Ganetespib

—因利乘便，顺势而为 从“占据驱动”到“事件驱动”，靶向蛋白降解正在改写药物发现规则。而热休克蛋白家族的HSP90和HSP70，凭借其天然携带E3泛素连接酶网络的独特能力，正悄然开辟一条全新的降解赛道。 传统PROTAC依赖CRBN或VHL等少数E3连接酶，易因耐药突变失效；而HSP介导的降解技术，通过双功能分子将致病蛋白“拴”到分子伴侣上，劫持内源泛素化平台，实现高效、选择性的蛋白清除。从HSP90到HSP70，从客户蛋白到非客户蛋白，这一领域在2024-2026年迎来了快速发展。那么，HSP介导的降解究竟能否成为PROTAC之后的新范式？它的优势、挑战与未来潜力又在哪里？ 近期报道的多项研究，通过CHAMP、HEMTAC、HIM-PROTAC、HSPTAC等不同技术路线，验证了HSP介导降解在BRD4、CDK4/6、GPX4、PARP1、ERK5等多个靶点上的可行性，甚至实现了泛素-蛋白酶体与分子伴侣介导自噬的双通路协同。 何为HSP介导蛋白降解？ 热休克蛋白（Heat Shock Protein, HSP）家族是细胞内最核心的分子伴侣系统。其中，HSP90和HSP70负责数百种“客户蛋白”的正确折叠、成熟、稳定和功能调控。然而，除了经典的伴侣功能外，HSP90还有一个鲜为人知却极具转化潜力的特性：它天然地与大约30%的人类E3泛素连接酶存在物理结合，形成庞大的“泛素化平台”。换句话说，HSP90本身就像一座预先架设好的降解基站，周围环绕着多种E3连接酶（如CHIP、CUL5、MDM2、TRIM25等），随时准备对靠近的底物进行泛素化标记。 基于这一特性，科学家们提出了一种全新的蛋白降解策略：设计一种双功能小分子，一端结合目标致病蛋白（POI），另一端结合HSP90（或HSP70）。这种分子就像一座“分子桥梁”，将POI强行拉近到HSP90/E3复合物附近，从而诱发POI的泛素化，最终被蛋白酶体降解。与传统PROTAC需要额外引入E3配体（如来那度胺的CRBN配体或VHL配体）不同，HSP介导的降解技术巧妙地“劫持”了细胞内天然高表达且自带E3网络的分子伴侣系统，因此也被称为“无需E3配体的降解技术”。 从HSP90到HSP70：降解技术的迭代与里程碑 开创者：CHAMP平台（BRD4，2022年进入临床） 最早将HSP介导降解从概念推向临床验证的，是国内企业珃诺生物（Ranok Therapeutics）。其CHAMP平台的核心设计思路是：利用肿瘤组织中HSP90复合物高度激活的独特生物学特性：肿瘤中的HSP90处于“激活态”（ATP结合构象），而正常组织中为“静息态”（ADP结合或无核苷酸构象），从而使CHAMP分子天然具备“肿瘤选择性药代动力学”特征。 CHAMP的代表分子RNK05047靶向BRD4，由BRD4配体（基于JQ-1）、HSP90配体（基于ganetespib）和连接链组成。在MV-4-11白血病细胞中，RNK05047能够高效降解BRD4，IC50在纳摩尔级别。免疫共沉淀实验直接检测到了BRD4-CHAMP-HSP90三元复合物的形成，且降解作用严格依赖蛋白酶体通路（可被MG132完全阻断）。在临床前研究中，RNK05047展现了令人印象深刻的药效：在MV-4-11小鼠移植瘤模型中，单次给药后即可实现肿瘤中90%以上的BRD4蛋白被持续降解，给药三周后大多数肿瘤完全消失。这一效果远超常规的小分子降解剂，也印证了HSP90介导降解在实体瘤模型中的巨大潜力。 临床进展方面，RNK05047早在2022年8月即在美国启动I/II期临床（CHAMP-1研究，NCT05487170），并于2023年2月获得中国CDE的IND受理，同年3月在中国完成了I期临床首例患者给药，成为首个进入临床试验的中国本土BRD4选择性蛋白降解剂。截至2025年10月，临床初步结果显示其安全有效，目前该分子已推进至中美两国的临床II期研究阶段。 Figure 1 BRD4-CHAMP DOI: 10.1158/1538-7445.Am2021-971 概念拓展：HEMTAC（CDK4/6，2024年）在珃诺临床推进的同时，学术界也在积极探索HSP90介导降解在其他靶点上的普适性。山东大学团队设计了名为HEMTACs（HSP90-mediated targeting chimeras）的分子。他们选择CDK4/6作为目标蛋白，采用已上市的CDK4/6抑制剂帕博西尼作为靶蛋白配体，同时选用全合成的小分子HSP90抑制剂BIIB021作为HSP90结合端，通过不同长度的聚乙二醇或碳链连接两者，合成了一系列HEMTAC分子。 