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文
目
录
1、孙敏捷教授:质量源于设计与高端制剂的开发和质量控制
2、使用质量源于设计方法表征单克隆抗体细胞培养生产过程
3、重组蛋白的生产和纯化:一次性系统、连续工艺以及质量源于设计
一、孙敏捷教授:质量源于设计与高端制剂的开发和质量控制
（原创 药学进展 药学进展）
[ 摘要 ] 质量源于设计（QbD）是基于科学和质量风险管理原则的方法，在药物设计和制造中发挥重要作用。随着制剂技术的革新，药物制剂向复杂、高效、个性化的方向发展。在高端制剂 / 药物递送系统的开发中，由于制剂复杂多变、研究人员经验有限，QbD 的实施仍会遇到许多挑战。结合案例重点介绍了 QbD 的主要元素、实施步骤及辅助工具，旨在强化对 QbD 流程和工具的理解；举例介绍了 QbD 在缓控释制剂、纳米制剂和生物技术产品开发及分析方法开发中的应用和优势。QbD 方法同样有助于高端制剂的开发，并最终给制造商、监管机构和患者带来更大的利益。
质量源于设计（quality by design，QbD）理念在21 世纪初由美国食品和药品管理局（FDA）引入制药行业 [1]。随后，人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）出台了药物开发（Q8）[2]、质量风险管理（Q9）[3]和药物质量体系（Q10）[4] 等相关指南，详细阐述了QbD 理念。作为一种系统的药物开发方法，QbD 以预定义的产品目标为起点，以科学和质量风险管理为基础，强调对产品和过程的理解及过程控制 [2]。QbD 对于制药行业来说是一个机遇，为药品带来价值，为制药行业、监管部门和患者带来利益 [5]。
尽管 QbD 的理念和优势已被广泛接受，但其在制药行业中的应用尚未被完全开发。受资金、时间和经验的限制，制药行业对 QbD 方法的实施和基础知识的掌握仍有欠缺 [5-7]。Grangeia 等 [5] 的调查研究显示，QbD 方法主要应用于常规剂型，如速释片。然而对于高端制剂或药物递送系统开发，对其工艺如何影响产品质量的理解还不足，产品开发阶段相当复杂，需要大量的知识积累且耗费时间 [8]。QbD将是一种有效的策略，增强对处方和工艺的理解，优化复杂给药系统。因此本文结合 QbD 方法实施案例，展开介绍了 QbD 的主要元素、实施步骤及辅助工具；以缓控释制剂、纳米制剂、生物技术产品为主，介绍了 QbD 在高端制剂开发中的应用及优势，以期为国内制药行业更好地实施 QbD 提供思路；此外，分析方法作为药品研发中质量控制的手段，其 QbD 方法的实施也将加以介绍。
1
质量源于设计的执行步骤与工具
QbD 的执行步骤如图 1 所示。
1.1 目标产品质量概况和关键质量属性
明确目标药品的质量概况是实施 QbD 的第一步。ICH Q8 将 目 标 产 品 质 量 概 况（quality target product profile，QTPP）定义为“从理论上达到对药品质量特性的前瞻性总结，确保预期的质量，同时兼顾药品的安全性和有效性 [2]”。FDA 发布了简 略 新 药 申 请（abbreviated new drug application，ANDA）的 QbD：分别选取缓释制剂 [10] 和速释制剂 [11] 的实例，介绍了开发早期由原研药品的特点、说明书、质量标准及临床给药特点等方面总结QTPP 的方法。同样的，在开发高端药物制剂过程中，QTPP 可以从剂型、规格、给药途径、药动学、稳定性等方面入手 [10]。以上这些质量要求被称为质量属性（quality attributes，QAs），其中受制剂处方或生产工艺的变动而受到影响的关键质量属性（critical quality attributes，CQAs）是药物开发过程的研究重点 [12]。
Sipos 等 [13] 开发了一种无增黏剂和防腐剂的美洛昔康（meloxicam）鼻腔给药聚合物胶束冻干粉针，其再分散性好，2 s 内复溶为液体产品，作为滴鼻剂或喷雾剂可随时使用。该产品 QTTP 被定义为基于 Soluplus®（聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物）的含美洛昔康的聚合物胶束，具有合适的粒径及分布、最佳的物理化学特性、适当的溶解性和渗透性，以便通过鼻内给药到达中枢神经系统，作为一种非甾体抗炎药用于成人患有神经退行性疾病的治疗。风险评估将可能影响最终产品的潜在因素分为材料特性、生产方法、产品特性和治疗期望。产品的 CQAs 为平均粒径、多分散性、zeta 电位、溶出时间、包封率、溶解性和渗透性、稳定性、毒性 / 刺激性，对聚合物胶束的质量和疗效影响大，由此进行控制，指导产品和工艺开发，以确保所需的产品质量。
