Neomycin Sulfate

点击上方蓝字关注我们 摘要 民族药理学相关性： 砂仁（Amomum villosum Lour., AVL）是一种传统中药，广泛用于治疗妊娠相关呕吐和预防流产。子痫前期（PE）是一种严重的妊娠综合征。近期研究已证实PE与消化系统之间存在相互作用。然而，AVL抗PE是否与肠道相关尚不确定。 研究目的： 本研究基于肠-胎盘轴探讨了AVL对PE的治疗作用及潜在机制。 材料与方法： 砂仁水提物（WOA）经沸水提取后冻干制成颗粒。建立NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）诱导的PE小鼠模型，评估WOA的预防作用。此外，采用16S rRNA基因测序分析肠道微生物组成和结构。应用粪菌移植（FMT）实验验证WOA重塑的肠道菌群的功效。 结果： WOA对PE具有保护作用。值得注意的是，WOA以剂量依赖性方式显著降低母体高血压和尿蛋白水平，促进胎儿宫内生长，从而改善不良妊娠结局。此外，WOA通过降低sFlt-1（可溶性fms样酪氨酸激酶1）与PlGF（胎盘生长因子）的比值来调节血管生成失衡，修复胎盘损伤，并通过增加FPN1、FTH1、xCT和GPX4蛋白水平抑制胎盘铁死亡。WOA显著上调胎盘和结肠中的紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin1），增强胎盘和肠道屏障。WOA通过富集双歧杆菌和Akkermansia改善肠道菌群失调。粪菌移植（FMT）实验揭示WOA对胎盘和肠道的保护作用依赖于肠道微生物组成。此外，补充双歧杆菌（B. bifidum）和香草酸（VA，WOA的主要成分）均可改善PE症状。有趣的是，体内外分析结果表明，VA可富集B. bifidum。 结论： 本研究首次证实WOA通过富集双歧杆菌、增强肠-胎盘屏障、抑制胎盘铁死亡来预防PE。我们的发现为肠-胎盘轴在AVL保护PE中的重要作用提供了有力证据，为临床提供了新的靶点。 1. 引言 子痫前期（PE）是一种严重的妊娠并发症，以妊娠20周后出现新发高血压和蛋白尿为特征，是母婴死亡的主要原因之一（Mol等，2016）。全球PE发生率约为2-8%，对母婴健康构成重大威胁。PE患者更易发生中风、心血管疾病和糖尿病，而胎儿则易发生早产、宫内生长受限、胎盘早剥和死亡（Dimitriadis等，2023）。根据《妊娠期高血压和子痫前期诊治指南（2020）》（妊娠高血压疾病学组和妇科学，2020），PE的对症治疗包括使用口服降压药控制血压，以及静脉注射硫酸镁减少抽搐和痉挛。当药物无法控制PE的病理进程时，需立即终止妊娠以避免不良妊娠结局（Poon等，2019；Rana等，2019）。因此，寻找安全有效的预防和治疗PE方法仍是紧迫的临床挑战。 胎盘在PE的进展中起着关键作用，受多种病理因素影响。根据公认的PE两阶段模型，胎盘功能障碍是主要原因（Roberts和Hubel，2009；Staff，2019）。PE发生时，由于胎盘滋养细胞浸润不足导致子宫螺旋动脉重构异常，引起子宫螺旋动脉狭窄。子宫螺旋动脉狭窄导致胎盘缺血缺氧，进而导致形态发生异常，最终导致胎盘功能障碍。为了补偿子宫螺旋动脉的异常重构，母体血管收缩以试图增加血压并将更多血液推向胎盘，导致母体高血压。此外，功能障碍的胎盘释放多种生物活性化合物，包括抗血管生成因子、炎症细胞因子和脂质过氧化物。这些物质进入母体血液循环，导致内皮功能障碍和炎症反应，损害血管正常的收缩和舒张活动，进而减少各器官的血流量（Redman和Sargent，2009；Simas等，2014；Yuan等，2005）。特别是肾脏供血减少导致肾小球滤过膜通透性增加，使本应保留在血液中的蛋白质渗入尿液，最终导致蛋白尿（Bartal等，2022）。同时，胎盘功能障碍损害母体向胎儿的营养转运，导致宫内生长受限，增加新生儿呼吸窘迫综合征和支气管肺发育不良的风险（Dimitriadis等，2023；Hansen等，2010；Wang等，2012）。除了经典的PE两阶段模型理论，近期研究表明PE患者循环中铁浓度显著升高，可触发胎盘铁死亡（Liu等，2019a；Yang等，2023；Yang等，2022；Zhang等，2020a）。Beharier等（2020）的早期报告表明，铁死亡信号通路激活导致胎盘滋养细胞功能障碍。相反，抑制铁死亡显著减少胎盘脂毒性损伤并缓解PE症状（Yang等，2022）。这些研究表明，抑制胎盘铁死亡对保护胎盘功能至关重要，可作为胎盘疾病（如PE）的治疗方法。 临床研究报告了PE患者的肠道微生物失调（Chen等，2020b）。在早期体内研究中，接受PE患者粪菌移植（FMT）的大鼠表现出病理和症状的显著加重，而接受健康孕妇肠道菌群的大鼠则观察到强烈的保护作用（Jin等，2022），明确表明肠道细菌在PE进展中发挥重要作用。与此发现一致，益生菌罗伊氏乳杆菌通过改善肠道菌群失调和内皮功能障碍缓解小鼠PE症状（Li等，2023）。