在B16F10黑色素瘤细胞中，化合物26展现出了最优的降解活性：对CDK4的DC50约为26 nM，对CDK6约为19 nM，最大降解率分别达到88%和92%，且在12小时内即可明显观察到降解效果。机制验证方面，加入蛋白酶体抑制剂MG132后降解完全被阻断；构建负对照分子（乙酰化修饰HSP90结合位点）完全丧失降解能力，排除了单纯的HSP90抑制效应；共免疫沉淀实验直接检测到了HSP90、化合物26与CDK4/6三者共存的三元复合物。在小鼠B16F10黑色素瘤异种移植模型中，化合物26以40 mg/kg剂量腹腔注射给药两周后，肿瘤体积明显缩小，且小鼠体重无明显下降，显示出良好的体内耐受性。 Figure 2 Design of CDK4/6-targeting HEMTACs. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01648 靶向“不可成药”GPX4：HIM-PROTAC（2024年） 谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是铁死亡通路中的关键抑制因子，其活性位点浅平、难以被传统小分子抑制剂精准靶向，因此降解策略具有独特优势。覃江江团队在2024年发表于《Journal of Medicinal Chemistry》的研究中，设计了一类名为HIM-PROTAC的新型降解工具。他们合成了两个系列的分子，其中GDCNF-11表现出最强的降解活性，DC50低至0.08 μM，且降解效果在12小时内开始显现，24小时接近完全。 机制验证方面，加入MG132后GPX4降解被完全阻断；共免疫沉淀实验直接检测到了HSP90、HIM-PROTAC与GPX4三者形成的三元复合物；表面等离子体共振实验证实GDCNF-11与HSP90的结合亲和力（KD=0.19 μM）与母体抑制剂BIIB021相当。负对照分子（乙酰化或去除HSP90配体）完全丧失降解能力。通过siRNA敲低实验发现，CUL5和CHIP是参与GPX4泛素化的主要E3连接酶。在功能上，GDCNF-11能够显著提高细胞内脂质过氧化物水平、活性氧和亚铁离子浓度，并引起典型的铁死亡形态学变化。在HT-1080异种移植小鼠模型中，腹腔注射GDCNF-11（50 mg/kg）显著抑制肿瘤生长，且未引起明显的体重下降或主要脏器毒性。相比之下，将ML162和BIIB021联合给药的小鼠在治疗第10天即开始死亡，说明HIM-PROTAC并非两种抑制剂的简单叠加，而是通过协同招募HSP90/E3复合物实现了更安全、更有效的降解。 Figure 3 (A) Schematic diagram of system Xc-/GSH/GPX4 axis to trigger ferroptosis. (B) Representative chemical structures of reported GPX4 inhibitors. (C) Schematic diagram of HSP90 recruiting E3 ubiquitin ligases. (D) Representative chemical structures of reported HSP90 inhibitors. (E) Schematic diagram of heat shock protein 90 interactome-mediated proteolysis targeting chimera (HIM-PROTAC) to degrade POI. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.4c01518 突破客户蛋白限制：HSPTAC降解PARP1（2025年） 此前所有HSP90介导的降解对象均为HSP90的天然客户蛋白，这意味着HSP90抑制剂本身就可能引起非特异性的客户蛋白降解。本团队在2025年发表于《Journal of Medicinal Chemistry》的研究中，成功将HSP90介导的降解策略拓展到了非客户蛋白PARP14。他们首先通过生物层干涉实验、pull-down实验和定量蛋白质组学分析，证实PARP1与HSP90之间不存在直接结合，且HSP90抑制剂AT13387无法诱导PARP1降解。在此基础上，他们设计了一类名为HSPTACs的双功能分子，由AT13387、奥拉帕尼以及不同连接链组成。 经过系统筛选，化合物DDO3602表现出最优的降解活性：在MCF-7乳腺癌细胞中，DC50为490.3 nM，在1 μM浓度下可降解约70%的PARP1蛋白，且降解在3小时内即开始显现。全蛋白质组学分析显示DDO3602对PARP1具有高度选择性。