1.2 风险评估
在建立了期望产品的 QTPP 和 CQAs 后，需要对处方变量和工艺参数进行风险评估，确定关键物料属性（critical material attributes，CMAs）和关键工艺参数（critical process parameters，CPPs）。风险评估是实施 QbD 的重要工具，也是质量风险管理过程的第一步，这一过程包括识别、分析和评估，用于识别风险发生的可能性及其后果和严重程度[3]。常见的风险评估工具包括：石川图 / 鱼骨图、失效模式及后果分析（failure mode and effects analysis，FMEA）、故障树形图分析、危害分析和关键控制点、风险排序和过滤等 [3]。其中，以 FMEA[14-15] 和石川图 [16-17] 最为常用。
QbD 的开展需要进行充分的风险评估，包括CQAs 确定前、风险控制和风险控制完成后 [9]。Mohammed 等 [9] 演示了 QbD 方法的实施流程（见图1），过程中使用了3次FMEA，在实验设计（design of experiments，DoE）完成后进行风险评估确定风险是否降低。如果风险没有降低，那就说明可能使用了错误的 CPPs 或 CMAs，应查明这些风险因素的可能性和潜在严重性以及由此产生的失效模式，从而减轻风险因素。
1.3 实验设计、设计空间和控制策略
DoE 是 QbD 常用工具，用于确定影响过程的输入因素（如 CMAs、CPPs）和该过程的输出（即CQAs）之间的关系，最终确定最佳工艺条件和设计空间 [18]。DoE 一般包括筛选和优化设计。PlackettBurman 设计是常用的筛选设计，仅用于筛选关键因素 [19]。响应面法是一种广泛使用的优化方法，包括中心复合设计 [20]、Box-Behnken 设计 [17] 等，运用数学模型和统计分析方法，考察各变量或变量之间的交互作用对关键质量属性的影响，从而获得最优条件。在药品的整个生命周期中，DoE 对产品设计的选择、稳健的商业生产流程、设计空间和总体控制策略均至关重要 [21]。
合理的 DoE 将有效减少实验次数，降低研究成本并确保结果可靠。Prentice 等 [22] 在单抗纯化过程中，基于 QbD 方法，先后运用全因子实验设计和部分因子实验设计（包括 2 个中心点），依次评估了使用辛酸钠进行宿主细胞蛋白还原沉淀的 7 个工艺参数对产品质量（沉淀产物和产品中的宿主细胞蛋白杂质、单体纯度、电荷变化）和工艺性能（步进收率和过滤性能）的影响。相比于单一多变量全因子实验设计，本研究的两步 DoE，在不影响工艺理解的情况下，将实验总数由 128 个减少到 32 个。通过工艺建模和模型拟合分析最终获得设计空间和控制策略：沉淀步骤中辛酸钠浓度≤ 1%（m/v）、pH 5.0 ~ 6.0 可实现产品的宿主细胞蛋白含量小于0.01%、沉淀步骤产率≥ 90% 的预期目标。沉淀步骤 pH 5.0 ~ 5.3 则可实现产品的宿主细胞蛋白含量小于 0.007%。
设计空间内的处方、工艺可最大限度地实现产品所需的 CQAs。Hales 等 [20] 通过 QbD 开发了用于结肠靶向的负载姜黄素聚合物微粒（Col-CUR-MPs）口服给药系统。通过中心复合设计确定输入变量 [pH依赖性肠溶性聚合物 Eudragit® FS 比例、姜黄素浓度和聚合物混合物（Eudragit® FS-聚己内酯）浓度 ]和响应（粒径和粒径分布、载药量和包封率、收率、体外释放）之间的函数关系。实验设计的有效性和回归模型对实验数据的拟合度通过拟合优度（R2）、预测精度和方差分析来验证。设计空间被描述为二维等高线图。在设计空间内、外各选择了一个配方制备 Col-CUR-MPs，结果显示，设计空间内的配方所制备的产品，其 CQAs 均达到期望，而设计空间外的配方，除粒径分布外，所有实验结果均在期望范围之外。Kim 等 [23] 运用 QbD 将替米沙坦和氨氯地平双层片开发成单层片（TA），随着 DoE 模型的开发和验证，最终通过多维组合 CMAs 和 CPPs 对每个响应的单独接受区域得到最佳设计空间。在设计空间内制备的 TA 与双层市售产品 Twynstar® 具生物等效性，但 TA 尺寸减少了 50%，且无需再使用双层压片机，简化了工艺，实现了比传统双层片（90% ~95%）更高的单层片产品产量（95%~100%）。综上，实施 QbD 的目的不仅限于得到某一最佳处方或工艺最优解，关键在于建立一种可以在一定范围内调节偏差以保证产品质量的处方和工艺，即设计空间。在对产品和工艺的理解上，建立控制策略，确保生产的产品在设计空间设定的质量标准之内，并进行持续监控和改进，保证产品在生命周期内质量一致。
1.4 过程分析技术