除肠道微生物的直接影响外，PE的调节还受其代谢产物影响。例如，肠道菌群分泌的短链脂肪酸（SCFA）据报道可增强PE小鼠的胎盘生长和血管化（Jin等，2022；Pronovost等，2023）。氧化三甲胺（TMAO）通过调节炎症和氧化应激相关信号通路，影响血管内皮细胞的迁移和血管生成以及滋养细胞的迁移和侵袭，促进PE的发展（Wang等，2024）。鉴于这些综合结果，关注肠道微生物为PE的管理提供了创新策略。 砂仁（Amomum villosum Lour., AVL）是中国"南药"之一，也是"药食同源"药材，据报道对孕妇使用安全（Zhao等，2021）。AVL具有多种功能，包括保肝、抗肿瘤、治疗胃肠道疾病和缓解妊娠呕吐（Feng等，2024；Luo等，2022；Wei等，2024）。AVL的药理作用包括抗炎、抗菌、抗氧化和抗高血脂（Kim等，2020, 2022；Tang等，2020；Yan等，2015）。根据《中华人民共和国药典（2020年版）》，AVL传统上用于化湿开胃、温脾止泻、理气安胎（Commission，2020）。值得注意的是，安胎功能旨在保护妊娠期间免受各种不利因素影响，确保女性健康，促进胎儿生长发育，防止胎儿死亡。临床上，AVL的中成药如保胎丸和孕康合剂广泛用于治疗妊娠呕吐和预防流产。然而，AVL作为单味中药对PE的影响尚待确定。本研究集中于AVL对PE的保护作用，并将肠-胎盘轴确定为贯穿本研究的基础靶点通路。我们的发现丰富了AVL安胎能力的现有知识体系，并突出了临床治疗PE的新潜在方法。 2. 材料与方法 2.1. 试剂与化学品 砂仁由苏畅博士（深圳市药品检验研究院，中国）提供和鉴定。表儿茶素、香草酸、虎杖苷和异槲皮苷购自中国食品药品检定研究院。NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）购自MedChemExpress（HY-18729A，美国）。 2.2. WOA的制备与特征分析 砂仁使用前粉碎，蒸馏水浸泡30分钟。然后沸水提取3次，过滤获得滤液。合并滤液作为砂仁水提物（WOA）。为进行质量控制，我们采用高效液相色谱（HPLC）定量检测表儿茶素、香草酸、虎杖苷和异槲皮苷。这些化合物的浓度分别为3.15、11.73、1.13和0.38 mg/mL。（方法见补充表1和图S1）。 2.3. 动物 C57BL/6雌性和雄性小鼠购自生物技术有限公司（SCXK，2019-0010，中国），在标准光暗周期条件（12小时:12小时，25℃）下饲养。所有动物实验均经南方医科大学机构动物伦理护理委员会批准（SMUL202404008）。 2.4. 动物实验 L-NAME诱导的PE小鼠模型此前已有描述（Huang等，2022）。简而言之，经过一周的适应期后，雄性小鼠与雌性小鼠按1:2比例配对过夜。有栓的雌性小鼠视为怀孕，当天定为妊娠第0天（GD0）。从GD9到GD18，小鼠皮下注射125 mg/kg/d L-NAME，于GD18处死。 WOA灌胃实验。 孕鼠随机分为六组（每组n=6）：(1)正常妊娠组（NP）；(2)子痫前期组（PE）；(3)WOA低剂量组（WOA-L）；(4)WOA中剂量组（WOA-M）；(5)WOA高剂量组（WOA-H）；(6)拉贝洛尔组（Labetalol）。除NP组小鼠外，其他组小鼠从GD9到GD18皮下注射L-NAME。NP和PE组小鼠灌胃生理盐水，每天一次，持续18天。WOA-L、WOA-M和WOA-H组小鼠分别灌胃130、260和520 mg/kg WOA。Labetalol组小鼠灌胃拉贝洛尔（Disano，江苏，中国）20 mg/kg。所有干预每天进行一次，持续18天。小鼠于GD18处死。WOA的给药参考中国药典推荐的AVL临床剂量（Commission，2020），并按Chen等方法调整（Chen等，2018）。 粪菌移植（FMT）实验。 将WOA高剂量组小鼠（供体）的粪便重悬于PBS中，制成125 mg/mL的悬液。然后离心混合物，取上清液用于菌群移植。孕鼠随机分为三组（每组n=6）：(1)正常妊娠组（NP）；(2)子痫前期组（PE）；(3)FMT-WOA-H组（FMT-WOA-H）。除NP组小鼠外，其他组小鼠从GD9到GD18皮下注射L-NAME。NP和PE组小鼠每天灌胃生理盐水，持续18天。FMT组小鼠先接受5天抗生素（ABX）治疗（万古霉素100 mg/kg、硫酸新霉素200 mg/kg、甲硝唑200 mg/kg和氨苄青霉素200 mg/kg）以消除肠道微生物（Jin等，2022）。随后，每天口服WOA-H供体粪便一次，持续10天。小鼠于GD18处死。 双歧杆菌（B. bifidum）补充实验。 孕鼠随机分为三组（每组n=6）：(1)正常妊娠组（NP）；(2)子痫前期组（PE）；(3)双歧杆菌组（B. bifidum）。