机制验证方面，生物层干涉实验表明，在DDO3602存在下HSP90与PARP1可被桥接（亲和力66.5 nM）。共免疫沉淀实验直接检测到了三元复合物。加入MG132后PARP1降解被完全阻断，且泛素化检测显示多聚泛素化修饰增加。质谱鉴定出至少五种E3连接酶（TRIM25、UBR5等）参与了降解。更重要的是，DDO3602展现出了显著的肿瘤选择性：在MCF-7细胞中有效降解PARP1，而在正常乳腺上皮细胞MCF-10A中无效。在小鼠MCF-7异种移植模型中，20 mg/kg DDO3602显著抑制肿瘤生长，效果优于奥拉帕尼、AT13387及两者联合用药。组织分布实验显示，给药12小时后肿瘤组织中DDO3602的浓度比肝脏、肾脏高出33倍以上。 Figure 4 Design of PARP1-HSPTACs. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5c00409 临床新靶点拓展：CHAMP降解ERK5（2026年） 2026年，Yang、Yin等人在《Cell Communication and Signaling》上报道了基于CHAMP平台的ERK5降解剂RNK06138及后续口服优化分子RNK06395。RNK06138在MOLP‑8骨髓瘤细胞中的DC50为111.7 nM，最大降解率74%；在多种实体瘤细胞系中DC50均低于100 nM。Co-IP实验直接捕获到HSP90‑RNK06138‑ERK5三元复合物。与AX15836相反，RNK06138不仅不促进ERK5入核，反而剂量依赖地降低其水平。在A427移植瘤模型中，RNK06138给药后72小时肿瘤内浓度远高于血浆及正常组织，肿瘤生长抑制率达67%-103%。为改善口服生物利用度（RNK06138的口服F仅0.38%），研究者通过缩短连接链获得RNK06395，口服F提升至7.6%。在A427模型中，口服50 mg/kg每日一次使肿瘤抑制率达87%；在MOLP‑8移植瘤中，治疗后肿瘤体积缩小至接近无瘤状态。 Figure 5 Development of a chaperone-mediated protein degrader targeting ERK5 that efficaciously reduces tumor growth. DOI: 10.1186/s12964-026-02682-w 范式革新：HSP70-PROTAC双通路降解（2025年） 上述所有工作均基于HSP90。2025年，覃江江团队在《Advanced Science》上报道了首个基于HSP70的PROTAC技术（HSP70-PROTAC），将分子伴侣介导的降解从HSP90拓展至HSP70，并首次实现了UPS与分子伴侣介导自噬（CMA）的双通路协同降解。 研究人员以GPX4为靶点，将ML162与HSP70抑制剂apoptozole连接，得到GDAz-3。在HT-1080细胞中，GDAz-3的DC50低至0.13 μM，且在8小时内即可明显降低GPX4水平，降解速率显著快于HSP90-based HIM-PROTAC。机制验证方面，加入MG132后降解被完全阻断，且泛素化增加，表明UPS是主要途径。更令人兴奋的是，透射电镜观察到大量自噬体，自噬抑制剂3-MA可部分逆转降解，敲低CMA关键受体LAMP2A后效应减弱，免疫荧光显示GPX4与LAMP2A共定位增加。首次证明HSP70-PROTAC能同时激活UPS和CMA。研究发现Hsc70通过共伴侣蛋白BAG3与CHIP连接，敲低BAG3或CHIP完全消除降解，明确了Hsc70-CHIP-BAG3复合物的核心作用。 与经典PROTAC相比，HSP70-PROTAC展现出克服耐药的潜力：在CRBN或VHL敲低的HT-1080细胞中，GDAz-3仍能有效降解GPX4；在内源性VHL缺失的786-O细胞中，GDAz-3依然有效，而VHL-based PROTAC和HSP90-based HIM-PROTAC均无效。此外，该策略具有普适性：将apoptozole与JQ-1连接后，GDAz-15能有效降解BRD4。在HT-1080异种移植小鼠模型中，GDAz-3（60 mg/kg）显著抑制肿瘤生长（TGI=67%），且未引起明显体重下降或脏器毒性；而ML162或apoptozole单用或联用均导致小鼠死亡。药物分布实验显示，GDAz-3在肿瘤组织中的浓度显著高于心、肝、肺、肾等正常组织。 