过程分析技术（process analytical technology，PAT）也是 QbD 开发中一个重要工具。常用的过程分析仪有拉曼光谱、近红外光谱、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱和紫外/可见光谱等 [24-25]。PAT 通过对药物制造和生物加工过程进行实时近线、在线或线内测量，快速、无损地提供化学和物理性质信息，必要时有可能对参数立即进行调整，以纠正错误，增强对过程的控制 [26-27]。
Gavan 等 [28] 采用微近红外光谱技术，结合 DoE和多元数据分析，对含 2 种活性药物成分产品的流化床造粒过程的关键造粒参数——颗粒水分含量进行线内监测。该研究根据配方的特殊性对工艺参数进行精确控制，实现了产品在设计空间内的维护，消除了材料相关的变异性，并提供了一个用户友好的过程控制策略。Won 等 [29] 在运用 QbD 方法开发由缓释层中的高剂量盐酸二甲双胍（metformin）和速释层中的低剂量酒石酸艾格列汀（evogliptin tartrate）组成的双层片剂过程中，采用近线透射拉曼光谱，实时测量双层片中小剂量药物的含量均匀性。该研究基于 QbD 和 PAT 解决了 2 种药物剂量差异较大的情况下，对 CQA（如药物含量均匀度）的负面影响。
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基于质量源于设计的缓控释制剂开发
FDA 发布的 ANDA 中缓释制剂的实例 [10]，设计为速释颗粒、延迟释放包衣微丸和外加缓冲剂及其他辅料一起压制的刻痕片，为缓释口服固体制剂研发中实施 QbD 提供了经验和知识。Kanwal等 [30] 通过合理使用 QbD 方法和工具，成功开发了苯磺酸氨氯地平（amlodipine besylate）和辛伐他汀（simvastatin）差速释放固定剂量复方片，Eudragit® RSPO-磷酸二钙共混物是控制药物释放的关键，实现片剂中 2 种药物的差异释放。Patel 等 [31]运用 QbD 方法制备供儿童患者使用的头孢泊肟酯（cefpodoxime proxetil）双释微丸型干混悬剂。该过程构建鱼骨图确定 CQAs，再用 FMEA 定量评估速释微丸和缓释微丸的初始风险变量的风险优先级数。预实验确定 HPMC K100M 浓度和 Eudragit® RSPO浓度是影响药物释放的关键。HPMC K100M 浓度和Eudragit® RSPO 的浓度被选为 32 全因子实验中的自变量，Q2（2 h 药物累积释放量）、Q10（10 h 药物累积释放量）、t50（药物释放 50% 所需时间）和t90（药物释放 90% 所需时间）为因变量，通过响应面分析确定设计空间，并制定双释微丸的控制策略：滚圆速度（1 200 r·min-1）、滚圆时间（15 min）、挤出速度（55 r· min-1）、挤出时间（10 min）、混合时间（5 min）、干燥时间（10 ~ 15 min）和黏合剂浓度（1%~3%）。
Shinde 等 [17] 采用 QbD 法开发了聚乙二醇包衣的琥珀酸美托洛尔（metoprolol succinate）微丸型缓释片。该研究以微丸片的含量、释放度和硬度作为 CQAs；通过石川图和 FMEA 分别定性、定量评估影响药品质量的潜在风险参数；采用 PlackettBurman 设计（七因素两水平）筛选显著因素，选择羟丙甲纤维素、乙基纤维素、固化时间进行 BoxBehnken 设计优化变量范围。该羟丙甲纤维素微丸型缓释片的开发通过最少的实验来实现所需的药物释放特性，从而减少开发时间、成本和劳动力，最终配方和工艺在设计空间内能保证产品质量。
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基于质量源于设计的纳米制剂开发
制药行业普遍重视开发纳米药物产品以提高药物的治疗性能，拓展临床应用 [32]。然而也由于纳米药物设计复杂、结构不稳定和在纳米尺度上的制药特性使得纳米工程药物的质量和安全性更难控制，限制了其工业生产和临床应用 [32]。因此有必要以一种更可控和更一致的方式开发纳米药物。QbD 及产品 CQAs 的识别和规范对于药物纳米材料的设计、开发和生产至关重要 [33]。
广泛定义的 CQAs 一般包括纳米材料的形态、尺寸、多分散性、表面电荷、载药量、药物包封率、体外药物释放曲线、药代动力学性能、药物稳定性等 [32-36]。以脂质体为例，Németh 等 [35] 基于 QbD通过薄膜水合法制备了不含活性药物成分的脂质体制剂“中间体”，QTPP 为球形、大的单层囊泡。QbD 提供了一个实用的决策系统，该系统能够根据未来需要的预定目标，即活性成分、剂型和给药途径的要求，改变脂质体性质，快速得到质量稳定的目标产品。Lu 等 [36] 将 QbD 方法用于含有亲水活性药物成分的脂质体产品的制备。该研究选用局麻药布比卡因（bupivacaine）作为模型化合物，定义并评估了多囊脂质体药物产品的 3 个 CQAs：粒径、形态和药物包封率，使用风险评估来监控显著影响包封率和粒径的处方和工艺过程，证明了 QbD 用于多囊脂质体系统的可行性和优势。
