Neomycin Sulfate

摘要：流感仍然是主要的公共卫生问题之一，因为它每年都会流行，并有可能引发全球大流行。包括疫苗和抗病毒治疗在内的多种对策正在用于对抗季节性流感感染；然而，由于抗病毒药物的持续抗药性以及与其他疫苗相比流感疫苗相对较低且不可预测的效率，它们的有效性一直受到讨论。对疫苗作为预防和控制流感的有前途方法的兴趣日益增加，可能会提供具有潜在提高效率的替代疫苗开发选项。除了市场上现有的灭活、减毒活和重组流感疫苗外，目前正在探索诸如病毒样颗粒（VLPs）和纳米颗粒等新型平台，以及新的疫苗配方。这些平台提供了设计具有改进属性的流感疫苗的机会，以最大化质量和安全性。流感疫苗的生产过程也在向前发展，涉及基于鸡蛋和细胞的生产、纯化过程，以及对物理化学属性和疫苗降解途径的研究。这些将有助于设计更稳定、优化的疫苗配方，指导当代分析测试方法和通过实施该领域最新进展的实现。 1.流感病毒及其亚型 流感病毒是正黏液病毒科的一种包膜病毒。感染脊椎动物的流感病毒有四个属：A型、B型、C型和D型，它们根据基质蛋白和核蛋白的抗原差异进行区分。A型是迄今为止最有毒的病毒，可导致严重的呼吸道疾病或死亡。它甚至可能导致新的流感流行病和全球大流行。B型流感病毒也会导致人类的季节性流感流行。有两种流行的B型流感病毒谱系，即B/Yamagata和B/Victoria，它们包含在季节性流感疫苗中。与此同时，C型流感病毒通常引起轻微症状，并不已知引起流行病，而D型流感病毒已被确认感染猪、牛和羊，并未被识别为在人类中引起疾病。病毒携带一个负义、单链RNA(ssRNA)基因组，分为八个（A型、B型）或七个（C型、D型）独立的片段。在透射电子显微镜(TEM)下，A型和B型流感病毒在形态上无法区分（图1）。 图1.(A) 流感病毒的透射电子显微镜图像，主要呈球形，粒径约为100-150纳米；(B) 流感A型病毒的示意图，表示病毒组分，包括表面糖蛋白HA和NA，M1和M2蛋白，非结构蛋白和核蛋白。 它们具有直径约100纳米的球形或丝状形态，球形结构的直径通常超过300纳米，丝状形态的长度通常超过300纳米。A型流感病毒颗粒表面覆盖有病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。每个平均大小为120纳米的病毒颗粒在其脂质膜上有大约300-400个HA和40-50个NA，尽管不同亚型之间的每种蛋白的数量各不相同。这两种糖蛋白成为进一步细分A型流感病毒的基础。迄今为止，已鉴定出18种HA亚型和11种NA亚型。H1-3和N1,2株（例如A/H1N1和A/H3N2）主要感染人类，目前作为季节性流感株在人类中流行。也有记录显示，其他亚型如高致病性H5N1也会导致家禽爆发和人类感染。 病毒膜上存在少量的基质离子通道蛋白(M2)，其比例大约是每10-100个HA分子一个M2。脂质包膜及其三种蛋白(HA、NA和M2)包裹着称为M1的基质蛋白，它环绕着病毒核心。病毒内部含有非结构蛋白2(NS2)和核糖核蛋白(RNP)复合体，该复合体由RNA片段和核蛋白(NP)层叠构成，RNA依赖的RNA聚合酶由两个聚合酶基础亚基(PB1和PB2)和一个聚合酶酸性蛋白(PA)亚基组成。 流感B型病毒的结构配置几乎与四种膜蛋白相同：HA、NA，以及代替M2的NB和BM2在B型病毒中发现。流感C型和D型病毒在结构上与A型和B型病毒明显不同，它们只有一种主要的表面糖蛋白，即HA酯酶融合糖蛋白，其功能类似于A型和B型病毒的HA和NA。流感C型和D型病毒颗粒有多种形态：它们呈椭圆形或球形，直径为80-120纳米，或呈丝状，直径相似，但长度在微米范围内。2.流感病毒生命周期 流感病毒的复制周期经历了几个阶段，如图2所示，如下：(1)病毒附着在唾液酸受体上，(2)病毒进入宿主细胞，(3)病毒颗粒的融合和解壳，(4)vRNPs进入细胞核，随后病毒RNA基因组的转录和复制，然后vRNPs从细胞核中导出，(5)病毒组分的组装和在宿主细胞膜上的出芽，最后(6)新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 图2.流感A型病毒的生命周期：(1) 病毒通过HA附着在唾液酸受体上；(2) 病毒通过内吞作用进入宿主细胞；(3) 病毒颗粒的融合和解壳；(4) vRNPs进入细胞核，随后病毒RNA基因组的转录和复制，然后vRNPs从细胞核中导出；(5) 病毒组分的组装和在宿主细胞膜上的出芽；(6) 新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 (1) 病毒附着在唾液酸受体上：病毒感染的第一阶段是HA附着在宿主细胞膜表面的唾液酸上。唾液酸通过糖苷键与HA的碳水化合物相连。有两种连接对于HA的特异性至关重要；(i) a(2, 3)连接在禽类的消化道或人类、猴、马的支气管组织中丰富，以及猪的上呼吸道肺上皮，(ii) a(2, 6)连接在人类上呼吸道细胞表面以及蝙蝠和猪的气管中发现。 (2) 病毒进入宿主细胞：病毒结合后发生受体介导的内吞作用，病毒以内体形式进入宿主细胞。 (3) 病毒颗粒的融合和解壳：内体的酸性pH值（pH 5-6）导致病毒和内体膜融合，并打开M2离子通道蛋白，使核酸酸化，从而允许vRNP从M1中释放出来，进入宿主细胞的细胞质，然后进入细胞核。 (4) vRNPs进入细胞核后的转录和复制：构成vRNP（NP、PA、PB1和PB2）的病毒蛋白检测到可以附着在细胞核输入机制上的核定位信号，因此进入细胞核进行转录和复制过程。负义RNA首先被转化为正义RNA，并作为生成病毒RNA的模板，随后由病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）启动内部RNA合成。通过其C末端结构域，RdRp与RNA聚合酶II（Pol II）的大亚基相关联，继续转录以产生成熟的mRNA。然后vRNPs通过核孔从病毒核心中导出。 (5) 病毒组分的组装和出芽：病毒的蛋白组分，即HA、NA和M2，被运输到膜的顶部区域，病毒颗粒从极性上皮细胞中出芽。 (6) 新病毒颗粒从宿主细胞中释放：在形成病毒颗粒后，由NA切割糖蛋白和糖脂上的唾液酸残基，使新合成的病毒颗粒能够从宿主膜上释放并传播到附近的细胞。3.流感病毒的HA和NA HA和NA是主要的跨膜糖蛋白，HA大约占病毒表面的80%。这两种糖蛋白识别宿主细胞的同一分子，即唾液酸(SA)。除了病毒的感染力和传播力外，这两种蛋白还与病毒的毒力特性、宿主特异性和对抗病毒治疗的抗性有关。HA和NA结构的带状图示于图3中展示。 图3.1918年人类HA（蛋白质数据银行(PDB) ID: 1RUZ）和2009年H1N1 NA与奥司他韦(PDB ID: 3TI6)复合物的带状图，其受体结合位点以蓝色圆圈显示。(A) HA单体；(B) NA单体；(C) 三聚体HA和(D) 四聚体NA从顶部显示。 HA由三个不可区分的亚基（同源三聚体）组成，附着在病毒脂膜上，每个单体都拥有一个包含受体结合域的球形头部，以及一个杆状区域（图3A）。这种蛋白负责病毒与其目标细胞的初次接触，这些细胞含有末端唾液酸残基。此外，HA通过内吞作用促进病毒进入宿主细胞，从而将核蛋白送入细胞质。HA作为流感病毒上的主要抗原，成为抗体中和的主要靶标。 NA（图3B）是一种四聚体蛋白，由四个相同的多肽组成，包括一个球形头部、一个细胞质尾部、一个跨膜域和一个杆状区域。它是一种酶，通过催化从一系列糖缀合物（如糖蛋白和糖脂）中切割末端α-(2,3或2,6)-酮苷键唾液酸，破坏HA所识别的受体，因此在病毒复制周期中发挥着至关重要的作用。NA作为一种生物学剪刀，切割HA和细胞表面糖苷的唾液酸残基，促进病毒进入期间病毒的运动，以及从新合成的病毒颗粒的表面糖蛋白上切割，从而允许病毒从宿主细胞中释放并继续感染其他细胞。 流感病毒完全依赖于HA和NA的平衡作用来建立有效的感染。在初次感染期间，受体结合亲和力的增加似乎也需要增加病毒NA的受体破坏活性。另一方面，在感染的后期，增强的受体结合是一个严重的不利因素，因为它会阻止新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 4.HA和NA的糖基化 在流感病毒的复制周期中，由于复制过程的错误，病毒基因可能发生小的变化，这可能导致抗原漂移（病毒基因的小变化或突变，可能导致HA或NA的变化）。除了氨基酸序列的改变，抗原漂移通常还涉及病毒糖蛋白的糖基化模式的变化。HA和NA都具有N-糖基化潜在区域，通过N-糖苷键将寡糖链添加到存在于Asn-AA-Ser/Thr序列中的Asn残基上，其中AA可以代表除脯氨酸以外的所有氨基酸。这种附加是在内质网（ER）中存在的糖基转移酶和寡糖转移酶酶的帮助下发生的，随后在通过ER和高尔基体转移过程中，通过甘露糖苷酶和糖苷酶对寡糖进行结构改变。这种翻译后修饰对流感病毒生命周期至关重要，它影响生物合成、结构稳定性和糖蛋白功能。 HA的糖基化位点位于杆状区域，有助于HA的分子稳定性、其受体结合和宿主的免疫反应。先前的研究还表明，HA球形头部的糖基化可能暴露或保护抗原位点，使病毒能够逃避中和抗体。自1977年以来，四种季节性人类流感病毒株，两个A型亚型（A/H1N1和A/H3N2）和两个B型谱系（B/Victoria和B/Yamagata）已在全球范围内传播。图4展示了A/H1N1和A/H3N2株从1918年到2018年的糖基化模式的演变，即它们首次引入人类和当前流行的模式。1918年大流行A/H1N1和1968年A/H3N2流感病毒的HA杆状区域的糖基化已知是高度保守的。1918年A/H1N1在残基27、28、40、304、498和557处拥有六个保守的N-糖基化（NLG）位点（图4A），而1968年A/H3N2在残基24、38、54、301和499处有五个糖基化位点（图4B）。另一方面，HA的球形头部多年来经历了随后的糖苷增加和丢失。A/H3N2 HA球形头部的NLG位点数量从1968年最初的两个（位于残基97和181）增加到2018年季节性株的八个（位于残基79、138、142、149、160、174、181和262），在1975年左右97位点消失后。同样，1918年A/H1N1在其消失于1957年之前获得了越来越多的糖苷，并在1977年重新出现直到2009年A/H1N1株取代它之前具有相同的糖基化剖面。目前流行的A/H1N1株是猪系病毒的重组结果，糖基化与非常早期的人类A/H1N1相似。与此同时，自1983年Victoria和Yamagata谱系分裂以来，流感B病毒的NLG位点一直保持在大约10-12个位点相对稳定。 图4. 