Figure 6 The reported active GPX4-targeting degraders and schematic diagram of HSP70-PROTAC to degrade POI via UPS and CMA. DOI: 10.1002/advs.202513655 临床进展与突破：CHAMP平台的启示 在上述众多技术路线中，珃诺生物的CHAMP平台无疑是走得最远的一个。RNK05047（BRD4降解剂）的临床初步结果显示其安全有效，目前处于中美II期。而RNK06395（ERK5降解剂）的成功口服优化，证明了CHAMP平台不仅适用于血液瘤，也能在实体瘤相关靶点上实现高效降解。从临床转化的角度看，HSP介导降解技术面临几个关键问题：分子量问题（双功能分子通常超过600 Da），但RNK06395通过连接链优化将口服生物利用度提升至7.6%，证明优化空间存在；热休克反应（HSP90抑制剂本身会诱导HSP70上调），但CHAMP分子通过桥接机制而非抑制机制，引发的反应显著减弱；肿瘤选择性（已有多个研究证实肿瘤组织中分子蓄积远高于正常组织），这为治疗窗口提供了理论基础。 思考与展望 HSP介导的靶向蛋白降解技术，在短短两年内完成了从概念验证到临床II期的跨越。它深刻揭示了细胞内蛋白稳态调控网络的“可编程性”——分子伴侣天然就是连接底物与降解机器的高效平台。然而，繁华之下，暗流涌动。 机制深度决定技术高度。 目前仅鉴定出CHIP、CUL5、TRIM25等少数E3连接酶，但HSP90的相互作用组包含超过300种蛋白，其中E3连接酶多达数十种。未来需要借助化学蛋白质组学、CRISPR筛选和冷冻电镜等技术，系统绘制“分子伴侣-E3-底物”的三维图谱。临床转化面临真实考验。 双功能分子的口服生物利用度和透膜性仍是传统难题；长期用药是否激活代偿性保护通路，需审慎评估；正常组织中的“脱靶降解”风险可能导致意料之外的毒性。范式突破才刚刚开始。 HSP70-PROTAC可同时激活UPS和CMA双通路，这提示分子伴侣介导的降解可能远比我们想象的复杂。不同分子伴侣所招募的E3网络存在显著重叠但又不完全相同，未来或可根据肿瘤的E3连接酶表达谱，个性化选择最佳的降解支架。 从更广阔的视角看，HSP介导降解技术不仅仅是PROTAC的“替补队员”，它正在开创一个全新的药物哲学：不是外源性引入人工组件，而是深度驯化细胞内源的高阶调控网络。展望未来，基于HSP的降解剂有望从肿瘤靶点延伸至神经退行性疾病、抗病毒乃至抗衰老领域。而能否将这些令人兴奋的实验室发现转化为患者床头的良药，将决定这一新范式最终是昙花一现，还是真正改写药物研发的版图。 参考资料： 1. Foley KP, Ye L, Wang M, et al. Abstract 971: Chaperone-mediated protein degradation (CHAMP): A novel technology for tumor-targeted protein degradation. Cancer Research. 2021;81:971-971. 2. Li Z, Ma S, Zhang L, et al. Targeted Protein Degradation Induced by HEMTACs Based on HSP90. J Med Chem. 2023;66(1):733-751. 3. Dong J, Ma F, Cai M, et al. Heat Shock Protein 90 Interactome-Mediated Proteolysis Targeting Chimera (HIM-PROTAC) Degrading Glutathione Peroxidase 4 to Trigger Ferroptosis. J Med Chem. 2024;67(18):16712-16736. 4. Liu W, Liu J, Shu H, et al. HSP90 Mediates Targeted Degradation of Nonclient Protein PARP1 for Breast Cancer Treatment. J Med Chem. 2025;68(19):19933-19954. 5. Yang X, Yin W, Xu M, et al. Development of a chaperone-mediated protein degrader targeting ERK5 that efficaciously reduces tumor growth. Cell Commun Signal. 2026;24(1):157. 6. Dong J, Li Y, Liang H, et al. HSP70 Interactome-Mediated Proteolysis Targeting Chimera (HSP70-PROTAC) for Ferroptosis-Driven Cancer Treatment. Adv Sci (Weinh). 2026;13(12):e13655. 往期回顾： 变构位点：难药靶标的突破点 逆合成驱动的分子生成：AIDD 最后一公里？ FBDD：解锁难成药靶点 CIP：药物设计的时空与逻辑 抗肥胖药物：从单靶点到多通路 排版/整理：杨俊杰

