Dactinomycin

点击蓝字 关注我们 高三尖杉酯碱通过m6A-YTHDF2依赖机制调控EWSR1相分离抑制急性髓系白血病进展 iMeta主页：http://www.imeta.science 研究论文 ● 期刊: iMeta (IF 33.2, 中科院双一区Top) ● 英文题目：Homoharringtonine suppresses acute myeloid leukemia progression by orchestrating EWSR1 phase separation in an m6A-YTHDF2-dependent mechanism ● 中文题目：高三尖杉酯碱通过m6A-YTHDF2依赖机制调控EWSR1相分离抑制急性髓系白血病进展 ● 原文链接: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/imt2.70089 ● DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.70089 ● 2025年10月30日，北京大学医学部曾克武、屠鹏飞、薛瑞栋和赵翔宇等在iMeta在线发表了题为“Homoharringtonine suppresses acute myeloid leukemia progression by orchestrating EWSR1 phase separation in an m6A-YTHDF2-dependent mechanism”的文章。 ● 本研究联合化学蛋白质组学和蛋白质微阵列方法，鉴定EWSR1为高三尖杉酯碱（HHT）的直接作用靶点，揭示了HHT结合EWSR1诱导液—液相分离（LLPS），进而通过招募YTHDF2破坏m6A介导的mRNA降解，从而破坏白血病细胞稳态并抑制AML增殖。整合转录组与单细胞RNA-seq分析发现EWSR1在AML中高表达且与不良预后及HHT敏感性相关。该研究不仅阐明了HHT以相分离为中心的抗白血病机制，确立了EWSR1–YTHDF2–m6A轴在AML进展中的关键作用，这些发现确定EWSR1是HHT的直接效应因子和AML治疗反应性的预测性生物标志物。 ●  第一作者：刘婷婷、陈丽婷、裴旭颖、胡少男 ●  通讯作者：曾克武（ZKW@bjmu.edu.cn）、屠鹏飞（pengfeitu@bjmu.edu.cn）、薛瑞栋（rxue@hsc.pku.edu.cn）、赵翔宇（zhao_xy@bjmu.edu.cn） ●  合作作者：卓芳芳、陈泽坤、刘扬、王竞康、张继超、曹琦、王静、魏田田、韩博 ●  主要单位：北京大学药学院、北京大学人民医院、内蒙古大学生物医学研究院、北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室  亮 点 ● 通过整合化学蛋白质组学分析等，EWSR1被鉴定为高三尖杉酯碱（HHT）在AML中的直接细胞靶点； ● HHT与EWSR1结合可诱导其发生构象改变，促进相分离并使m6A识别蛋白YTHDF2被隔离； ● EWSR1既是HHT的治疗效应分子，又是AML治疗反应性的预测性生物标志物。  摘 要 高三尖杉酯碱（HHT）广泛用于急性髓系白血病（AML）的联合治疗方案中，但其直接细胞靶点尚不明确，从而限制了精准应用。本研究通过化学蛋白质组学与生物物理学验证，鉴定出EWS RNA结合蛋白1（EWSR1）是HHT的主要作用靶点。研究发现，HHT以微摩尔级亲和力结合EWSR1的RNA识别结构域，诱导其发生变构，促进寡聚化并驱动液–液相分离（liquid–liquid phase separation，LLPS）。形成的EWSR1凝聚体选择性招募m6A识别蛋白YTHDF2，在细胞质内形成枢纽中心，而HHT在其中破坏YTHDF2与mRNA的相互作用。这种隔离作用削弱了m6A介导的RNA降解，稳定了关键转录本（如TNFRSF1B和HMOX1），从而抑制AML细胞的增殖。整合转录组学与单细胞RNA-seq分析表明，EWSR1在AML中显著上调，尤其在造血祖细胞和髓系亚群中表达升高，并且高EWSR1表达与不良预后及增强的HHT敏感性密切相关。在体内实验中，敲低EWSR1显著削弱了HHT的抗白血病疗效，表明EWSR1对药物反应至关重要。综上所述，本研究揭示了HHT通过相分离驱动的抗AML作用机制，确立了EWSR1–YTHDF2–m6A轴作为白血病进展的重要调控通路，并将EWSR1定位为HHT治疗中的关键功能靶点及预测性生物标志物，为优化HHT相关疗法提供了理论基础。 视频解读 Bilibili：https://www.bilibili.com/video/BV16v1ZBCENw/ Youtube：https://youtu.be/Fdbq7C4Kjjw 中文翻译、PPT、中/英文视频解读等扩展资料下载 请访问期刊官网：http://www.imeta.science/ 全文解读 引  言 临床治疗急性髓系白血病（AML），尤其是急性早幼粒细胞白血病（APL），主要采用三氧化二砷与全反式维甲酸的联合疗法。然而在多数情况下，该策略需与化疗药物协同使用。高三尖杉酯碱（HHT）最初是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于慢性髓系白血病（CML）的治疗药物。值得注意的是，近年来HHT在AML临床治疗中展现出显著潜力。特别是当砷剂与全反式维甲酸联合疗法与HHT同步使用时，可产生强大的协同效应，揭示出独特的抗白血病机制。但目前对HHT治疗AML的潜在靶点仍知之甚少。因此，通过评估HHT相关靶基因的表达水平，我们有望识别哪些AML亚型患者可能对HHT治疗具有更高敏感性。 EWS RNA结合蛋白1（EWSR1）广泛存在于真核生物中，在基因表达相关表观遗传调控、RNA加工及细胞信号转导等多种细胞机制中发挥关键作用。EWSR1的表达上调与肿瘤发生存在密切关联，提示其在多种癌症发展中可能扮演重要角色。最近研究发现，AML患者中EWSR1相关嵌合融合基因出现频率极高，证实了EWSR1与AML发病之间的重要联系。此外，多项研究强调了EWSR1在与AML进展相关细胞过程中的功能意义，其中可能涉及p53/p21、JAK2等信号通路。然而，EWSR1触发AML进展的分子机制尚未完全阐明。 液-液相分离（LLPS）被认为是驱动无膜细胞器形成的关键过程。EWSR1可持续发生LLPS，并表现出增强的类液体样松弛与扩散特性。例如，EWSR1被证实会破坏应激颗粒的形成——后者作为无膜区室在细胞应激应答机制中具有重要作用。此外，EWSR1与FUS形成的融合蛋白会促进异常相分离发生，导致染色质重塑因子被错误招募从而引发转录事件。EWS（即EWSR1）-FLI1融合蛋白在靶标结合位点发生相分离，招募RNA聚合酶II并增强基因转录。因此，调控EWSR1参与的相分离过程可能成为对抗AML进展的有效治疗策略。 N6-甲基腺嘌呤（m6A）作为主要的RNA修饰，在调控mRNA稳定性与翻译过程中起核心作用。研究表明mRNA中多个m6A残基的存在可显著增强相分离。尤为重要的是，YTH结构域家族蛋白（YTHDF1-3）作为关键m6A阅读蛋白，已成为相分离的重要推动因子。例如，mRNA-YTHDF复合物的形成及其随后分配至以液-液相分离为特征的内源性区室（如P小体、RNA颗粒和应激颗粒），充分证明了YTHDF在相分离中的作用。同时，研究显示YTHDF1可驱动AML进展；YTHDF2在多种AML亚型中过表达，且为疾病发生与维持所必需。此外，YTHDF2受AML1/ETO-HIF1α环路调控，并通过控制全局m6A甲基化促进AML细胞增殖。这些证据共同确立了YTHDF在AML发展中的核心地位。 本研究通过合成生物素标记的分子探针，鉴定出EWSR1是HHT在AML细胞中的特异性细胞靶点。我们进一步观察到，HHT直接结合EWSR1的RNA识别motif并显著促进其相分离。出乎意料的是，EWSR1凝聚滴可特异性促进YTHDF2的招募，导致针对TNF受体超家族成员等影响AML细胞增殖关键因子的m6A RNA降解作用减弱。体内实验证实，敲低EWSR1会显著削弱HHT的抗白血病效果。因此，EWSR1参与调控YTHDF2功能在AML治疗中具有重要临床意义。 总之，本研究揭示了EWSR1相分离在AML进展中的独特分子机制。同时，HHT作为靶向EWSR1的小分子化合物的发现，为EWSR1高表达AML患者的精准治疗开辟了新的道路。 结  果 EWSR1被确定为HHT在AML中的细胞靶点 为阐明高三尖杉酯碱（HHT）的直接结合蛋白，我们利用生物素标记的HHT探针（bio-HHT）（图1A, S1, S2）对包含超过20,000种重组蛋白的人类蛋白质组微阵列进行了筛选。将bio-HHT与蛋白质组微阵列共孵育后，使用Cy3标记的链霉亲和素（Cy3-SA）对与HHT有结合亲和力的蛋白进行标记。信号强度以信噪比（SNR）进行量化。该分析初步鉴定出42个具有高置信度结合（SNR > 3）的候选蛋白。基于微阵列实验中SNR值与结合特异性之间存在正相关的既定认知，我们重点关注了SNR值最高的前10个蛋白（图1B）。从中，我们根据SNR排名及其在癌症通路（如蛋白酶体功能、RNA加工和转录调控）中的已知作用，优先选择了五个候选靶点（PSMA3、EWSR1、LRRC1、HNRNPD和FAM98A）。