1918年HA（A）和1968年HA（B）的一些NLG位点。这些NLG位点是最初确定的，而红色、绿色和黄色的NLG位点是后来获得的。粉红色圆圈代表NLG位点的演变。1918年A/H1N1最初拥有六个NLG位点，并在1977年获得了两个NLG位点，但失去了两个，而2009年A/H1N1获得了三个。当前流行的2018年A/H1N1株又失去了五个NLG位点。与此同时，1968年A/H3N2 HA球形头部的NLG位点从1968年最初的两个增加到当前2018年株的八个（随着时间的推移，NLG位点的数量和位置发生了变化）。 HA中的糖基化位点和糖苷剖面的变化影响病毒与宿主免疫系统的相互作用。逃避中和抗体的识别使病毒能够继续在人类群体中传播。因此，需要更多的研究来研究病毒糖蛋白的糖基化模式，以设计更好的针对流感病毒的疫苗。虽然已知HA的NLG有助于免疫逃逸和流感病毒的毒力，但NA的NLG如何影响其功能仍然不清楚。先前发表的研究表明，N8 NA蛋白的糖基化对正确的四聚体化是必要的。此外，NA蛋白头部结构域的糖基化对正确的成熟是必需的。在最近的一项研究中，Bao等人探讨了A/1933/WSN/H1N1（WSN）病毒NA蛋白中NLG修饰的功能。结果表明，NA蛋白的NLG修饰对其出芽至关重要。在转染细胞中，非糖基化NA蛋白失去了出芽能力。此外，NLG修饰的缺失显著降低了突变病毒的出芽和复制。在小鼠模型中，NLG在219位点的缺失显著减弱了WSN病毒。有建议称，在细胞中过表达非糖基化NA蛋白诱导了未折叠蛋白反应（UPR），这可能会影响NA蛋白的出芽能力，从而减弱突变病毒的毒力。 5.流感流行病与大流行  流感病毒可以通过感染呼吸道引起严重的传染病，可能导致住院甚至死亡。据预测，每年的季节性流感大约有300万至500万例严重疾病和29万至65万例相关呼吸道死亡。东南亚和撒哈拉以南非洲的死亡率最高，75岁及以上的老年人、五岁以下儿童以及患有长期疾病使他们更容易感染流感或其并发症的个体，是严重后果和死亡的高风险群体。 新的A型流感病毒株每2至5年不定期出现，持续3至6个月，具体取决于地区。流感流行病通常被称为流感季节，可能与天气和气候有关。病毒表面糖蛋白HA和NA内的特定突变使得病毒能够逃避宿主免疫系统，导致自然感染或接种疫苗后都无法对病毒产生持久免疫力。流感病毒抗原性的微小变化被称为抗原漂移，这是流感流行病频繁发生的基础，使得每年都有必要根据世界卫生组织的建议更新流感疫苗以匹配当前流行的毒株。 另一方面，流感大流行是由病毒抗原性的显著变化引起的，大约每10至40年发生一次；然而，它可能在任何时候发生。历史上记载，20世纪至少发生了三次大流行：1918-1919年的西班牙流感、1957-1958年的亚洲流感和1968-1969年的香港流感，各自的死亡率从毁灭性到温和不等。这些大流行病毒通过不同流感病毒株的RNA片段重组获得了新的亚型。这种遗传变化，被称为抗原转变（由两种病毒株的基因组重组引起的病毒抗原性的突然变化），允许病毒株从一个动物物种跳到另一个物种，从动物跳到人类。 1918年的大流行，也称为西班牙流感，是有史以来第一次也是最严重的流感大流行。据估计，该病毒通过感染全球约25-30%的人口，杀死了大约5000万个体，约占世界人口的2.7%。2018年Spreeuwenberg等人的更近期分析表明，早期估计过高。他们自己的估计将死亡人数定为1740万，占世界人口的0.95%。1918年大流行是由A/H1N1亚型流感病毒引起的，被认为是几乎所有人类A型流感病例的共同祖先。这不仅包括1918年H1N1病毒的抗原“漂移”后代，还包括1957年（H2N2）、1968年（H3N2）和2009年（H1N1）出现的遗传重组大流行病毒。1957年2月在中国湖南省出现的H2N2亚型流感A病毒，被认为在临床上比导致1918年大流行的H1N1病毒更温和，全球死亡率为110万。该病毒在全球传播，直到1968年H3N2出现，引起了另一次大流行。它首先在中国出现，然后迅速传播到香港。1968年大流行，也称为香港流感，相比之下是一次较温和的大流行，死亡人数约为100万。21世纪的流感大流行始于2009年初，当时一种新的猪源性流感病毒出现并取代了以前的季节性流感H1N1。最初在墨西哥发现的病毒迅速在全球传播，并在74个国家报告感染后，世卫组织于2009年6月宣布为大流行。该病毒，也称为“2009 H1N1”，是两种已存在的猪流感病毒—北美H1N2和欧亚H1N1—之间的重组产物。 过去二十年，直接从鸟类到人类的禽流感病毒传播的报告有所增加，导致禽流感A/H5N1在家禽中的持续爆发和相关的人类感染。1997年，首次在香港检测到人类感染H5N1的致命病例。六年后的2003年，该病毒作为一种高致病性禽流感病毒重新出现，在当地家禽中引起了毁灭性的爆发，引发了对潜在流感大流行的担忧。这些爆发在几个国家已成为地方病，埃及、印度尼西亚和越南的病例数量最多。2007年，有证据表明中国有限的人传人H5N1。此外，世卫组织报告称，2006年和2007年在印度尼西亚和巴基斯坦分别观察到有限的、非持续的人传人H5N1病例。2014年1月8日，加拿大报告了美洲首例H5N1感染病例，是一名从中国返回的旅行者。尽管人类感染这种病毒并不常见，但大约60%的病例导致死亡。2019年11月，世卫组织宣布自2003年以来共有861例经核实的人类禽流感A(H5N1)病例，导致455例死亡，最后一例于2019年4月30日在尼泊尔报告。 6.针对流感流行病和大流行的疫苗  有几种疫苗用于对抗流感流行病和大流行。流感疫苗每年根据当前流行株的全球监测进行重新配制。因此，每年接种疫苗仍然是预防季节性流行性感冒的最有效方法。 目前，全球使用三种类型的疫苗：灭活流感疫苗(IIV)、减毒活流感疫苗(LAIV)和重组HA疫苗（表1）。每种疫苗都有其优点和缺点。疫苗可以诱导免疫效应分子，包括体液效应分子（B淋巴细胞产生的抗体），能够特异性结合病毒抗原，以及细胞效应分子（细胞毒性CD8+ T淋巴细胞），通过杀死感染细胞来限制病毒在体内的传播。所有流感疫苗都需要每年更新，因为免疫持续时间很短，并且要匹配流行病毒的抗原性。因此，世卫组织和其他利益相关者每年两次会面，根据全球流通病毒的抗原和遗传特性以及不同国家的流行病学信息，选择最合适的流感病毒。其中一次流感疫苗组成会议针对北半球，另一次针对南半球。 多年来，含有两种流感A（H1N1和H3N2）和一种流感B病毒系的三价疫苗被配制出来，以提供对三种不同流感病毒的保护，尽管存在两种不同的B病毒系。因此，为了更广泛地保护当前流行的病毒，将第二种B病毒系添加到配方中，制成四价流感疫苗。目前批准的流感疫苗在HA数量或抗原性方面进行了定量标准化，但并非在中和抗体（NA）方面。因此，疫苗的NA含量和NA免疫原性可能差异很大。 6.1.灭活流感疫苗(IIV) 灭活病毒疫苗是全球最常用的方法，因为它的高安全性和相对较低的生产成本。因此，它在全球流感疫苗市场中占有最高的百分比。IIV适用于六个月以上的儿童，如Afluria Quadrivalent、Fluarix Quadrivalent、FluLaval Quadrivalent和Fluzone Quadrivalent；然而，一些IIV仅适用于65岁及以上的个体，如Fluad和Fluzone High-dose Quadrivalent（表1）。这种类型的疫苗通常在鸡胚或哺乳动物细胞培养中培养病毒（图5）。已经证明IIV可以诱导局部和全身免疫，尽管可能需要加强疫苗接种以维持抗体滴度。IIV有三种类型：全病毒灭活疫苗、裂解病毒灭活疫苗和亚单位灭活疫苗。 图5.流感疫苗制造过程。基于鸡蛋和基于细胞的疫苗制造都是从在鸡蛋或细胞中培养的候选疫苗病毒（CVV）开始的（步骤1）。在收获、分离、过滤和纯化之后（步骤2），病毒通常使用甲醛进行化学灭活，以制造灭活流感疫苗，或者通过化学表面活性剂破坏，以准备分裂病毒疫苗或亚单位疫苗（步骤3）。最后一步涉及填充-完成过程和包装，在冷链条件下交付和储存产品（步骤4）。重组流感疫苗不需要整个病毒的生长；只需获得HA抗原的遗传信息，并与杆状病毒结合，以便于将遗传信息（DNA）传递到宿主细胞中表达HA抗原。然后生产、收获、过滤、纯化抗原，接着制备疫苗。 6.1.1.全病毒灭活疫苗(WIV) 全病毒疫苗是最早使用的流感疫苗。然而，在接种后报告了若干系统性和局部副作用。这些不良反应可能源于疫苗中的杂质，如鸡蛋蛋白。不过，疫苗生产技术的改进已经使得疫苗更安全，杂质更少，副作用更少。在WIV中，在鸡胚中孵化和生长后，病毒颗粒主要用甲醛或β-丙内酯化学灭活，然后进行纯化（图5）。尽管这种方法是流感病毒灭活最常用的方法，但也可以采用其他方法进行病毒灭活，包括加热和辐射。 由于市场上已经出现了其他类型的疫苗，如裂解病毒灭活疫苗，具有较少的反应原性效应，因此这种类型的流感疫苗的使用目前受到限制。疫苗3Fluart是由Fluart Innovative Vaccines Kft.生产的WIV，仅在欧洲使用。 6.1.2 裂解病毒灭活疫苗 目前使用的大多数流感疫苗是裂解病毒或亚单位疫苗，因为它们具有适当的免疫原性和生产便利性。然而，由于缺乏整个病毒结构，它们失去了一些固有的免疫原性，这与WIV不同。裂解病毒疫苗可以通过使用Triton-100或辛基葡萄糖苷等表面活性剂化学破坏病毒膜来制备。然后，通过切向流过滤去除表面活性剂。表1总结了美国（代表北半球）和澳大利亚（代表南半球）的季节性流感裂解病毒疫苗，包括其制造商和适用年龄组信息。 在澳大利亚，大多数季节性流感疫苗是裂解病毒灭活疫苗，市场上有五种疫苗：FluQuadri（由Sanofi, 美国宾夕法尼亚州生产）、Vaxigrip Tetra（由Sanofi-aventis, 新西兰奥克兰生产）、Fluarix Tetra（由GlaxoSmithKline Biologicals, 德国德累斯顿生产）、Afluria Quadrivalent（由Seqirus, 澳大利亚墨尔本生产）和Influvac Tetra（由Abbott, 荷兰霍夫多尔普生产）。在美国，裂解病毒灭活疫苗也占季节性流感疫苗的主要部分，有五种疫苗：Afluria Quadrivalent（由Seqirus, 澳大利亚墨尔本生产）、Fluarix Quadrivalent（由GlaxoSmithKline Biologicals, 德国德累斯顿生产）、FluLaval Quadrivalent（由ID Bio-medical, 加拿大魁北克省拉瓦尔生产）、Fluzone High-dose Quadrivalent（由Sanofi, 美国宾夕法尼亚州生产）和Fluzone Quadrivalent（由Sanofi, 法国巴黎生产）。 