除NP组小鼠外，其他组小鼠从GD9到GD18皮下注射L-NAME。NP和PE组小鼠每天灌胃生理盐水，持续18天。B. bifidum组小鼠每天灌胃200 μL双歧杆菌（1×10⁸ CFU/mL），持续18天。小鼠于GD18处死。 香草酸（VA）干预实验。 孕鼠随机分为四组（每组n=6）：(1)正常妊娠组（NP）；(2)正常妊娠加香草酸组（NPVA）；(3)子痫前期组（PE）；(4)子痫前期加香草酸组（PEVA）。除NP和NPVA组小鼠外，PE和PEVA组小鼠从GD9到GD18皮下注射L-NAME。NP和PE组小鼠每天灌胃生理盐水，持续18天。NPVA和PEVA组小鼠每天灌胃70 mg/mL VA（阿拉丁，中国），持续18天（Kumar等，2014a）。小鼠于GD18处死。最后，采集血液，8000 rpm、4℃离心10分钟分离血清。解剖并称重胎儿和胎盘。血清和组织储存于-80℃。 2.5. 血压测量 使用BP-2010A无创血压仪（Softron Biotechnology，北京，中国）在GD0、4、8、10、12、14和16测量收缩压（SBP）。 2.6. 苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）分析 H&E染色和IHC按此前描述进行（Huang等，2022）。胎盘和结肠均使用ZO-1、Occludin和Claudin-1抗体（Abmart，中国）孵育。使用Image-Pro Plus 6.0软件（Media Cybernetics Inc.，美国）分析平均光密度。 2.7. 实时定量PCR（RT-qPCR） 使用动物总RNA分离提取纯化试剂盒（Foregene Co., Ltd.）提取总RNA。使用天根粪便DNA提取试剂盒提取粪便DNA。使用HiScript III All-in-one RT SuperMix（诺唯赞生物科技，中国）将mRNA转化为cDNA。所有qPCR使用HiScript II Q RT SuperMix（诺唯赞生物科技，中国）并在LightCycler480（Roche Diagnostics International，瑞士）上进行。引物信息见补充表3。 2.8. Western blot分析 胎盘样品使用RIPA裂解液（美仑生物，中国）裂解。胎盘蛋白经10% SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜（Millipore，Billerica，MA，美国）。5%脱脂牛奶封闭1小时后，膜与多种一抗4℃孵育过夜，然后与二抗室温孵育1小时。使用凝胶成像系统（FluorChem R，ProteinSimple，San Jose，CA，美国）扫描膜。使用ImageJ软件评估条带强度。抗体见补充表4。 2.9. 酶联免疫吸附试验（ELISA） 小鼠尿蛋白（UP）ELISA试剂盒、血管内皮生长因子（VEGF）ELISA试剂盒、胎盘生长因子（PlGF）ELISA试剂盒、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFlt-1）ELISA试剂盒和脂多糖（LPS）ELISA试剂盒购自江苏酶免实业有限公司。谷胱甘肽（GSH）ELISA试剂盒和丙二醛（MDA）ELISA试剂盒购自伊莱瑞特生物科技。小鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒购自美仑（中国）。各ELISA试剂盒按厂家说明进行评估。 2.10. 16S rRNA基因测序 采集各组小鼠粪便。使用ABI GeneAmp 9700 PCR热循环仪扩增细菌16S rRNA基因。然后使用实时定量PCR扩增16S rRNA基因的V3-V4区。使用Illumina MiSeq（PE300）进行测序，美吉生物负责数据分析。随后，使用UPARSE 11将精修序列聚类为操作分类单元（OTUs）。每个OTU选择丰度最高的序列作为代表序列。使用16S rRNA基因数据库（如Silva v138）分析代表序列，置信度阈值为0.7。使用Mothur V.1.30.2基于OTU信息计算α多样性。然后进行PCA分析计算微生物相对丰度的相似性。使用线性判别分析效应大小（LEfSe）进行物种分类分析的生物标志物发现。通过STAMP V2.1.3软件使用未观察状态群落重建系统发育调查（PICRUSt）分析。 2.11. 细菌培养 双歧杆菌（B. bifidum，ATCC 29521）在BBL肉汤培养基（山东拓普生物工程有限公司，Cat# M1409，中国）中厌氧条件下（10% H₂、10% CO₂、80% N₂，37℃）培养。 2.12. 体外厌氧培养 按描述收集PE组小鼠粪便进行培养（Gu等，2018；Li等，2021；Sun等，2023）。将粪便样品（1.0 g）重悬于10 mL无菌厌氧PBS中，通过离心获得细菌沉淀，并重悬于无菌厌氧PBS中。