Rapalli 等 [15] 基于 QbD 方法开发含有低表面活性剂浓度的酮康唑（ketoconazole）纳米立方液晶的外用水凝胶。该纳米立方液晶由弯曲的双连续的三维脂质双分子层和 2 个互穿但不接触的水相纳米通道组成，立方体中间相的分隔作用可用于引入亲水、亲脂和两亲性的客体药物 [37]。基于 QbD 方法开发的纳米立方液晶比前人的方法 [38] 具有更高的经济效益和更低的表面活性剂含量，实现了配方的优化，且在批量扩大研究中成功应用。
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基于质量源于设计的生物技术产品开发
据 Ter Horst 等 [6] 统计，2014—2019 年通过欧盟全面申请提交并使用 QbD 开发的大多数医药产品是小分子产品，而生物技术产品只占少数。生物技术产品及其制造过程复杂，产品质量依赖于生产工艺的稳定性和耐受性以及全过程控制，因此，对生物技术产品实施 QbD 仍然是一项挑战 [39]。生物技术产品 CQAs 可分为以下类别：与产品相关的变体和杂质、宿主细胞杂质、设施相关的属性，以及与确定生物疗法的特性和效力相关的属性 [14]。
糖基化是许多抗体产品的 CQA，抗体糖基化修饰决定了抗体产品的特性和效力 [40]。Agarabi 等 [41]在细胞培养中实施 QbD，以稳定的高质量抗体产量为目标，利用 Plackett-Burman 设计筛选出影响单克隆抗体糖基化谱的关键因素为培养温度和非必需氨基酸的补充，展示了一个能预测性改变单克隆抗体聚糖结构的单克隆抗体平行生物反应器培养模型。这项研究可用于指导未来的实验工作，筛选细胞培养参数，在产品产量和关键生化质量属性的一致性之间更好地取得平衡。
Rathore[14] 介绍了 QbD 在一个生物类似药——粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，GCSF）的纯化过程中的应用。该研究主要围绕受下游工艺步骤影响的 CQAs：与产品相关的变体和杂质，如氧化、还原、聚集和甲酰甲硫氨酸化。运用 DoE 筛选和优化了蛋白质折叠步骤、pH 调节步骤和单一色谱步骤（基于 PAT 的混合模式色谱），为色谱步骤开发创建高通量过程开发平台，最终产品回收率可达 90.0%，纯度水平大于 99.0%。对比GCSF 商业工艺，基于 QbD 的工艺不仅使工艺产量提高了近 3 倍，而且使工艺时间缩短至原来的 1/3，从而使工艺的总体生产率提高了近 10 倍。
综上，在生物技术产品的上、下游工艺中使用QbD 方法，围绕产品 CQAs，展开实验设计和数据统计分析，获得了稳健的设计空间。虽然有些步骤仍难以实现放大生产，但是增强了研究者对生物加工过程和产品的理解，并为 QbD 导向的生物技术产品开发提供了先验知识。
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基于质量源于设计的分析方法开发
在药品研发和评价过程中，使用 QbD 和生命周期管理原则进行分析方法开发，能确保在整个生命周期内获得可靠、准确和一致的性能方法，并确保原料药和制剂的安全性和质量 [42]。基于 QbD 的分析方法开发（analytical quality by design，AQbD）方法实施步骤如图 2 所示 [43]，工具与 QbD 类似。
AQbD 方法被广泛用于色谱方法开发。Tol 等 [44]运用 AQbD 方法，成功开发了一种高效液相色谱（HPLC）方法，同时测定阿巴卡韦（abacavir）、拉米夫定（lamivudine）和多替拉韦（dolutegravir）组合的抗逆转录病毒制剂中的有关物质。该复方制剂中存在近 30 个峰，包括 3 种原料药、11 种已知杂质和其他辅料，其相关物质的分析非常具有挑战性。最 初 采 用 一 次 一 因 素（one-factor-at-a-time，OFAT）方法来开发，结果需要用 2 种不同的 HPLC法测定有关物质。因此建立了 AQbD 方法：分析目标是分离所有的临界峰并达到足够的选择性。在 OFAT 实验基础上确定拉米夫定羧酸杂质的保留时间和 2 个阿巴卡韦杂质之间的分离度是最重要的 2 个 关 键 方 法 属 性（critical method attributes，CMA）。选择柱温、流动相 B 组成、缓冲液 pH 为关键因素，通过中心复合设计和实验结果的方差分析，发现缓冲液 pH 是对 2 个 CMA 影响最大的因素。由于 2 个 CMA 的最优 pH 区域不同，因此建立并验证了 2 个设计空间，每次忽略 2 个 CMA 中的一个。引入三元梯度程序解决了 pH 敏感问题。进行了蒙特卡罗模拟，在设计空间内识别出具有低故障风险和高质量保证的正常工作范围，建立了确定稳健色谱分离区域的方法可操作区域（method operable design region，MODR）。与2种单独的分析方法相比，该方法减少了约 50% 的分析时间、资源和溶剂消耗，给制剂分析带来更多的便利和更高的成本效益。