6.1.3.亚单位灭活疫苗 通常，亚单位疫苗只包含病毒的抗原部分：HA和NA。这些蛋白质是通过使用表面活性剂裂解病毒后从流感病毒中纯化的（见图5）。这种类型的流感疫苗通常需要佐剂来诱导足够的免疫原性，特别是在老年人中。Seqirus生产的Fluad和Fluad Quadrivalent是可用于65岁及以上人群的亚单位流感疫苗。另一个疫苗，由Mylan Health生产的Influvac Tetra，适用于三岁以上人群（见表1）。由于它们的免疫原性相当且反应原性低，所需的疫苗剂量大和高生产成本，所有这些都需要进一步改进。自20世纪70年代以来，裂解病毒比亚单位病毒疫苗更常用。 6.2.减毒活流感疫苗（LAIV） LAIV的开发是为了模仿自然感染和免疫，而不引起严重疾病，从而诱导体液和细胞免疫。LAIV最早在20世纪60年代提出，方法是在鸡蛋中在非最佳条件下培养流感病毒。这些减毒病毒对温度敏感，只在25°C（冷适应）下生长。冷适应供体病毒经过几次传代，温度逐渐降低，在孵化的鸡蛋中进行。因此，当LAIV通过鼻内给药时，它可以在与鼻咽粘膜表面相同的温度范围内生长。LAIV比IIV有一些优势，因为它主要诱导局部粘膜免疫和局部免疫球蛋白A（IgA）的产生以及IgG，而IIV只有系统性IgA和IgG抗体。然而，由于使用活病毒进行免疫的风险，LAIV不推荐用于免疫功能低下的个体（免疫受损）或与他们密切接触的人。 由MedImmune生产的FluMist Quadrivalent（见表1）是一种经美国批准的鼻内LAIV季节性流感疫苗，可安全用于2至49岁的儿童和成人，包含四种流感毒株（两种流感A和两种流感B）。由AstraZeneca生产的Fluenz Tetra在欧洲获批，是另一种用于2至17岁儿童的LAIV。截至2021年，澳大利亚尚未批准任何LAIV。 6.3.重组HA疫苗 重组HA疫苗可以通过昆虫细胞和杆状病毒的重组蛋白表达技术生产，因为它们产量高且成本效益好（见图5）。昆虫细胞是用于重组蛋白表达的典型细胞系，Gibco Sf9细胞系是最常用于人类或兽医医学中重组蛋白表达的细胞系。 重组HA疫苗比基于鸡蛋的流感疫苗有优势：没有来自鸡蛋适应的不需要的突变（见表1）。此外，重组HA疫苗是鸡蛋过敏者的合适选择。尽管重组HA疫苗和IIV的作用机制相似，但重组HA疫苗的免疫原性较低，因此需要比IIV多三倍的HA才能诱导出与IIV相同的抗体滴度。重组HA疫苗的另一个优势是它适合流感大流行，因为它可能需要更短的制造时间，并且由于缺乏高致病性病毒，它比其他流感疫苗更安全。然而，由于在儿童中缺乏效力，重组HA疫苗仅限于成人。由赛诺菲巴斯德生产的Flublok Quadrivalent是第一种重组HA疫苗（见表1）。 7.流感疫苗制造过程 目前，流感疫苗可以通过三种不同的方法生产：传统的基于鸡蛋的疫苗（传统方法）、基于细胞的疫苗和重组HA疫苗。这些方法在图5中总结。基于鸡蛋和基于细胞的疫苗制造都是从在鸡蛋或细胞中培养的候选疫苗病毒（CVV）开始的（步骤1）。在收获、分离、过滤和纯化之后（步骤2），病毒通常使用甲醛进行化学灭活，以制造灭活流感疫苗，或者通过化学表面活性剂破坏，以准备分裂病毒疫苗或亚单位疫苗（步骤3）。重组流感疫苗不需要整个病毒的生长；只需获得HA抗原的遗传信息，并与杆状病毒结合，以便于将遗传信息（DNA）传递到宿主细胞中表达HA抗原。最后一步涉及填充-完成过程和包装，在冷链条件下交付和储存产品（步骤4）。 7.1.基于鸡蛋的疫苗 自20世纪40年代以来，基于鸡蛋的疫苗一直是每年生产数百万流感疫苗的最常见方法。无论疫苗株如何，都需要大量的鸡蛋供应来在鸡蛋中培养目标病毒。这种方法从选择预测的循环病毒株开始，然后是HA和NA的遗传片段在鸡蛋中可以大量生长且具有良好安全特性的鸡蛋适应病毒中的重组，如A/Puerto Rico/8/1934。在这些重组病毒产生后，它们被注入孵化的鸡蛋中生长，然后进行测序确认以收集候选病毒。经批准的病毒随后由世界卫生组织全球流感监测和响应系统（GISRS）的附属中心交付给私营制造商。制造商在孵化的鸡蛋中大量生产病毒，然后纯化重组病毒。然后，使用甲醛或β-丙内酯化学灭活纯化的病毒，并标准化HA含量，去除非病毒蛋白的污染物。HA蛋白是诱导针对流感病毒的抗体的关键因素，因此是流感疫苗开发的重点。 尽管基于鸡蛋的制造方法有许多好处，例如通常获得高滴度的流感病毒和大规模生产的重要经验，但有几个缺点可能影响其效率。首先，重组病毒在鸡蛋中的适应性和筛选分离病毒的抗原性延迟了为下一个流感季节生产流感疫苗所需的时间，因此，必须在即将到来的流感季节之前很久就开始生产流感疫苗。然而，一些流感株（如H3N2病毒）在鸡蛋中生长不佳。因此，使用这些株的流感疫苗生产需要很长时间，并因影响标准生产时间框架而延迟疫苗的交付。在基于鸡蛋的制造过程中，病毒没有被监测并且会发生突变。这种鸡蛋适应性可能导致生产与循环株不匹配的病毒，从而导致疫苗效力下降。此外，由于潜在的禽流感病毒在鸡舍中的暴露风险，还存在生物安全问题。 7.2.基于细胞的疫苗 美国食品药品监督管理局（FDA）在2012年批准了Flucelvax，这是美国首个获批的基于细胞的流感疫苗。使用Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞来培养病毒。基于细胞的方法可以类似于基于鸡蛋的方法，使用选定毒株的HA和NA进行病毒的重组。与基于鸡蛋的方法相比，基于细胞的方法具有一些优势。首先，使用细胞可以克服鸡蛋短缺的限制，并由于依赖生物反应器的容量，提供了更灵活的疫苗生产方法。因此，与基于鸡蛋的疫苗相比，基于细胞的疫苗可以在更短的时间内生产。此外，在鸡蛋中培养病毒时可以观察到HA蛋白更异质的糖基化谱。一些研究调查了使用哺乳动物细胞作为基质可以增强疫苗免疫原性相对于禽类细胞的理论。 此外，基于细胞的疫苗是曾经经历过鸡蛋过敏的人的合适选择，因为它们的产品不含鸡蛋蛋白。有趣的是，基于细胞方法最重要的优势之一是缺乏由于鸡蛋适应而引起的HA突变。因此，在2016年，FDA批准了使用基于细胞的病毒，以防止由鸡蛋适应引起的进一步突变。 尽管基于细胞的方法存在优势，但仍然存在一些缺点。与基于鸡蛋的疫苗相比，大规模生产基于细胞的疫苗的经验仍然较少。此外，根据美国疾病控制中心（CDC），Flucelvax的成本比基于鸡蛋的疫苗高出40%。尽管程度较小，但在细胞培养中由于连续传代，HA和NA蛋白仍然可能发生突变。 8.流感疫苗配方和成分  疫苗必须含有确认对人类安全的成分。此外，每种疫苗成分都具有特定的目的，即增加抗原的免疫原性并保持疫苗配方稳定。 8.1.活性成分 病毒抗原，活性药物成分（API）作为免疫原性成分，是疫苗最关键的部分。每个流感季节，世界卫生组织（WHO）都推荐在四价疫苗中包含四种流感病毒，在三价疫苗中包含三种毒株。因此，四价流感疫苗包含四种流感毒株（两种流感A型毒株和两种流感B型毒株），三价流感疫苗包含三种流感毒株（两种流感A型毒株和一种流感B型毒株）。 8.2.佐剂 佐剂是改善疫苗免疫反应的化合物。其中包括如氢氧化铝（Panflu）、磷酸铝和硫酸铝钾等铝盐。佐剂被认为通过使抗原靠近注射部位，使免疫系统细胞容易接触到它们，从而增加免疫反应。疫苗中使用铝佐剂通常意味着每剂疫苗的抗原较少，在某些情况下，需要较少的疫苗剂量。疫苗中佐剂的使用通常与接种后注射部位的局部反应有关。其他佐剂也可以用于流感疫苗，如病毒体或油包水乳液（MF59、AS03、AF03）。Fluad Quad是澳大利亚唯一的含佐剂（MF59）流感疫苗。 8.3.稳定剂 稳定剂用于保持疫苗效力，通过在储存期间保持抗原和其他疫苗成分完整。稳定剂还防止疫苗成分粘附在疫苗瓶的侧面。稳定剂的例子包括糖（乳糖和蔗糖）和氨基酸（甘氨酸和谷氨酸钠）。 8.4.防腐剂 防腐剂用于某些疫苗配方中，以消除疫苗中的真菌和/或细菌感染。防腐剂最初是为了避免多剂量瓶中的细菌污染（不用于单剂量瓶疫苗）。硫柳汞、苯氧乙醇和苯酚是所使用的防腐剂之一。尽管全球范围内与使用防腐剂相关的重大有害效应相对较少，如过敏，但防腐剂已在众多疫苗接种中使用。 8.5.痕量成分 疫苗中的痕量成分是在生产初期使用的微量化学物质或物质，或从容器中浸出的，例如。根据生产程序，细胞培养液、鸡蛋蛋白、抗生素或灭活剂的痕量可能存在。在某些情况下，最终疫苗成分中只发现这些化合物的少量。 抗生素有时会在加工阶段使用，以确保不发生细菌污染。一些流感疫苗含有如新霉素、多黏菌素B和/或庆大霉素等抗生素。此外，预充疫苗注射器可能含有用作预充疫苗注射器润滑剂的硅油的痕迹。在WIV和分裂病毒灭活疫苗的开发过程中，使用灭活剂，最终疫苗含有相对较少的这些灭活化学物质或分裂剂，如甲醛、戊二醛或表面活性剂。 9.新型流感疫苗平台  9.1.类病毒颗粒（VLP）疫苗  VLP由表面病毒糖蛋白组成，它们自组装形成看起来像病毒的非复制颗粒。这些颗粒模仿原生病毒结构，但缺乏遗传物质，不能引起感染。VLP已成功开发为疫苗，并已用于对抗包括乙型肝炎病毒（Heptavax-B（由默克公司，新泽西州怀特豪斯）、Engerix-B（由葛兰素史克生物制品，比利时里克斯萨尔特）、H-B-VaxII（由默克公司，怀特豪斯，美国）和Hepavax-Gene（由杨森疫苗公司，韩国仁川））、人乳头瘤病毒（Gardasil（由默克公司，怀特豪斯，美国）、Cervarix（由葛兰素史克生物制品，比利时里克斯萨尔特）、Cecolin（由中国北京万泰生物制药）、Gardasil-9（由默克公司，怀特豪斯，美国））和戊型肝炎病毒HEV（Hecolin，由中国北京万泰生物制药）。因此，VLP平台已被证明是生产疫苗的良好策略，包括流感疫苗。 VLP已与乙型肝炎病毒核心（HBc）结合，并含有三个串联副本的M2蛋白（3M2e）以及核蛋白（NP）表位，以克服流感快速演变的挑战。VLP可以直接激活先天免疫，或通过刺激抗原呈递巨噬细胞或树突细胞，从而有效诱导病毒特异性T细胞和B细胞反应。此外，流感VLP疫苗可以包含几种不同的病毒蛋白（HA、NA、M1或M2e）在单个VLP上单独或组合，为更广泛的保护提供一定的灵活性。将纯病毒神经氨酸酶添加到传统流感疫苗中，可产生平衡且广泛的免疫反应。此外，由于蛋白质的保守性，M2e是通用疫苗开发的潜在靶标。由M1和NA组成的VLP复合物诱导了对同源和异源A亚型的反应性抗体反应和显著的保护水平。一些VLP流感疫苗候选物已进入临床试验（见表2）。Novavax公司的一种重组A（H1N1）2009流感VLP疫苗（HA）在2012年进行了2期临床试验，以评估其安全性和免疫原性。