肝内胆管癌（iCCA）是第二大原发性肝癌，恶性程度高、预后极差，晚期患者中位生存期仅约1年。它最让人头疼的，不是没有药，而是肿瘤内部高度“杂乱”——同一块肿瘤里，不同区域的基因、免疫、代谢完全不一样，这就是肿瘤内异质性（ITH）。因为异质性，临床分型经常“判错型”、治疗“踩空”、免疫药“没效果”，成了精准治疗的最大拦路虎！近日，樊嘉院士团队破解了这一“卡脖子”难题！ 3月30日，复旦大学中山医院樊嘉院士团队在Cell子刊《Cell Reports Medicine》（IF=10.6）发表了题为“Robust transcriptomic hallmarks targeting intratumor heterogeneity in intrahepatic cholangiocarcinoma”的重磅研究。该研究通过整合多组学数据，系统性探究了基因表达异质性在肝内胆管癌（iCCA）中的生物学基础及其对现有分子分类的影响，进一步开发了一个受基因表达异质性影响较小的稳健分类系统，将不同的 iCCA 亚型与特定的治疗机会联系起来，并确定了亚型特异性的免疫组化和血清生物标志物。这些研究结果为将分子分类转化为临床实践铺平了道路，为未来临床探索中的精准治疗策略提供了潜在框架。研究策略全景解析：利用多区域转录组数据，系统表征iCCA基因表达异质性特征，证实肿瘤微环境（免疫/基质）是驱动ITH的主要因素。稳健分型：筛选低肿瘤内异质性、高肿瘤间差异性（LIHV）基因集，构建不受取样偏差影响的分子分型体系。机制挖掘：结合单细胞测序、免疫微环境解析与功能实验，阐明CXCL5-中性粒细胞在炎症型iCCA中的关键作用，揭示各亚型免疫逃逸与信号通路特征。临床转化：鉴定GPRC5A、VTCN1等免疫组化标志物及CEA、CA19-9血清标志物，提出HSP90抑制剂联合抗PD-1、抗PD-1联合抗TIM-3等亚型特异性治疗方案。 关键结果一、iCCA肿瘤内基因表达异质性景观为刻画肝内胆管癌（iCCA）的基因表达肿瘤内异质性（ITH），研究者分析了该团队既往研究中的多区域取样iCCA队列（45例患者，205个肿瘤亚区，每例患者3–6个亚区），并基于RNA测序的无监督层次聚类。结果表明大多数肿瘤内亚区域按患者聚集（37/45），8名患者表现出分离的亚区（图1A）。证实iCCA中基因表达ITH的普遍存在。通过计算每个基因在肿瘤内亚区间的标准差，并在基因水平和患者水平汇总分数，对基因表达ITH进行定量。患者级基因表达ITH与肿瘤纯度、免疫评分和基质评分呈正相关（图1B）。通过每个肿瘤不同数量的亚区域模拟患者层面的基因表达ITH以评估采样次数对基因表达ITH的影响。结果显示大多数肿瘤中约四次样本后，ITH分数趋于平稳（图1C），表明在iCCA内采集四个亚区通常足以捕捉基因表达多样性。在基因层面，基质和免疫细胞标志物的基因表达ITH分数高于其他基因（图1D）。这一发现得到了基质和免疫细胞相关特征中ITH分数升高的支持（图1E）。相比之下，增殖相关的标志基因表现出低表达水平的IITH，包括MYC靶点、有丝分裂纺锤体、E2F靶点和G2M检查点。参与蛋白质分泌和DNA修复的基因中观察到最低的ITH分数。这些结果表明肿瘤微环境是基因表达ITH的关键驱动因素。 图1 患者基因表达ITH及iCCA基因水平分析 二、基因表达ITH对分子亚型和预后预测的影响为评估基因表达ITH如何影响分子分型，将8种已发表的iCCA转录组分型方法应用于本多区域取样队列。27.8%的肿瘤受取样偏倚影响（同一肿瘤根据取样亚区不同可被归入不一致亚型）（图2B）。在多区域取样iCCA队列（45例患者）中使用分型方法中的基因集进行层次聚类，将肿瘤亚区分为2–45个簇。聚类一致性曲线清晰显示，不同基因集受ITH影响程度不同：Andersen基因集受影响较小，Job基因集更易受影响（图2C）。分析3个近期发表的iCCA单细胞RNA测序队列数据，并量化8个基因集在不同细胞类型中的表达。8个基因集呈现截然不同的表达分布（图2D）。基于3个scRNA-seq队列中肿瘤细胞与其他细胞类型间的显著差异表达，将基因分为三组：肿瘤细胞高表达、肿瘤细胞低表达、其他。