF/DF 可用于去除 DNA、宿主细胞蛋白（HCP）和 Benzonase® 核酸内切酶，在超速离心后步骤中，还可用于去除蔗糖。300 kDa 的装置适用于体积浓缩。 典型的 UF/DF 条件为： 跨膜压力（TMP）为 10 - 15 psi 进料流速为 5 - 6 L/min/m² 浓缩倍数为 20 - 50X 平均渗透通量为 50 LMH 由于浓缩倍数较高，一些工艺采用补料分批浓缩模式。 使用 500 kDa 的膜并控制通量操作可去除宿主细胞 DNA 和蛋白质。TFF 工艺对低分子量 DNA 的去除效果较好，但对高分子量分子的去除效率较低。在某些情况下，根据病毒毒株的大小，使用 1000 kDa 的过滤器可以实现对病毒的有效截留。在渗透控制的双泵 TFF 中，典型的平均过滤通量为 20 - 35 LMH，进料流速为 5 - 6 L/in/m²，TMP 为 4 - 5 psi。密度梯度离心 密度梯度（区带）离心或色谱法通常用于进一步纯化病毒。区带离心分为沉淀和分级两个步骤。虽然区带离心可以生产出高纯度的产品，但产率较低，操作也较为繁琐。色谱法 在基于细胞培养的工艺中，对灭活的病毒进行尺寸排阻色谱和阴离子交换色谱，以去除 DNA 和 HCP。由于病毒体积较大，阴离子交换色谱步骤采用流通模式。在某些情况下，先进行尺寸排阻色谱（SEC），然后进行阴离子交换色谱（AEX）。SEC 通常用于去除小溶质和蛋白质，但难以实现与核酸的分离。AEX 树脂在使用足够浓度的 NaCl 时，流感病毒不会与树脂结合，而核酸和其他杂质会结合到树脂上。尽管宿主细胞 DNA（hcDNA）的大小与流感病毒颗粒相似，但 DNA 的无规卷曲结构使其与刚性球形的病毒颗粒相比，与树脂的结合更强。 添加去污剂以防止病毒颗粒聚集，可以提高纯度（降低 hcDNA）和产品产率。SEC 步骤的平均产品产率为 85%，总蛋白含量和核酸含量可降低 30 - 35%。阴离子交换步骤的平均产品产率超过 80%，核酸含量可降低约 60 - 70 倍。色谱纯化的总体产品产率为 50 - 55%，总蛋白降低 15 - 20 倍，核酸降低超过 500 倍。核酸酶处理去除 DNA 美国食品药品监督管理局（FDA）规定，肠胃外给药剂量中残留的宿主 DNA 不得超过 100 pg。欧洲药品管理局（EMA）和世界卫生组织（WHO）允许肠胃外给药剂量中残留 DNA 为 10 ng，口服疫苗剂量中残留 DNA 为 100 μg。Benzonase® 核酸内切酶是一种基因工程核酸内切酶，能够切割所有形式的 DNA 和 RNA。1 单位的 Benzonase® 核酸内切酶在 30 分钟内可将约 37 μg 的 DNA 降解至低至 3 - 8 个碱基对（<6 kDa）。如果原始缓冲液系统中不存在 MgCl₂，则需要添加 1 - 2 mM 的 MgCl₂以保证 Benzonase® 核酸内切酶的最佳活性。进料中 DNA 的存在取决于细胞 / 病毒类型以及收获步骤中使用的方法和技术。在 Benzonase® 核酸内切酶处理后，需要在后续的纯化步骤中定量去除工艺流中的 Benzonase® 核酸内切酶。因此，最好在工艺的上游充分使用 Benzonase® 核酸内切酶处理。有多种方法可用于从工艺中去除 Benzonase® 核酸内切酶，包括 TFF（截留分子量 300 kDa）、阴离子交换色谱（AEX）和区带离心。有报道称，使用约 0.9 - 1.1 U/mL 的 Benzonase® 核酸内切酶在 30 - 37°C 下处理收获物 4 - 8 小时，可降解宿主细胞核酸。由于法规要求，必须对工艺中残留的 Benzonase® 核酸内切酶进行测量和检测，通常采用基于 ELISA 的方法进行检测。裂解工艺制备裂解疫苗 大多数流感疫苗是 “裂解” 疫苗，即通过去污剂处理制备而成。这一步骤会破坏病毒包膜，释放内部的抗原成分，如与病毒 RNA 相关的衣壳核蛋白和包膜内部的基质蛋白（M 蛋白）。这种裂解过程去除了一些病毒成分，从而使疫苗的反应原性降低。 在裂解之前，需要将浓缩的单价（单株）病毒悬液用无菌缓冲液稀释。 当向纯化的流感病毒悬液中加入两亲性非离子去污剂（如 0.5% 的 Triton® X - 100 溶液）和 / 或阴离子脱氧胆酸钠（DOC）时，就会发生病毒裂解。聚山梨酯（Tween® 系列产品）和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）也适用于病毒裂解步骤。