这种VLP流感疫苗在单次接种后显示出强大的免疫反应，仅有轻微的不良事件。此外，Medicago公司的一种基于植物的QVLP（HA）在2019年完成了2期临床试验。基于植物的VLP流感疫苗能够诱导强大的抗体反应和抗原特异性CD4+ T细胞。这些VLP疫苗候选物能够产生体液和/或细胞反应。它还通过诱导对四种不同流感毒株（两种流感A型和两种流感B型）的抗体，显示出交叉保护。 9.2.抗原呈递细胞（APC）诱导型疫苗 CD11c+ 树突状细胞（DCs）在病毒感染期间通过积累和转化病毒抗原为肽段，并通过主要组织相容性复合体（MHC）在二级淋巴器官向T细胞呈递，从而显著促进适应性抗病毒免疫反应。一些临床前工作已经进行，以通过诱导抗原呈递细胞来加强针对流感病毒的T细胞反应。例如，Fonteneau及其同事研究了流感病毒感染对纯化的血液DCs的影响及其向CD8+和CD4+ T细胞呈递病毒抗原的能力。他们证明，暴露于流感病毒可以诱导抗流感病毒的TH1型CD4+ T细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的扩增。这些发现表明DCs在产生抗病毒T细胞反应中具有新功能，暗示这些DCs在适应性免疫反应中扮演重要角色。另一种方法表明，将alpha-Gal表位嫁接到HA上可以增强APCs对流感疫苗病毒的摄取。因此，通过有效地针对APCs进行疫苗接种，可以增强流感病毒疫苗的免疫原性。此外，可以使用融合DNA疫苗将流感HA靶向到APCs，这些疫苗编码的蛋白能够双价地结合到流感HA上，将其靶向到APCs的不同表面分子上。这种靶向能够诱导对CD8+/Th1 T细胞反应或抗体/Th2反应的免疫反应。 9.3.基于纳米粒子的流感疫苗 传统的流感疫苗可以提供针对病毒的系统性保护；然而，对于流感病毒，也期望在粘膜呼吸道中提供局部保护。纳米粒子具有如溶解度和稳定性等特性，使它们适合粘膜免疫，因为它们能够诱导针对呼吸道病毒的免疫。这些纳米粒子可以来自天然或合成来源，并作为抗原载体。因此，与其他病毒相比，使用纳米粒子对抗流感病毒的研究更多。番木瓜花叶病毒纳米粒子被用作三价灭活流感疫苗的佐剂，并已在小鼠免疫中进行了测试。这种纳米粒子疫苗在诱导基于IgG2、IgA和支气管肺泡灌洗样本及血清中的IgG滴度的抗流感免疫方面，发现优于IIV，特别是在鼻内免疫后。此外，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒子与流感A（H1N1）保守肽结合，并作为疫苗鼻内给药。这种疫苗能够诱导抗原特异性的CD4+和CD8+ T细胞，从而在猪的肺部诱导保护。因此，诱导能够针对感染过程中涉及的多个途径的交叉保护性抗体，对于更好地保护流感病毒将大有裨益。两种不同的保守流感抗原（螺旋C和基质蛋白2（M2e）的外域）被链接在一个自组装的纳米粒子中，以实现这一目标。它们能够在小鼠模型中诱导中和抗体。 9.4.通用流感疫苗 尽管疫苗接种是预防流感感染的最有效方式，但流感病毒的抗原转变和抗原漂移使它们能够逃避抗体中和。流感病毒的这些变化是不可预测的，因此流感疫情管理非常具有挑战性。为了克服当前流感疫苗的局限性，一种提供长期和广泛保护的通用流感疫苗将非常理想。理想的通用流感疫苗应该对所有流感病毒（A型和B型）的HA和NA亚型或抗原突变都有效。为了达到这个目标，疫苗应该诱导交叉保护性抗体，这可能通过针对HA、NA或M2或内部蛋白如M1和NP中发现的保守表位来实现。HA的茎或柄区域在不同毒株的流感病毒中高度保守，被认为是开发通用流感疫苗非常有希望的目标。此外，一些从人类中分离出的针对病毒柄区域的抗体能够中和所有流感A型病毒亚型，可以用于开发通用流感疫苗。例如，开发了一种顺序嵌合HA疫苗技术，将免疫反应从头部重定向到柄域（表3）。嵌合HA由来自第1组或第2组流感病毒的柄域和来自禽流感病毒亚型的头部域组成。在2020年完成I期临床试验后，这种通用流感疫苗候选物被发现是安全的，并能唤起针对血凝素保守、免疫亚显性柄的广泛、强烈、持久和有效的免疫反应。此外，开发了一种计算优化的广泛反应性抗原（COBRA）针对H1作为通用流感疫苗（表3）。为了评估B细胞的广度，由COBRA血凝素（HA）（称为P1）诱导的抗体分泌细胞与由历史H1N1疫苗株诱导的抗体分泌细胞进行了比较。P1 HA诱导的单克隆抗体（mAbs）展示了广泛的HA识别范围，从狭窄到广泛的反应性mAbs。还开发了一种新的疫苗Multimeric-001，通过包含流感A型和B型毒株的HA、NP和M1蛋白的保守线性表位，来防御季节性和大流行性流感病毒类型，与突变无关（表3）。这种疫苗在2020年的III期临床试验中进行了评估，以评估其保护和耐受性，以及体液和细胞免疫反应。该疫苗耐受性良好，没有记录到严重不良效应。体液和细胞反应表明，该疫苗具有针对突变无关的流感病毒株的交叉免疫。在接受季节性疫苗接种前给予Multimeric-001剂量的参与者中，与单独季节性疫苗接种相比，H1N1和H3N2株的抗体反应更大。此外，在接种Multimeric-001的人群中，与基线相比，H1N1、H3N2和流感B的CD4+和CD8+ T细胞反应有所增加。 10.疫苗产品的表征  大部分疫苗生产时间（70%）都用于质量测试，以确保纯度、效力和疫苗安全性。在流感疫苗开发过程中，需要进行广泛的表征，以确保生产步骤遵循现行良好生产规范（cGMP）。尽管疫苗生产不同，质量控制测试必须考虑某些物理化学参数的方面，如纯度、含量、均质性和稳定性。 10.1.纯度  疫苗的纯度是确定最终疫苗产品中“活性”疫苗抗原比例的关键物理化学标准。最终，通过疫苗抗原测量的纯度程度将取决于测试的特异性、额外的定量方法以及产品样本的准备，以及非产品杂质。因此，至关重要的是使用选择性测定法来测量潜在的非产品/工艺相关杂质（例如，宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和/或RNA、脂质、细胞培养诱导剂等）和产品相关杂质（例如，分子重量变体，如聚集体和降解产物），以界定低于定义量的污染物和杂质的存在。此外，需要通过过滤、离心或蒸发方法去除灭活剂来纯化IIV。需要在最终产品中去除分裂病毒疫苗中的分裂材料，如Triton-100，这可以通过过滤或其他分离方法如疏水作用色谱来完成。表4总结了几种可能使用的方法，通常结合使用，以确定疫苗纯度。例如，使用正交过程如质谱法，可以准确测量分子质量，并且还可以详细说明共价变化（即糖基化）的身份和位置。此外，由于杂质在质谱分析中可能表现出与疫苗抗原相同的质量/电荷（m/z）比率，因此使用另一种正交方法如光散射（尺寸排除色谱、多角度激光光散射）来测量基于半径的回转半径的质量，有助于在质谱分析中将疫苗抗原与未解决的杂质分离。 10.2.含量 HA是流感病毒中的主要抗原蛋白，疫苗中的HA含量必须足以激发免疫系统。因此，任何类型的流感疫苗中HA的含量必须达到15 µg/mL。使用传统的蛋白质估算方法如UV吸收280 nm、双缩脲酸测定、Bradford测定、Lowry测定、基于洗涤剂的荧光检测、带荧光染色的定量凝胶电泳、胺标记“衍生化”（使用荧光探针）和酶联免疫吸附测定（ELISA）来进行定量。尽管每种方法都有潜在的优点和缺点，但了解测量方法与样本体积、pH环境、灵敏度、通量、稳健性和测定精度之间的关系至关重要。最后，评估“活性”疫苗抗原在产品相关杂质存在下的数量对于制定正确的剂量指南至关重要。 10.3.均质性 可以使用多种技术确定疫苗抗原中蛋白质的大小或分子量：分离和散射方法是主要的两种方法。在分离方法中，可以对样本施加力（例如，机械、离心、电力），根据大小、电荷、疏水性等不同特征分离分子，然后根据其运动确定生物分子的大小、形状或电荷。分离方法包括色谱测定，如高效液相色谱、凝胶电泳和沉降平衡。除了光散射方法，质谱和荧光光谱等其他光谱方法在样品表征时也常被使用。此外，透射电子显微镜（TEM）和流动成像显微镜等显微镜方法在蛋白质表征方面也有重要应用（表4）。场流分离是一种根据分子在狭窄通道中层流的取向分离蛋白质/糖蛋白/颗粒的技术，较小的分子流动更快，较大的分子（无法快速分散）流动缓慢。使用质谱法评估蛋白质的分子量或规模有助于蛋白质识别，并在定量和定性阶段量化蛋白质纯度、共价修饰和降解产物。光散射和电子显微镜（EM）是用于表征和确定基于蛋白质/糖蛋白的疫苗抗原的大小或WIVs中病毒大小分布的两种常用技术。此外，疫苗产品中蛋白质聚集的存在可能影响疫苗的稳定性和效力。这些聚集体可能是由于在分裂病毒流感疫苗的生产中去除分裂剂（表面活性剂）引起的。除了EM和光散射，UV-Vis吸收光谱和荧光发射光谱是识别蛋白质聚集的可靠技术。EM是确定大型蛋白质或蛋白质复合物大小和形状的直接成像工具。然而，由于仪器的高成本和进行此类实验所需的专业知识，通常选择其他技术（如光散射）作为大小分析的主要方法。通过动态光散射可以测量分子量、分布、扩散系数和流体动力学半径。 10.4.稳定性 了解蛋白质/糖蛋白疫苗抗原的功能和稳定性对于疫苗在激发所需的保护性免疫反应方面的总体效力至关重要。疫苗的不稳定性可能由不同因素引起，如热量、光线、辐射、环境变化或与容器或其他疫苗成分的相互作用。过度加热或冷冻可能会加速疫苗效力的丧失。因此，必须谨慎处理疫苗，密切关注它们的处理，以确保它们质量高，并提供最大效力。这可以通过使用冷链将疫苗保持在限制性温度环境中（这是保持效力所需的）从生产者到最终消费者来实现。此外，在分裂病毒疫苗中，表面活性剂类型、孵化时间、病毒浓度、表面活性剂浓度和病毒分裂比例是可能影响疫苗稳定性的其他因素。例如，在稀释或去除表面活性剂后可能会出现聚集，因此应通过优化过滤步骤的数量来监测剩余表面活性剂浓度，以维持疫苗的稳定性和效力。可以使用多种分析方法来研究疫苗稳定性，如荧光发射光谱、UV-Vis吸收光谱和血凝抑制试验（HI）测定（表4）。由于聚集和/或降解是影响蛋白质/糖蛋白稳定性的典型特征，利用这些分析方法有助于识别聚集体的大小或分子量，以了解疫苗的短期和长期稳定性。 11.流感疫苗的有效性 流感疫苗的有效性一直是流感疫苗的主要问题，因此每年都会评估季节性流感疫苗的有效性。疫苗的有效性测量可能会受到一些因素的影响，如被调查的人群、研究设计、评估的结果以及分析的流感疫苗季节。通常情况下，在流感季节，当大多数流通的流感病毒与流感疫苗中使用的病毒非常匹配时，流感疫苗接种会降低一般人群感染流感疾病的风险，降低幅度在40%到60%之间。然而，如果流感疫苗与流行病毒匹配度不高，则对由常见流通病毒引起的疾病几乎没有或没有保护作用。