在8个基因集中，Andersen基因集包含最高比例的肿瘤细胞高表达基因，而Job基因集具有最高比例的肿瘤细胞低表达基因（图2E）。这些发现提示肿瘤细胞特异性基因可能受基因表达ITH影响更小。收集了7种已发表的iCCA预后表达特征，并计算每个肿瘤亚区的风险分数，46.7%的患者同时具有高风险与低风险肿瘤亚区，提示这些预后表达特征的效力显著受ITH影响（图2F）。超过半数患者存在误分类风险，并可能接受不恰当治疗。这些结果强调基因表达ITH影响大多数现有分子分型与预后表达特征，增加iCCA误分类风险。 图2i CCA中已发表分子亚型和预后特征的鲁棒性 三、低肿瘤内异质性/高肿瘤间变异性（LIHV）基因集鉴定研究者进一步优化筛选策略，在表达水平绘制每个基因的ITH与肿瘤间异质性分数。采用分位数回归评估ITH与肿瘤间异质性的关系，并建立两个标准筛选目标基因：肿瘤间异质性分数高于均值；基因位于回归线下方且超出95%置信区间。该方法鉴定出1341个呈现相对更高肿瘤间异质性而非ITH的基因（图3A，被命名为低肿瘤内异质性/高肿瘤间变异性（LIHV）基因集，其分型稳健性最优，反映在聚类一致性曲线中（图3B）。将8个已发表转录组分型方法的基因集标注到散点图中，观察到截然不同的分布模式（图3C）。Andersen、Job和Sia基因集分别主要聚集在右下、右上和左侧区域（图3C）。这种分布提示Andersen基因集受ITH影响较小，而Job基因集更易受影响。一致地，Andersen基因集具有最高比例的LIHV基因，而Job基因集和Sia基因集的比例显著更低，这与其各自分型稳健性相关（图3B、3D）。这些结果提示LIHV基因集在同一肿瘤不同亚区表达均一，且在不同iCCA间具有强区分能力。来自3个scRNA-seq队列的表达谱显示，LIHV基因集包含在多种细胞类型中高表达的基因，其中肿瘤细胞占比最大（图3E）。KEGG通路分析显示其富集于药物代谢、O-糖链生物合成与MAPK信号相关通路（图3F），这与MAPK信号和糖链生物合成在iCCA早期肿瘤发生中的关键作用一致。比较LIHV基因集与其他基因的拷贝数改变模式。LIHV基因集显著富集克隆性拷贝数增加，而克隆性与亚克隆性缺失均减少（图3G），提示早期拷贝数增加可能有助于肿瘤亚区间的稳健表达。综上，鉴定出在表达水平具有LIHV特征的核心基因集，为理解其与iCCA肿瘤发生的潜在关联提供见解。 图3 LIHV基因集的鉴定与特征 四、不受ITH影响的分子分型体系构建为建立最大化肿瘤间差异、最小化肿瘤内取样偏倚的稳健分子分型，研究者使用LIHV基因集在4个独立iCCA队列中进行层次聚类。鉴定出5个不同分子亚组：炎症型（SI）、代谢型（SII）、非典型型、（SIII-1）、免疫沉默型（SIII-2）、神经退行型（SIII-3）每个亚组在预后、临床病理特征、CNV和基因突变方面均存在显著差异（图4A）。炎症型预后最差，其次为代谢型；而非典型、免疫沉默和神经退行型在所有4个队列中呈现相近且更优的总生存期（图4B）。这些结果强调该分子分型的可重复性与预后相关性。临床层面，在所有队列中，炎症型iCCA以大导管型、血管侵犯增加、淋巴转移、糖类抗原19-9（CA19-9）和癌胚抗原（CEA）水平升高及TNM晚期为主要特征（图4A）。遗传层面，在Fu-iCCA队列中：炎症型显著富集KRAS和SMAD4突变；代谢型富集TP53突变；免疫沉默型富集FGFR2改变；神经退行型富集IDH1/2突变（图4C）。免疫沉默型和神经退行型具有更高频率的3p21.3（BAP1）拷贝数缺失，与这些亚组中BAP1突变富集一致（图4A、4C）。通过计算KEGG通路与MSigDB特征集分数，比较各亚组的转录组与蛋白质组特征（图4D）。在4个iCCA队列中：炎症型iCCA特征为糖酵解、磷酸戊糖途径、聚糖代谢、炎症反应及多种肿瘤发生相关信号通路上调，包括MAPK、ERBB和VEGF信号；代谢型iCCA显著上调脂类、氨基酸和维生素代谢通路；神经退行型iCCA主要与神经退行性疾病通路及TGFβ信号激活相关；非典型与免疫沉默型未观察到特异性通路富集。将其应用于多区域取样iCCA队列，发现45例患者中仅1例出现分型不一致：5个肿瘤亚区被归为代谢型，1个归为神经退行型（图4E）。这表明该分型体系有效最小化表达水平ITH的影响。所定义的亚组同样与既往iCCA分子亚型部分相关（图4F）。综上，该研究提出不受ITH影响的分型体系，鉴定出5个亚组各自独特的分子与临床病理特征。 图4 LIHV定义亚群的临床病理学和分子特征 五、该分型揭示独特的肿瘤免疫微环境为探究不同亚组的肿瘤微环境，使用TIMER2.0和Danaher等方法分析免疫细胞亚群。