HuProtTM微阵列使用纯化的重组蛋白评估结合亲和力，而细胞下拉实验更能捕捉白血病细胞复杂生理环境中的靶蛋白。后续的下拉实验结合细胞培养中稳定同位素标记（SILAC）这一定量全局蛋白质组学方法表明，在所有候选靶点中，EWSR1的富集程度最为显著。如图1C和S3所示，具有高轻/重同位素比的EWSR1被确定为HHT的关键候选靶蛋白。尽管PSMA3、LRRC1、HNRNPD和FAM98A在体外使用纯化蛋白时显示出与HHT的强结合，但它们在白血病细胞模型中的结合较弱，这凸显了简化生化系统与复杂生理环境之间的根本差异。为进一步阐明EWSR1在AML中的生物学意义，我们深入分析了来自TCGA数据库的相关临床数据。该数据库中的转录组学研究表明，与正常组织相比，EWSR1 mRNA表达在多种恶性肿瘤中显著上调，尤其在AML组织中（图1D, E）。此外，利用Kaplan-Meier（KM）方法评估了EWSR1对AML患者的预后意义。我们的发现表明，EWSR1表达升高与AML患者总生存期较差存在显著关联（图1F），这提示EWSR1与AML进展呈正相关。 为进一步研究EWSR1与临床AML进展的相关性，我们整合了来自健康个体和AML患者的公开单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（GSE120221和GSE241989），共获得178,532个高质量单细胞数据。按19名AML患者和20名健康对照（HCs）的UMAP可视化显示，AML骨髓的转录组发生了明显变化（图1G）。UMAP可视化和小提琴图显示，AML患者的EWSR1表达显著高于健康个体（图1H, I, S4A）。鉴于AML与健康对照骨髓中存在相似的分化层级，所有细胞根据经典的造血谱系标志物被分为四个谱系：以CD34为特征的造血干祖细胞（HSPC）、以LYZ、CD14和FCGR3B为特征的髓系细胞、以HBA为特征的红系细胞，以及以CD3D和CD79A为特征的淋巴系细胞（图S4B）。在AML患者中，HSPC和髓系细胞约占每个样本的50-90%，而健康个体中以淋巴系细胞和红系细胞为主（图S4C）。基于无监督聚类，这些谱系被进一步划分为21个亚群。单细胞分析表明，EWSR1在AML患者中表达更高，特别是在HSPC亚群（包括CD34+ HSC、周期循环CD34+ HSC、多能祖细胞（MPP）、周期循环MPP和肥大细胞祖细胞（MCP））以及髓系亚群（如粒单核祖细胞（GMP）、早幼中性粒细胞、CD14+单核细胞、CD16+单核细胞和树突状细胞（DCs））中（图S4D-F）。综上所述，EWSR1高表达的HSPC和EWSR1高表达的髓系细胞在AML骨髓中占主导地位，表明EWSR1是AML干预的关键治疗靶点。 接下来，我们通过蛋白质印迹分析评估了多种肿瘤细胞系中EWSR1的蛋白表达。结果显示，与实体瘤细胞相比，EWSR1在AML白血病细胞中的表达显著增高（图1J, S5A）。HHT在体外对多种肿瘤细胞系显示出广谱抑制作用，尤其是对HL-60、NB4和Kasumi-1等AML细胞（图1K）。同时，Pearson相关系数表明，EWSR1蛋白水平与HHT的IC50值呈负相关（图1L）。此外，我们评估了HHT在一组AML细胞系（包括Kasumi-1、NB4、HL-60、U937、THP-1、OCI-AML2和HEL）中的效力（图S5B）。这些模型代表了主要的FAB亚型（M2-M6）并涵盖了不同的遗传背景。HHT在所有测试的细胞系中均表现出有效的抗白血病活性，IC50值持续处于低纳摩尔范围。值得注意的是，HHT敏感性与EWSR1表达呈负相关（Pearson r = -0.7972, p = 0.0318，图S5C），表明更高的EWSR1水平与增加的HHT敏感性相关。这些发现进一步支持了EWSR1在体外介导HHT抗白血病效应中的关键作用。另外，对原代患者来源样本的评估显示，AML样本中的EWSR1表达相较于健康对照显著升高（图1M）。用浓度递增的HHT处理来自12名代表FAB亚型M2-M5患者的原代AML细胞，结果显示HHT具有显著的抗白血病效应，IC50值处于纳摩尔范围（图1N）。值得注意的是，EWSR1表达水平与HHT IC50值呈负相关（Pearson r = -0.6451, p = 0.0173），表明更高的EWSR1表达预示着AML患者对HHT的敏感性更高（图1O）。总之，这种显著的相关性强调了EWSR1表达与AML细胞对HHT治疗反应性之间的潜在联系。 图1.EWSR1被鉴定为高三尖杉酯碱（HHT）的细胞靶点 （A）HHT及其生物素化类似物（bio-HHT）的化学结构。（B）利用人类蛋白质组微阵列技术筛选HHT靶点蛋白。（C）HHT候选靶点蛋白筛选流程示意图。（D）通过GEPIA数据库分析EWSR1在31种癌症组织与正常组织中的表达谱。横轴为TCGA数据库癌症类型缩写，全称对应如下：子宫癌肉瘤（UCS）、子宫内膜癌（UCEC）、胸腺瘤（THYM）、甲状腺癌（THCA）、睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）、胃腺癌（STAD）、皮肤黑色素瘤（SKCM）、肉瘤（SARC）、直肠腺癌（READ）、前列腺癌（PRAD）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、胰腺癌（PAAD）、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、肺鳞癌（LUSC）、肺腺癌（LUAD）、肝细胞肝癌（LIHC）、低级别胶质瘤（LGG）、急性髓系白血病（AML）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、肾透明细胞癌（KIRC）、肾嫌色细胞癌（KICH）、头颈鳞癌（HNSC）、胶质母细胞瘤（GBM）、食管癌（ESCA）、弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBC）、结肠腺癌（COAD）、胆管癌（CHOL）、宫颈鳞癌和腺癌（CESC）、乳腺癌（BRCA）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、肾上腺皮质癌（ACC）。（E）TCGA数据库中EWSR1在健康组织与AML组织的表达箱线图（健康对照70例，AML组173例，**p < 0.01）。（F）Kaplan-Meier生存曲线显示EWSR1表达与AML患者总生存期的关联（采用对数秩检验）。（G）健康对照与AML个体单细胞转录组数据的UMAP可视化。（H）健康对照与AML细胞中EWSR1表达的UMAP可视化（点代表单个细胞，颜色深度反映标准化表达水平）。（I）基于标准化值（对数刻度）的健康对照与AML患者单细胞EWSR1表达水平小提琴图。（J）多种白血病细胞系与实体瘤细胞系中EWSR1的免疫印迹分析。（K）HHT对各类白血病及实体瘤细胞系的抗肿瘤效应评估。（L）特定肿瘤细胞系中EWSR1表达与HHT半抑制浓度（IC50）的相关性（标注Pearson相关系数r）。（M）AML患者（n=26）与健康对照（n=11）EWSR1表达的定量PCR分析（*p < 0.05，未配对双尾t检验）。（N）原发性AML细胞（12例患者）经梯度浓度HHT处理48小时后的细胞存活曲线（通过CCK-8法检测，各曲线代表不同FAB亚型患者（M2-M5））。（O）AML患者EWSR1表达水平与HHT敏感性（IC50值）的相关性分析。 EWSR1的RNA识别结构域介导HHT结合 为进一步确认HHT与EWSR1之间的直接相互作用，我们进行了SPR分析，结果显示二者具有强结合能力，KD值为6.132 μM（图2A）。同时，我们采用MST技术验证了这一相互作用（KD值为3.137 ± 1.107 μM）（图2B）。此外，我们利用生物素标记的HHT探针在NB4和HL-60细胞中进行了下拉实验以捕获EWSR1蛋白。与对照组相比，与HHT结合的EWSR1蛋白水平显著增加，从而证实了HHT与EWSR1的相互作用。而加入游离HHT进行竞争性结合则有效逆转了这种相互作用（图2C）。我们还采用DARTs分析进一步验证了HHT与EWSR1的结合（图2D）。同时，CETSA实验也验证了这些发现，揭示了HHT与EWSR1之间显著的结合亲和力（图2E）。为阐明EWSR1蛋白中与HHT相互作用的具体结构域，我们将该蛋白划分为不同的N端区域（氨基酸1-300）和C端区域（氨基酸301-656，即RNA识别结构域）。下拉实验证实，HHT直接与EWSR1的C端相互作用（图2F, S6）。随后，我们成功表达了C端蛋白，并分别进行了MST和SPR实验。值得注意的是，我们的结果一致表明HHT与EWSR1 C端区域存在特异性相互作用（图2G, H）。总之，我们的研究为HHT与EWSR1的RNA识别结构域直接相互作用提供了有力证据。 图2. HHT结合EWSR1的RNA识别结构域 （A）表面等离子共振（SPR）实验显示HHT与EWSR1的结合亲和力。（B）微量热泳动（MST）分析HHT与EWSR1的结合作用，基于三次独立实验计算获得解离常数为3.137 ± 1.107 μM。