Nompari 等 [45] 首次应用 AQbD 方法建立了一种快速、灵敏的超高效液相色谱法测定疫苗上清中乙型脑膜炎抗原，用于乙型脑膜炎疫苗（Bexsero）的常规分析。Iliou 等 [46] 基于 AQbD 开发液相色谱-质谱联用方法，最短的分析时间内完成雷贝拉唑原料药中 2 种潜在基因毒性杂质的定量分析。AQbD 方法在超高效液相色谱-质谱联用[47]、气相色谱-质谱联用[48]、超临界流体色谱[49]中也有应用，用于鉴定、含量测定、稳定性研究、含量均匀度和杂质研究。在分析方法中运用 QbD，从整体的角度来考虑方法的稳健性以及过程和产品的可变性，可实现产品质量控制的方法稳健性和在生命周期中的调节灵活性。
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胡雪丹，李菁，孙敏捷 *（中国药科大学药剂学教研室，江苏 南京 210009）
二、使用质量源于设计方法表征单克隆抗体细胞培养生产过程
（工艺小白 工艺小白）
摘要
细胞培养制造中质量源于设计 (QbD) 的目标是开发制造工艺，提供具有一致关键质量属性 (CQA) 的产品。 QbD 方法可以通过使用过程参数风险排序和实验统计设计 (DOE) 更好地理解过程。 QbD 流程首先分析 CQA 和关键绩效指标 (KPI) 方面的流程参数风险。 DOE 的初始研究筛选对 CQA 具有重大影响的因素，并描述过程 KPI 的响应特征。在此提供的案例研究中，使用缩小模型的多因素过程表征研究导致通过离子交换色谱 (IEC) 测量的单克隆抗体 (MAb) 的电荷异质性发生显着变化。 DOE 迭代研究使用筛选和响应面设计来缩小操作参数范围，以便将电荷异质性控制在可接受的水平。
简介
在生物制药行业中，在生产治疗性重组蛋白的细胞培养过程的过程表征和验证中使用质量源于设计 (QbD) 概念正在不断发展。QbD 涉及进行基于科学的风险分析，进而定义统计设计的研究，用于了解工艺参数的变化如何影响产品质量 。之前已使用基于实验设计 (DOE) 的策略来验证产生单克隆抗体 (MAb) 的细胞培养过程 ，并且已针对集成生物过程的各个方面发表了 QbD 方法 。分析方法的进步以及对产品质量属性和工艺相关杂质的日益严格的审查使得 DOE 在工艺验证过程中的使用变得越来越重要，因为需要将质量融入工艺而不是依赖质量通过测试 。基于 DOE 的方法可以更深入地了解当给定单元操作的多个工艺操作参数同时变化时，产品质量属性和工艺相关杂质如何变化，从而增加关于培养步骤或稳健性的工艺知识。
在这项工作中，使用 QbD 方法来表征中国仓鼠卵巢 (CHO) MAb 工艺的接种和生产培养步骤。在评估了操作参数对关键质量属性 (CQA) 和关键绩效指标 (KPI) 的风险后，设计并执行了初步的多变量研究。对 CQA 的因素影响进行了统计建模，并设计了后续研究，以进一步了解和控制变化最大的 CQA 的参数影响（酸性 MAb 种类，即酸性变体）。通过离子交换色谱 (IEC) 定量的产品酸性变体水平可以替代多种 CQA（例如脱酰胺和糖化）。最后，对每个步骤分别测试模型预测的最坏情况条件，并组合测试，以确定每个测试操作参数的多元操作范围 (MAR)。结果表明，即使工艺参数在其建议的 MAR 边缘运行，酸性变体也可以控制在可接受的水平。MAR 和经过验证的可接受范围或 PAR（如行业指导文件中所定义）以及源自单变量研究的组合，最终得出过程的设计空间描述。
结果
随着操作参数范围的缩小，以及从研究设计中删除延长的 N-1 培养时间，酸性变异反应得到改善（即降低；图 1）。图 1 图 A 和 B 中显示了每种情况下的各个酸性变体反应以及工艺参数值。在目标工艺条件下执行的对照案例导致酸性变体水平为 28-31%（图 1，图 A 和 B 箭头））。在最初的研究中，酸性变异水平高达 41%（图 1，A 图）。与目标工艺相比，低种子密度的情况会导致高酸性变异。当中等浓度时，较低的种子密度和培养温度水平缩小，以及消除延长的培养时间，低种子情况下的酸性变异水平相对于最初的研究急剧下降（图1，B图）。窄范围研究中酸性变异体的最高水平为 32%，该值非常接近控制过程范围。