因此，流感疫苗的有效性每年都有所不同，从2004-2005年的10%到2010-2011年的60%不等（见图6）。 图6.根据美国疾病控制中心的数据，2004年至2020年间季节性流感疫苗在美国的有效性波动。 许多参数导致疫苗反应的不一致性，包括内在的病毒特性以及宿主因素。越来越多的数据表明，宿主变量如年龄、性别、怀孕和免疫历史在改变流感疫苗的有效性方面发挥重要作用。因此，更好地了解影响流感疫苗诱导的免疫的宿主变量，可能有助于通过优化甚至定制疫苗类型、剂量和佐剂使用，提高现有季节性和未来通用流感疫苗的有效性。自2004年以来，通常使用测试阴性设计（TND）来测量流感疫苗的有效性，当时卫生官员开始追踪流感疫苗的有效性。TND是一种修改后的病例对照方法，它对比了因流感样症状来到医疗保健场所的个体的疫苗接种状况。尽管它最大限度地减少了与寻求医疗活动相关的选择偏差，但它的局限性在于它只包括寻求呼吸疾病治疗的人。然而，随机对照试验更适合测量疫苗的有效性，因为它们较少受到选择和混杂偏差的影响。 为了提高流感疫苗的有效性，可以使用不同的策略。例如，增加疫苗的HA抗原剂量，以实现更高的血凝抑制滴度和免疫原性。最近的元分析显示，高剂量IIV比标准剂量IIV更有益于避免因流感住院，以及减少65岁以上个体与流感相关的死亡率。使用皮内疫苗接种是提高疫苗有效性的另一种选择，显示出等于或优于通过肌肉注射获得的血凝抑制水平。这归因于真皮内抗原呈递细胞数量的增加，这是增强皮内疫苗接种免疫原性的机制之一。向疫苗中添加佐剂是另一种提高疫苗效力的方法。与无佐剂的三价灭活疫苗相比，引入新型佐剂三价灭活疫苗已被证明可以增强老年人的免疫反应，并减少因流感和肺炎住院的风险。另一个选择是使用非基于鸡蛋的系统，以避免突变和其他变化，如在病毒鸡蛋适应过程中病毒蛋白的翻译后修饰，包括糖基化。 12.结论  由于广泛的病毒变异和漂移，流感可以逃避宿主的免疫防御，因此，它仍然是一个重要的、周期性的全球公共卫生挑战。因此，需要每年更新流感疫苗。目前市场上有三种流感疫苗：灭活流感疫苗（IIV）、减毒活流感疫苗（LAIV）和重组血凝素（HA）疫苗。像大多数其他疫苗一样，流感疫苗的配方复杂，需要几个关键成分，如病毒抗原、佐剂、防腐剂和稳定剂，以保持稳定和有效的疫苗配方。此外，疫苗在加工步骤和最终产品中经过许多质量测试，以确保疫苗符合标准并且安全使用。尽管如此，仍需要更多的研究来克服当前流感疫苗的局限性，如效力低、生产时间长以及缺乏交叉保护。为此，新的流感疫苗候选物正在进行中，以提高疫苗效力或提供针对许多不同毒株的交叉保护（即通用流感疫苗），以克服每年更新疫苗的需求。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：在自然和临床样本中检测病毒是研究和诊断中的一个复杂问题。存在不同的病毒分离和鉴定方法，包括PCR、CRISPR/Cas技术、NGS、免疫分析和基于细胞的检测。随着基因工程方法的发展，利用细胞培养的方法已成为有用且信息丰富的手段。分子生物学方法可以提高细胞培养对特定病毒的敏感性和特异性，并可用于生成报告基因细胞系。这些细胞系在病毒感染后表达特定的报告蛋白（例如，GFP、荧光素酶和CAT），可以在实验室环境中被检测。基因组编辑和合成生物学方法的发展为设计细胞培养中的病毒报告系统提供了新的视角。本综述旨在描述病毒学方法的一般情况以及目前存在的基于细胞的方法的开发实例。 1.引言 病毒是人类群体中许多疾病的病因，其中一些疾病可能导致流行病和大流行。为了防止这类事件，需要从患者和自然样本中快速检测出分离的病原体，以及研究分离物的属性。目前，有几种病毒检测方法。与PCR、CRISPR/Cas技术、NGS（下一代测序）、免疫分析和基于细胞的检测方法相关的检测方法（表1）。所有这些方法都有优点和局限性，必须用于解决特定问题，以便全面研究病毒。有些方法只允许检测病毒核酸或蛋白质，而其他方法允许检测活病毒颗粒，并且可以用来确定感染的剂量和时间以及生命周期的机制。最广泛使用的病毒检测方法是基于病毒基因组材料的扩增。除了基于PCR的检测外，还有基于扩增的其他方法（例如，SDA—链置换扩增，NASBA—基于核酸序列的扩增，3SR—自我维持序列复制，以及LAMP—环介导的等温扩增）。这些方法不仅可以在研究中应用，也可以在临床检测中应用。这些方法允许直接检测病毒DNA，但在病毒RNA的情况下，PCR之前必须进行反转录。基于PCR的方法由于扩增而足够敏感，允许检测样本中的少量分子。然而，一些作者指出，基于PCR的方法在检测某些病毒（如人类肠道病毒）方面的灵敏度低于基于细胞的方法。此外，使用基于PCR的方法可能与假阳性结果有关。此外，基于PCR的方法只允许检测病毒基因组而不是活病毒。然而，目前正在开发与下一代测序相关的改进病毒检测方法。这些方法主要被用来检测纯化和浓缩的病毒（即来自细胞培养），使用这种方法在临床样本中检测病毒的问题是病毒与宿主基因组的比例不足。为了解决这个问题，通过详细比较现代方法来纯化和富集临床材料中的病毒颗粒，设计了一种可以有效增加病毒基因组相对于宿主基因组数量的方法。这导致测序样品准备成本的降低以及随后生物信息学分析的改进。CRISPR-Dx病毒检测方法基于导向性内切酶：CRISPR相关蛋白（Cas）。这种方法使用Cas13家族的蛋白质，它们对RNA表现出“附带的”，非特异性的切割活性。考虑到这种效果，建立了一种名为SHERLOCK（特异性高灵敏度酶报告解锁）的方法。这种具有高灵敏度的核酸检测工具涉及病毒基因组材料的扩增和Cas13蛋白间接切割荧光标记的RNA探针，允许样本中病毒材料的定量。这种方法的灵敏度来自于即使是生物材料中微量的病毒核酸也经过重组酶聚合酶扩增（RPA），对于RNA病毒检测，还有一个额外的反转录步骤。然后使用DNA依赖性RNA聚合酶T7将放大的病毒DNA副本转换回RNA。此后，使用gRNA，Cas13蛋白识别病毒核苷酸序列，导致标记的核苷酸的附带切割，从而允许定量确定样本中的病毒含量。这个方向系统正在不断发展，以提高其灵敏度并改善登革热病毒或寨卡病毒（ZIKV）的检测。另一种流行的病毒检测方法是使用基于抗原的检测。这种方法既可以在研究中使用，也可以在临床诊断中使用。使用针对病毒的抗体的标准方法包括病毒中和试验、血凝抑制、补体固定和间接免疫荧光。这些方法仅用于诊断已知病毒，其衣壳结构已被研究。使用终点稀释分析评估病毒滴度是基于细胞培养上清的血凝试验。然而，正如观察到的流感病毒由于病毒基因组编码血凝素的序列中突变的快速积累导致氨基酸替代，使用这种方法研究病毒的抗原特性是复杂的。这种方法应用的一个问题是病毒在标准细胞系中的复制能力较差，例如MDCK细胞。也许这种检测将随着新敏感系的使用而得到改进。在这方面，使用基于检测病毒核蛋白的基于抗原的检测来改进病毒循环的监测将有助于测量临床样本中的病毒滴度。已经为IgG（免疫球蛋白G）和IgM（免疫球蛋白M）蛋白开发了这种技术，允许监测人群中的疾病。在与黄病毒相关的疾病的情况下，IgM通常在疾病表现后的几天内产生，并且通常可以在几个月内检测到。然而，在黄病毒感染的情况下，抗体的交叉反应是可能的。此外，IgG在IgM抗体发展后的几天内被检测到，并且可以检测到几个月。使用这种方法，已经提供了许多病毒的检测方法，例如ZIKV和戊型肝炎病毒。有一组使用细胞培养检测活病毒的方法。这些方法的斑点检测始于1950年。与细胞培养相关的病毒检测方法已经开发出来，并显示出巨大的潜力，因为它们提供了许多优点。使用这些方法，不仅可以确定病毒颗粒的存在，还可以表征病毒属性，这在开发新病毒引起的疾病的治疗方法时极为重要。此外，从细胞培养中获得的病毒颗粒可以通过电子显微镜进行研究，以检查病毒形态。所有使用细胞培养识别和研究病毒的方法可以分为两类。第一种方法利用病毒感染的细胞病变效应（CPE），这意味着细胞在病毒释放后死亡，可以在显微镜下检测和定量。然而，基于CPE的方法繁琐且灵敏度低，无法检测非细胞病变性病毒。可以使用不同的细胞系进行病毒检测，例如NSK、MDCK、UMNSAH/DF1、BS-C-1、Vero、A549、HEK293或HeLa细胞，它们可以作为培养和检测具有不同效率和特异性的病毒的基质。第二种方法与产生报告细胞系有关，其中特定细胞被修改以在病毒感染时产生报告蛋白。这种报告器的特性应该非常特定于病毒，以允许研究人员特别检测感兴趣的病毒。在病毒感染的情况下，病毒蛋白识别报告结构作为病毒基因组或具有特定切割位点的嵌合蛋白，从而产生可量化的信号，研究人员可以检测到。根据它们的基因组结构和生命周期，不同病毒的检测有不同的原理。一些RNA病毒的载体中的病毒结构的转激活可以通过病毒感染、蛋白质的切割和病毒蛋白酶释放报告器来发生，具有核复制周期的负链RNA病毒可以被minigenome模拟病毒检测。 总之，基于细胞的方法是当前可用的病毒检测和表征方法的重要类别之一。这些策略都有优缺点，这些在本节中进行了描述，但主要的区别特征是，基于细胞的方法可以用来分离和研究活的病毒颗粒；然而，在应用这些方法时存在一个问题，与细胞培养中的低敏感性（病毒进入细胞的能力）和许可性（病毒在细胞中复制的能力）有关。由于细胞系的这两个属性共同促进了细胞方法的发展，除非报告中提到了具体差异，否则它们通常可以统称为“灵敏度”。为了解决这个问题，正在开发新的方法。细胞系对特定病毒的敏感性取决于病毒附着在细胞膜受体上以及与细胞抗病毒反应相关的宿主基因。现代分子生物学方法已经允许开发遗传修饰的细胞，这些细胞增加了病毒的产生。本综述旨在描述一般的病毒学方法和今天使用的基于细胞的方法的具体发展示例。 2.CPE检测和敏感细胞系 为了提高活病毒颗粒研究方法的灵敏度，正在开发提高细胞培养灵敏度的技术。为了研究病毒的生物学特性，例如决定它们宿主物种特异性和增殖率的因素，以及产生活病毒颗粒，需要允许病毒传播的细胞系。病毒的一个基本特性是其进入细胞并产生病毒后代的能力。病毒复制后是宿主细胞的形态和生化变化，最终导致细胞破坏。根据病毒种类，这些变化有几种形式，例如合胞体形成、细胞变圆或细胞溶解。这种可见的细胞变化通常称为细胞病变效应。基于这一特性，开发了许多病毒感染性测定方法（例如，组织培养感染剂量（TCID50）、半数致死剂量（LD50）、痘和斑点测定），以及其他生物/化学测定方法（例如，检测血吸附、血凝和总蛋白）和通过电子显微镜直接计数病毒颗粒。在病毒研究技术的发展中，胚鸡卵（ECE）方法是细胞基础病毒研究技术的替代品。对于一些病毒，ECE仍然经常用于病毒分离。尽管ECE可以支持各种流感病毒分离株的生长，但它们有几个限制，这些限制与胚胎中连续繁殖可能导致血凝素糖蛋白的改变有关，这导致产生与原始分离株不同的卵适应病毒。