01
引言
囊泡是由非离子表面活性剂形成并经胆固醇稳定的双层囊泡。它可 包封亲水性和疏 水性负载，其中亲水性药物将被载入核心，疏水性药物将被包封在双层结构中[1]。囊泡递送系统已被用于皮肤感染治疗、癌症治疗、神经退行性脑部疾病治疗 以及化妆品领域[2-5]。库尔卡尼等人将亲水性药物环丝氨酸和脂溶性药物乙硫异 烟胺包封于囊泡中，用于治疗耐药结核病。与游离药物相比，该 组合展现出更强的 细菌抑制作用[6]。他们还利用囊泡通过鼻腔向脑部递送双药，具备鼻向脑部靶向 的优势[7]。亲水亲油平衡值 ( HLB ) 和临界堆积参数 ( CPP ) 是影响囊泡性能的两 个关键因素[8,9]。该系统相较于脂质体具有优势，具备稳定性高、成本低的特点 [10]。与单分子层胶束不同，其双层构象……确保了对具有不同亲水/疏水特性的有效载荷的包裹[11]。据报道 ，脂质体通常 通过细胞间途径经皮肤转运。非离子表面活性剂会软化角质层，而 弹性双层囊泡进 一步提高了药物的经皮吸收[12-14]。研究人员已通过在脂质体表面偶联 特定配体 开发出具有主动靶向特性的脂质体，使其能够与过表达受体的细 胞结合并被其内化 [15]。经穿透肽 tLyP-1(CGNKRTR) 修饰的聚乙二醇化脂质体，其肽偶联脂质体的 [ IC 50] 低于无肽脂质体[16]。
白藜芦醇(反式- 3,4′,5-三羟基芪， RSV ) 是一种来源于植物的多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、神经保护、抗肿瘤、抗菌和抗衰老等活性[17-20]。 白藜芦醇作为抗氧化剂，其羟基作为电子供体可终止自由基的链式反应。研究发现，白藜芦醇能抑制氧化剂刺激的小鼠体内的核因子- K B ( NF - K B ) 以及基质金属蛋白 酶 (MMP) 的表达，从而减少胶原蛋白的生成。降解[21]。瑞舒伐他汀经口服给药后，在肝脏中被尿苷二 磷酸葡萄糖醛酸转移酶 ( UGT ) 和磺基转移酶 ( SULT ) 快速降解为葡萄糖醛酸苷和磺酸盐，半衰期极短[22,23]。此外，其水溶性低且遇光不稳定 ，限制了其在药物中的应用[24]。因 此，瑞舒伐他汀亟需合适的递送系统。
皮肤中的成纤维细胞表达两种重要受体 C D44 和 PHAMM, 这两种受体参与细胞增殖、淋巴细胞归巢和再循环过程。CD44 是一种在多种肿瘤中过表达的糖蛋白受体，而透明质酸 (HA) 作为一种线性多糖，与 CD44 受体具有高度亲和力，被广泛 应用于药物和基因递送领域[25]。透明质酸具有生物相容性、可生物降解性和吸湿性，还具备伤口愈合活性。基于透明质酸的纳米载体能够调控药物释放并实现治疗剂的靶向递送，从而提高疗效、减少副作用[26-2 8]。透明质酸可作为外用和经 皮递送的有效纳米载体。其多项特性，包括特异性受体结合、 皮肤水合作用、生物黏附性以及粘弹性，共同促成了它在增强皮肤渗透和细胞摄取方面的潜在作用[29,30]。有研究表明，透明质酸可与 CD44 受体结合并激活丝裂原活化蛋白激酶 ( MAPK ), 进而促进胶原蛋白生成[31,32]。同时，透明质酸在人正常多形核中性 粒细胞中与 CD44 结合，能够抑制 p38- 丝裂原活化蛋白 激酶的磷酸化、基质金属蛋白酶 ( MMP ) 的表达以及胶原蛋白的降解[33]。受 透明质酸- CD 44 相互作用 的驱动，基于透明质酸的组装体分子量在与 CD 44 过表达肿瘤细胞的黏附过程中发挥关键作用[34]。
醇质体已被用作纳米递送系统，具有透皮吸收性好、稳定性高和成本效益佳等优势。醇质体主要依赖被动转运机制，但其缺乏主动靶向能力可能会限制其治疗潜力。本研究设计了一种基于醇质体的递送系统，该系统整合了透明质酸修饰的P407(P407-LHA), 以促进白藜芦醇(RSV) 的局部递送并靶向人成纤维细胞上的 CD44 受体。经 LHA 修饰的 P407 醇质体有望增强皮肤渗透性，选择性结合 CD44 受体并在皮肤中蓄积，从而提升其抗衰老效果。研究通过体外细胞模型和体内动物实验，评估了载白藜芦醇醇质体 (RSV@ 醇质体)的皮肤 渗透性、靶向效率、抗氧化活性以及胶原蛋白生成量。
02
材料与方法
2.1. 材料
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 ( EDC ) 、 12- 肉豆蔻 酸酯- 13- 乙酸佛波酯 ( TPA , 纯度≥99%)和氰基硼氢化钠 ( NaCNBH 3, 纯 度95%)均购 自英国海舍姆的 Alfa Aesar 公司。 Kolliphor P407 购自美国新泽西州的巴斯夫股份有限公司。 N- 羟基琥珀酰亚胺 ( NHS , 纯度98%)购自美国新泽西州的Acros Organics 公司。白藜芦醇(反式-3,4′,5-三羟基芪， RSV ) 购自日本东京的东京化成工业株式会社。透明质酸钠 ( LHA , 分子量29,000道尔顿)购自中国台湾高雄的龙辰兴贸易股份有限公司。 胆固醇、氘代氯仿以及2'.7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFDA,>97%) 均购自美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇股份有限公司。高糖型杜氏改良伊格尔培养基粉末购自美国纽约州格兰岛的赛默飞世尔科技旗下吉布森公司。胎牛血清 ( FBS )、 青霉素 - 链霉素 - 两性霉素 B 溶液 以及胰蛋白酶- EDTA 溶液(0.5%胰蛋白酶，0.2% EDTA 四钠)购自以色列贝特哈埃梅克 kibbutz 的以色列生物工业贝特哈埃梅克有限公司。30%过氧化氢水溶液购自日本东京的昭和化学工业株式会社。L929 小鼠成纤维细胞系(ATCCECCL-1W) 购自中国台湾新竹的生物资源保存与研究中心。Sicrol 可溶性胶原蛋白检测试剂盒购自英国安特里姆的 Biocolor 公司。