表 2 描述了初始宽范围 N 研究主效应模型，包括针对测试的每个操作参数的参数估计值和方差分析的 p 值。在最初的 N 研究中，酸性变异反应上升高达 44%。在相同运行持续时间内收获的对照生产培养物的酸性变异水平为 29-32%，这对于延长培养持续时间的过程来说是正常的。表 2 中的参数估计显示了当参数水平从中点变化到高或低设置时操作参数对酸性变体水平的预测影响。例如，当初始培养温度从 37°C 变为 38°C 时，酸性变体预计会增加 1.9%。本研究的主效应模型的标准误差为0.73%。在最初的 N 研究中，三个操作参数的估计值均为 p＜0.10。这些参数是培养物 pH、温度和温度变化时间（表 2）。在三因素中心组合设计中进一步研究了这三个因素；这种类型的实验设计包括所有三个因素的全因子案例和轴向（或单变量）案例。在本研究中，温度和温度转换时间设计的阶乘部分的测试范围被缩小，而出于制造能力的考虑，初始 pH 值在与初始生产研究相同的范围下进行测试。图 2 显示了酸性变体的预测响应，源自 3 因子中心复合研究，pH 和温度在测试的阶乘（多变量）和轴向（单变量）范围内变化。与 pH 值和温度相比，本研究中的温度变化时间对酸性变体的影响要小得多。
对于 N-1 和 N 培物，每个操作参数的酸性变异水平的最坏情况，是根据图1和2中描述的数据预测的。1 和 2 以及表 2。研究了三种最坏情况：[1] 最坏情况 N-1 设置，包括延长 N-1 培养持续时间，然后是目标 N；[2] 延长 N 培养持续时间的最坏情况 N，源自目标 N-1 培养；[3] 最坏情况 N-1 和最坏情况 N 的组合，两者都延长了培养时间。根据先前研究的统计模型，酸性变异水平预计将高于窄范围研究中的水平，但低于最初大范围研究中观察到的水平。表 3 表明这一预期得到了满足。
讨论
这项工作表明，QbD方法可以成功地用于表征CHO细胞培养MAb生产过程。所使用的方法在概念上类似于目前关于QbD的指导。一般来说，该策略是通过使用迭代多元（DOE）和有针对性的单变量实验来识别CPP并定义过程参数的操作范围。
然后应用统计建模，并测试预测的最坏情况，以确认模型的代表性。基于QbD的整个制造过程验证实验应包括上游和下游单元操作的联系。将单元操作联系起来的实验结果有助于严格建立一个提供可接受CQA水平的整体工艺设计空间。QbD和连锁研究的方式正在演变。
在目标加工条件下，用于这项工作的细胞培养过程通常会产生27-31%的酸性变体水平。在最初宽范围内操作培养参数的多变量研究表明，酸性变体水平可能高达44%。迭代DOE的使用使我们能够专注于驱动酸性变体反应的关键参数。缩小工艺参数范围将酸性变体降低到可接受的水平。
尽管这项工作仅关注酸性变体，但由于其水平在测试的操作条件下发生了很大变化，因此从同一工作中评估了其他几个CQA，如影响互补依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞细胞毒性（ADCC）效力的糖型、MAb聚集体以及与工艺相关的杂质，发现它们在拟议的设计空间内达到了可接受的水平。
三、重组蛋白的生产和纯化:一次性系统、连续工艺以及质量源于设计
（生物工艺与技术）
近年来，对治疗性蛋白质（尤其是单克隆抗体）的需求不断增长，这增加了对实用且经济的工艺技术的需求。这类技术在过去几十年中发展迅速。本文将概述主要的生物技术生产系统，重点是哺乳动物培养，并简要介绍了原核细胞系统、转基因技术和植物细胞，以及主要的纯化系统，重点是过滤、离心、沉淀和层析等技术。同时，还将讨论生物制药的关键质量属性概念及其与质量源于设计概念的关系，以及降低商品成本和提高工艺稳健性的策略，以确保在大规模生产工厂内持续安全地生产生物制药。
一次性系统
在过去二十年中，一次性生产系统的发展一直在加速。这反映在用于哺乳动物细胞培养和微生物培养的一次性系统数量不断增加。一次性系统目前不仅用于培养，还用于下游单元操作，例如过滤和层析步骤。目前仅使用一次性系统就可以生产蛋白质。
用于哺乳动物细胞培养和蛋白质生产应用的一次性生物反应器具有低功率输入、低混合能力、有限的氧气传输、限制性排气能力和有限的泡沫管理等特点。因此，将这些一次性生物反应器转移到可用于微生物生产的一次性发酵罐中是一项挑战，因为微生物发酵需要高混合能力，并且具有更高的氧气传输需求。目前这一代一次性发酵罐仅用于生产最不具挑战性的 5% 的微生物发酵。
一次性生物反应器用于生产正在开发和上市的产品。Shire是第一家使用体积高达 2000 升的一次性生物反应器生产其产品的公司。一次性技术的优势在于：
经济高效的生产技术
通过引入一次性系统，设计可以从培养系统中移除所有与工艺过程不直接相关的项目，例如不锈钢工厂内至关重要的在位清洗 (CIP) 和在位蒸汽灭菌 (SIP) 系统。此外，通过引入一次性系统可以降低资本成本 (CAPEX)。在比较一次性和重复使用不锈钢 2 × 1000 L 新设施成本的案例研究中，一次性设施显著降低了 CAPEX，而运营成本 (OPEX) 增加了。总体而言，这些研究表明，与固定的不锈钢设施相比，投资灵活的一次性设施是有益的。必须注意的是，必须在产品获得监管机构批准之前对新生产设施做出投资决策。