研究通过血凝试验比较这两种方法，比较不同的细胞系，并使用关于CPE和TCID50/mL的信息。注意到低致病性禽流感病毒在所有细胞系中的复制效率都低于胚胎。然而，作者强调，使用MDCK、CEK和CEF等细胞系可以节省时间和资源，因为它允许处理更多的样本量，尽管病毒复制效率较低，但可能仍然有益。现在，使用CPE作为主要工具之一的细胞方法也已经应用于其他类型的病毒。例如，这种方法被用来研究与天花病毒在系统发育上密切相关的马铃薯痘病毒。使用这种方法可以区分马铃薯痘病毒和密切相关的鼠疫和牛痘病毒，因为它们在细胞病变效应上的差异。此外，基于细胞的方法也被用来研究几种ZIKV分离株之间的差异。在这些研究中，Vero细胞系上的细胞病变效应被用来估计感染滴度，作为研究病毒株的一种方法。发现两种寨卡病毒分离株，NR-50244和NR-50241，可以有效感染HEK293细胞，这很快导致明显的CPE和细胞普遍溶解。现代方法不仅可以寻找特定的细胞系，还可以确定观察到的效应背后的机制，这与不同的细胞受体有关。因此，进行了系统研究ZIKV对各种细胞系的趋向性等研究。ZIKV已被证明对来自不同组织（如肌肉、胎盘和肝脏）的七种以上细胞系具有趋向性。广泛的趋向性可以通过潜在的ZIKV受体在各种器官中的广泛分布来解释。以前曾显示，在人类上皮细胞系中，这种病毒积极复制，导致IFN-β（干扰素β）的抗病毒效应。这些研究报告了一系列有用的细胞系，用于在病毒学实验室中培养ZIKV。从所有上述方法中，我们可以得出结论，基于CPE的策略在不同病毒的研究中广泛使用。然而，这些方法通常耗时，选择一种对特定类型的病毒敏感且理想选择性的细胞系并不总是容易的。此外，提高细胞培养的灵敏度对于开发使用报告器结构检测病毒颗粒的方法很重要，这将有助于改进基于细胞的技术。这个问题可以通过两种方式解决。可以增加细胞培养对特定感兴趣病毒的灵敏度，或者创建一种对所有病毒高度敏感的细胞系，以解决与检测来自患者样本的未知病毒代理有关的问题。这个话题仍然相关，因为有时需要使用几种标准细胞系来检测病毒。如果不使用病毒特异性细胞系，则应使用多个细胞系进行病毒检测。例如，在涉及从16个样本中分离呼吸道病毒的实验中，包括流感样本，3个样本仅在Mv1 Lu细胞中显示CPE；3个仅在MDCK细胞中显示CPE；其余样本在两个细胞系中都显示CPE。已经有许多增加细胞培养对某些病毒的敏感性和许可性的示例。获得的细胞系MDCK-SIAT1对人类流感病毒的敏感性高于对禽流感病毒的敏感性。增加参与细胞表面受体合成的酶表达的方法是有希望的，以创建对不同病毒敏感的细胞系。例如，目前还没有适当的系统来传播诺如病毒（HuNoV）。尽管如此，已知HuNoV与位于细胞膜中的组织血型抗原受体相互作用。这些受体的成熟是一个多阶段过程。然而，有证据表明特定的糖基转移酶等酶参与了这些途径。因此，这些酶的过度表达可能会增加细胞培养对诺如病毒的灵敏度。 在另一项与流感病毒有关的研究中，通过对人呼吸道跨膜蛋白酶（TMPRSS2或MSPL）的过度表达来修改MDCK细胞系。在没有胰蛋白酶的情况下，这些细胞支持了基于致病性禽流感病毒的三种重组疫苗的生长。以下作为示例的研究与细胞系对广泛dsDNA基因组病毒—单纯疱疹病毒（HSV）的增加许可性有关。最早生产的敏感细胞系之一用于HSV检测。为了细胞转染，产生了包含病毒反激活蛋白VP16（称为α-TIF或Vmw65）与Moloney白血病病毒的长末端重复（LTR）序列的构建物。VP16的产生使细胞对HSV更敏感，并增加了病毒产量200倍，这适用于CPE测定。为了创建用于病毒学研究的报告器细胞系，需要增加细胞对病毒的敏感性和病毒基因组在细胞中的复制率。解决了这个问题，就可以生成高分辨率的报告器细胞系，并增加疫苗株的生产。已经证明，使用RNA干扰，减少与免疫反应相关的哺乳动物细胞中某些基因的活性，可以增加EV71（脊髓灰质炎病毒和肠病毒71）的增长高达80倍。发现通过使用CRISPR基因编辑技术敲除EP300（组蛋白乙酰转移酶p300）和ZNF205（锌指蛋白205）等基因，可以增加病毒颗粒的产量。类似的研究描述了通过敲除单个Vero细胞宿主基因实现轮状病毒增长18倍的增加。通过敲除BST-2（骨髓基质抗原2）基因，阻断病毒从细胞中的释放，获得了有希望的结果。一些具有脂质包膜的病毒，如MHV68（小鼠γ疱疹病毒68）、猪流行性腹泻病毒、流感病毒和牛痘病毒的释放，在BST-2基因敲除的动物细胞系中显著增加。这项研究的结果显示，这种方法可以增加许多病毒的生产。许多病毒的复制与细胞破坏有关。例如，腺病毒科的成员通过p53非依赖机制启动细胞死亡。在这方面，增加细胞培养的灵敏度的一个有趣的方法是生成抗凋亡的细胞培养。凋亡是一个多组分机制，涉及半胱氨酸蛋白酶或AIF1（同种异体炎症因子1）在半胱氨酸蛋白酶非依赖途径中。敲除所有这些基因是必要的，以抑制这种机制。这个问题通过CRISPR/Cas9技术解决了，其中使用了几个sgRNA，导致这些基因从HEK293T细胞系中移除。进一步的分析表明，携带促凋亡蛋白的病毒颗粒比在标准细胞系中更有效地产生。可以得出结论，细胞培养后的病毒分离和CPE测定是生物样本中病毒鉴定最常用的方法，提高细胞培养灵敏度的现代方法非常有希望。然而，值得讨论的是这种方法目前存在的不足。基于CPE的斑点形成单位（PFUs）的定量是量化不同病毒水平的广泛方法，但这种方法是费力的；例如，大多数病毒家族需要长时间的复制（长达一周），细胞培养在特定条件下进行（湿度、介质的pH值）。此外，病毒的培养需要在处理病原体时采取某些安全预防措施。此外，大多数标准病毒检测协议包括在感染后几天的细胞固定免疫染色。此外，这种方法基于使用合适的细胞系和应用其他病毒检测方法，例如使用抗体检测病毒。由于样本中病毒颗粒计数通常很低，抗原检测抗体并不总是可用的，隔离和生产病毒颗粒需要多次尝试，并且需要开发对病毒感染具有增加灵敏度的细胞系。因此，这种方法不提供快速结果。此外，一些病毒（即拉沙病毒）显示出非常低的PFU值，因此CPE方法的应用无用。即使在广泛的细胞系中相对容易生长的病毒也可能耗时且昂贵。 3.报告器细胞系 为了使基于细胞培养的方法更简单、更具信息性和更方便，已经开发了报告器细胞系。报告器细胞系包括在病毒感染后产生报告蛋白的特定细胞。报告器应对感兴趣的病毒非常特定，以允许研究人员检测特定病毒。病毒感染后，病毒蛋白识别报告构建物作为病毒基因组或嵌合蛋白，并产生可检测的信号。报告器细胞系对病毒学研究和疫苗制造非常有用。尽管基于报告器的方法可能需要生长活病原体病毒，因此限于具有特定生物安全级别的实验室，但它们易于扩大规模，比标准病毒学方法劳动强度小，从而大大增加了传染性病毒的检测。这种方法导致了快速、客观的病毒定量研究，包括评估病毒滴度、抗病毒敏感性和中和滴度。使用报告器细胞系与传统基于活病毒的方法相比具有几个相当大的优势。首先，该方法比其他基于活病毒的方法更快。在这种方法中，不需要耗时的培养和免疫染色技术，结果可以在12-48小时内获得。另一个优势是报告器细胞系可以检测少量感染的细胞。例如，显示水痘-带状疱疹病毒荧光素酶活性的报告器细胞系可用于检测每个样本少于10个感染的细胞。报告构建物的关键特征是报告基因。荧光蛋白和酶如β-半乳糖苷酶或荧光素酶可以作为报告基因。值得注意的是，根据它们的基因组结构和生命周期，用于检测不同病毒家族的报告活性的研究中使用了各种元素。在宿主核中复制的负链RNA病毒（正黏病毒，丝状病毒）已使用称为minigenome的构建物进行检测。具有（+）RNA基因组的病毒（阿尔法病毒或丙型肝炎病毒）的报告系统也涉及可以被病毒蛋白识别的minigenome构建物。然而，这组病毒使用了不同的方法。一些具有RNA（+）基因组的病毒（黄病毒和小肠病毒）编码一个包含结构和非结构蛋白的大多肽。这个多肽通过宿主和病毒蛋白酶进一步加工成单个蛋白。当报告器在病毒蛋白酶切割肽的特定位点时被激活，可以检测到病毒感染。逆转录病毒和具有DNA基因组的病毒（疱疹病毒）可以通过带有病毒启动子调节的报告构建物的质粒稳定细胞转染来检测。报告盒的转录是由病毒进入启动的。下面，我们将考虑一些目前在病毒学中用于检测不同病毒家族的报告器细胞系的发展。这些研究可以为基于先前表征的属于同一类别的病毒的报告构建物组装方法的相似性，为新型病毒的检测系统的发展提供基础。 3.1.用于ssRNA(-)基因组病毒检测的报告器细胞系 3.1.1.正黏病毒科，流感病毒 流感A和B是广泛传播的病毒，负责人类年度流行病，并与巨大的经济损失有关。流感根据其神经氨酸酶和血凝素类型分为不同的亚型和株。在生物样本中准确和快速地检测这些病毒对于病毒感染诊断和疫苗制造至关重要。报告器细胞系概念首次应用于流感病毒。几年后，李等人为流感A和B病毒开发了报告盒。流感病毒激活的报告器细胞系技术用于研究包括生成一个可以在病毒复制响应中产生任何信号的报告系统。流感A和B病毒的基因组分为八个片段。在感染期间，病毒聚合酶复合体的蛋白和NP核蛋白参与产生RNA(+)链和病毒基因组复制。为了激活这些过程，需要顺式作用元素，这些元素是非翻译的保守区域，在基因组流感病毒RNA序列的末端（50 -和30 -UTR）。用于细胞中的流感病毒A的报告构建物包含位于NP基因组片段的50 -和30 -UTR之间的荧光素酶或GFP（绿色荧光蛋白）编码区域。该构建物克隆到质粒DNA（pDNA）中，并由聚合酶I启动子和终止子元件驱动，生成RNA在50 -或30 -末端没有额外的核苷酸。线性化的pDNA整合到宿主细胞基因组中（图1）。这个构建物在感染期间模仿病毒基因组片段，报告基因表达是使用病毒聚合酶复合体实现的。通过类似方法生成了流感B病毒的报告系统。从HEK293T、BHK-21和MDCK细胞中获得了报告器细胞系。使用一组呼吸道病毒，评估了报告蛋白的激活特异性。特异性诱导很高，流感A和B病毒之间有轻微的交叉激活。尽管在报告器细胞系和MDCK细胞中确定的TCID50相似，但报告器细胞系在获得结果的时间减少（从六天到两天）、增强的客观性和减少繁琐的实验程序方面有明显的优势。这些报告器细胞系已成功用于抗体中和和抗病毒敏感性实验。 图1. 用于ssRNA（-）基因组病毒检测的分子报告器系统。报告器系统的原理基于不带有帽子和polyA尾的mRNA的产生。这样的RNA模仿病毒基因组。核糖酶水解RNA或RNA聚合酶I启动子。这个转录物模仿（-）病毒RNA，允许它使用病毒蛋白进行复制。报告蛋白的转录发生在以这种方式获得的（+）RNA上。3.1.2.丝状病毒科，埃博拉病毒 埃博拉病毒是一种丝状病毒，它在中非广泛传播，并在西非和欧洲出现。埃博拉病毒感染以急性发热为特征，死亡率约为50%。