结果发现，中性粒细胞在炎症型iCCA中持续富集。巨噬细胞在大多数比较中主要富集于代谢型iCCA。淋巴细胞或基质细胞未观察到一致差异（图5A）。对Fu-iCCA队列的配对组织芯片（n=179）进行免疫组化（IHC）。与免疫分析结果一致，炎症型与代谢型分别呈现CD66b+中性粒细胞（P=0.002）与CD68+巨噬细胞显著增加，5个亚组间CD3+T细胞、CD20+B细胞或αSMA+成纤维细胞无显著差异（图5B）。进一步比较5个亚组的免疫特征。代谢型在4个iCCA队列中细胞毒性活性与T细胞共刺激分子表达升高，同时伴随T细胞共抑制与免疫检查点活性增强（图5C）。相反，免疫沉默型的细胞毒性活性、II型干扰素（IFNγ）反应与免疫检查点活性显著降低，其次为非典型型。代谢型多种免疫检查点表达升高，包括CTLA-4、LAG3和TIGIT（图5C），提示免疫抑制性肿瘤微环境。SIII亚组（非典型、免疫沉默、神经退行）呈现B7-H4（VTCN1）和B7-H3（CD276）高表达，尤其是神经退行型呈现TIM-3（HAVCR2）显著上调（图5C）。这些发现强调5个亚组间独特的肿瘤免疫景观与肿瘤-免疫相互作用，这些因素共同影响肿瘤进展与患者预后。 图5 LIHV定义亚组间不同的免疫微环境 为鉴定与炎症型iCCA中性粒细胞浸润增加相关的关键趋化因子，进行趋化因子表达与中性粒细胞浸润水平的相关性分析。在中性粒细胞趋化因子中，CXCL5与中性粒细胞浸润呈现最强正相关，免疫组化与免疫分析结果均证实这一点（图5D）。CXCL5在4个iCCA队列的炎症型iCCA中均显著升高（图5E），并在Fu-iCCA队列中于蛋白水平得到验证。比较Xue的scRNA-seq队列中不同细胞类型的平均表达水平，结果显示肿瘤细胞与巨噬细胞CXCL5表达高于其他细胞类型（图5F）。炎症型iCCA样本的肿瘤细胞与巨噬细胞CXCL5表达显著高于其他亚组（图5G）。qPCR与Westernblot均验证敲低与过表达效率，其中siCXCL5-1敲低效果最显著，被选用于进一步研究（图5H）。从2名健康供体分离中性粒细胞，并与肿瘤细胞在Transwell小室中共培养。RBE细胞中CXCL5过表达显著促进中性粒细胞迁移，而HuCCT1细胞中CXCL5敲低抑制中性粒细胞迁移（图5I）。在CXCL5过表达RBE与对照HuCCT1细胞中，使用抗CXCL5抗体阻断CXCL5均抑制中性粒细胞迁移（图5I），证实CXCL5在中性粒细胞迁移中的关键作用。通过流体动力学尾静脉注射（HTVI）与原代细胞培养构建携带KRASG12D突变和Trp53敲除（KTP）的小鼠iCCA细胞模型，随后使用慢病毒诱导CXCL5过表达，并通过qPCR与Westernblot验证（图5J），将对照与CXCL5过表达KTP细胞皮下注射到同系C57BL/6J小鼠。来源于CXCL5过表达KTP细胞的肿瘤显著更大、生长更快（图5K）。肿瘤组织流式细胞术分析显示，CXCL5过表达肿瘤中浸润中性粒细胞数量与比例均显著增加（图5L）。这些发现强调CXCL5在肿瘤进展与炎症微环境形成中的关键作用。六、靶向亚型特异性脆弱性的有效治疗策略为探究亚型特异性治疗脆弱性，研究者分析了该团队既往研究中iCCA类器官的体外药物反应数据。使用NTP方法将iCCA类器官分为不同亚组。12例iCCA类器官样本中，8例归为炎症型，2例归为免疫沉默型，1例归为神经退行型，1例未分类。对于临床iCCA标准治疗基石药物吉西他滨，炎症型iCCA类器官比免疫沉默与神经退行型更敏感（图6A）。炎症型iCCA类器官对促凋亡药物呈现反应性，与其凋亡信号增加（图4D）和凋亡抑制基因BCL2表达降低一致。炎症型iCCA类器官对靶向热休克蛋白90（HSP90）与受体酪氨酸激酶（RTK）信号的药物更敏感（图6A），与炎症型iCCA转录组信号通路改变一致。使用9种可用工具（主要基于抗PD-1临床试验）预测其对免疫检查点抑制剂的敏感性。代谢型最敏感、炎症型最耐药的趋势（图6B），与代谢型iCCA多种免疫检查点表达上调一致（图5C）。对KTP细胞来源的肿瘤组织进行RNA-seq，并与常用iCCA小鼠HTVI模型整合，KRAS/p19与KRAS/Trp53模型类似炎症型，而NICD/AKT与YAP/AKT模型分别重现免疫沉默型与神经退行型特征（图6C）。KRAS/p19与KRAS/Trp53模型均呈现炎症反应、凋亡、KRAS与mTOR信号升高（图6C）。在KTP细胞中使用多种对炎症型有效的药物进行体外药物测试，HSP90抑制剂展现最理想抗肿瘤反应，被选用于炎症型iCCA的免疫联合治疗（图6D）。构建KRAS/p19与KRAS/Trp53HTVI模型，并使用溶剂对照、抗PD-1、Alvespimycin（HSP90抑制剂）或Alvespimycin联合抗PD-1治疗（图6E）。