裂解过程需要在室温下持续搅拌工艺流体与去污剂至少一小时。如果需要，裂解步骤的时间可以延长至 24 小时。 为了确保每个成分都被完全灭活，在病毒裂解过程之后，会进行二次病毒灭活作为额外的安全措施。无菌过滤 在生产过程中进行无菌过滤的时间取决于疫苗是全病毒疫苗还是裂解病毒疫苗。 全病毒疫苗：一些基于细胞培养的流感疫苗，如 H5N1 疫苗，属于全病毒疫苗。对于这些病毒，在工艺的最后阶段对最终原液进行无菌过滤。 裂解病毒疫苗：对于裂解病毒疫苗，在裂解步骤之后进行最终的无菌过滤。根据流感毒株的不同，最终无菌过滤器的容量有时较低（约 20 - 50 L/m²）。在这种情况下，会使用 0.45 µm 或 0.65 µm 的预过滤器来保护除菌级过滤器并提高其容量。除菌级过滤器的容量根据进料质量和是否使用预过滤器而有所不同，通常在 200 - 400 L/m² 之间。0.45/0.22 µm 的除菌过滤器也常被用作终端无菌过滤器（如果认为需要预过滤），从而将工艺从两步过滤简化为一步过滤。制剂 在基于细胞培养的流感疫苗市场中，只有少数几种裂解流感病毒疫苗会添加佐剂。用于商业流感疫苗制剂的基于水包油乳剂的佐剂有 MF59 和 AS03。例如，Optaflu® 疫苗是一种基于细胞培养的三价季节性流感疫苗（裂解疫苗，灭活的 HA 和 NA），它添加了佐剂 MF59。一剂 0.5 mL 的 Optaflu® 疫苗含有总共 45 μg 的 HA（15 μg x 3）和 0.25 mL 的 MF59 佐剂。 由于配制好的疫苗不能进行过滤除菌，因此佐剂和纯化的裂解病毒抗原需要分别进行过滤除菌，然后再进行无菌混合。通常使用 0.22 µm 的过滤器对基于乳剂的佐剂进行无菌过滤。由于水包油佐剂的性质，必须使用能够在必要的细菌挑战截留测试中防止穿透的过滤器。 最终的制剂通常包含缓冲剂（如柠檬酸钠脱水物、柠檬酸一水合物、氯化钾、磷酸二氢钾和 / 或磷酸氢二钠脱水物）、等渗剂（氯化钠）和稳定剂（六水合氯化镁或二水合氯化钙）。总结：基于细胞培养的流感疫苗 在过去的十到二十年中，基于细胞培养的流感疫苗生产取得了显著进展。细胞培养生产为解决传统基于鸡蛋的流感生产中经常出现的生产瓶颈提供了一种创新方法。这不仅使其成为季节性流感疫苗的一种有价值的替代生产方法，而且在我们应对可能发生的流感大流行时，它也是一项必不可少的技术。2. 基于鸡蛋的流感疫苗 基于鸡蛋的流感疫苗目前在市场上占据了大部分份额。经过三十多年的商业规模应用，这是一种已被充分了解的生产工艺。图 2 展示了在鸡胚中生产灭活裂解病毒型流感疫苗的通用流程。 病毒繁殖与收获 将受精的鸡蛋放入孵化器中，在约 37°C 的环境下孵化 9 - 12 天，以促进胚胎发育。然后将流感病毒接种到存活胚胎的尿囊中。为了抑制潜在的细菌生长，会在接种物中添加抗生素（通常是多粘菌素和新霉素的混合物）。接着，将感染后的鸡蛋在湿度可控的孵化器中，于约 33 - 35°C 下再培养 2 - 3 天，以使病毒在最佳条件下繁殖。通过将孵化后的鸡蛋迅速冷却至约 2 - 8°C，停止繁殖过程。从感染的鸡蛋中收集富含病毒颗粒的尿囊液。为了加快生产过程并提高产能，上游的这一步骤通常会使用自动接种器、孵化器和收获器实现自动化。一个鸡蛋可产生 3 - 10 mL 的尿囊液。每剂三价疫苗所需的 HA 产量因毒株和制造商而异，通常需要 0.7 - 3 个鸡蛋。一个满负荷运转的传统基于鸡蛋的流感疫苗生产设施每天能够处理多达 60 万个鸡蛋。鸡蛋成本约占疫苗原液成本的 50%。典型的全规模商业批次每天使用约 25 万 - 35 万个鸡蛋（约 1500 - 2000 升尿囊液）。尿囊液的澄清 为了去除尿囊液中的大颗粒污染物，尤其是像羽毛、喙、血管和血细胞等初级组织成分，需要进行多步澄清。 初级澄清步骤：初级澄清通常采用 4000 - 5000 g 的低速连续离心。较大的颗粒会沉淀形成 pellet，而流感病毒则留在上清液中。 二级澄清步骤：二级澄清通过正常流过滤（NFF）完成。另一种选择是使用 0.65 µm 或 0.45 µm 的微滤膜装置进行切向流过滤（TFF），并控制渗透通量。由于流感病毒在操作 pH 下带负电荷，可能会与含有硅藻土的正电荷深层过滤器结合，因此可以使用优化的高盐缓冲液（通常为 1 - 2 M NaCl）冲洗，以提高工艺产率。