如前所述，分子方法非常有用，但结果不允许检测感染性病毒。这使得评估特定病毒分离株的致病性并预测对埃博拉病毒研究非常重要的爆发变得困难。标准基于细胞的方法在埃博拉病毒研究中也存在限制，包括在获得结果之前的14天期限。所有这些特征是开发报告器细胞系的关键先决条件。基于负义minigenome的埃博拉病毒检测的报告器细胞系得到了发展，该minigenome由细胞RNA聚合酶II转录的组成型巨细胞病毒（CMV）启动子调控（图1）。添加锤头核糖酶（对应于核糖酶A的一些修改）使mRNA模仿埃博拉病毒基因组。因此，目标转录物没有帽子或聚腺苷酸化。因此，组装了一个由以下顺序排列的功能组件组成的嵌合minigenome：最小病毒启动子、埃博拉病毒RNA的50-UTR、绿色荧光蛋白序列和病毒RNA的30-UTR。该构建物两侧是两个核糖酶。构建的盒式结构通过PiggiBac转座子整合到VERO-E6细胞系基因组中。minigenome的转录由病毒复制复合体介导，产生报告蛋白。该系统对不同种类的埃博拉病毒有效，不与密切相关的马尔堡病毒发生交叉反应。将这种基于细胞的方法与用于病毒定量的免疫荧光测定法进行比较，表明它们具有相同的效率。此外，测试了临床样本，该测定法在报告细胞中产生了阳性结果。 3.2.用于ssRNA(+)基因组病毒检测的报告器细胞系 3.2.1.甲病毒科，阿尔法病毒 阿尔法病毒亚科包括辛德比斯病毒，它会导致人类严重发热。病毒的非分段基因组由两个功能区域组成。多聚蛋白的直接翻译，随后被病毒蛋白酶进一步加工，从ssRNA(+)的第一部分开始。这些蛋白对晚期蛋白的转录和病毒基因组的复制是必需的。晚期或结构蛋白由ssRNA(-)转录的亚基因组RNA编码。辛德比斯病毒基因组的cDNA克隆是报告器细胞系发展的第一步。报告构建物基于辛德比斯病毒亚基因组RNA的cDNA。报告盒在Rous肉瘤病毒长末端重复（LTR）启动子的控制下，克隆到质粒中，可以在细胞中恒定表达。这个转录物模仿ssRNA(+)，由晚期启动子和萤火虫荧光素酶ORF组成，两侧是病毒顺式作用元素（图2）。当细胞被病毒感染时，产生识别顺式元素的非结构病毒蛋白，合成ssRNA(-)。这个RNA是合成亚基因组RNA的模板。这些过程模仿病毒生命周期阶段。荧光素酶的翻译从人工亚基因组RNA的晚期启动子开始。表达这个报告盒的质粒转移到BHK细胞中，并获得了对G418有抵抗力的稳定转化体。在辛德比斯病毒复制水平高的情况下，报告蛋白活性在长达4小时的时间内被检测到。此外，应注意，荧光素酶测定与CPE测定等效且同样敏感。然而，在感染后26小时检测到荧光素酶活性时，没有观察到CPE。尽管辛德比斯病毒不被认为是严重的人类病原体，其他与阿尔法病毒更密切相关的病毒（东部/西部马脑炎病毒）和更远亲的病毒（风疹病毒）是重要的病原体，并且对于检测这些病原体，开发特定和准确的技术非常感兴趣。报告系统方案基于这些病毒从亚基因组(+)RNA合成结构蛋白作为病毒复制产物的能力。在第一阶段，细胞中会产生模仿病毒(+)RNA的mRNA。在感染期间，(+)RNA被病毒蛋白识别并复制形成(-)RNA副本。在下一步中，这个(-)RNA作为亚基因组(+)RNA转录的模板链；晚期启动子被病毒蛋白激活，可以合成报告蛋白。 图 2. 针对具有亚基因组RNA检测的正义单链RNA病毒的分子报告系统。 3.2.2.甲病毒科，风疹病毒 风疹是一种严重的传染性病毒感染。尽管这种病毒引起的疾病在儿童和成人中大多是轻微的，但在怀孕期间，它可能导致死产或胎儿畸形。因此，当怀疑感染风疹时，需要准确诊断。目前，风疹病原体的诊断基于血清学方法和逆转录PCR（RT-PCR）和基于PCR的方法。然而，由于风疹病毒在细胞培养中没有明显的细胞病变效应，因此在细胞培养中分离活病毒进行进一步研究是一种非常费力的方法。因此，这种病毒的检测方法基于风疹病毒和肠道病毒（例如，柯萨奇病毒，回声病毒的成员）的共感染10天，有明显的CPE。当这些病毒共同培养时，由于风疹病毒诱导的干扰素的产生，细胞病变效应和肠道病毒的复制会减少，这表明宿主细胞中存在这种病原体。已经开发了一种具有特定报告器的风疹病毒细胞系，以便于使用基于细胞的方法进行研究，而无需添加辅助病毒。与其他甲病毒一样，风疹病毒基因组由ssRNA(+)组成，分为两部分。第一部分编码病毒RNA复制所需的早期蛋白，第二部分编码病毒粒子的结构蛋白。报告构建物基于基因工程亚基因组RNA（图2）。这个RNA在非结构蛋白领域有一个600 bp的缺失，以防止在没有野生型病毒的情况下合成报告器。结构蛋白区域被完全替换为报告蛋白（氯霉素乙酰转移酶（CAT）或绿色荧光蛋白（GFP））。ssRNA(-)转录成亚基因组RNA已经在体外合成，并通过转染到VERO细胞系。报告蛋白表达仅在对特定病毒感染有反应时发生。这种方法已经证明对实验室株和临床样本中的病毒都敏感。 3.2.3.黄病毒科，丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒（HCV）引起严重的急性或慢性肝损伤。HCV感染发展为慢性肝炎，与肝细胞癌高度相关。估计有7100万人患有慢性丙型肝炎病毒感染。丙型肝炎在临床样本中使用基于PCR和免疫学方法进行检测，提供足够的诊断精度。然而，为了研究活病毒的性质，需要基于持续细胞系的方法。由于丙型肝炎病毒在标准细胞培养中难以复制，因此开发了基于基因工程构建物和细胞系的各种方法，模拟不同的病毒生命周期阶段。其中一种方法是通过细胞系中的报告盒来响应病毒进入和感染。此外，有必要为HCV研究和抗病毒药物开发研究开发一种新的基于细胞的方法。许多基于HCV的报告系统基于特定的病毒蛋白酶活性。病毒基因组是一个翻译成多聚蛋白的序列。为了处理成熟的病毒蛋白，多聚蛋白被病毒和细胞蛋白酶切割。下面提供了为丙型肝炎病毒开发的双报告系统的描述。由人巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的报告构建物由绿色荧光蛋白（GFP）组成，与分泌型碱性磷酸酶（SEAP）通过HCV NS3/4A蛋白酶的NS4A/B连接位点相连。将开发的报告系统传递到肝癌Huh-7细胞和来自Huh-7细胞的Ava5细胞中，使用慢病毒转导。几周后，选择稳定转化体。在病毒感染期间，病毒表达HCV NS3/4A蛋白酶，并将报告蛋白分开，这些蛋白被检测到（图3）。通过荧光检测、磷酸酶活性分析和西方印迹分析确认了这两种蛋白的存在。在其他研究中，SEAP基因被荧光素酶基因替换。 图3. 用于带有基因组多聚蛋白检测的ssRNA(+)基因组病毒的分子报告器系统。报告器系统基于特定病毒蛋白酶在处理原始病毒多聚蛋白以产生最终蛋白中的蛋白酶切割。报告蛋白在病毒蛋白酶的切割位点与病毒蛋白结合，并在感染后释放。 另一种基于细胞的报告器方法涉及构建一个模仿病毒基因组的minigenome，该基因组被NS5B RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)识别，这是抗病毒治疗的共同靶标。报告构建物受CMV启动子控制。报告系统模仿病毒ssRNA(-)，由带有IRES序列的50病毒UTR、30病毒UTR和由核糖酶用于从宿主细胞合成的mRNA切割的反义方向的荧光素酶组成（图4）。在HCV感染期间，NS5B RNA聚合酶识别minigenome构建物中的未加工区域并合成ssRNA(+)，以IRES依赖的方式翻译成荧光素酶蛋白。该系统已转移到BHK-21和Ava5细胞中，并用于评估RdRp活性和研究RdRp抑制剂的有效性。因此，HCV报告细胞系可以成为研究HCV性质和寻找HCV治疗新化合物的有用工具。 图4. 模仿用于丙型肝炎病毒(HCV)检测的基因组的分子报告器系统。携带报告构建物所有元素的mRNA转录后，末端片段被核糖酶自我掐断。这样的mRNA模仿(-)RNA病毒基因组。病毒蛋白在感染期间识别此RNA并复制它。在(+)RNA链上，有一个用于报告蛋白合成的内部核糖体进入位点。 3.2.4.黄病毒科，黄病毒 登革病毒(DENV)和寨卡病毒ZIKV是人类病原体，能够引起大规模爆发。登革病毒感染的机制尚未完全了解。研究ZIKV和DENV感染对细胞过程的影响是必要的，以预测疾病的严重程度并开发针对性和有效的治疗方法。对这些感染的实验室研究存在与其他病毒家族相似的限制。通常使用免疫分析或基于扩增的方法检测DENV感染的细胞反应。例如，已经开发了一种用于感染细胞培养中DENV的免疫染色程序。然而，由于DENV蛋白不在细胞表面暴露，因此需要前固定和渗透细胞以准确检测病毒感染；因此，这种方法不允许观察活细胞中的感染。同样，识别细胞中ZIKV感染的基本方法依赖于带有固定和渗透的免疫染色程序。使用基于扩增的方法和测序的限制与其他病毒相同，不允许我们使用活病毒进行研究。为了实时观察DENV感染，开发了一种基于病毒蛋白酶活性的报告构建物的Vero细胞系。报告系统与丙型肝炎病毒的蛋白酶诱导报告盒高度相似（图3）；然而，报告蛋白通过NS3病毒丝氨酸蛋白酶识别位点与病毒蛋白NS4B的部分连接。所得到的细胞系被四种DENV血清型感染。检测到GFP表达，从而相应地检测到病毒感染的开始。因此，可以使用此报告器在不破坏细胞的情况下检测DENV感染。然而，这种方法存在一个问题：报告细胞系中编码的NS4B片段据报道会影响细胞功能（例如，抑制I型IFN信号）。已经使用了类似的方法来研究ZIKV感染。病毒NS4B蛋白编码序列和病毒蛋白酶切割位点与绿色荧光蛋白在组成型启动子的控制下克隆在同一开放阅读框中。肝细胞癌（Huh7细胞系）和腺癌细胞（A549细胞系）通过表达报告器的慢病毒颗粒进行转导。在生产寨卡病毒的感染细胞中，病毒蛋白酶NS2B和NS3与其切割位点相互作用，可以使用荧光显微镜检测GFP的表达。所描述的报告系统可以检测ZIKV的非洲和亚洲株，但相同的构建物不会被DENV激活。这个系统对ZIKV感染的研究非常重要。 3.2.5.小核糖核酸病毒科，肠病毒 肠病毒是包括许多种类病毒的属，如柯萨奇A和B病毒、回声病毒（肠病毒A和B）、脊髓灰质炎病毒（肠病毒C）和肠病毒68或72。这些病毒是人类病毒病原体中最普遍的。肠病毒是许多严重人类疾病的原因，如无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、心包炎和手足口病(HFMD)。水环境被肠病毒污染是肠病毒传播的主要原因，因为这种病毒在水中非常稳定，并且感染剂量低。肠病毒感染的大规模爆发使得有必要开发一个快速可靠的病毒监测系统。 传统的肠病毒检测和定量方法基于细胞培养中CPE的观察。然而，这种类型的测定非常费力，不能产生快速结果；因此，它不适用于常规应用。