《国际生物大分子杂志》325卷(2025 年)147250页
2.2. P407-LHA 的合成
P407 修饰的 LHA 合成步骤如下(方案1)[35-37]。第一步，将 P407(5 克 ) 溶解于二甲基亚砜(10毫升)中，随后与乙酸酐 ( Ac 2 O,350 微升)反应30小时。加入冷乙醚终止反应，经过滤和纯化后收集 P40 7- 醛沉淀产物。第二步，将 P407- 醛(1.89克)、氯化铵( NH 4 Cl ,160.5 毫克)和氢氧化钾(120毫克)溶解于甲醇中。提前将 NaCNBH 3(188.52 毫克)溶解于5毫升甲醇，缓慢滴入上述溶液并在避光条件下反应24小时。加入冷乙醚后收集沉淀，再以5000转/分钟离心10分钟。加入水并透析(截留分子量8000道尔顿)24小时，经冷冻干燥后得到 P407- 胺。随后通过1 H- 核磁共振和傅里叶变换红外光谱对其进行表征，并采用滴定法分析氨基端基的转化率。第三步，将 P407- 胺与 LHA进一步偶联， P407- 胺 ： LHA:EDC :NHS 的摩尔比为1:20:200:200。将 LHA 溶解于 ddH ₂O 中，加入 EDC 和 NHS , 在避光条件下反应2小时。提前将 P407- 胺溶解于 ddH 2O 中，随后逐滴加入反应体系，在避光条件下反应 48小时。将产物透析 (截留分子量8000道尔顿)24小时后冷冻干燥， 再用冷甲醇洗涤，以5000转/分钟离心5分钟。收集 P407- LHA 沉淀，置于干燥器中干燥。随后通过1 H- 核磁共振 (NMR) 和傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 对 P407-LHA 进行表征。将 P407LHA 溶解于1%的 CF₃COOD/D2O 中，通过1 H- 核磁共振( NMR ) 进行分析。记录了聚环氧丙烷上- CH 3 质子对应的区域(δ1.1-1.2 ppm )以及 LHA 上 - NHCOCH3 质子对应的区域(δ1.9-2.0 ppm)[38], 并通过公式计算 LHA 的结合率(%)。在傅里叶变换红外光谱分析中，将2 mg 样品与100 mg 溴化钾混合，在红外灯下研磨后压制成片。红外光谱仪的分辨率设置为4 cm-1 ,扫描速率为2 mm /s, 在4000-400 cm - 1范围内扫描收集红外光谱。
2.3. 纳米囊泡的制备与表征
制备了 P407 类脂质体。将非离子表面活性剂 P407(6.0 毫克)和胆固醇(7.7 毫克)共溶于2毫升无水乙醇中，随后在6000转/分钟的均质化条件下缓慢注入10毫升水中，持续均质化5分钟。之后通过旋转蒸发仪去除乙醇。
按照以下方法制备由 P407- LHA 构成，以及质量比为1/2和2/1的 P407- LHA 与 P407 共混物构成的类脂质体：将 P407-LHA 溶于水中，将 P407 和胆固醇共溶于无水乙醇。在45摄氏度、6000转/分钟的均质化条件下，将有机相缓慢注入水溶液中，持续均质化5分钟。随后通过旋转蒸发仪去除乙醇。
制备载药类脂质体 ( RSV @ 类脂质体)时，将白藜芦醇( 1 .0毫克/毫升)与P407、胆固醇共溶于无水乙醇中。将 RSV @类脂质体进行透析(截留分子量8 000道尔顿),搅拌处理4小时。最后将类脂质体置于4摄氏度下保存，待后续表征。
通过动态光散射 ( DLS ) (英国伍斯特郡马尔文仪器公司的 Nano-ZS 90 粒径电位仪)测定粒径和 Zeta 电位。药物包封率、载药量和囊泡回收率在囊泡冷冻干燥后进行测定。精确称量的 RSV@ 囊泡溶解于甲醇 中，采用紫外分光光度计在307 nm 处测定 RSV 的浓度。RSV 的包封率 (EE(%)) 和载药量( DL(%)) 通过以下公式计算。
图式1 . (A)P407 - 胺和 (B)P407- 长链羟烷基胺的合成路线
通过透射电子显微镜( TEM ) (日本东京日立高新技术公司)观察纳米囊的形态：将纳米囊置于铜制电镜载网上，滴加磷钨酸溶液(质量体积浓度2%)并静置1分钟。去除多余试剂后，样品在室温下干燥，随后在100千伏电压下进行透射电子显微镜观察。
Encapsulation efficiency(%)=Determined amount of RSV in niosomes ×100% / Total RSV
Drug loading(%)=Determined amount of RSV in niosomes ×100% / Total niosome weight
2.4. 体外释放研究
将 RSV @ 脂质体重悬于1毫升 pH 7.4 和 pH 5.0 的磷酸盐缓冲液 ( PBS ) 中，每种缓冲液均含0.01%叠氮钠和0.5%吐温80,随后将其置于覆盖有透析膜(截留分子量12000-14000道尔顿)的瓶中。将该瓶放入含有24毫升相同释放介质的试管中，于37℃、100转/分钟的振荡水浴中浸泡。在特定时间间隔，取出部分释放介质，补入等体积新鲜介质。在307 纳米波长下测定释放介质中 RSV 的浓度。