（C）下拉实验验证HHT在NB4和HL-60细胞中与EWSR1的结合，通过蛋白质印迹分析HHT磁珠免疫共沉淀的EWSR1。（D）药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验表明，HHT增强EWSR1对蛋白酶解的耐受性。（E）细胞热转移（CETSA）实验显示HHT提升EWSR1在不同温度梯度下的稳定性。（F）HHT与EWSR1结构域结合的下拉实验分析。（G）MST检测显示HHT与过表达GFP-EWSR1-C的HEK293T细胞裂解液中的EWSR1-C结构域直接结合。（H）SPR分析HHT与EWSR1-C重组蛋白的结合特性。 HHT通过氢键结合EWSR1的RNA识别结构域 为深入研究HHT与EWSR1相互作用的关键氨基酸，我们合成了HHT的光亲和标记探针（HHT-PAL），用于探查EWSR1 C端区域（尤其是RNA识别结构域）中潜在的修饰肽段（图3A, S7）。如图3B所示，当EWSR1-C与HHT-PAL结合后，在紫外线照射下通过双吖丙啶基团发生共价交联。随后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定了结合肽段。结果显示存在多个分子量增加665.3194的肽段，该数值与HHT-PAL探针的分子量相符（图3C, S8）。重要的是，我们鉴定出两条特异性肽段序列393-TGQPMIHIYLDKETGKPK-410和425-AAVEWFDGKDFQGSK-439作为HHT探针的潜在修饰位点。由此确定交联精确位点位于EWSR1的RNA识别结构域（353-453）内。我们通过分子对接研究了HHT与EWSR1 RNA识别结构域（PDB代码：2CPE）的结合模式（图3D）。结果显示，HHT与EWSR1中的四个残基（T393、P396、M397和I400）形成氢键。此外，观察到HHT与H399残基之间存在π-π相互作用。为验证这些氨基酸是否参与介导EWSR1与HHT的结合，我们构建了多个EWSR1-C的单点及多点突变体。通过MST和下拉实验评估了HHT与这些EWSR1突变体的结合亲和力。如图3E-G所示，突变体与HHT的亲和力较野生型显著减弱，表明T393、P396和I400残基对HHT与RNA识别结构域的相互作用至关重要。在下拉实验中，野生型EWSR1显示清晰的条带，表明与HHT强效结合；作为非关键残基对照的M397A突变体则表现出与野生型相当的结合能力；而预计对相互作用至关重要的T393A、P396A和I400A突变体均导致HHT结合显著减弱，表现为条带强度明显降低，Mut4组合突变体同样显示结合能力下降（图S9）。这些发现为EWSR1的RRM结构域中T393、P396和I400残基是HHT结合所必需的观点提供了直接实验证据，有力支持了我们的计算预测和MST数据。因此，HHT可能通过多个氢键与EWSR1结合，进而介导下游细胞信号通路的调控。 图3. HHT通过氢键与RNA识别结构域相互作用 （A）HHT-PAL探针的合成路线。（B）点击化学探针标记的HHT-PAL探针在EWSR1-C中鉴定共价修饰肽段的示意图。（C）液相色谱-串联质谱分析HHT-PAL探针与EWSR1-C结合的共价修饰肽段。（D）HHT与EWSR1（353-453）蛋白结构（PDB: 2CPE）的分子对接模拟。（E、F）MST分析显示HHT与EWSR1-C突变体（包括单点突变及多点突变）的直接相互作用。（G）EWSR1-C突变体结合常数汇总表。 HHT促进EWSR1蛋白液滴形成 既往研究表明，EWSR1易于发生液-液相分离并在细胞环境中形成蛋白液滴。本研究通过生物信息学分析评估了EWSR1各结构域对其相分离现象的影响。分析揭示了EWSR1内部存在大量内在无序区域，特别是N端转录激活结构域和C端富含RGG的结构域，这些结构域在促进全长EWSR1的液-液相分离中起关键作用（图4A）。为验证此发现，我们用GFP标记的EWSR1表达载体转染HEK293T细胞，并对单个液滴的特定区域进行荧光漂白后恢复（FRAP）分析。结果显示，荧光漂白后80秒内焦点区域呈现显著恢复，证实其具有动态液态特性（图4B）。同时，这些斑点通过液滴融合现象展现出类液体性质（图4C）。使用可破坏液态凝聚态的化学试剂1,6-己二醇处理后，EWSR1斑点的丰度显著降低（图4D）。此外，我们还在NB4细胞中证实了EWSR1相分离的发生（图4E, F）。 为探究EWSR1具体哪个结构域驱动相分离，我们设计了一系列GFP标记的构建体并监测其形成斑点的能力。结果显示EWSR1-N和EWSR1-C能形成与全长EWSR1相似的明显斑点（图4G）。我们进一步采用光诱导液滴实验研究驱动EWSR1相分离的核心结构域。该体系通过将光响应蛋白Cry2（在蓝光照射下发生自聚集，图S10A）与EWSR1各结构域进行基因融合构建。Cry2的这一特性可作为“种子”启动内在无序区域的凝聚体形成。延时成像显示，蓝光照射导致EWSR1-N和EWSR1-C结构域形成大量液滴（图4H）。相衬显微镜观察进一步发现，体外实验中EWSR1-C可形成蛋白液滴，且HHT处理能增强该过程（图S10B）。延时成像显示HHT逐渐促进EWSR1发生相分离，导致NB4细胞在2小时内凝聚体数量增加（图4I, S10C）。鉴于HHT可能改变EWSR1的相分离行为，我们进行了FRAP检测。结果显示HHT显著降低了EWSR1和EWSR1-C液滴的荧光恢复速率（图4J, K）。我们推测HHT可能通过影响EWSR1-C的构象改变LLPS的物理化学特性。体外实验证实，HHT不仅促进EWSR1-C凝聚体形成并增加液滴密度（p < 0.05），还显著延长了EWSR1-C的荧光恢复时间，表明其可能驱动EWSR1-C凝聚体发生液固相转变（图4L），从而降低其环状结构与流动性。这些结果共同揭示了EWSR1在AML细胞中显著的相分离特性，且该过程可被HHT有效调控。 图4. HHT促进EWSR1蛋白的液-液相分离 （A）利用天然无序区域预测算法（PONDR）、朊病毒样氨基酸组成分析（PLAAC）和内在无序蛋白预测（IUPred2）对无序区域进行预测。概率评分低于0.5表示有序区域，高于0.5表示无序区域。上方为EWSR1蛋白结构示意图。（B）左侧为代表性显微图像，右侧为荧光漂白后恢复定量分析，展示80秒内EWSR1-GFP凝聚体在光漂白前后的动态变化（白框标示漂白区域，n=3个凝聚体）。比例尺：10 μm。（C）HEK293T细胞中EWSR1-GFP凝聚体的融合过程。比例尺：10 μm。（D）转染EWSR1-GFP的HEK293T细胞经3.5% 1,6-己二醇处理与未处理的活细胞成像。比例尺：5 μm。（E）NB4细胞中EWSR1-GFP凝聚体的形成。比例尺：2 μm。（F）NB4细胞中EWSR1的免疫荧光染色（细胞核经DAPI标记）。比例尺：2 μm。（G）GFP标记的EWSR1截短蛋白的亚定位图像。（H）蓝光刺激不同时间点下，HEK293T细胞中EWSR1（FL）、EWSR1-N和EWSR1-C-Cry2的聚类代表性图像（采用488 nm激光激发）。比例尺：5 μm。（I）HHT处理后NB4细胞中斑点结构快速增加的代表性显微图像。比例尺：2 μm。（J）HEK293T细胞中EWSR1-GFP经HHT处理与未处理的FRAP定量分析（数据以均值±标准差表示，n=4）。（K）HEK293T细胞中EWSR1-C-GFP经HHT处理与未处理的FRAP定量分析（数据以均值±标准差表示，n=5）。（L）体外EWSR1-C-GFP经HHT处理与未处理的FRAP代表性图像及定量分析（数据以均值±标准差表示，n=5）。比例尺：5 μm。（J-L）统计学显著性采用双尾Student’s t检验（**p < 0.01）。 HHT通过变构机制促进EWSR1相分离 为探究EWSR1相分离的分子机制，我们构建了双分子荧光互补（BiFC）报告系统。基于venus蛋白的强荧光特性，我们将其分割为略有重叠的N端片段（VN173）和C端片段（VC155），并将这两个结构域分别整合至EWSR1的C端区域，成功获得EWSR1-VN和EWSR1-VC两种载体。共转染这两种表达载体后，EWSR1变体间的直接相互作用可导致VN与VC结构域物理结合，形成具有完整荧光功能的Venus蛋白。如图5A、B所示，BiFC实验证实了EWSR1的自相互作用，表明其可能形成同源二聚体或寡聚体。值得注意的是，HHT处理显著增强了这种相互作用，证明HHT通过靶向EWSR1的C端区域有效加速其自聚集。此外，免疫印迹分析显示，HHT以浓度依赖性方式显著促进EWSR1的寡聚化（图5C）。我们推测该自聚集机制可能源于HHT诱导EWSR1-C蛋白发生构象改变。通过色氨酸荧光分析发现，HHT引起EWSR1-C荧光强度显著降低，表明其可诱导EWSR1-C构象变化（图5D）。进一步利用圆二色谱（CD）分析EWSR1-C的二级结构发现，随着HHT浓度增加，222 nm处的摩尔椭圆度值逐步下降，表明蛋白质螺旋度降低与浓度变化直接相关（图5E）。这种构象转变可能进一步促进蛋白聚集。随后，我们采用氢氘交换质谱（HDX-MS）研究变构机制，结果显示HHT提高了两条特征肽段（NKRTGQPMIHIYL、FAWRTECNQ）的氢氘交换速率（图5F）。