随后，在厌氧条件下（37℃，140 rpm）孵育以激活细菌。接下来，将粪便接种物在培养基中（含或不含5 mg/mL VA）厌氧条件下孵育。孵育0、12和24小时后，培养样品4℃8000 rpm离心10分钟，收集离心沉淀用于DNA提取和检测。 2.13. 统计分析 使用IBM SPSS Statistics 25进行统计分析。数据以均值±标准差表示。使用Student's t检验评估组间均值差异。多重比较采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Bonferroni事后检验。显著性水平为p<0.05，p<0.01和p<0.001。 3. 结果 结果1. WOA灌胃缓解PE小鼠PE症状和不良妊娠结局 为研究WOA缓解PE的功效，我们用低、中、高剂量WOA干预L-NAME诱导的PE小鼠模型（图1A）。L-NAME干预后，与NP组相比，PE组小鼠SBP显著进行性升高（图1B），GD18尿蛋白浓度显著升高（图1C），表明PE小鼠模型成功建立。与PE组相比，WOA-L、WOA-M、WOA-H和Labetalol治疗后SBP和尿蛋白显著降低，尤其是WOA-H干预效果最佳（图1B和C）。这表明WOA以剂量依赖性方式降低SBP和尿蛋白水平。此外，使用胎盘重量和胎儿重量评估PE小鼠的不良妊娠结局。与NP组小鼠相比，PE组小鼠胎盘和胎儿重量较低，表明PE导致不良妊娠结局（图1E和F）。然而，经WOA-L、WOA-M、WOA-H和Labetalol治疗后，胎盘重量显著高于PE组（图1E）。WOA-M和WOA-H组干预后能显著增加胎儿重量，恢复到与NP组相同水平（图1D-F）。胎儿-胎盘重量比用于反映胎盘效率。PE组该比值明显低于NP组，表明PE导致胎盘效率低下（图1G），这种低效率可通过WOA-H干预逆转，恢复到与健康妊娠小鼠相当的胎盘效率水平。综上所述，我们发现高剂量WOA在缓解PE小鼠PE症状和不良妊娠结局方面效果最佳。因此，后续实验评估WOA-H。 结果2. WOA缓解PE小鼠血管生成失衡 胎盘功能障碍与血管生成失衡相关（Burwick和Rodriguez，2024）。为探讨WOA对PE小鼠胎盘和血管状态的影响，我们分析了胎盘的结构改变以及胎盘和血清中的血管生成因子。首先，观察胎盘组织形态学变化（图2A）。与NP组胎盘相比，PE组胎盘的迷路区和结合区比例更高。然而，WOA-H干预后这种增加的比例被抵消，从而证明WOA-H减轻PE对胎盘结构的损伤（图2B）。然后，评估关键促血管生成因子如血管内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PlGF），以及抗血管生成因子如可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFlt-1）以评估血管状态。与NP组相比，PE组小鼠胎盘Vegf和Plgf mRNA水平显著失调，而sFlt-1水平显著升高（图2C）。WOA-H组观察到胎盘Vegf和Plgf表达显著增加，sFlt-1表达显著降低（图2C）。血清样品中也观察到血管生成失衡，但可通过WOA-H干预逆转（图2D-F）。此外，与NP组相比，PE组sFlt-1与PlGF比值升高，该比值临床上用于评估PE风险。有趣的是，WOA-H干预显著降低该比值，与NP组无显著差异（图2G）。这些发现证明WOA-H减轻PE对胎盘结构的损伤和PE小鼠的血管生成失衡。 结果3. WOA抑制PE小鼠胎盘铁死亡 铁死亡导致胎盘功能障碍，可能促进PE的发病机制（Shan等，2023）。为评估WOA的预防作用是否与胎盘铁死亡相关，我们研究了胎盘组织中铁死亡相关标志物。与NP组相比，PE组胎盘Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4 mRNA水平显著失调，提示PE小鼠胎盘铁死亡被激活。然而，WOA-H给药显著逆转了铁死亡相关因子的下调（图3A-D）。有趣的是，血清中VEGF、PlGF和sFlt-1与胎盘中铁死亡相关因子（Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4）呈显著正相关（图3E-G），提示胎盘铁死亡与PE小鼠血管生成失衡密切相关。此外，与NP组相比，PE组小鼠胎盘FPN1、FTH1、xCT和GPX4蛋白水平显著降低，但这些蛋白经WOA-H干预后显著逆转（图3H和I）。铁死亡的特征是Fe²⁺促进的脂质过氧化增加。与NP小鼠相比，PE小鼠胎盘Fe²⁺浓度更高，WOA-H干预可将其降低至健康妊娠水平（图3J）。还评估了胎盘和血清中的谷胱甘肽（GSH）和脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）水平。与NP组小鼠相比，PE组小鼠胎盘和血清中MDA水平显著升高，GSH水平显著降低。