所有释放曲线进一步采用零级动力学模型($Qt= k0 \times t$)、 一级动力学模型($\ln (1-Qt)=-k1 t$)、Higuchi 模型($Qt=kh \times t^{1/2}$) 和 Hixson-Crowell 模型进行拟合。$k0$、$k1$ 和$kh$分别代表各模型的速率常数，$Qt$ 代表时间 $t$ 时的药物释放百分比。根据拟合效果最佳的模型(以相关系数最高为判定依据)确定速率常数和相关系数[39]。
2.5. 体外皮肤渗透
采用 Franz 扩散池进行 RSV@ 脂质体通过 Wistar 大鼠腹部皮肤的体外透皮实验。所有动物实验均经台湾大学机构动物护理与使用委员会批准 (IACUC 20220472), 并符合美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》。剃除 Wistar 大鼠腹部毛发，去除脂肪组织，并用生理盐水清洁皮肤。随后将皮肤夹持于供给室与接收室之间，向接收室加入8 mL pH 7.4 的磷酸盐缓冲液。向供给侧放置含200 μg 白藜芦醇的 RSV @ 脂质体。将扩散池置于37 ℃环境中 ，以400转/分钟的转速持续搅拌。在24小时内的特定时间点从接收室取样，并补充等体积的新鲜培养基。采用紫外分光光度法在307 nm 波长下测定各样品溶液中白藜芦醇的浓度。
24小时结束后，用甲醇清洗皮肤表面。测定甲醇中白藜芦醇的浓度，该浓度代表残留在皮肤表面未渗透的白藜芦醇。随后将皮肤晾干，用卡尺测量其厚度。采用胶带剥离法计算积聚在角质层中的白藜芦醇含量[38]。将胶带( 3 M Scotch MagictM ) 裁剪成1 cm ² 片，贴于皮肤表面后撕下。该过程重复五次。将胶带浸入5毫升甲醇中，超声处理30分钟。通过紫外光谱法测定白藜芦醇的浓度，该浓度代表角质层中的药物含量。将包含表皮和真皮的残留皮肤剪成碎片，用3毫升磷酸盐缓冲液以6000转/分钟的速度匀浆2分钟。此过程重复三次。将皮肤匀浆以 21000倍重力离心10分钟。上清液用甲醇稀释后，通过紫外光谱法进行分析。
2.6. L929 细胞的抗氧化性与胶原生成
将 L929 大鼠成纤维细胞以每孔$1 \times 10^4$ 个细胞的密度接种至96 孔板中，在含10%牛血清和1% PSA 的 DMEM /F12 培养基中培养，于3 7℃、5% CO2 环境中孵育24小时。随后移除培养基，用 PBS 冲洗细胞。将 H₂O2 稀释于培养基(1/6000)中，加入细胞中并孵育6小时[40]。分别加入含0.1% DMSO 的无血清培养基中的白藜芦醇 (RSV)、 空白纳米囊泡(20、40、100 μg/mL) 以及载白藜芦醇纳米囊泡( RSV @ niosomes , 含10、20、50 μ M RSV ), 继续孵育24小时。再次移除培养基，用 PBS 洗涤细胞。加入10 μM 的2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯( DCFDA ) 溶液，孵育30分钟。移除培养基，用 PBS 洗涤细胞三次。使用Paradigm 多模式酶标仪 ( SpectraMax Paradigm , Molecular Devices , 美国加利福尼亚州森尼韦尔市)在488 nm 和520 nm 波长下测定2,7-二氯荧光素( DCF ) 的吸光度。以经 H2O2 预处理6小时的 L929 细胞中的活性氧 ( ROS ) 水平作为100%对照。以样品组 ROS 水平与对照组 ROS 水平的比值计算抗氧化活性(以抑制 ROS 生成的百分比表示)。
用浓度为50 μ M 的 RSV 溶液、空白纳米囊泡和 RSV@ 纳米囊泡处理经 H2O2 预刺激的 L929 细胞24小时后，进一步研究了其胶原生成情况[41]。采用 Sircol 胶原检测试剂盒 (S1000) 测定胶原含量[42]。使用 Paradigm 多模式微孔板检测仪在540 nm 波长下测定光密度 ( OD ), 并根据校准曲线计算相应的胶原含量。将未受刺激的 L929 细胞的胶原水平设为 100%作为对照。用纳米囊泡制剂处理后，胶原生成率(%)通过将样品测得的胶原水平除以对照组的胶原水平计算得出。
2.7. 老化皮肤动物实验
所有动物实验均获台湾大学机构动物护理与使用委员会批准 (IACUC 20220472), 并符合美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》。雄性 Wistar 大鼠 ( 6 周龄，体重150-200 克)购自台湾宜兰的 BioLASCO 公司。大鼠皮肤抗衰老实验的设计方案如图2所示。将每只大鼠背部皮肤剃毛后划分为四个4 cm ² 区域，每个区域用12- 0- 十四烷酰佛波醇- 13- 乙酸酯 ( TPA ,200 微升丙酮中含30微克)刺激3小时[43]。随后，每日涂抹一次含有10毫克白藜芦醇 ( RSV ) 的 RSV 溶液、 RSV@P407 脂质泡囊及 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 脂质泡囊 ，连续7 天。第8天对大鼠实施安乐死，收集皮肤组织， 用2份甲醇清洗后，切分为1-cm² 块。采用胶带剥离法测定角质层中的白藜芦醇含量，该操作重复进行五次 [40]。将胶带浸入甲醇中，超声处理30分钟。