依赖逆转录PCR的分子方法对于检测病毒基因组等价物来说更加快速和准确。这种方法的限制在于它被认为是对病毒传染性能力的间接评估。 基于细胞的报告系统的发展代表了快速实验程序和揭示病毒性质及病毒感染细节的研究之间的折衷。肠病毒以及其他带有ssRNA(+)基因组的病毒产生特定蛋白酶，这些蛋白酶对成熟病毒蛋白的处理是必需的。其中之一是高度选择性和高效性的蛋白酶2A(2Apro)。因此，肠病毒的报告构建物基于使用这种蛋白酶特异性切割融合蛋白（图3）。该系统通过荧光共振能量转移(FRET)使用受体荧光蛋白EYFP(增强型黄色荧光蛋白)和供体ECFP(增强型青色荧光蛋白)之间的相互作用，它们由包含2Apro切割位点的短肽序列连接。编码供体和受体蛋白的盒式结构由组成型真核启动子驱动，克隆到表达质粒中。BGMK细胞转染了构建的表达报告系统的质粒，并获得了对G418有抵抗力的稳定转化体。在肠病毒感染期间，2Apro被表达并切割了其自身的特定位点。此后，两种荧光蛋白之间的相互作用被破坏，导致ECFP荧光强度增加。因此，可以在感染后大约7.5小时内检测到少量的病毒病原体。 所得到的报告细胞系对三种肠病毒感染显示ECFP荧光，并且不被不产生2Apro的甲型肝炎病毒(HAV)激活。据推测，这样的报告系统可以用于研究基于抗蛋白酶活性的抗病毒药物的开发。 3.3.用于逆转录病毒检测的报告细胞系 Retroviridae，慢病毒 慢病毒属的主要传染性病原体是牛免疫缺陷病毒（BIV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）。HIV会导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS）。AIDS会导致免疫系统逐渐功能障碍，并引发严重的感染和多器官功能障碍。BIV是一种与HIV在关键遗传和结构特征上相似的慢病毒。此外，BIV还是感染牛免疫系统功能障碍相关病理过程的原因。 确定病毒库中感染性颗粒的数量对于研究病毒生命周期阶段、开发病毒药物疗法以及在病毒基因组中寻找突变至关重要。可以从病毒的终点稀释中确定HIV库的定量滴度，但这些检测对于大量样本来说非常费力。因此，进行了专注于报告细胞系开发的研究。 在HIV研究中，细胞对HIV的敏感性是由细胞表面存在CD4（分化群4）受体所赋予的。第一条HIV报告细胞系是在20世纪80年代末开发的，基于转染的淋巴细胞系中的转录激活。CAT报告基因在HIV-1的LTR启动子的控制下克隆，并且可以被HIV Tat转录激活因子诱导（图5）。这些报告细胞被HIV激活，并且在较小程度上被人类T细胞白血病病毒4型和猴免疫缺陷病毒（SIV）激活。报告细胞系没有被马传染性贫血病毒、人类T细胞白血病病毒1型和2型，或单纯疱疹病毒1（HSV1）激活。另一种携带β-半乳糖苷酶基因的细胞系，作为HIV检测的报告基因，依赖于HeLa细胞。同样的方法被用来从人胶质母细胞瘤和猕猴乳腺肿瘤中产生HIV报告细胞系。此后，由HIV LTR驱动的GFP被用来生成改良的HeLa CD4细胞，用于检测HIV-1感染。 图5. 用于逆转录病毒和双链DNA基因组病毒检测的分子报告器系统。在未感染的细胞中，病毒启动子没有mRNA合成。当细胞感染发生后，病毒蛋白存在下开始转录和翻译报告蛋白。 然而，基于HIV LTR的报告系统有一些缺点。首先，这种系统在没有Tat的情况下表现出一定的基础表达水平。第二，它可能被细胞转录因子、细胞因子、增殖素甚至病毒包膜蛋白非特异性激活。有人提出，通过使用另一种调控蛋白Rev作为转录激活因子，可以解决这些问题。产生了一个新的含有GFP的构建物。使用荧光蛋白报告系统的优点在于其简单性，以及使用广泛可用的仪器检测和感染活细胞的能力。虽然GFP荧光信号在甲醛固定下是稳定的，但它也可以在未固定的活细胞中轻易检测到。GFP检测可以使用常规荧光显微镜和荧光素滤光片组合进行。此外，表达GFP报告蛋白的活细胞可以通过常规流式细胞术进行计数和排序。 基于RT-PCR的BIV检测方法已经推出。虽然这种病毒检测方法敏感且快速，但不能用于评估感染性病毒滴度，这是该方法的一个相当大的局限性。因此，采用了与HIV相同的方法来生产BIV的报告细胞系。报告细胞系基于可以被BIV感染的牛、犬和兔组织培养。CAT基因被用作报告基因，由BIV的LTR启动子驱动。在可检测到CAT基因基础表达的牛和犬细胞系中，细胞因子在LTR表达中起作用。然而，感染导致表达增加（50至80倍）。牛白血病病毒或牛合胞体病毒仅导致表达增加2至3倍。在BIV报告细胞系的进一步开发中，研究人员转而使用GFP作为报告基因，仍然由BIV LTR驱动。所得到的细胞系作为与BIV非常密切相关的病毒Jembrana病病毒的报告线发挥作用，但不是牛泡沫病毒的报告器。 目前正在使用基于细胞系的方法研究的另一种逆转录病毒是猿泡沫病毒（SFV）。基于BHK-21细胞构建了SFV的报告细胞系。获得了由SFV LTR驱动的β-半乳糖苷酶基因的报告细胞系。在这项研究中，使用了几种SFV菌株作为实验室适应菌株，并且还使用了来自两只黑猩猩、两只大猩猩和一只猕猴的血液中的天然菌株。在感染自体菌株后72小时内启动报告基因表达。另一种SFV菌株获得了相同的结果。细胞被证明是量化不同菌株的有效工具。作者表明，不同SFV菌株的复制速率在不同细胞中是不同的。 3.4.双链DNA基因组病毒 3.4.1.疱疹病毒科，单纯疱疹病毒 HSV-1型和2型感染在全球普遍存在。由疱疹病毒感染引起的发病率是一个重要问题。HSV感染可以引起一系列疾病，并改变感染者的免疫状态。此外，免疫功能低下的患者（AIDS患者、器官移植受者、白血病患者）的HSV感染会导致严重疾病。尽管HSV在哺乳动物细胞培养中繁殖良好，但由于必须对感染细胞进行免疫染色以识别抗原，因此病毒感染的检测是一个繁琐的过程，以便进行准确诊断。使用这种方法，在大多数情况下，可以在24至48小时内获得结果。在1990年代初开发了一种报告细胞系，允许更快地检测这种病毒。双链DNA病毒的报告系统与逆转录病毒的报告构建物类似（图5）。在这个盒式结构中，大肠杆菌LacZ基因被用作报告基因，克隆在HSV ICP6（HSV核糖核苷酸还原酶大亚基）启动子的控制下，进入一个表达真核载体。然后，使用设计好的报告构建物和携带新霉素抗性基因的质粒转化BHK细胞。为了获得稳定的报告细胞系，BHK细胞在含有选择性抗生素的培养基中培养。这种涉及病毒启动子的报告系统的便利性在于，HSV ICP6启动子在未感染的细胞中没有被激活，HSV的激活非常具体；因此，在同一培养物中容易区分感染和未感染的细胞。使用所描述的报告系统，通过β-半乳糖苷酶活性在接种后几小时内（最多6小时）发生感染检测。使用这种报告细胞系进行病毒检测的有效性与在病毒学研究中使用的标凈基于细胞的方法相当，例如斑点分析。两种类型的HSV都激活了所开发的报告盒，而其他Herpesviridae成员（人巨细胞病毒（HCMV）、带状疱疹病毒（VZV））的非特异性激活则没有发生。因此，指示细胞系可以为在细胞培养中快速观察HSV感染提供有用的方法。 3.4.2.疱疹病毒科，γ-疱疹病毒 最重要的γ-疱疹病毒种类之一是与卡波西肉瘤相关的疱疹病毒（KSHV或人疱疹病毒8（HHV8））。这种病毒可以引起卡波西肉瘤，这是一种经常在AIDS患者中发展的癌症。通过基于细胞的方法研究病毒生命周期特征的一个障碍与病毒在大多数细胞系中难以培养的事实有关。因此，使用诸如确定病毒滴度这样的标准方法具有挑战性。因此，报告细胞系的开发基于至少在低水平上允许的细胞（HEK293T细胞、永生化内皮细胞、一些癌细胞系等。）。如前所述，基于PCR或基于ELISA的基因组等价物测量的分子生物学方法不能反映病毒的传染性能力。 用于指示细胞系开发的方法是使用以下方法。HH8基因组编码主要调节剂Rta，它激活一系列宿主和病毒启动子，并调节病毒生命周期中裂解程序的激活。Rta调节的启动子之一是多聚腺苷酸化核（PAN）RNA的细胞启动子。这个启动子片段可以被野生型病毒激活，并且lacZ基因被克隆到报告质粒中。然后，稳定转染HEK293T细胞。研究表明，HHV8病毒感染激活了报告盒，并且β-半乳糖苷酶活性水平是病毒剂量依赖性的。 3.4.3.疱疹病毒科，水痘-带状疱疹病毒 水痘-带状疱疹病毒（VZV）是水痘的原因，可能由于初次感染或感染细胞中病毒的再激活而出现严重并发症。可用的、快速的、针对性强的方法允许检测VZV是耗时和费力的，这使得开发针对性的病毒治疗和耐药菌株鉴定变得复杂。 基于病毒启动子特异性激活的VZV报告细胞系已经开发出来。测试了几个VZV启动子序列，最好的序列被证明是ORF9启动子，因为它具有特异性、强烈的激活。荧光素酶基因位于ORF9启动子的下游。质粒组装后，MeWo细胞和BSC40细胞被转染，并使用G418筛选稳定转化体。所获得的细胞克隆之一被用于进一步研究，因为它在对VZV的反应中显示出高荧光素酶活性，并且在没有VZV的情况下背景活性水平低。此外，在感染细胞和未感染细胞与报告盒共培养的情况下，报告器被激活。为了检测非特异性报告器再激活，细胞系被HCMV、人疱疹病毒6（Z29）和人疱疹病毒7（SB）感染。在所有这些情况下，都没有发现荧光素酶活性。然而，HSV1感染的指示细胞激活了荧光素酶活性，与VZV感染后24小时观察到的水平相似。然而，HSV1感染的细胞在感染后48小时表现出强烈的细胞病变效应；因此，荧光素酶活性降低，这使得区分HSV1感染和VZV感染变得可行。 4.结论  病毒检测方法包括一系列分子和细胞方法。基于细胞的方法在病毒学研究中占有相当大的部分。任何用于病毒检测的细胞系都必须具有灵敏度特征，这指的是易感性和许可性。通常，灵敏度是细胞被少量病毒独立于物种感染的能力。在实验室中，可以通过敲除细胞抗病毒反应基因或通过简单地在实验室收藏的不同培养物中选择敏感细胞系来实现许可性。易感性是细胞系被特定病毒种类感染的属性。在实验室中，可以通过增加病毒结合细胞受体的表达来增加易感性。改善这两个属性可以使细胞系成为病毒分离和研究的便捷工具。传统上，病毒感染的研究是基于CPE的基础上进行的，但这种方法并不适用于每种病毒，在这种情况下需要额外的耗时研究。这个问题已经通过使用携带分子传感器系统的细胞系来解决，这些系统允许通过存在容易检测的报告蛋白来检测感染性病毒代理。这种方法可以用于定量研究，作为CPE方法的更快的类似物。通过整合分子技术来提高分子报告器构建的灵敏度，可以实现病毒学中基于细胞方法的优化。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。