然而，WOA-H治疗显著降低MDA水平，显著增加血清和胎盘GSH表达（图3K-N）。值得注意的是，WOA-H组血清和胎盘中GSH水平高于NP组（图3M和N）。这些数据表明WOA-H改善紊乱的铁稳态，逆转细胞内抗氧化剂耗竭并抑制PE小鼠脂质过氧化。总之，WOA-H抑制胎盘铁死亡以保护PE小鼠胎盘功能。 结果4. WOA增强PE小鼠胎盘和肠道屏障 胎盘是连接母体和胎儿的重要器官，具有交换营养物质和抵抗母体有害物质的功能。在PE的病理过程中，异常胎盘形成导致炎症反应；反过来，胎盘炎症通过破坏紧密连接导致胎盘屏障功能丧失（Fisher，2015a；Tossetta等，2014a；Ward等，2023）。为验证WOA对PE的保护作用是否与胎盘屏障相关，我们检测了胎盘中的炎症和紧密连接蛋白。首先，与NP组相比，PE组胎盘中促炎细胞因子（Il-1β、Il-6和Tnf-α）mRNA水平更高。然而，WOA-H补充显著降低这些水平（图4A）。与NP组相比，PE组血清中TNF-α和IL-6水平显著升高，而WOA给药抑制了这种升高（图4B，图S2A）。这些结果表明WOA-H补充可改善PE小鼠的胎盘炎症。然后，我们评估了胎盘中紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）的含量。与NP组相比，PE组紧密连接蛋白mRNA水平显著降低，表明PE损害胎盘屏障完整性，然而WOA-H修复了这种损伤（图4C）。此外，免疫组织化学分析呈现相同结果（图4E和F）。总之，这些发现表明WOA-H增加胎盘屏障完整性以保护胎盘结构。 母体营养物质通过肠道吸收，进入循环并通过胎盘输送给胎儿。然后，我们评估了WOA-H对PE小鼠肠道的影响。与NP组相比，我们观察到PE组结肠中Il-1β、Il-6和Tnf-α mRNA水平显著增加，表明PE小鼠发生肠道炎症。重要的是，WOA-H治疗后肠道炎症可缓解（图4A）。肠道炎症导致屏障损伤以增加屏障通透性，导致肠道微生物产生的有害物质进入循环。我们发现与NP组相比，PE组血清脂多糖（LPS，肠道屏障完整性的重要标志物）持续升高，然而WOA-H干预将其逆转至正常妊娠水平（图4D）。这一发现表明WOA-H降低肠道屏障通透性以保持肠道屏障功能（图4D）。在结肠中，与NP组相比，PE组Zo-1、Occludin和Claudin-1 mRNA水平确实降低，但在WOA-H组中增加（图4C）。免疫组织化学分析揭示相同结果（图4G和H），这在胎盘中也观察到。值得注意的是，胎盘和结肠中的ZO-1、Occludin和Claudin-1呈显著正相关，提示肠-胎盘轴可能参与PE的改善（图S3A-C）。总之，WOA-H给药增强胎盘和肠道屏障并减轻PE小鼠的炎症反应。 结果5. WOA改善PE小鼠肠道菌群失调 PE患者的肠道微生物组处于菌群失调状态并促进疾病发病。为探讨WOA对PE小鼠肠道微生物的影响，我们进行了16S rRNA基因测序分析。首先，我们分析α多样性以评估物种丰富度和多样性。反映物种丰富度的Chao指数和Ace指数显示，与NP组相比，PE组显著增加，但在WOA-H组中降低（图S4A-B）。包括Shannon指数和Simpson指数在内的物种多样性显示，与NP和PE组相比，WOA-H组显著降低（图5A和B）。然后，主坐标分析（PCA）显示PE组肠道菌群构建与NP组和WOA组显著偏离（图5C）。为阐明各组肠道菌群的组成和结构，我们在门和属水平进行了进一步分析。在门分类水平，小鼠中前5位的微生物为芽孢杆菌门、放线菌门、脱硫杆菌门、拟杆菌门和疣微菌门（图5D）。在属分类水平，与NP组相比，PE组葡萄球菌和Lachnoclostridium相对丰度更高；PE组双歧杆菌和Akkermansia相对丰度显著降低，然而WOA-H治疗显著将其丰度恢复至NP组水平（图5E）。我们进一步进行线性判别分析效应大小（LEfSe）分析，通过在属水平识别微生物生物标志物来区分不同组（图5F）。Christensenellaceae_R-7_group和Candidatus_Stoquefichus作为病原体或条件致病菌，在PE组中确实更高（图S4C-D）。然而，补充WOA-H导致双歧杆菌和Akkermansia（被认为是产SCFA细菌）增加（图5G和H）。接下来，我们整合表征每组的8个最相关分类群计算微生物菌群失调指数（MDI），用于评估微生物菌群失调程度。与NP组相比，PE组MDI显著升高，但这种效应被WOA-H补充逆转（图S4E），提示PE小鼠发生肠道微生物菌群失调，然而WOA干预逆转这种菌群失调。 进行Spearman相关分析以评估肠道微生物丰度与PE相关参数（包括PE症状、血管生成因素和胎盘肠道屏障特征）之间的关联（图5J）。Christensenellaceae_R-7_group和Candidatus_Stoquefichus与SBP、sFlt-1/PlGF比值和LPS呈显著正相关。