方案2 大鼠皮肤抗衰老实验流程图
基于 RSV 标准曲线测定并计算甲醇溶液中 RSV 的浓度。将包含表皮/真皮层的残留皮肤剪碎，加入磷酸盐缓冲液 (PBS), 以6000转/分钟的速度匀浆2分钟，该过程重复三次。将匀浆后的皮肤组织进行离心处理，以21000 倍重力加速度离心10分钟，收集上清液并用甲醇稀释，用于白藜芦醇 (RSV) 分析。
此外，还对皮肤中的活性氧 ( ROS ) 水平进行了评估。将二氯二氢荧光素二乙酸酯 (DCFDA) 加入磷酸盐缓冲液 (PBS) 中，然后添加至组织匀浆上清液中并孵育30 分钟。检测生成的2,7-二氯荧光素的荧光强度，采用激发波长488纳米、发射波长520 纳米测定(DCF)。另一方面，使用Sircol 胶原蛋白检测试剂盒(货号 S1000)[42] 测定胶原蛋白含量。利用Paradigm 多功能微孔板检测仪在540 纳米波长下测定吸光度 (OD) 值，并基于标准曲线计算胶原蛋白含量。
2.8. 统计学分析
所有统计分析均使用 SigmaPlot 12.5(美国加利福尼亚州圣何塞的 Systat Software 公司)进行。采用单因素方差分析 (ANOVA ) 和非配对 t 检验对各组进行比较。P 值为<0.05时被认为具有统计学显著性。
一组 P407 - 胺 ( 图 2 B) 。 Forbes 等人报道，羟基的出峰范围为：聚乙二醇( PEG ) 对应3200-3550 cm -1, 而胺基的出峰范围为聚乙二醇-胺 ( PEG -amine) 对应3300-3500 cm-1 。 然而，羟基的峰强度远大于 氨基的峰强度[44]。本研究中 P407 与 P407 - 胺的傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 相似，仅在 P407 的-OH 峰转化为 P407- 胺的 - NH₂ 峰时，峰强度存在差异(图2 A 与图2 B 对比)。该结果证实 P407 的端羟基(- OH ) 成功转化为 P 407 - 胺中的端氨基(-NH2), 通过滴定法测定其转化率为94.33±13.61%。图2 C 显示 LHA 的特征峰出峰位置分别为3432.20 cm -1 (峰1)、2909.00 cm -1 ( 峰 2 ) 、1618.83 cm -1 (峰3)和1039.14 cm -1 (峰4),分别对应羟基、 - CH ₂ 基团、羰基( -C=0) 和醚键(-C-O-)。P40 7- LHA 在1500-1200 cm -1 范围内同时呈现出LHA 的特征峰与 P407- 胺的指纹区特征峰(图2 D)。
03
结果与讨论
3.1. P407-LHA 的表征
以 P407 - 胺与 LHA 单体摩尔比1:20合成 P407- LHA , 反应4 8小时，产率为73.1±11.1%。通过¹ H- 核磁共振( 'H-NMR) 和傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 对P407-LHA 进行表征。图1展示了 P407- 胺、 LHA 和 P407-LHA 的1 H- 核磁共振 (¹H-NMR) 谱图。 P407-LHA 出现了对应 P407 - 胺和 LHA 的三个特征峰，包括δ1.1-1.2 ppm 处对应聚环氧丙烷链段- CH₃ 质子的 a 峰、δ3.6-3.7 ppm 处对应 P407 - 胺 - CH₂ 质子的 b 峰，以及δ1.9-2.0 ppm 处对应 LHA 的 -NHCOCH₃ 质子的 c 峰。 P407-LHA 上 LHA 的接枝率为32.93±0.73%。
图2展示了 P407 、 P407 - 胺、 LHA 和 P407-LHA 的傅里叶变换红外光谱。3441.12cm-1 处的峰对应于 P407 的 - OH 基团(图2 A), 而3447.07 cm-1 处的峰对应于-NH
3.2. 纳米囊泡的表征
由 P407 、 P407- LHA 及其共混物 (P407/P407- LHA 的比例为2 /1和1/2)组成的纳米囊泡相关数据列于表1和图3A 中。所有纳米囊泡的粒径均在200至300 纳米之间， PDI<0.2 表明其粒径分布较窄。 P407-LHA 纳米囊泡的粒径大于 P407 纳米囊泡(273.1±4.1纳米与220.8±0.7纳米相比)。共混纳米囊泡(P407/P407-LHA(2/1) 和 P407/P407-LHA(1/2)) 的粒径介于纯 P407 和纯P407-LHA 制剂之间，且随着 P407-LHA 比例的增加，粒径也随之增大。所有纳米囊泡均具有负的 Zeta 电位，且随着 P407-LHA 含量的增加， Zeta 电位的负值更大[45]。
Fig. 3. (A) Particle size distribution of niosomes composed of P407, P407/P407-LHA(2/1), P407/P407-LHA(1/2), and P407-LHA. (B) TEM micrographs of P407 and P407/P407-LHA(1/2) niosomes at magnifications of 100 k and 1500 k.