其中NKRTGQPMIHIYL肽段对RNA识别及HHT结合至关重要。综上，这些发现阐明HHT通过变构调控EWSR1，进而促进蛋白寡聚化并加速蛋白液滴形成。 图5. HHT通过变构调控促进EWSR1相分离 （A）双分子荧光互补（BiFC）实验示意图展示EWSR1结合作用。共聚焦显微图像显示BiFC阳性信号细胞（HEK293T细胞共转染EWSR1-VN与EWSR1-VC，细胞核经DAPI染色）。比例尺：10 μm。（B）BiFC阳性细胞的定量分析。（C）不同浓度HHT处理的NB4细胞中EWSR1寡聚化的免疫印迹图像。（D）荧光光谱分析HHT诱导EWSR1-C构象变化（在280 nm激发下检测重组EWSR1-C与不同浓度HHT作用的荧光发射光谱）。（E）圆二色谱分析HHT介导的EWSR1-C构象变化。（F）氢氘交换质谱（HDX-MS）证实HHT通过变构机制调控EWSR1-C构象。 HHT增强EWSR1-YTHDF2相互作用以抑制m6A识别 为探究EWSR1液滴可招募的蛋白质组分，我们尝试通过相分离形成的凝聚体进行蛋白质谱分析。如图6A所示，我们采用免疫共沉淀（Co-IP）结合SILAC定量蛋白质组学技术，鉴定出EWSR1的潜在结合底物蛋白，如HNRNPM和YTHDF2，这两种蛋白此前均被报道与蛋白液滴形成相关（图6B）。我们特别关注YTHDF2，因为其在蛋白质相分离中的基础作用及其与肿瘤细胞增殖的密切关联。通过分析TCGA数据集，发现AML患者中YTHDF2表达与EWSR1呈正相关（图6C）。基于健康个体与AML患者的单细胞RNA测序数据集，我们发现YTHDF2的表达分布模式与EWSR1高度相似（图S11A）。相较于健康对照，YTHDF2在AML患者中表达更高，尤其在HSPC和髓系亚群中显著（图S11B-E）。单细胞水平分析进一步检测到EWSR1与YTHDF2表达水平呈显著相关性，在AML患者中呈现强烈的共表达模式（图S11F,G）。差异基因表达分析证实，EWSR1与YTHDF2在AML患者中均显著上调（图S11H）。这些发现为AML分子机制提供了重要见解，提示YTHDF2可能作为EWSR1驱动AML进展的关键下游效应子。 通过Co-IP实验，我们发现HHT处理能显著增强EWSR1与YTHDF2在293T细胞和NB4细胞中的相互作用（图6D, S11I）。此外，HHT还促进了EWSR1与YTHDF2的YTH结构域结合（图6E）。我们进一步探索了YTHDF2的YTH结构域与EWSR1特定区域的相互作用，结果显示EWSR1的C端区域与特异性识别m6A修饰位点的YTH结构域直接互作（图6F）。分子对接表明EWSR1-C截短体通过独特的蛋白-蛋白相互作用界面与YTHDF2的YTH结构域特异性结合（图6G）。基于YTHDF2在细胞m6A修饰过程中的已知功能，我们推测EWSR1相分离可能通过招募YTHDF2在调控细胞内RNA稳定性中发挥重要作用。HHT促进EWSR1与YTHDF2相互作用，驱动细胞质凝聚体形成，从而限制YTHDF2识别m6A修饰RNA的能力。在对照组细胞中，YTHDF2呈弥散性胞质分布并与m6A广泛共定位；而HHT处理后，YTHDF2被隔离至含EWSR1的 puncta结构中，导致其m6A识别活性降低（图S11J）。这些结果说明EWSR1在HHT作用下可作为YTHDF2介导的m6A识别的负调控因子。通过合成生物素化RNA探针和m6A探针进行RNA下拉实验，我们发现细胞中YTHDF2的富集程度显著降低（图6H），而其他m6A阅读蛋白（包括IGF2BP1、YTHDF1和YTHDF3）的结合则未受明显影响（图S11K）。此外，过表达EWSR1同样导致RNA下拉实验中YTHDF2富集减少（图6I）。 为探究HHT对全局m6A RNA水平的影响，我们在NB4细胞中进行m6A斑点印迹实验。如图S12A所示，HHT处理引起m6A水平浓度依赖性升高，亚甲蓝染色证实RNA上样量一致。时序分析进一步显示m6A积累随HHT处理时间逐渐增强（图S12B）。通过LC-MS/MS对m6A/A比值的定量分析，确认m6A水平呈浓度依赖性显著增加（图S12C）。YTHDF2作为关键m6A阅读蛋白，正常情况下结合m6A修饰的mRNA并促进其降解。HHT破坏EWSR1-YTHDF2相互作用后，损伤了该功能，阻止YTHDF2识别并降解m6A修饰的RNA，最终导致这些转录本累积。因此，观察到的全局m6A水平升高可能是YTHDF2功能失常（由于m6A修饰转录本滞留）的次级效应。这些发现共同强化了EWSR1作为HHT调控YTHDF2 m6A识别功能关键靶点的证据。 图6. HHT增强EWSR1-YTHDF2相互作用并抑制m6A识别 （A）基于稳定同位素标记氨基酸细胞培养（SILAC）技术的蛋白质组学实验示意图（左）。通过免疫共沉淀（Co-IP）联合质谱分析鉴定EWSR1相互作用蛋白，右图为所有鉴定蛋白的散点分布。（B）EWSR1前10个相互作用蛋白列表。（C）AML患者中EWSR1与YTHDF2 mRNA表达的相关性分析（Pearson相关系数r=0.6）。（D）NB4细胞中通过免疫共沉淀评估EWSR1与YTHDF2的相互作用，采用ImageJ软件定量免疫沉淀组分中YTHDF2的富集程度。（E）YTHDF2与EWSR1结合区域定位。将EWSR1-HA与YTHYTHDF2-Myc共转染至HEK293T细胞，利用抗HA抗体进行免疫沉淀。右图显示免疫沉淀组分中Myc信号强度（相对于输入组Myc水平标准化）。（F）EWSR1与YTHYTHDF2-Myc结合区域定位。将不同EWSR1构建体与YTHYTHDF2-Myc共转染HEK293T细胞，采用抗Myc抗体进行免疫沉淀。下图显示免疫沉淀组分中HA（EWSR1）信号强度（相对于输入组HA水平标准化）。（G）YTH结构域（PDB: 4RDO）与EWSR1-C结构的分子对接模拟。（H）HHT处理下YTHDF2与m6A RNA探针或未甲基化RNA探针孵育的下拉实验。右图显示免疫沉淀组分中YTHDF2富集量化（相对于输入组YTHDF2水平标准化）。（I）过表达EWSR1条件下YTHDF2与m6A结合的下拉分析。右图显示免疫沉淀组分中YTHDF2相对富集量化（相对于输入组YTHDF2水平标准化）。数据以均值±标准误表示（三次独立实验，*p < 0.05, **p < 0.01）。 HHT通过EWSR1-YTHDF2轴稳定m6A修饰转录本 EWSR1参与RNA代谢调控的作用已被广泛报道。为此，我们对NB4细胞进行RNA测序（RNA-seq）。火山图显示6036个基因显著上调，5862个基因显著下调（图7A）。通过KEGG和GO通路富集分析发现，差异表达基因主要富集于线粒体自噬、细胞周期及RNA降解通路（图S13A）。GO生物过程分析表明，这些基因主要参与核糖体生物发生、自噬、中性粒细胞脱颗粒、中性粒细胞活化、mRNA加工及mRNA剪接等过程（图7B）。为验证EWSR1敲低是否与HHT处理的转录特征高度相关，我们构建EWSR1敲低的NB4细胞进行RNA-seq分析，共鉴定出2121个上调基因和1421个下调基因（图7C）。KEGG分析显示差异基因在内质网蛋白质加工、RNA降解等通路显著富集（图S13B）。GO富集分析揭示EWSR1敲低细胞中核糖体生物发生、中性粒细胞脱颗粒、mRNA加工等生物过程显著富集（图7D）。特别重要的是，HHT处理组中约2872个基因的表达变化与EWSR1敲低组存在显著重叠和强相关性，为EWSR1作为HHT功能靶点提供了额外证据（图7E）。 肿瘤坏死因子（TNF）及其受体超家族（TNFSF/TNFRSF）在免疫应答和程序性细胞死亡中起关键作用。本研究观察到HHT处理的NB4细胞中TNFRSF14、TNFRSF11B、TNFRSF10B、TNFRSF25、TNFRSF21、TNFRSF12A和TNFRSF1B显著上调（图7F）。通过甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）分析YTHDF2下游靶基因，发现上调的m6A修饰基因主要富集于TNF信号通路（图7G），而下调的m6A修饰基因与自噬和AMPK信号通路显著相关（图S13D）。HHT显著提升白血病细胞中TNFRSF1B和HMOX1 mRNA的m6A修饰水平（图7H, S13E）。由此我们推测HHT可能影响TNFRSF1B和HMOX1 mRNA的稳定性。qRT-PCR分析进一步证明，HHT抑制TNFRSF1B和HMOX1 mRNA降解的同时，减少其与YTHDF2的结合（图7I-K）。综上表明，HHT通过增强EWSR1与YTHDF2的相互作用，抑制YTHDF2对m6A修饰靶基因TNFRSF1B和HMOX1的识别，最终诱导白血病细胞凋亡（图7L）。 图7. HHT通过EWSR1-YTHDF2轴调控m6A修饰RNA的稳定性 （A）HHT处理的NB4细胞中差异基因表达火山图。（B）HHT处理组差异表达基因的GO富集分析。（C）shEWSR1与shNC NB4细胞差异表达基因火山图。（D）shEWSR1与shNC组差异基因GO富集分析气泡图。（E）EWSR1 siRNA与40 nM HHT处理组基因表达变化相关性散点图。（F）HHT处理与未处理NB4细胞差异mRNA的qRT-PCR分析（每组含3次生物学重复，各进行1次技术重复）。（G）m6A修饰上调基因的KEGG通路富集分析。