然而，双歧杆菌和Akkermansia与SBP和sFlt-1/PlGF比值呈负相关。这些发现表明WOA在PE小鼠中的增强作用与有益菌的存在相关，而与有害菌的存在呈负相关（图5J）。肠道菌群组成的变化总是伴随着生理功能的变化。因此，我们进行PICRUSt分析预测基因组水平的微生物生理功能。使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）注释和功能富集，我们鉴定了18个在PE和WOA-H组间富集水平不同的功能类别（图5I）。特别是，与PE病理相关的铁死亡功能通路在PE组中显著增强。此外，WOA-H组显著增强与营养代谢相关的微生物功能，如嘌呤代谢、淀粉和蔗糖代谢以及赖氨酸生物合成（图5I）。总之，这些结果支持WOA改善PE小鼠肠道菌群失调，WOA的作用可能与其益生元功能相关。 结果6. WOA小鼠肠道菌群移植缓解PE小鼠症状和血管失衡 进行粪菌移植以确认WOA对PE的有益作用是否通过肠道菌群介导（图6A）。与PE组相比，FMT-WOA-H组小鼠SBP和尿蛋白显著降低（图6B和C），胎盘重量、胎儿重量、胎儿-胎盘重量比显著增加（图6D-G）。这些结果表明FMT干预改善了母体PE症状，促进胎儿生长，提高胎盘效率。同时，在FMT组中，与PE组相比，胎盘迷路区与结合区的比值增加（图6H和I），提示FMT干预减轻PE引起的胎盘结构损伤。然后，我们探讨WOA调节的微生物群对PE小鼠血管生成因子的影响。与PE组相比，FMT-WOA-H组血清VEGF和PlGF水平显著增加，血清sFlt-1和sFlt-1与PlGF比值显著降低（图6J-M），证明FMT缓解PE小鼠血管生成失衡。此外，与PE组相比，FMT-WOA-H组血清LPS水平显著降低（图6N），表明FMT有效降低肠道通透性。总之，FMT干预减轻PE小鼠表型，改善不良妊娠结局，减轻胎盘损伤并逆转PE小鼠血管生成失衡。这些结果表明肠道菌群在WOA缓解PE的过程中发挥显著的上游作用。 结果7. 补充双歧杆菌缓解PE小鼠症状 我们观察到WOA干预后益生菌双歧杆菌显著富集。此外，我们确定是双歧杆菌（B. bifidum）在WOA-H组小鼠胎儿中富集（图7A）。然后，为研究双歧杆菌对PE的缓解作用，我们给L-NAME诱导的PE小鼠补充双歧杆菌（图7B）。与PE组相比，补充双歧杆菌确实降低SBP和尿蛋白水平（图7C和D），显著增加胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比，提示双歧杆菌可减轻PE表型、不良妊娠结局并提高胎盘效率（图7E-H）。与PE组相比，双歧杆菌组胎盘迷路区与结合区的比值降低，从而证明双歧杆菌可逆转PE对胎盘结构的损伤（图7I和J）。评估关键血管生成因子以评估胎盘血管状态。与PE组相比，双歧杆菌组胎盘Vegf和Plgf表达显著上调，sFlt-1表达显著下调（图7K），支持双歧杆菌干预恢复胎盘血管生成失衡。我们还发现与PE组相比，双歧杆菌组小鼠胎盘中铁死亡相关标志物（Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4）mRNA水平显著上调（图7K）。此外，与NP组相比，PE组胎盘中Fe²⁺增加、GSH降低，补充双歧杆菌后这些指标被逆转（图7L和M）。这些发现提示双歧杆菌抑制胎盘铁死亡以保护PE小鼠胎盘功能。因此，补充双歧杆菌通过缓解母体症状、改善不良妊娠结局、减轻胎盘损伤、逆转血管生成失衡和抑制胎盘铁死亡来缓解PE小鼠PE。 结果8. 香草酸富集双歧杆菌缓解PE小鼠症状 为研究WOA的哪种成分发挥抗PE保护作用，我们分析了WOA的成分（图S1和补充表2）。其中，香草酸（VA）是最重要的成分（含量11.73 mg/mL）。首先，我们通过将PE组小鼠新鲜粪便与VA在厌氧条件下共培养，证实VA促进双歧杆菌体外生长（图8A）。体外共培养12小时后，与单独在培养基中培养的肠道微生物相比，VA共培养的肠道微生物中双歧杆菌表达确实上调（图8B）。补充VA后（图8C），正常妊娠小鼠未观察到不良影响；但PE小鼠与PE组相比SBP和尿蛋白更低（图8D和E），胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比更高（图8F-I），提示VA可缓解PE症状并减轻不良妊娠结局和胎盘效率低下。与PE组相比，PEVA组胎盘迷路区与结合区的比例更低（图8J和K），证明VA可逆转PE对胎盘结构的损伤。特别是，我们在PEVA组小鼠粪便中检测到双歧杆菌高表达（图8L）。 总之，VA富集双歧杆菌以缓解PE小鼠症状。 4. 讨论 PE是一种严重危害孕妇和围产儿生命健康的妊娠相关疾病。目前，由于病因不明，缺乏有效的预测、预防和治疗PE的方法（Brown等，2018）。中药具有多通路、多成分、多靶点的独特优势，在PE的防治方面取得了成就（Jin等，2022；Liu等，2021；Yang等，2023）。