图3 B 展示了 P407 和 P4 07/P407- LHA (1/2) 纳米囊泡的透射电子显微镜 (TEM) 图像。结果显示，与动态光散射 (DLS) 测量结果一致，纳米囊泡在水合作用下会发生溶胀，从而导致粒径明显增大。
3.3. 白藜芦醇纳米囊泡的表征
图 4 A 展示了负载白藜芦醇的纳米囊泡 ( RSV@ 纳米囊泡)的粒径和 Zeta 电位。与空白纳米囊泡相比，RSV@纳米囊泡的粒径增大，Zeta 电位的负值也更大。RSV@纳米囊泡保持了均一的粒径分布，其多分散系数为PDI<0.3。 图 4B 和
Fig. 4. (A) Particle size as well as zeta potential, (B) encapsulation efficiency,and (C) drug loading of RSV@niosomes (n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01).
图 4C 展示了白藜芦醇在纳米囊泡中的包封率和载药量。RSV@P407 纳米囊泡的对应值分别为 62.1±2.7%和9.58±0.87%,而将 P407- LHA 组分引入纳米囊泡后，这两个数值均有所提升，最终 RSV@P407-LHA 纳米囊泡获得了最高的载药性能(包封率82.8±1.1%,载药量13.35± 0.46%)。这表明 LHA 在提高纳米囊泡内白藜芦醇含量方面发挥着重要作用。推测 LHA 会插入纳米囊泡的双层膜中， 增大纳米囊泡的尺寸，从而使其能够负载更高含量的白藜芦醇[46]。
3.4. RSV@ 脂质体的体外释放
图5展示了白藜芦醇从 RSV@P407 以及 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 纳米囊泡在 pH7 . 4和 pH 5.0 释放介质中的体外释放情况。与 RSV 纳米囊泡不同， 白藜芦醇溶液呈现快速释放特征，在 pH 7.4 和 pH 5.0 释放介质中分别于8小时和 4小时末实现药物完全释放。 RSV@P407 纳米囊泡和 RSV@P407/P407-LHA(1/2 ) 纳米囊泡在模拟生理 pH 7.4 的释放介质中实现了药物的持续释放，$f_2<50$。 RSV@P407/P4 07- LHA(1/2) 纳米囊泡中白藜芦醇的释放速度慢于 R SV@P407 纳米囊泡，在最初一小时内的突释效应更低，这表明 LHA 降低了白藜芦醇从纳米囊泡中的释放速率。
Fig. 5. In vitro release of RSV solution, RSV@P407 and RSV@P407/P407-LHA(1/2) niosomes in pH 7.4 and pH 5.0 release media (n = 3).
RSV@P407 和 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 纳米囊泡的药物释放均符合 Higuchi 扩散动力学，速率常数分别为$11.07 \pm 0.15\%/h^{1/2}$($r^2=0.9920 \pm 0.0030$) 和$10.20 \pm 0.11\%/h^{1/2}$($r^2=0.9890 \pm 0.0018$), 对应的 $t{50}$ 值分别为$6.24 \pm 0.14$ 小时和$17.14 \pm 0.64$小时。另一方面，本研究还开展了 RSV 纳米囊泡在 pH 5.0释放介质中的体外释放实验，以模拟皮肤环境。观察发现， 由于白藜芦醇在酸性条件下的溶解度提升[47],其在 pH 5.0 介质中的释放速度快于 pH 7.4 介质。酸性条件下纳米囊泡的药物释放同样符合 Higuchi 扩散动力学，速率常数分别为$21.481 \pm 0.9163\%/h^{1/2}$($r^2=0.9723 \pm 0.0085$) 和$16.739 \pm 0.061\%/ h^{1/2}$($r^2=0.9897 \pm 0.0072$), 对应的 $t{50}$ 值分别为$1.61 \pm 0.19$小时和$3.65 \pm 0.05$小时。这些结果表明， RSV 纳米囊泡有望在皮肤中沉积并实现白藜芦醇的持续释放。
脂质体白藜芦醇递送系统中也观察到了类似的缓释行为：游离白藜芦醇呈现快速释放特征，5小时末约90%的药物释放，而脂质体递送系统中白藜芦醇的体外释放速度较慢，24小时后仅约80%的药物释放[48]。
3.5. 体外皮肤渗透
图6展示了使用 Franz 扩散池，在24小时内 RSV@ 脂质体通过 Wistar 大鼠皮肤进行体外渗透后，角质层、表皮/真皮以及接收液中白藜芦醇的累积含量。大多数脂质体成功穿透角质层并在表皮/真皮层积累，其中 RSV@P407/P407-LHA(1/2)脂质体的积累量最高。基于 LHA 的 RSV@ 脂质体通过皮肤向接收液的转运情况在这三种制剂中相似，且显著低于 RSV@P407 脂质体。这些结果表明， LHA 能够增强 RSV@ 脂质体穿透角质层的能力，促进其在表皮和真皮中的沉积，并减少药物向接收液的渗透。有研究报道， HA 可使角质层水合，并帮助纳米载体通过受体介导的过程内化进入细胞[49]。 HA 与 CD44 受体的结合，以及 P407 的表面活性剂特性，共同促成了 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 脂质体在皮肤中的高积累。
Fig. 7. (A) Relative ROS levels (%) in H2O2-stimulated L929 cells after treatment with blank niosomes and RSV@niosomes formulated by P407, P407/P407-LHA(2/1), P407/P407-LHA(1/2), and P407-LHA at various concentrations of niosomes (20, 40, 100 μg/mL) and drugs (10, 20, 50 μM) for 24 h. The ROS level pre-induced by H2O2 for 6 h was served as 100 % (the control group).