（H）HHT处理后TNFRSF1B与HMOX1基因m6A修饰水平变化。（I、J）HHT处理组NB4细胞中TNFRSF1B与HMOX1 mRNA的衰减曲线。（K）HHT处理NB4细胞中YTHDF2免疫沉淀产物对TNFRSF1B与HMOX1的富集度。（L）HHT调控EWSR1相变机制示意图。 EWSR1作为AML体内治疗靶点的验证 为在体内验证HHT通过EWSR1介导抗AML作用，我们利用慢病毒转导构建了稳定敲低EWSR1（shEWSR1）及对照（shNC）的NB4和Kasumi-1细胞系，Western blotting证实EWSR1蛋白水平降低约70%（图8A）。采用这两种细胞系在免疫缺陷小鼠中构建两种AML模型：将NB4细胞移植至NOD/SCID小鼠，通过流式细胞术量化白血病细胞浸润；将荧光素酶标记的Kasumi-1细胞移植至NOG小鼠，通过生物发光成像（BLI）纵向追踪白血病进展。通过尾静脉注射HHT（0.5 mg/kg）连续治疗四周，期间纵向监测白血病进展并持续记录存活率（图8B）。通过尾静脉采血进行CD45免疫荧光染色，流式细胞术分析显示第28天对照组外周血中NB4细胞（人CD45+）克隆扩增比例达0.58%，而野生型EWSR1小鼠经HHT治疗后降至0.16%（图8C、D）。在EWSR1敲低小鼠中，对照组与HHT治疗组第28天外周血NB4细胞比例分别为0.25%和0.21%。生存曲线分析表明：在野生型模型中，HHT治疗显示出显著抗白血病效果，显著延长小鼠生存期；而在EWSR1敲低模型中，HHT未能进一步延长小鼠生存期（图8E）。HHT治疗组的生存延长与NB4细胞在外周血中的克隆扩增呈负相关。Kasumi-1模型中获得一致结果：BLI显示shNC组肿瘤负荷快速增加，HHT治疗与EWSR1敲低均能显著抑制白血病进展；但HHT联合EWSR1敲低并未产生叠加效应，表明EWSR1是HHT发挥疗效的必要条件（图8F）。生物发光信号定量分析证实上述发现（图8G）。生存分析同样显示：HHT治疗与EWSR1敲低均可显著延长生存期，但联合干预未产生额外生存获益（图8H）。这些结果充分证明EWSR1是HHT在体内发挥抗AML作用的直接靶点。 图8. 靶向EWSR1的HHT在体内抑制AML进展 （A）感染shNC或shEWSR1慢病毒颗粒后EWSR1表达的免疫印迹及相对定量分析（**p < 0.01，n = 3）。（B）体内实验流程示意图：于第-7天经尾静脉注射NB4或Kasumi-1-luc细胞，第0天开始HHT治疗。（C）在指定时间点采集外周血样本，通过流式细胞术分析NB4细胞（人CD45+），图示第28天代表性结果。（D）各组小鼠移植后第16、22、28天外周血中NB4细胞定量。（E）移植NB4细胞小鼠的Kaplan-Meier生存曲线（采用Mantel-Cox（log-rank）检验分析）。（F）接种Kasumi-1-luc细胞的NOG小鼠在指定时间点（第14、19、24、29、35、42、50天）的典型生物发光成像，展示不同处理组（shNC、shNC+HHT、shEWSR1、shEWSR1+HHT）肿瘤负荷（色彩标尺：最小值7.54e4，最大值1.99e7 p/sec/cm²/sr）。（G）Kasumi-1-luc移植小鼠总荧光通量（p/s）定量，显示各组肿瘤进展的显著差异（采用双因素重复测量方差分析及Dunnett’s多重比较检验）。（H）Kasumi-1-luc移植小鼠的Kaplan-Meier生存曲线，展示组间生存期差异。数据以均值±SD表示；**p < 0.01，***p < 0.001；N.S.无统计学意义。"shNC"为对照组，"shEWSR1"为EWSR1敲低组，"HHT"为HHT治疗组。 讨  论 目前，急性髓系白血病（AML）——特别是急性早幼粒细胞白血病（APL）的临床治疗主要采用三氧化二砷与全反式维甲酸的联合方案。然而，仍有部分患者在此方案治疗后出现疾病复发。因此，在临床实践中，应用砷剂与全反式维甲酸联合疗法的同时，往往需要协同使用化疗药物。HHT作为广泛使用的白血病治疗药物，对多种白血病亚型均显示出疗效。尤其在APL治疗中，通常采用HHT与砷剂联合方案以显著降低疾病复发风险。通过鉴定HHT的直接作用靶点并检测AML患者中相应靶基因的表达水平，我们有望筛选出对HHT治疗更敏感的患者人群。本研究运用化学生物学技术，鉴定出EWSR1是HHT在AML细胞中的直接分子靶点。这一发现阐明了EWSR1高表达与AML疾病进展之间的密切关联，同时表明EWSR1表达水平与HHT治疗反应性呈正相关。因此，在AML临床治疗过程中进行患者基因分型，可能有助于提升HHT的临床疗效。 我们靶点鉴定策略的核心优势在于整合了两种互补的正交验证方法：（1）基于无细胞体系的高通量HuProt™人类蛋白质组微阵列，用于分析HHT与纯化重组蛋白的结合特征；（2）基于SILAC标记的细胞下拉实验，用于捕获白血病细胞天然生理环境中的蛋白质相互作用。这种双重策略旨在最大限度降低简化生化系统带来的假阳性，同时确保其在活细胞中的生物学相关性。HuProt™微阵列初步鉴定出42个与HHT强结合（SNR > 3）的候选蛋白，我们从中筛选出SNR值最高的前10个靶点（包括EWSR1、PSMA3、LRRC1、HNRNPD和FAM98A）。随后在NB4细胞中进行的SILAC下拉实验证实，EWSR1是富集程度最显著的靶点，其轻/重同位素比值较次要候选靶点高出约2.5倍。EWSR1在体外与细胞实验中均位列前茅的一致性结果，为其作为HHT主要作用靶点提供了有力证据。相比之下，PSMA3和LRRC1等蛋白虽然在微阵列中显示强结合，但在天然条件下富集较弱，这凸显了纯体外方法的局限性及细胞验证的重要性。这些正交研究结果共同支持EWSR1作为HHT在白血病细胞中关键功能介导者的优先地位。 既往研究表明EWSR1具有相分离特性，但其相分离与RNA m6A修饰间的确切联系及其在AML发病机制中的作用尚未完全阐明。本研究发现EWSR1通过相分离招募YTHDF2，进而调控AML细胞中一系列RNA的稳定性。我们强调了一种以HHT为分子探针的选择性诱导EWSR1相分离的化学策略，该策略通过m6A-YTHDF2依赖机制有效调控RNA稳定性，展现出潜在治疗价值。这些发现为开发AML靶向治疗提供了重要见解，并深化了我们对其分子机制的理解。 临床证据表明EWSR1基因表达水平升高与患者生存率降低及不良预后密切相关，提示EWSR1可作为癌症治疗的潜在靶点。本研究阐释了HHT通过促进细胞内EWSR1相分离，进而招募YTHDF2至蛋白液滴，最终阻碍AML进展的作用机制。因此，靶向EWSR1-YTHDF2轴为AML治疗提供了新策略。鉴于HHT在临床中可增强砷剂联合疗法的疗效，我们推测EWSR1-YTHDF2轴可能与三氧化二砷和全反式维甲酸产生协同效应。此外，目前尚未有三氧化二砷或全反式维甲酸参与EWSR1介导信号机制的相关报道。因此，EWSR1可能为揭示HHT的协同效应提供分子生物学证据。 值得注意的是，本研究揭示了HHT并非直接增加EWSR1表达，而是通过促进其相分离过程发挥作用。研究发现EWSR1相分离的启动主要由其自身聚合过程介导，且这一过程受到与关键m6A相关蛋白（特别是YTHDF2）的多重相互作用促进。我们提出EWSR1聚集性的增强可能源于其RNA识别模体内特定氨基酸间的氢键相互作用，这些相互作用对促进聚合物快速组装继而触发EWSR1相分离至关重要。HHT与EWSR1的精确结合位点位于C端RNA结合结构域——该区域已知负责EWSR1的相分离。因此，HHT可能通过与该结构域内特定氨基酸建立特异性氢键，促进两个EWSR1蛋白的结合。这种特异性氢键的形成对于构建EWSR1蛋白与HHT组成的三元复合物具有关键作用。本研究曾尝试解析HHT-EWSR1复合物结构，但受限于EWSR1固有的生物物理特性：其广泛的内在无序区域（特别是N端低复杂度结构域）产生的构象异质性阻碍了稳定晶格的形成，这种可塑性结合液-液相分离特性导致动态凝聚体聚集而非晶体形成，反映了含IDR/LLPS蛋白结构解析面临的普遍挑战。 结  论 本研究鉴定出EWSR1是HHT的关键作用靶点，进而揭示其通过调控EWSR1相分离缓解AML进程的分子机制，深化了对EWSR1-YTHDF2-m6A轴在AML发展中核心功能的认识，为HHT的临床应用提供了机制依据，并为针对不同遗传背景AML患者开发精准治疗策略提供了新思路。 方  法 人类样本收集与细胞系 本研究收集了11名健康供者（HC组）和26例AML患者的骨髓单核细胞（BMMCs）。人白血病NB4细胞系（女性来源）由上海交通大学医学院陈国强教授馈赠，HL-60和HEK293T细胞系购自北京协和医学院细胞资源中心。K562、THP-1、Kasumi-1、OCI-AML2和MOLM13细胞系源自美国典型培养物保藏中心（ATCC），荧光素酶标记的Kasumi-1细胞系（Kasumi-1-luc）购自上海富衡生物科技有限公司。所有细胞均经聚合酶链反应（PCR）检测，确认无支原体污染。NB4与HL-60细胞使用RPMI 1640培养基（Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA）培养，培养基中添加10%胎牛血清（FBS, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）及双抗（100 mg/mL青霉素与100 mg/mL链霉素）。