增加 GMP 批次数量
通过引入一次性系统，可以增加生产活动中可生产的 GMP 批次数量，因为不再需要耗时的清洁和设备灭菌。因此，从一批到另一批所需的周转时间缩短了。
为 GMP 设施设计提供灵活性
当使用不锈钢系统时，设备的变更可能会对不锈钢罐、管道等的设计产生影响。这些设备变更将影响设施的整体验证状态。通过使用一次性系统，设备变更可以轻松纳入其中，因为一次性工艺的设置非常灵活。与不锈钢系统一样，如果变更会影响已验证的工艺，则必须重新考虑工艺的已验证状态，并且可能需要重新验证。
加快实施和上市时间
由于一次性系统具有极大的灵活性，与“传统”不锈钢设备相比，产品上市速度受生产过程不同开发阶段可能引入的工艺变更的影响较小。但是，该工艺需要在上市前进行验证。如果在工艺验证后引入变更，则可能需要重新验证。在这方面，与传统的不锈钢设备没有区别。
降低水和废水成本
由于系统是一次性使用的，因此总清洁成本将大大降低。这不仅减少了用水量，还减少了清洁系统和为下一批产品进行设置所需的时间。
降低验证成本
使用一次性系统时，不再需要每年进行清洁和灭菌的验证成本。
一次性系统的缺点是运营费用会增加，并且需要一次性袋子和管子的储存设施。此外，公司对一次性系统供应商的依赖也是一个需要考虑的因素。在最近全球爆发的冠状病毒疫情中，这一点变得非常明显。最后，一次性塑料中的可溶出物和可析出物可能会进入您的产品，从而导致潜在的安全性和有效性问题。
不锈钢生物反应器的优势显而易见，因为这种传统技术易于理解和控制，尽管不锈钢路线过去和现在仍存在重大缺点，例如昂贵且不灵活的设计、安装和维护成本，以及在设施和设备鉴定和验证工作上花费大量时间。但对于非常大体量的产品，不锈钢仍然是最经济可行的选择，因为目前的一次性生物反应器的可放大性有限。
连续生产
目前，大多数生物制药都是批次生产的。一般来说，一个生物反应器中的产物在一个纯化系统中处理，以生产药物物质。连续工艺旨在以较低的成本实现更高的产品质量。基本设计是以连续模式运行生物反应器过程。
在批次工艺中，细胞密度在培养过程中不断增加，直至达到最高水平，随后由于细胞裂解，细胞密度下降。产物将基于预先定义的活细胞密度收获，以防止细胞死亡影响产品质量。在连续模式下的生物反应器工艺中，细胞密度保持在相对稳定的水平，不是批次工艺那样持续约两周，而是持续数周。这是通过将生物反应器连接到灌流模式下的过滤装置来实现的，该过滤装置连续去除反应器内的产物、添加新鲜培养基，并通过细胞废弃，去除多余的细胞。随后将连续移除的产物上样到捕获柱上，后者可以半连续模式运行。原则上，连续工艺只能通过自动化系统操作，通过实时调整关键工艺参数 (CPP) 来实现关键质量属性 (CQA) 的期望值。这极大地提高了工艺稳健性、生产率和设备利用率。这种自动化连续工艺的总体结果是降低了生产成本。行业对生物制药行业连续工艺的兴趣日益浓厚，但由于存在许多挑战，采用率仍然很低：（1）以连续模式运行的不同单元操作需要仔细调整和协调；（2）与批次工艺相比，在产品开发过程的早期阶段也需要更高水平的工艺理解；（3）彻底了解灌流模式下的细胞行为至关重要，这需要先进的分析工具，以应用于过程控制分析，确保维持 CPP。
质量源于设计
目前监管机构的期望，特别是在实施21 世纪基于风险的 GMP 时，是采用风险分析、设计空间、控制策略和质量源于设计 (QbD) 的原则。实施 QbD 应使生产过程始终如一地提供高质量的产品。此外，它还确保通过适当的控制策略识别和控制关键的变异源。对产品、其生产过程和原材料进行详细的端到端评估将需要定义：
1. 关键质量属性 (CQA)
根据 ICH Q8 (R2)，关键质量属性 (CQA) 的定义如下：“为确保所需的产品质量，应在适当的限度、范围或分布内对物理、化学、生物或微生物特性进行表征。”生物制品的关键质量属性 (CQA) 基本上是通过测量其对安全性和有效性的影响来评估的。
2. 关键工艺参数 (CPP)
根据 ICH Q8(R2)，CPP是其可变性对关键质量属性有影响的过程参数”。它们通过合理的科学判断确定，并基于先前的知识、开发、规模放大和生产经验。应监测和控制关键工艺参数，以确保产品质量与开发和生产的历史数据相当或更好。定义关键工艺参数时应考虑的质量属性包括纯度、定性和定量杂质、微生物质量、生物活性和含量。
3. 关键材料属性 (CMA)
CMA 是工艺过程中使用的材料，会影响质量属性。它们的判断方式与上文对 CPP 的判断方式相同。CMA 应通过经过验证的来料检验进行监测和控制。
4. 控制策略