(B) The collagen restoration (%) in H2O2-stimulated L929 cells after treatmentwith blank niosomes and RSV@niosomes at a drug concentration of 50 μM for 24 h. The collagen level in L929 cells without H2O2 stimulation was defined as 100 % (the control group) (n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
3.6. L929 细胞中活性氧的抑制与胶原蛋白的修复
图 7 A 展示了在未添加脂质体的对照组基础上， H2O2 刺激的 L929 细胞经空白脂质体(20、40、100 μ g/ mL ) 和不同药物浓度(10、20 、50 uM ) 的 RSV@ 脂质体处理24小时后，活性氧 ( ROS ) 水平(%)的变化。以 H₂O₂ 预刺激6小时的L929 细胞中 ROS 生成量为100%(对照组)。结果表明， P407 脂质体并未降低ROS 水平，反而诱导了 ROS 的生成(>100%)。将白藜芦醇掺入后， RSV@P 407 脂质体使 ROS 水平降低，在IC50 浓度约为50 μM 时效果显著。与 R SV@P407 脂质体类似，空白的 LHA 基 P407/P407-LHA 和 P407- LHA 脂质体也表现出 ROS 水平降低的现象，说明其具有抗氧化活性。当将 RSV 掺入 LHA 基脂质体后， ROS 水平的降低效果进一步增强。这些结果表明， LHA 基脂质体与 RSV 联合使用具有协同抗氧化活性，可显著降低 ROS 水平。其中， RSV@P407/P40 7-LHA(1/2) 脂质体的抗氧化活性最佳，在降低 ROS 方面表现更优。空白 P407- LHA 脂质体的抗氧化效果优于 P407 脂质体，凸显了 LHA 的抗氧化应用潜力[50]。有研究报道， LHA 与CD44 结合可抑制细胞因子和 NADPH 氧化酶的活性，从而阻止 ROS 的生成与扩散 [51,52]。将 RSV 掺入 LHA 基 P407/P407-LHA(1/2) 脂质体可进一步增强其抗氧化效果。 RSV 的抗氧化活性源于其羟基和芳香环的供电子特性，这有助于终止自由基的链式反应[53]。
图 7 B 展示了在药物浓度为50μ M 的空白纳米囊泡或 RSV @ 纳米囊泡处理24小时后 ，H ₂ O2 刺激的 L929 细胞中胶原蛋白的恢复百分比。未受H2O2 刺激的 L929细胞中的胶原蛋白水平被定义为100%并作为对照，而受 H2O2 刺激的 L929 细胞中胶原蛋白水平降至66.94±0.38%。空白 P407 纳米囊泡将胶原蛋白恢复至83.36±3.62%,而由 P407/P407- LHA (2 /1) 、 P407/P407-LHA(1/2) 和 P407-LHA 组成的基于 LHA 的空白纳米囊泡则分别将胶原蛋白恢复至10 4.38±2.86%、109.37±4.16%和94.40±2.82%。载药的 RSV@ 纳米囊泡，包括 RSV@ P407/P407 、 RSV@P407/P407-LHA(2/1) 、 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 和 RSV@P407-LHA, 进一步将胶原蛋白恢复率提升至122.49±3.20%、134.74 ±2.91%、142.64±7.44%和131.35±3.34%。相比之下，仅药物溶液将胶原蛋白恢复至89.86±0.92%,这一数值显著低于 RSV@纳米囊泡所达到的效果。有研究表明，透明质酸与成纤维细胞上的 CD 44 结合可诱导转化生长因子- β ( TGF -β) 的产生，从而促进胶原蛋白的生成[54,55]。载药后， RSV@P 407/P407- LHA (1/2) 纳米囊泡表现出最高的胶原蛋白恢复效果，达到142.64±7.44%。透明质酸基脂质体显著提高了白藜芦醇在炎症性 L929 细胞中的细胞摄取效率，有效降低活性氧水平并促进胶原修复。
3.7. 动物实验
3.7.1. 白藜芦醇在老化皮肤中的分布
将 RSV 溶液、 RSV@P407 纳米囊泡 和 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 纳米囊泡局部应用于 TPA 刺激的 Wistar 大鼠。衰老皮肤中 RSV 的累积含量如图8所示。药物在表皮和真皮层的积累量遵循以下顺序： RSV@P407/P407-LHA( 1/2) 纳米囊泡(588.26±24.23 μg)> RSV @P407 脂质体(369.13±37.74 微克 ) > RSV 溶液(62.41±14.57 微克 ) , 各组间存在显著差异。 RSV@ 脂质体在老化皮肤中的蓄积量远高于 RSV 溶液。 RSV@ 脂质体递送系统，尤其是基于 LHA 的 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 脂质体，不仅能保护 RSV 免受酶解，还能增强其穿透角质层的能力，使其在老化皮肤的表皮和真皮中蓄积更多。