由于其有益的药理特性，挥发油已被广泛研究（Commission，2020）。然而，据我们所知，关于AVL非挥发性成分的研究有限。水煎是中药常用的制备方法。因此，在本研究中，我们制备了砂仁水提物（WOA）并评估其对PE的作用。我们证明WOA抗PE是通过恢复血管生成失衡、抑制胎盘铁死亡和增强肠-胎盘屏障实现的。值得注意的是，WOA通过香草酸活性诱导双歧杆菌富集，减轻模型小鼠PE。我们的结果支持妊娠期间补充AVL作为预防和治疗PE的潜在安全有效方法。 胎盘作为母体和胎儿之间的桥梁，负责营养转运和防御有害物质。健康的胎盘促进胎儿生长，而功能不良的胎盘可导致胎儿生长受限（Fisher，2015b；Tossetta等，2014b；Ward等，2023）。越来越多的临床研究报告PE患者总铁浓度显著增加，关键是胎盘发生铁死亡（Liu等，2019b；Yang等，2022；Yang等，2022；Zhang等，2020b）。铁死亡是一种以铁过载和脂质过氧化为特征的细胞死亡形式（Lee等，2024）。在我们的研究中，除PE小鼠胎盘铁浓度过度外，FPN1（用于铁输出）和FTH1（用于铁储存）蛋白表达显著下调，进一步证实铁稳态失衡。此外，PE小鼠胎盘铁死亡相关蛋白表达改变，xCT、GSH和GPX4蛋白水平显著下调，表明细胞内抗氧化剂耗竭。这些发现是PE小鼠胎盘铁死亡的特点。值得注意的是，WOA干预后铁死亡相关蛋白水平和胎盘Fe²⁺显著恢复至正常水平，表明WOA改善紊乱的铁稳态并逆转细胞内抗氧化剂耗竭以抑制PE小鼠胎盘铁死亡。 升高的铁诱导肠道上皮细胞铁死亡，破坏肠道黏液层，导致紧密连接蛋白丢失，促进肠道炎症，导致肠道屏障损伤（Chen等，2020c；Fang等，2018；Jaeggi等，2015；Luo等，2021；Qi等，2020）。此外，据报道过量铁破坏肠道有益菌和有害菌之间的平衡。PE与肠道菌群失调相关，可加剧病理过程，提示肠-胎盘轴的参与（Chen等，2020a）。特定肠道细菌（如机会致病菌梭杆菌）易位进入胎盘，最终触发炎症和胎盘形成和生长不良（Hampton，2020）。Zhang等（2024）的早期研究揭示调节肠-胎盘轴可有效缓解肠道来源的胎盘损伤或胎儿生长受限。我们课题组此前证明葛根（PLR）通过保护肠道和胎盘屏障改善PE小鼠症状（Huang等，2022）。在我们的研究中，WOA通过多种途径有效修复PE小鼠肠道屏障，如减轻肠道炎症、增强肠道紧密连接蛋白表达和维持肠道屏障通透性。修复的肠道屏障可抑制病原菌和LPS易位，从而减少胎盘炎症并增强保护胎盘的能力。在胎盘中，WOA干预减少炎症同时增加紧密连接蛋白表达，进一步证实其对胎盘屏障的保护作用。相关分析揭示肠道和胎盘屏障的一致变化，进一步支持肠道与胎盘之间的关联。此外，根据将WOA处理小鼠粪菌移植至PE小鼠获得的数据，肠道菌群被证实为WOA影响的关键上游调节因子。因此，我们推断WOA通过调节肠-胎盘轴保护胎盘。 肠-胎盘轴在PE中至关重要，诱导肠道微生物组成改变可产生有益作用（Ahmadian等，2020；Chen等，2020a）。在我们的研究中，我们观察到Akkermansia和双歧杆菌丰度与收缩压以及sFlt-1/PlGF比值呈负相关，提示Akkermansia和双歧杆菌可能参与PE血压和血管生成的调节。有趣的是，WOA处理的PE小鼠中Akkermansia和双歧杆菌相对水平同时显著上调。在2型糖尿病小鼠接受葛根抗性淀粉给药后也检测到Akkermansia和双歧杆菌富集（Song等，2021）。与我们之前的发现相似，葛根抗性淀粉（PLR-RS）补充增加缺血性卒中大鼠Akkermansia和双歧杆菌含量，突出这两种细菌之间的共生关系（Lian等，2023）。Akkermansia muciniphila是一种定植于黏膜层的肠道共生菌，据报道通过其衍生的细胞外囊泡和短链脂肪酸代谢产物减轻PE症状，促进滋养细胞侵袭从而改善螺旋动脉重构（Chen等，2023；Jin等，2022）。肠道微生物组是一个复杂的生态系统，成员之间的相互作用负责肠道微生态的稳定性，影响宿主健康和疾病（Wu等，2021）。我们推测Akkermansia将肠道黏液层厚度增加至有益程度以维持肠道完整性（Derrien等，2008；Yan等，2021），这可能为双歧杆菌的定植和生长提供适宜的肠道环境。双歧杆菌是一种公认的肠道益生菌，通过增强紧密连接蛋白表达对肠道屏障发挥保护作用（Tang等，2023），表明其对防止有害细菌和内毒素易位的保护作用。母体妊娠期双歧杆菌治疗促进胎盘形态发生、营养转运和胎儿生长（Lopez-Tello等，2022）。此外，在后代中，双歧杆菌塑造肠道微生物组并促进免疫系统发育（Cheng等，2022）。双歧杆菌在早期两样本孟德尔随机化研究中与PE相关（Li等，2022）。在我们的研究中，在WOA处理的PE小鼠胎儿中检测到四种优势双歧杆菌（B. bifidum、B. longum、B. breve和B. animalis），其中B. bifidum被确定为最关键的菌株。