HEK293T细胞采用高糖DMEM培养基（DMEM, Macgene, Beijing, China）培养，补充10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。所有细胞均在37°C、5% CO2的湿润恒温培养箱中培养。 化合物配制 本研究使用的高三尖杉酯碱（HHT）购自陕西省宝鸡市辰光生物有限公司（纯度 > 98%）。将其溶解于二甲基亚砜（DMSO）配制成20 mM的储存液，并于-20 °C保存。于每次体外实验前，将HHT储备液用相应培养基稀释至所需工作浓度。实验培养基中DMSO的终浓度始终控制在0.1%以下，以排除其潜在干扰。 生物素标记HHT探针的合成 在酯化反应条件下（35 °C，使用DCC和4-ppy作为催化剂），使化合物HHT与丙炔酸反应生成HHT-HEX中间体。随后将CuSO4（8 mM）、叠氮-聚乙二醇-生物素（100 mM）和HHT-HEX（50 mM）溶解于1.5 mL点击化学反应缓冲液中（该缓冲液含800 μM tris（（1-benzyl-4-triazolyl）methyl）amine （TBTA）、8 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）和40% t-butyl alcohol （t-BuOH）。向混合液中通入氮气后，于4 °C孵育过夜。反应产物采用薄层色谱法（TLC）进行分离纯化，展开剂为二氯甲烷/甲醇体系。最终，通过核磁共振波谱（NMR）与高分辨质谱（HRMS）对所得生物素标记HHT探针的化学结构进行了确证。 HHT-PAL探针的合成 将50 mg HHT、22 mg 3-（3-（but-3-yn-1-yl）-3H-diazirin-3-yl）propanoic acid （BDPA）、37 mg 1,3-dicyclohexylcarbodiimide （DCC）和27 mg 4-pyrrolidinopyridine （4-ppy）加入2 mL二氯甲烷溶液中，于35°C加热反应12小时。采用硅胶柱色谱法（流动相：二氯甲烷/甲醇体系）对反应产物进行分离纯化。通过高分辨率电喷雾电离质谱（HRESIMS）、氢核磁共振（¹H NMR）及碳核磁共振（¹³C NMR）技术对HHT-PAL探针的化学结构进行确证。 免疫印迹 将蛋白裂解液与含125 mM Tris-HCl（pH 6.8）、20% SDS、10%甘油、0.5% β-巯基乙醇和0.5%溴酚蓝的蛋白上样缓冲液混合，98°C加热10分钟。蛋白样品经SDS-PAGE凝胶分离后，转印至0.45 μm聚偏二氟乙烯膜。用5%脱脂牛奶封闭膜的非特异性结合位点后，分别与以下特异性一抗于4°C孵育过夜：GAPDH（1:5000，Proteintech）、EWSR1（1:1000，Proteintech）、HA（1:1000，CST）、His（1:1000，CST）、YTHDF2（1:1000，Proteintech）和Myc（1:1000，CST）。经相应二抗（1:5000稀释）孵育后，使用超敏化学发光底物进行蛋白条带显影。 人类蛋白质组微阵列分析 本研究使用的HuProt™人类蛋白质组微阵列v3.1购自CDI Laboratories公司。将蛋白质组微阵列置于摇床（60 rpm）上，用封闭液（含3% BSA的PBS溶液）封闭1小时，随后立即与含10 μM生物素标记HHT（bio-HHT）的孵育液于室温反应1小时。用PBST缓冲液清洗三次后，加入1:1000稀释的Cy3-链霉亲和素进行标记。经PBST缓冲液冲洗和双蒸水漂洗后，离心干燥，最后通过GenePix 4200A微阵列扫描仪采集信号。信噪比（SNR）通过计算前景与背景信号强度中位数的比值获得。以平均SNR表示蛋白质信号强度，并设定SNR ≥ 2.5为筛选潜在结合靶点的阈值。 微量热泳动（MST）分析 采用MST技术检测HHT与EWSR1的相互作用。通过瞬时转染pEGFP-N1-EWSR1质粒，使HEK293T细胞过表达EWSR1-GFP融合蛋白，经NP40裂解液获取蛋白样品。将HHT母液进行梯度稀释（500 μM至15 nM），与含EWSR1-GFP或GFP的细胞裂解液混合后加至Monolith标准毛细管中。使用Monolith NT.115仪器进行检测（MST功率40%，LED/激发功率20%），通过MO. Affinity Analysis软件（Nano Temper Technologies）计算解离常数（KD值）。 细胞热转移实验（CETSA） 采用细胞裂解液CETSA方法研究HHT与EWSR1的直接相互作用。收集NB4细胞经NP40裂解液处理30分钟后，于4°C条件下12,000 × g离心10分钟，将上清液分为两份：实验组加入10 μM HHT，对照组加入等体积DMSO，均孵育2小时。随后将样品分装至反应管中，使用T100热循环仪进行热激处理（温度梯度37-78°C，持续3分钟），最后加入上样缓冲液，煮沸并进行免疫印迹分析。 药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验 收集细胞后用含1 mM PMSF的NP-40裂解液处理30分钟。将裂解液与TNC溶液（500 mM Tris-HCl，pH 8.0、100 mM CaCl₂、500 mM NaCl）混合，并分别与不同浓度HHT（0、0.1、0.2、0.4 μM）共孵育1小时。加入2 μg/mL链霉蛋白酶（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）于室温继续孵育20分钟，通过添加蛋白上样缓冲液，终止反应，98°C加热10分钟。最后使用EWSR1一抗体，通过蛋白质印迹分析样品。 质粒构建 人EWSR1蛋白的全长编码序列（氨基酸1-656）由上海捷瑞生物技术公司合成，并克隆至pCMV-HA载体。随后，通过同源重组法分别构建了EWSR1的截短体质粒，包括EWSR1-N（1-300）和EWSR1-C（301-656）。将上述序列进一步亚克隆至pEGFP-N1载体，获得EWSR1-EGFP、EWSR1-N-EGFP和EWSR1-C-EGFP融合表达质粒。为构建optoDroplet系统，将mCherry与Cry2WT序列插入pcDNA3.1载体，获得pcDNA3.1-mCherry-Cry2WT质粒。在此基础上，使用无缝克隆试剂盒将EWSR及其截短体编码序列分别插入线性化的pcDNA3.1-mCherry-Cry2WT载体，用于光诱导液滴实验。此外，将EWSR1-C（301-656）片段克隆至pGEX-4T-1载体，以获得N端GST标签的融合蛋白。所有构建体均经北京睿博兴科生物科技有限公司测序验证。 下拉实验 用不同HA标签的EWSR1质粒（包括全长HA-EWSR1、N端HA-EWSR1-N、C端HA-EWSR1-C，以及点突变体HA-EWSR1-M397A、T393A、P396A、I400A和Mut4）转染细胞。转染48小时后收集细胞，用含蛋白酶抑制剂PMSF的NP-40裂解液冰上裂解30分钟。随后，于4°C、12,000 rpm离心15分钟，收集上清液。将生物素标记的HHT与链霉亲和素磁珠预孵育2小时，再与细胞裂解液在4°C下共同孵育过夜。使用PBS充分洗涤磁珠以去除未结合组分，最后通过蛋白上样缓冲液洗脱结合蛋白，并进行蛋白质印迹分析。 双分子荧光互补(BiFC)分析 为进行BiFC分析，将EWSR1分别与mVenus荧光蛋白的N端片段（VN1-173）和C端片段（VC155-238）进行融合，并克隆至pcDNA3.1表达载体。当HEK293T细胞密度达到60%-80%时，采用线性聚乙烯亚胺法转染相应质粒。转染24小时后，用4%多聚甲醛固定细胞，Hoechst 33342（1 μg/mL）染色细胞核10分钟，PBS清洗后，使用蔡司LSM880激光共聚焦显微镜进行观察。 表面等离子共振(SPR)分析 采用Biacore T200系统研究HHT与EWSR1的分子相互作用。通过Sulfo-NHS/EDC化学偶联法激活CM5传感芯片，将重组人EWSR1蛋白用10 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）稀释后固定至芯片表面，并用乙醇胺封闭剩余活性位点。HHT样品用含5% DMSO的PBS-P缓冲液稀释，以20 μL/min的流速进样。结合数据采用稳态亲和模型进行分析，所有数据使用Biacore Evaluation Software（T200 Version 2.0）进行处理。 基因敲低 靶向EWSR1的siRNA（序列：5'-CGCCUAUGCAACUUCUUAUTT-3'）及阴性对照siRNA由苏州吉玛基因公司提供。用于稳定敲低的慢病毒shEWSR1载体及对照载体购自上海汉恒生物。为建立稳定敲低EWSR1的NB4细胞系，采用感染复数（MOI）为40的慢病毒颗粒进行转导。转导24小时后更换新鲜培养基，并加入5 μg/mL嘌呤霉素进行持续筛选，筛选周期为14天。 SILAC培养基制备与细胞培养条件 采用稳定同位素标记氨基酸细胞培养技术。