病毒灭活 这一化学处理步骤旨在确保没有活性病毒（流感病毒或任何污染病毒）进入下游工艺。为了降低污染风险，最好在工艺尽早阶段进行灭活。然而，由于灭活应在均匀的悬浮液中进行，且该悬浮液不应含有可能无法被灭活剂穿透的颗粒，因此一些制造商选择在工艺的后期阶段进行病毒灭活。有时，出于安全考虑，会进行两次灭活步骤。常用的灭活剂有 β - 丙内酯（BPL）、二元乙撑亚胺（BEI）和甲醛。作为交联剂，它们与病毒蛋白发生反应，消除流感病毒的感染性，同时保留其免疫原性。传统上，使用 BPL 灭活时，在 4°C 下以 0.1%（体积比）的 BPL 浓度处理 16 小时。（在生产过程中，该浓度不得超过。）福尔马林通常以 0.02% 的浓度在 37°C 下处理 18 - 72 小时。2 mM 的二元乙撑亚胺（BEI）已被证明在 37°C 下 48 小时内可灭活流感病毒。为了防止在灭活过程中发生聚集或沉淀，通常会添加甘油和蔗糖。病毒浓缩 在这个阶段，使用 TFF 对完整的病毒颗粒进行浓缩，以减少下游超速离心步骤的处理体积。渗滤还可以部分去除鸡蛋蛋白（45 kDa 的卵清蛋白、76 kDa 的卵转铁蛋白、49 kDa 的卵球蛋白、14 kDa 的溶菌酶等）、DNA 和灭活剂。可以在渗透通量控制的系统中使用 300 - 1000 kDa 的超滤膜；必须根据流感液的粘度和结垢特性仔细选择装置和操作参数。此步骤的典型体积浓缩倍数为 5 - 40X。在 1.5 - 3 psi 的 TMP 和 5 - 6 L/min/m² 的错流速度下，典型的通量为 20 - 50 LMH。超速离心分离病毒 在区带离心机腔中，通过将较低浓度的蔗糖覆盖在较高浓度的蔗糖上来形成蔗糖密度梯度。蔗糖梯度可以由浓度从高达 70% w/v 到低于 15% 的多个层组成。梯度的增量根据要纯化的产品而有所不同。将产品液泵入离心机转子 / 梯度中，并在约 40 - 150K 的离心力下进行处理。颗粒会在蔗糖浓度梯度中移动，直到到达与自身密度相匹配的层。收集含有流感病毒的目标馏分，用于进一步的下游处理。馏分的收集取决于毒株。此步骤的病毒产率可能在约 60% 到约 90% 之间（HA 测定的灵敏度可能有大约 30% 的固有差异）。流感病毒的裂解 在裂解之前，通常将浓缩的单价（单株）病毒悬液用无菌缓冲液（例如磷酸盐缓冲盐水 [PBS]）稀释至与工艺流体中病毒蛋白含量相关的标准光密度（OD）值。 病毒的裂解通常是通过向纯化的流感病毒悬液中加入两亲性非离子去污剂（如 Triton™ X - 100 水溶液）和 / 或阴离子脱氧胆酸钠（DOC）来实现的。聚山梨酯（Tween® 系列产品）和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）也适用于病毒裂解步骤。 裂解过程通常在室温下持续搅拌工艺流体和去污剂至少一小时。如果需要，裂解步骤的时间可以延长至 24 小时。在这个过程中，流感病毒的结构会被分解，因为包膜被破坏，病毒的内部抗原成分，如与病毒 RNA 相关的衣壳核蛋白和包膜内部的基质蛋白（M 蛋白）会被释放出来。 注意：在这个工艺阶段，可能会进行病毒灭活步骤（除了上游工艺中的灭活步骤之外，或者替代上游的灭活步骤）。超滤 / 渗滤 裂解后，使用 TFF 对产品液进行缓冲液渗滤。这可以去除去污剂成分，并将产品置于最终的缓冲液中。由于病毒颗粒已被裂解，必须使用更紧密的膜来截留病毒碎片。TFF 膜可以完全截留感兴趣的病毒成分，同时允许去除去污剂和蔗糖（以及灭活剂）。使用 50 kDa 的膜时，在 5 - 7 psi 的 TMP 和 4 - 5 L/min/m² 的错流速度下，平均预期通量约为 30 - 40 LMH。最终纯化原液的无菌过滤 每个单独生产的单价（单株）流感原液在进入最终制剂和灌装设施之前，都要进行无菌过滤步骤。PES 和 PVDF 类型的无菌级膜都可以在这一步骤中成功使用。然后，将完成的原液进行制剂、灌装和包装，以便进行接种。 现有的疫苗通常每种成分含有 15 mg。大多数季节性灭活裂解疫苗不添加佐剂。 在 H1N1 大流行疫苗中使用基于角鲨烯的水包油乳剂型专有佐剂系统 AS03（Pandemrix® 3）和 MF59（Focetria® 2），能够以较低的病毒抗原量（每剂 7.5 mg）诱导出保护性抗体水平。这种所谓的剂量节省效应有助于增加可用疫苗剂量的数量，这在大流行期间尤为重要，因为在这种情况下，由于生产能力有限，疫苗供应往往无法满足需求。