产品的控制策略是通过控制 CPP 和 CMA 来定义的。应根据与 CPP/CMA 相关的风险设计适当的控制策略。适当的控制策略将降低超出范围的 CQA 的概率/可能性并提高CPP/CMA 故障的可检测性。在产品的生命周期中，应根据新知识调整控制策略。将通过风险评估（例如故障模式影响分析，FMEA）来评估控制策略。
上述分析必须在工艺开发的所有阶段进行。然而，QbD 实践的起点是研究在早期发现阶段定义的（潜在）CQA。分析应在早期和后期开发以及商业规模生产期间继续进行。先前知识、分析开发、可比性研究和（非）临床研究结果有助于理解 CQA。通过在所有阶段进行此分析，QbD 原则将不断更新，因为它们基于产品开发和商业规模生产过程中不断增加的专业知识。
尽管并非强制性要求，但监管机构鼓励在工艺中实施设计空间。ICH Q8 将工艺的设计空间定义为：“输入变量（例如，材料属性）和工艺参数的多维组合和相互作用，这些变量和参数已被证明可以提供质量保证。在设计空间内操作不被视为变更。超出设计空间的移动被视为变更，通常会启动监管后的变更流程。设计空间由生产商提出。设计空间的优势在于它通常比操作范围更广。”
根据这些评估，CPP 和 CMA 适用于：
a) 正常工作范围 (NOR)：代表生产工艺历史变化的工艺范围
b) 可接受的操作范围：生产批次记录中指定的范围
c) 已证实可接受范围 (PAR)：生产出符合相关质量标准的产品的工艺过程的表征范围。
2008 年，生物技术行业的公司代表齐聚一堂，共同推动 ICH Q8 (R2)、Q9 和Q10 中所包含的原则，重点关注质量源于设计的原则。此次合作的成果是一份独特的文件：“A-Mab：生物工艺开发案例研究”。该案例研究是生物技术行业人士必读的。下图4.9显示了 A-Mab 产品实现的总体方法。
图 4.9. A-Mab 产品实现的总体方法说明了从分子设计开始，覆盖开发过程的一系列活动，最终形成用于商业规模生产的最终流程和控制策略。
质量保证和质量控制
重要的是，GMP 级生产工艺始终能够生产出高纯度和高质量的产品。FDA 和 EMA 都要求对生产控制进行合理而严格的记录。这包括生产过程每个步骤的记录和/或过程中检测，以确保最终产品符合预先定义的安全性和有效性规范。彻底了解细胞培养和蛋白质生成以及纯化过程对于最大限度地减少可能影响其安全性和有效性的重组蛋白质产品的生物可变性至关重要。即使使用最灵敏和最复杂的分析方法，这种可变性也可能无法检测到。
应使用质量源于设计来开发生产工艺。对于生产工艺中使用的每种分析方法，都应实施标准操作程序 (SOP)。应验证这些方法和生产工艺，以确保该过程充分表征最终的蛋白质产品，并能持续去除工艺中使用的外来化合物，如柱析出物、内毒素、残留宿主细胞蛋白和 DNA、细菌、病毒、化学品。验证级别取决于产品开发的阶段。在早期阶段（例如，对于用于临床前研究或 1/2 期临床研究的产品），完全验证安全方法并验证除病毒工艺至关重要。用于 3 期临床研究和市场规模生产的产品需要对所有工艺内、放行和稳定性指示方法进行全面验证，以及进行完整的工艺验证。
商业规模生产和创新
市场上重组蛋白的主要部分是哺乳动物细胞生产的单克隆抗体。自 20 世纪 80 年代初以来，药物生产工艺已经建立。这些工艺主要包括在搅拌罐生物反应器中进行生产、使用离心和膜技术澄清，然后进行Protein A 捕获、低 pH 病毒灭活、阳离子交换和阴离子交换层析法（或替代性层析技术）、除病毒过滤和用于产品制剂的 UF/DF。此类平台工艺可在非常大规模下持续运行，例如多个 10,000 L 生物反应器和更大的体积。产品回收率通常非常高（>70%）。由于生物反应器中的产物滴度已提高到一定水平，进一步提高对产品成本没有影响或影响甚微，因此，这些拥有满负荷运转的大型生产工厂的公司，其工艺开发的重点正转向了解当前平台的工艺基础。然而，随着更有效的产品，如抗体偶联药物的推出，以及生物仿制药产品的竞争加剧，以及市场规模小得多的新产品的推出，包括用于个性化医疗的方法，预计某些疾病适应症对单克隆抗体的需求可能会减少。需求降低，加上重组蛋白滴度和产量增加，将导致生物反应器尺寸减小，对灵活设施的需求增加，周转时间缩短，从而导致一次性技术和其它创新技术的使用增加。这些创新技术和能力包括工艺强化，即使用高浓度的产品和反应物来强化生产，并将工艺步骤组合成单个单元。创新还体现在制药行业引入连续工艺策略以及迈向全自动化设施，从而能够以更低的成本和更高的质量快速响应产能需求。设施将变得模块化和移动化，从而可以快速配置、组装和重新定位标准化的“即插即用”生产系统。预计还会引入过程分析技术 (PAT)，实现在线过程监控和实时药品放行。这包括开发支持多元数据分析、预测模型和闭环反馈控制的软件。
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