将DMEM基础培养基分为两组：轻标培养基补充L-精氨酸（Arg0）和L-赖氨酸（Lys0），重标培养基补充¹³C₆¹⁵N₄-L-精氨酸（Arg10）和¹³C₆¹⁵N₂-L-赖氨酸（Lys8）。细胞在含10%透析胎牛血清及双抗的相应标记培养基中培养，于37°C、5% CO₂条件下连续传代至少6代，以确保同位素标记效率超过95%。 免疫共沉淀实验 在SILAC培养基中培养的HEK293T细胞经HA-EWSR1质粒转染后，使用40 nM HHT处理。细胞经含1 mM PMSF的NP-40裂解液处理30分钟后，离心收集上清液，并与HA标签磁珠于4°C共孵育4小时。PBS清洗后，通过质谱分析结合蛋白，并采用相应抗体进行蛋白质印迹验证。 重组蛋白的表达与纯化 将EWSR1-C的DNA序列克隆至pET-32a(+)载体的EcoR I和Xho I酶切位点，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。菌株在含50 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中于37°C培养至光密度值为0.8时，加入500 µM IPTG，于16°C诱导表达12小时。随后以9000 rpm离心10分钟收集菌体，经超声破碎后重悬于缓冲液A（20 mM Hepes、250 mM NaCl、10 mM咪唑，pH 7.5），再于4°C、8000 rpm离心40分钟收集上清。将上清液加载至Ni-NTA琼脂糖珠，用缓冲液B（20 mM Hepes、250 mM NaCl、50 mM咪唑，pH 7.5）冲洗后，以缓冲液C（20 mM Hepes、250 mM NaCl、250 mM咪唑，pH 7.5）洗脱目标蛋白。纯化蛋白经超滤离心管浓缩后，通过12% SDS-PAGE检测纯度，最后保存于-80°C的PBS缓冲液中。 氢氘交换质谱分析 将EWSR1-C蛋白与HHT溶液，在室温下预平衡30分钟，随后用D₂O缓冲液稀释20倍进行氢氘交换标记。在设定时间点使用淬灭缓冲液（100 mM磷酸盐、4 M盐酸胍、0.5 M TCEP，pH 2.0）终止反应。样品经Waters ENZYMATE BEH胃蛋白酶柱在线酶解后，通过VanGuard预柱，以2%乙腈、100 µL/min流速脱盐3分钟，最后在ACQUITY UPLC BEH C18分析柱上进行分离。通过比较标记样品与未标记对照的质荷比差异，计算相对氘代掺入量。 m6A斑点印迹分析 参照文献方法并进行优化。提取poly(A)+ mRNA，在RNA孵育缓冲液中于65°C变性5分钟，加入等体积预冷SSC缓冲液后，使用Bio-Dot点样仪将样品点至Amersham Hybond-N+膜，并进行紫外交联。经5%脱脂牛奶封闭后，与m6A抗体于4°C孵育过夜。采用ECL化学发光底物显影，通过Tanon 5200成像系统采集信号。最后使用亚甲蓝对膜进行复染，作为RNA上样量对照。 LC-MS/MS定量m6A水平 参照文献方法，通过HPLC-MS/MS检测m6A/A比值。使用MolPure®细胞/组织总RNA提取试剂盒（翌圣）提取总RNA，并通过Hieff NGS® mRNA分离试剂盒（翌圣）纯化mRNA。取约60 ng RNA加入1 U核酸酶P1于42°C消化2小时，再加入100 mM碳酸氢铵和1 U碱性磷酸酶（Sigma, P5931）于37°C继续孵育2小时。样品稀释5倍后，取20 μL进行HPLC-MS/ Mm6AS分析。采用核苷-碱基离子转换进行定量（腺苷A：268→136；m6A：282→150），通过纯化核苷标准品绘制标准曲线计算A和m6A浓度。 RNA稳定性实验 用5 μg/mL放线菌素D和40 nM HHT处理NB4细胞2、5或6小时后，使用MolPure®总RNA提取试剂盒（翌圣）分离总RNA。通过RT-qPCR在罗氏LightCycler® 96系统上定量mRNA相对水平。按文献[44]方法计算mRNA周转速率与半衰期：放线菌素D阻断转录后，mRNA水平下降反映其降解速度。降解速率常数（Kdecay）通过以下公式计算：ln(C/C0) = -Kdecayt 该公式通过mRNA在t时刻浓度（C）与初始浓度（C0）比值的自然对数，关联降解速率常数（Kdecay）与时间（t）。通过绘制ln(C/C0)与时间（t）的关系图并进行线性回归拟合，可求得Kdecay值。半衰期（t1/2）指mRNA浓度降至初始值一半所需时间，即C/C0=½，计算公式为：ln(1/2) = -Kdecayt1/2推导得：t1/2 = ln2/Kdecay  m6A甲基化RNA免疫共沉淀测序 m6AMeRIP-Seq实验与云序生物（上海）合作完成。提取总RNA后去除核糖体RNA以富集非核糖体RNA组分，随后使用RNA片段化试剂将RNA打断至约200核苷酸片段。为捕获甲基化RNA，使用m6A特异性抗体（GenSeq m6A MeRIP Kit, GenSeq）包被蛋白A/G磁珠，与片段化RNA在4°C共孵育4小时。清洗RNA/抗体复合物去除非特异性结合RNA后，洗脱并纯化富集的RNA。采用GenSeq低起始量全RNA建库试剂盒分别构建免疫沉淀样本与输入对照样本的文库，按制造商说明完成文库制备。测序前使用安捷伦2100生物分析仪进行文库质量评估。 TCGA数据库急性髓系白血病生物信息学分析 癌症基因组图谱（TCGA）是广泛用于癌症生物信息学分析的综合数据资源。GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn）是专用于分析TCGA临床数据的在线工具，可评估各类癌症中基因表达水平与患者生存期的关联。基于GEPIA数据库数据，我们深入分析了EWSR1在多种恶性肿瘤组织与正常组织中的表达谱，并通过GEPIA2平台对高/低表达基因开展生存分析。 白血病小鼠移植瘤模型 于第1天经尾静脉向8周龄免疫缺陷小鼠（NOD/SCID或NOG）注射1×10⁷个人白血病细胞（NOD/SCID鼠用NB4细胞，NOG鼠用Kasumi-1-luc细胞）。从第7天起，每日经尾静脉注射HHT（0.5 mg/kg，0.1 mL生理盐水溶液）。在NOD/SCID-NB4模型中，从第16天起至第28天，每3-4天经尾静脉采集外周血样本，使用红细胞裂解液（10 mM NaHCO₃、1.5 mM NH4Cl、1 mM EDTA-2Na）去除红细胞后，通过FITC标记抗人CD45抗体（BD Pharmigen, San Diego, CA）与PerCP-Cy5.5标记抗鼠CD45抗体（BD Pharmigen, San Diego, CA）进行双染色流式细胞术分析。在NOG-Kasumi-1-luc模型中，于注射D-荧光素（150 mg/kg）后第14、19、24、29、35、42和50天通过活体成像系统监测肿瘤进展，以总光子通量（photons/sec/cm²/sr）量化信号强度。全程观察小鼠生存期，并采用Log-rank检验进行数据分析。 荧光漂白后恢复实验 用PEI转染pEGFP-N1-EWSR1至HEK293T细胞并培养24小时。在配备60倍油镜和488 nm激光器的尼康A1R共聚焦显微镜上进行FRAP检测。选择液滴区域用80%激光功率漂白4秒后，以每秒1帧的频率采集图像。监测漂白区域内荧光强度随时间恢复的情况，通过强度测量计算恢复速率和可动组分比例。基于三次独立重复实验数据生成平均荧光恢复曲线。 单细胞RNA测序数据分析 从GEO数据库下载20例健康供者和19例AML患者骨髓样本的单细胞RNA测序数据（GSE120221与GSE241989）。为排除低质量细胞干扰，设定以下筛选标准：剔除唯一分子标识符（UMI）少于500的细胞、线粒体基因表达占比超过20%的细胞，并使用scDblFinder软件（v1.16.0）排除双细胞。采用Seurat v4（v4.4.0）对过滤后数据进行处理，并通过Harmony（v1.2.0）校正批次效应。使用NormalizeData函数进行标准化后，选取变异度最高的4000个基因进行主成分分析（PCA）。基于前25个主成分，通过均匀流形近似与投影（UMAP）进行降维，并采用共享最近邻模块化优化算法（分辨率0.8）进行细胞聚类。根据骨髓分化标志物表达对细胞亚群进行注释：造血干细胞（CD34, AVP）、肥大细胞（TPSAB1, TPSB2）、单核细胞（CD14/CD16）、树突状细胞（CD1C）、T细胞（CD3D）、红系细胞（HBD）。 蛋白质组学数据统计分析 通过严格统计流程分析蛋白质组学数据以确保差异表达蛋白的可靠鉴定。对原始强度值进行对数转换、分位数标准化，并采用基于检测限假设的K最近邻算法填补缺失值。通过线性回归模型和经验贝叶斯调节（limma算法）评估差异表达，同时校正批次效应和生物学重复。将错误发现率（FDR）<0.05且|log₂FC|>1.5的蛋白质定义为显著差异蛋白。使用经过FDR校正的超几何检验进行GO和KEGG功能富集分析。通过构建相关性网络（|r|>0.8, p<0.01）和层次聚类识别共调控蛋白模块。所有分析均在R语言（v4.3.0）环境下按照严格质控标准完成。 相关性分析的统计方法 本研究采用系列统计方法评估变量间关联性，其中皮尔逊相关系数（r）作为量化线性关系的核心指标。