Fig. 9. Topical application of RSV solution, RSV@P407 niosomes and RSV@P407/P407-LHA(1/2) niosomes containing 10 mg of RSV on TPA stimulated Wistar rats once daily for 7 days. (A) Suppression of ROS levels (%) relative to aging skin without treatment of RSV formulations. (B) Suppression of ROS levels (%) relative to healthy skin without any treatment. (C)Collagen restoration (%) relative to healthy skin without any treatment (n = 3,*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
3.7.2. 活性氧抑制与胶原蛋白修复
图 9 A 展示了经 RSV 溶液、 RSV@P407 纳米囊泡和 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 纳米囊泡处理后，衰老皮肤中活性氧 (ROS) 水平的抑制情况。未接受 RSV 处理的 TPA 刺激的衰老皮肤中 ROS 水平设为100%。 RSV 溶液处理将 ROS 水平降至79.09±5.51% 。 RSV 纳米囊泡对 ROS 的抑制效果优于 RSV 溶液。具体而言，RSV @P407/P407- LHA (1/2) 纳米囊泡有效抑制了 ROS 水平 ，使其相较于对照组降至41.27±5.25%。图9 B 展示了衰老皮肤中 ROS 水平的抑制情况，正常皮肤(未接受 TPA 刺激和 RSV 处理 ) 的 ROS 水平设为100%。在 TPA 刺激的衰老皮肤中，相较于正常皮肤， ROS 水平升至291.02±20.01%。经 RSV 溶液、 RSV@P40纳米囊泡和 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 纳米囊泡处理后，衰老皮肤中的 ROS 水平分别降至230.17±16.04%、147.85±4.4 2%和120.10±15.29%。这些结果表明， RSV@P407 醇质体能够增强皮肤渗透性， 并通过降低活性氧 (ROS) 水平表现出显著的抗氧化活性。此外，醇质体中添加的透明质酸 (LHA) 可进一步放大这一效应，使活性氧水平更接近健康皮肤的水平。
图 9C 展示了经 RSV 溶液、RSV@P407 纳米囊泡以及 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 纳米囊泡处理后， TPA 刺激的老化皮肤中胶原蛋白的恢复情况。将健康皮肤中的胶原蛋白水平设为100%。结果显示，经 TPA 刺激后，老化皮肤中的胶原蛋白水平降至 65.93±2.88%。经 RSV 溶液处理后，胶原蛋白水平恢复至87 .25±2.85%,但仍低于正常皮肤中的水平。 RSV@P407 纳米囊泡进一步将老化皮肤中的胶原蛋白水平提升至112.77±9.00%,使其与正常皮肤相当。值得注意的是， RSV@P407/P407-LHA(1/2)纳米囊泡不仅恢复了胶原蛋白水平，还显著促进了胶原蛋白的生成，相对于正常皮肤达到了172.95±2.79%。
3. 8 综合评价
本研究中，以 P407 胺与 LHA 单体摩尔比1:20的比例合成 P4 07- LHA , 并在避光条件下反应48小时。 P407- LHA 上 LHA 的接枝率为32.93±0.73%,显著高于Cho 等人[56]报道的数值。这些适宜的反应条件(如摩尔比、避光处理等)实现了 LHA 与 P407 - 胺的高效接枝。
随后采用 P407、P407LHA 及其混合物，通过乙醇注入法制备了醇质体囊泡 。与薄膜水合法相比，乙醇注入法具有成本更低、操作便捷且适合规模化生产的优势[57]。此外，以往研究表明，采用该方法制备的醇质体，其粒径均匀度和载药效率均优于薄膜水合法制备的醇质体[58]。为确保白藜芦醇 ( RSV ) 有效穿透皮肤屏障并滞留在表皮和真皮层，将 RSV@ 醇质体的粒径控制在约200-300 纳米范围内。该粒径范围可避免因粒径过小导致白藜芦醇过度渗透至皮下微血管和体循环系统[59]。
所有 RSV@脂质体制剂均表现出负的 Zeta 电位，且该电位随带负电的 LHA 组分比例的增加而升高[45,60]。这证实了 LHA 成功掺入到共混脂质体中。此外，与RSV@P407 脂质体相比， LHA 的加入提高了 RSV 的载药量，尤其是在RSV @P407/P407- LHA (1/2) 脂质体中。根据以往研究，低分子量透明质酸可通过角质层水合作用及后续的 HA 受体介导摄取，提高药物载体的经皮吸收效率[61]。同时 ， LHA 的生物粘附特性有助于纳米载体滞留在表皮和真皮层中。因此，本研究制备的基于 LHA 的 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 脂质体，其药物在皮肤中的蓄积量显著高于 RSV@P407 脂质体(p<0.01)