我们发现补充B. bifidum的PE小鼠母体高血压和尿蛋白水平降低，胎儿重量和胎盘效率增加，胎盘损伤减轻。我们的发现首次表明双歧杆菌富集在PE改善中发挥作用。此外，肠道菌群组成的改变可显著影响其代谢产物。短链脂肪酸（SCFAs）是肠道菌群的重要代谢产物，与胎盘功能密切相关（Husso等，2023）。例如，肠道菌群产生的SCFAs促进巨噬细胞分化并抑制胎盘炎症，抵抗PE的发展（Huang等，2023）。此外，在我们的研究中，WOA富集的益生菌如Akkermansia和双歧杆菌可产生SCFAs。Akkermansia可通过SCFAs调节胎盘巨噬细胞极化和螺旋动脉重构，从而缓解PE（Jin等，2022）。一项临床研究显示，补充双歧杆菌和长双歧杆菌显著增加血液透析患者SCFAs水平（Wang等，2022）。高水平的SCFAs可减少肠道炎症并增强肠道屏障完整性，从而防止病原菌入侵（Pertiwi等，2024）。除了在肠道的保护作用外，SCFAs还可被吸收进入血液循环（Doan等，2024）。SCFAs在结肠的吸收涉及载体介导机制和简单扩散。参与SCFAs摄取的转运蛋白包括钠耦合单羧酸转运蛋白（SMCTs）和单羧酸转运蛋白（MCTs），位于肠道上皮和基底外侧膜（Hsu等，2024）。吸收后，SCFAs可通过循环系统延伸至许多远端器官系统（Sun等，2017）。因此，我们推测肠道菌群产生的有益代谢产物可通过血液循环到达胎盘并减轻PE引起的胎盘损伤。 除肠道微生物相互作用的影响外，WOA成分的直接作用也可能共同促进双歧杆菌的富集。我们发现VA干预增加体内外双歧杆菌丰度。目前，VA是食品、饮料、化妆品和制药工业中使用的重要的香料，表明其对孕妇应用的安全性（Lubbers等，2021）。在我们的研究中，通过HPLC对WOA成分定量显示香草酸（VA）、表儿茶素、虎杖苷和异槲皮苷为主要成分，其中VA含量最高。其中，VA分子量最小，提示其吸收速度更快，更容易进入血液循环系统。此外，VA是一种具有多种药理特性的酚酸化合物，包括抗高血压、抗炎和抗氧化活性（Ni等，2024）。据报道，VA通过上调L-NAME诱导的高血压大鼠主动脉内皮一氧化氮合酶（eNOS）表达使高血压正常化，突出其在高血压管理中的潜力（Kumar等，2014b）。此外，妊娠期间增加的铁需求最初通过动员母体储存满足，主要来自肝脏。随着这些储存耗尽，肠道成为铁吸收的主要来源，确保母体和后代供应充足（Millard等，2004）。据报道，VA通过限制肠道上皮细胞铁死亡抑制炎症并保护肠道屏障，提示其具有调节肠道铁吸收的潜力（Ni等，2024）。基于这些发现，我们推测WOA在PE小鼠中恢复血管生成、抗高血压和降低尿蛋白的作用可能与VA的生物活性密切相关。为验证这一假设，评估了口服VA对PE小鼠模型的作用。如预期，VA干预显著降低高血压，恢复尿蛋白水平，并逆转PE小鼠胎盘血管生成失衡（图S5）。有趣的是，VA在降低模型小鼠血压方面比WOA更有效（图S6）。此外，VA触发胎盘促血管生成因子（VEGF和PlGF）水平显著增加，同时抑制抗血管生成因子（sFlt-1），支持WOA通过VA调节保护PE模型小鼠血管功能的理论。据我们所知，迄今为止尚无关于AVL非挥发性成分对血管生成恢复贡献的研究。本研究数据支持基于其VA成分，AVL在缓解PE症状方面的新应用。然而，表儿茶素、虎杖苷和异槲皮苷干预PE的药效学研究也值得进一步研究。表儿茶素已被证明与NF-κB结合，提示其潜在抑制NF-κB磷酸化从而缓解PE内皮功能障碍（Rahayu等，2016）。据报道，表儿茶素还可降低精氨酸酶和NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）氧化酶活性，提示其在抗高血压和抗氧化方面的潜力（González-Garrido Chem等，2013）。此外，异槲皮苷主要通过ACE抑制、增加缓激肽、PGI2（前列腺素I2）和一氧化氮（NO）生物利用度缓解自发性高血压大鼠高血压（Gasparotto Junior等，2011）。此外，据报道异槲皮苷减少自发性高血压大鼠ROS（Gasparotto Junior等，2011）。这些研究表明它们在改善PE方面的潜在价值，值得我们进一步研究。 在本研究中，我们首次证明WOA和VA均对PE具有保护作用。WOA主要通过抑制胎盘铁死亡、保护肠道和胎盘屏障、重塑肠道微生物群来缓解PE。我们的发现进一步支持肠-胎盘轴，并提示AVL有潜力被开发为孕妇安全有效的功能性食品。 5. 结论 我们的发现首次表明，AVL通过VA活性富集肠道B. bifidum含量以缓解PE小鼠症状。此外，AVL通过调节与肠-胎盘轴相关的多种通路预防流产。本研究为AVL作为PE治疗药的系统开发和临床应用提供了新方向，具有理论意义和实践价值。 点个在看你最好看