该系数用于衡量两个连续变量间线性关联的强度与方向，计算公式如下： 其中 Xi 与Yi 代表变量观测值，X̄与Ȳ表示样本均值，n为样本量。系数取值范围为[-1, 1]，判定标准为：|r|≥0.8 提示强线性相关，|r|≤0.3 提示弱线性相关，接近0则表示无线性关联。 数据量化与统计分析 采用单因素方差分析（ANOVA）结合Dunnett多重比较检验，或Student’s t检验进行组间比较。单细胞测序数据与TCGA数据分析使用非参数Wilcoxon秩和检验。实验重复次数详见各图注与方法部分。数据以均值±标准差（SD）表示，显著性阈值设定为p < 0.05。 代码和数据可用性： 本研究使用的公共数据源自TCGA与GEO数据库，其余数据集获取自已发表文献（详见方法学部分）。所有测序数据已保藏于GSA-Human基因组序列归档系统（提交号HRA013431，https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/s/whx72O0s）。分析所用的全部数据与材料均包含于正文及补充材料中，相关数据与代码脚本详见GitHub（https://github.com/ZKW246/ZKWiMeta）。补充材料（附图、附表及图文摘要）可通过在线DOI或iMeta Science官网（http://www.imeta.science/）获取。 引文格式： Ting-Ting Liu, Li-Ting Chen, Xu-Ying Pei, Shao-Nan Hu, Fang-Fang Zhuo, Ze-Kun Chen, Yang Liu, et al. 2025. “Homoharringtonine suppresses acute myeloid leukemia progression by orchestrating EWSR1 phase separation in an m6A-YTHDF2-dependent mechanism.”iMeta 4: e70089.  https://doi.org/10.1002/imt2.70089 作者简介 刘婷婷（第一作者） ● 内蒙古大学生物医学研究院研究员，博士生导师。 ● 研究方向为中蒙药药效成分作用靶点鉴定与机制研究，以第一作者在iMeta、eBioMedicine、Pharmacology & Therapeutics、Acta Pharmaceutica Sinica B等期刊发表SCI论文5篇。主持国家级、省部级等基金3项。 陈丽婷（第一作者） ● 北京大学基础医学院在读博士研究生。 ● 研究方向为肿瘤基因组学，单细胞生物信息。以第一作者在iMeta期刊发表SCI论文1篇。 裴旭颖（第一作者） ● 北京大学人民医院血液科副研究员、主治医师、硕士生导师，北京大学血液病研究所所长助理。 ● 移植后免疫重建与病毒感染；细胞免疫治疗。以第一/通讯作者在iMeta、Clin Infec Dis、Cell Mol Immunol、Am J Hematol、Harmatologica等杂志上发表SCI论文。获得北京市科技新星、中华医学科技奖青年科学技术奖、北京榜样青年榜样、北京大学优秀青年医师等奖励，主持国家级、省部级等基金6项。 胡少男（第一作者） ● 内蒙古医科大学药学院讲师，硕士生导师。 ● 研究方向为中蒙药脑血管疾病，以第一作者在iMeta、Phytotherapy Research、Molecules等期刊发表SCI论文3篇。 曾克武（通讯作者） ● 北京大学博雅特聘教授，博士生导师，国家杰出青年科学基金获得者。 ● 主要研究方向为中药化学生物学，聚焦于中药小分子与疾病靶蛋白的相互作用机制研究，综合运用化学生物学、分子药理学及结构生物学等多学科交叉技术，揭示中药活性成分的直接作用靶点与分子机制。研究成果获教育部、中国医促会、中国中西医结合学会科学技术奖，入选2017年度中国十大医学进展、2022年度中医药十大学术进展及2024/2025年度国际中医药与传统医药高影响力研究。以第一或通讯作者在PNAS、STTT、Science Advances、Advanced Science、ACS Nano、Acta Pharmaceutica Sinica B、iMeta等国际学术期刊发表SCI论文130余篇，授权专利10余项。 薛瑞栋（通讯作者） ● 北京大学研究员，助理教授，博导，国家科技重大专项青年首席，国家优青，北京市科技新星，北大博雅青年学者。任职于北京大学-云南白药国际医学研究中心、药学院化学生物学系、国际癌症研究院及北京大学第一医院。 ● 研究方向为利用前沿的基因组学和多组学技术来揭示肿瘤发生发展的分子机制。主持卫健委四大慢病国家科技重大专项、多项国家自然科学基金及北京市重点专项。获中国抗癌协会科技奖一等奖、北大医学青年科技奖等。以第一/通讯作者在Nature (x2)、Cancer Cell (x2)、Gastroenterology (x2)、J Exp Med、iMeta等知名期刊发表论文17篇。获Faculty Opinions推荐，入选 “中国生物信息学十大进展”和“细胞出版社中国年度论文”。  赵翔宇（通讯作者） ● 北京大学人民医院副院长，研究员，博士生导师。 ● 主要研究方向为造血干细胞移植后免疫重建机制研究及白血病相关细胞治疗，获国家科技进步二等奖2次、华夏青年医学科技奖、中华医学青年科技奖、第32届北京青年五四奖章等多项奖励。以第一或通讯作者在CMI、JHO、Leukemia、CID、Cell Reports、STTT、iMeta等期刊发表 SCI论文60余篇；授权发明专利10项，转化1项。兼任中国研究型医院学会第二届细胞研究与治疗专业委员主任委员、北京医学会血液学分会副主任委员、中华医学会血液学分会青年学组副组长等。 屠鹏飞（通讯作者） ● 北京大学药学院教授，博士生导师，国家杰出青年基金获得者、岐黄学者。 ● 主要研究方向中药药效物质与创新药物发现、中药化学生物学、中药资源与质量控制等。承担国家重点研发计划、国家自然科学基金重点项目等国家项目70余项。成功创制有效部位新药2项，获得新药证书4个，临床批件8个。以通讯作者在Nat Commun、PNAS、iMeta等国际知名期刊发表论文370余篇。以第一完成人获得国家科技进步奖二等奖1项，教育部等部级一等奖5项。并获2016年“全国脱贫攻坚奖”、“最美生态公益人物”，2017年度“全国创新争先奖状”、“吴阶平医药创新奖”，第十六届中国药学发展奖创新药物特别贡献奖，第三批“全国高校黄大年式教师团队”带头人。 更多推荐 （▼ 点击跳转） 高引文章 ▸▸▸▸ iMeta | 引用20000+，海普洛斯陈实富发布新版fastp，更快更好地处理FASTQ数据 高引文章 ▸▸▸▸ iMeta | 兰大张东组：使用PhyloSuite进行分子系统发育及系统发育树的统计分析 高引文章▸▸▸▸ iMeta | 唐海宝/张兴坦-用于比较基因组学分析的多功能分析套件JCVI iMeta封面 1卷1期 1卷2期 1卷3期 1卷4期 2卷1期 2卷2期 2卷3期 2卷4期 3卷1期 3卷2期 3卷3期 3卷4期 3卷5期 3卷6期 4卷1期 4卷2期 4卷3期 4卷4期 4卷5期 iMetaOmics封面 1卷1期 1卷2期 2卷1期 2卷2期 2卷3期 iMetaMed封面 1卷1期 1卷2期 期刊简介 “iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2025年6月影响因子33.2，中科院分区生物学1区Top，位列全球SCI期刊前千分之三(65/22249)，微生物学科2/163，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆5/585！ “iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，目标是成为影响因子大于10的高水平综合期刊，欢迎投稿！ "iMetaMed"  是“iMeta” 子刊，专注于医学、健康和生物技术领域，目标是成为影响因子大于15的医学综合类期刊，欢迎投稿！ iMeta主页： http://www.imeta.science 姊妹刊iMetaOmics主页： http://www.imeta.science/imetaomics/ 出版社iMeta主页： https://onlinelibrary.wiley.com/journal/2770596x 出版社iMetaOmics主页： https://onlinelibrary.wiley.com/journal/29969514 出版社iMetaMed主页： https://onlinelibrary.wiley.com/journal/3066988x iMeta投稿： https://wiley.atyponrex.com/journal/IMT2 iMetaOmics投稿： https://wiley.atyponrex.com/journal/IMO2 iMetaMed投稿： https://wiley.atyponrex.com/submission/dashboard?siteName=IMM3 邮箱： office@imeta.science