在KRAS/p19与KRAS/Trp53模型中，抗PD-1治疗组的CK19+肿瘤区域比例与对照组相近（图6F）。这些结果提示炎症型iCCA对抗PD-1治疗耐药，与我们早期预测一致（图6B）。Alvespimycin与联合治疗相比对照组显著降低CK19+肿瘤区域比例，联合治疗呈现最优抗肿瘤反应（图6F、6G）。抗PD-1治疗组的肿瘤体积与重量与对照组相近，而Ganetespib与联合治疗显著抑制肿瘤生长（图6H）。这些发现提示HSP90抑制有效抑制炎症型iCCA的肿瘤进展，并可能增强抗PD-1治疗疗效。对于呈现TIM-3表达特异性上调的神经退行型iCCA（图5C），构建YAP/AKTHTVI模型，并测试抗PD-1联合抗TIM-3的双免疫检查点策略（图6E）。联合治疗相比对照与抗PD-1单药组显著降低CK19+肿瘤区域比例（图6I），提示抗PD-1联合抗TIM-3可能是神经退行型iCCA的有前景治疗策略。 图6 亚型特异性治疗脆弱性的识别 七、亚型特异性免疫组化与血清标志物鉴定为推动该分型的临床转化，研究者通过监督分析鉴定能够区分不同iCCA亚组的免疫组化生物标志。在LIHV基因集（n=1341）中，在至少3个iCCA队列中鉴定出176个在炎症型（SI）显著上调、71个在非典型/免疫沉默/神经退行型（SIII）上调的基因。经过严格筛选选出6个SI特异性与6个SIII特异性基因，各自在亚组间呈现独特表达模式。在Fu-iCCA队列的配对组织芯片上进行免疫组化，并量化每例iCCA病例的H-评分。scRNA-seq数据与免疫组化图像证实，这些基因主要在肿瘤细胞中表达（图7A）。炎症型iCCA的GPRC5A、S100P、CEACAM5H-评分显著更高，而SIII型iCCA的VTCN1、FXYD2、CHST9、ANXA9、DCDC2、ZBTB20H-评分升高（图7B）。绘制受试者工作特征（ROC）曲线，GPRC5A、S100P、CEACAM5、VTCN1、FXYD2与CHST9的曲线下面积（AUC）分别为0.853、0.818、0.805、0.814、0.790与0.750（图7C）。在SIII特异性免疫组化标志物中，VTCN1（又称B7-H4）展现最优诊断效率（图7C）。基于GPRC5A与VTCN1的最佳H-评分截断值将iCCA样本分为四个象限，准确率达65.9%（112/170；图7D）。在独立验证队列（n=209）的组织芯片上进行GPRC5A与VTCN1免疫组化，将不同象限的肿瘤样本分为SI、SII、SIII或未分类iCCA（图7D）。SI、SII与SIII型iCCA患者生存期存在显著差异，其中SIII型生存期最优，SI型最差（图7E）。两种常用血清生物标志物CA19-9与CEA在炎症型iCCA病例中均显著升高（图7F）。血清CEA与CA19-9的AUC在Fu-iCCA队列中分别为0.773与0.797，在HRA004766队列中分别为0.836与0.700（图7G）。这些发现强调血清CEA与CA19-9在炎症型iCCA无创诊断中的前景。 图7 亚型特异性生物标志物与临床分层 总结该研究以攻克iCCA肿瘤内异质性为核心策略，通过多区域+单细胞+多组学解析ITH驱动机制，筛选LIHV稳定基因集建立五分型体系，系统揭示各亚型临床、遗传、免疫与代谢特征，鉴定GPRC5A/VTCN1/CEA/CA19-9临床标志物，并提出HSP90i+PD-1、PD-1+TIM3等亚型精准治疗方案，最终形成一套不受异质性干扰、可直接临床转化的iCCA精准诊疗新范式。参考文献Lin Y, Peng L, Zhao H, et al. Robust transcriptomic hallmarks targeting intratumor heterogeneity in intrahepatic cholangiocarcinoma. Cell Rep Med. Published online March 30, 2026. doi:10.1016/j.xcrm.2026.102708中新法泽多维一体整合空间多组学解决方案北京中新法泽生物科技有限公司位于科研院校和创新人才聚集地北京海淀。公司围绕“中心法则”这一分子生物学的核心教条，专注常规、单细胞和空间多组学技术创新和服务，致力利用多维一体数据整合策略让前沿多组学技术为诊疗标志物开发、药物研发、动植物育种和基础研究创造价值，助力解读生命调控密码，改善人类健康。中新法泽致力提供从上游高通量探索到下游靶向验证，从空间转录组到空间蛋白组到空间代谢组，从细胞组成到空间分布，从临床发现到动物模型验证的一站式解决方案。