总结：基于鸡蛋的流感疫苗 基于鸡蛋的流感疫苗生产是一种成熟且已被充分了解的工艺，具有三十多年的商业规模应用经验。即便如此，它仍然面临着许多独特的挑战。病毒的持续基因突变要求每年生产的季节性疫苗都要包含选定病毒毒株的成分。毒株的产量是可变的，而且通常在实际的全规模生产之前无法确定。每种新的季节性疫苗都必须获得为期仅一年的疫苗许可证。 参考来源： 1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) website: Seasonal Influenza (Flu). et al. Method for producing viral vaccines. US patent US 2009/0060950 A1. 2. Dormitzer. (2011) Cell Culture-Derived Influenza Vaccines. Influenza Vaccines for the Future, Second Edition. 3. European Pharmacopoeia (2005) Influenza vaccine (Surface Antigen, Inactivated, Virosome), 5.0, 673–674. 4. Fiore et al. (2009) Seasonal influenza vaccines, Current Topics in Microbiology and Immunology, No. 333, 43–82. 5. Fiore et al. (2013) Inactivated influenza vaccines. Vaccines, Ed. S.A. Plotkin, W.A. Orenstein, P.A. Offit, 6th edition, Elsevier Sounders, 257–293. 6. Jadhav (2009) Influenza Vaccine Production Capacity Building in Developing Countries: Example from Serum Institute of India, WHO-IVR-GVRF, 6-9 December. 7. Layton et al. (2005) Influenza Vaccine Manufacturing, Research Triangle Institute, October, 12–15. 8. Rappuoli and Del Giudice, eds. (2010) Influenza Vaccines for the Future (Birkhäuser Advances in Infectious Diseases). New York: Springer Publishing Company, 293–312. 9. Matthews (2006) Egg-Based Production of Influenza Vaccine: 30 Years of Commercial Experience, The Bridge, vol. 36, No. 3, 17–24. 10. Wolff et al. (2008) Downstream Processing: From Egg to Cell Culture-Derived Influenza Virus Particles, Chem. Eng. Technol. No. 6, 846–857. 11. World Health Organization (1966), Recommendation for Production and Control of Influenza Vaccines (Inactivated), WHO Technical Report Series, No. 323. 12. World Health Organization (WHO). Available from: https://www.who.int/teams/global-influenza-programme 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。