本研究以 TPA 诱导的老年 Wistar 大鼠作为衰老动物模型。经 TPA 处理后，大鼠皮肤变得粗糙，且结构完整性受损。 TPA 常被用作衰老诱导剂，通过上调核因子K B ( NF - K B ) 和激活蛋白 - 1 ( AP -1) 的表达来诱导内源性超氧活性氧 ( ROS ) 的产生[62]。既往研究表明， CD -1 小鼠背部健康皮肤经 TPA 处理24小时后，炎症标志物髓过氧化物酶 ( MPO ) 的水平显著升高，约为健康皮肤的六倍[63]。
TPA 诱导的老年 Wistar 大鼠每日局部涂抹 RSV 溶液 、 RSV@P407 纳米囊泡以及RSV@P407/P407-LHA(1/2) 纳米囊泡，持续七天，以评估其治疗效果。 RSV 溶液仅能轻微改善皮肤粗糙状况，而 RSV@P407 纳米囊泡和 RSV@P407/P407 -LHA(1/2)纳米囊泡则能有效抚平老化皮肤，改善其整体外观。RSV 在老化皮肤中的积累量遵循以下顺序： RSV @P407/P407- LHA (1/2) 纳米囊泡> RSV @P4 07 纳米囊泡> RSV溶液。 RSV 的理化性质，以及其被尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 (UGT) 和磺基转移酶 (SULT) 降解的特性，限制了 RSV 溶液的抗氧化活性[64]。 RSV 纳米囊泡，尤其是 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 纳米囊泡，增强了 RSV 的穿透角质层并促进其在表皮和真皮层的积累，从而延长白藜芦醇的释放时间。这种长效释放有效促进了胶原蛋白的生成，并抑制了活性氧的产生。仅涂抹白藜芦醇溶液时，仅有3.57±0.53%的白藜芦醇在皮肤中积累。这些研究结果表明，白藜芦醇经皮递送需要纳米囊泡的辅助，尤其是 RSV@ P407/P407-LHA(1/2) 纳米囊泡，以保护白藜芦醇不被降解，促进其穿透皮肤屏障，并增强其在表皮和真皮层的积累。这进而有效降低了炎症皮肤中的活性氧水平，促进胶原蛋白再生，实现皮肤修复。
据报道，大鼠体内胶原蛋白的更新速率为每天3%至5%, 人类则为每天1%[65]。随着衰老进程，基质金属蛋白酶 (MMPs) 的表达会上调，这会导致前胶原 mRNA 表达量下降以及胶原蛋白合成减少[66]。研究发现，在老年人(>80 岁，n=18) 体内 ， MMP -1 的表达水平比年轻人(18-29岁， n=18) 高出约40%,最终使得胶原蛋白的生成量减少52%[67]。在本研究中，经 TPA 刺激后， Wistar 大鼠的胶原蛋白水平相较于正常健康皮肤下降至65.93±2. 88%。而 RSV@P407/P407- LHA(1/2) 纳米囊泡能有效诱导衰老皮肤中的胶原蛋白生成，其胶原蛋白水平甚至超过了健康皮肤。
总体而言， LHA 与人成纤维细胞上的 CD 44 受体特异性结合，促进了 RSV 囊泡高效穿透皮肤角质层，同时增强了皮肤渗透性与药物蓄积。此外， LHA 具有抗氧化活性，还能促进胶原蛋白合成，进一步助力皮肤再生。综合来看，囊泡、 LHA 与 RSV 的协同作用可触发强效的抗老化反应。
04
结论
本研究开发了用于经皮递送白藜芦醇以治疗皮肤老化的透明质酸修饰醇质体。基于 LHA 的载白藜芦醇 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 醇质体表现出缓释特性。皮肤渗透研究表明，基于 LHA 的醇质体显著增强了白藜芦醇向皮肤的递送。这种增强作用归因于 LHA 与人成纤维细胞上 CD44 受体的特异性结合，与不含 LHA 的 RSV@ 醇质体相比，白藜芦醇在表皮和真皮中的积累量更高。此外，它们在 H2O2 刺激的L929 细胞中有效降低了活性氧水平并促进胶原修复。体内动物研究进一步证实，RSV@P407/P407-LHA(1/2) 醇质体作为经皮递送白藜芦醇的纳米载体在抗衰老治疗中具有良好潜力。与不含 LHA 的 RSV@醇质体和白藜芦醇溶液相比，基于 LHA 的 RSV@P407/P407-LHA(1/2) 醇质体在表皮和真皮中的积累量显著更高，且胶原修复效果更优。因此，白藜芦醇与基于 LHA 的醇质体的组合成功发挥了强效的抗衰老功效。
05
CRediT 作者贡献声明
陈伟宗：撰写——初稿、方法学、调查、正式分析、数据整理、概念构思。
林文仁：撰写——审核与编辑、指导、资源、方法学、概念构思。
06
利益冲突声明
作者声明无利益冲突。陈 T 和林 WT 本研究由台湾国家科学技术委员会 ( NSTC 113-2320-B-002-055) 提供资金支持。数据可应要求提供。
07
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