AAV基因疗法开发的进展及质量控制

2024-03-12

基因疗法临床申请

嘉宾阵容以及授课话题已曝光，点击图片查询，合作热线：王晨 180 1628 8769文章来源：生物药知识云享腺相关病毒（AAV）载体是基因治疗领域最常使用的病毒载体之一，可将健康的基因拷贝运送到患者的细胞中，其应用潜力已经得到了大量的验证。作为递送基因疗法的有力工具，AAV具有许多吸引人的特征，包括无致病性、高效的长期基因表达、易于基因操作以及免疫反应低等特点，令人满意的一系列特性是其作为基因递送工具的重要原因。近年来，两款AAV基因疗法获批上市，包括治疗眼部疾病的Luxturna和靶向中枢神经系统的Zolgensma，进一步推动AAV成为了业界关注的焦点，持续升温。▲ Luxturna（左）和Zolgensma（右）目前，国内外AAV基因疗法的临床试验达200多项，在多种适应症上取得了进展，包括罕见眼科疾病、先天性耳聋、β地中海贫血症、血友病、杜氏肌营养不良、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、溶酶体贮积症等。国内近期也迎来了两款AAV体内基因治疗的监管动态：2021年3月，纽福斯宣布AAV基因治疗NR082获得国家药品监督管理局（NMPA）颁发的注册性药物临床试验（IND）许可，用于Leber遗传性视神经病变。NR082是国内首个获得临床试验许可的眼科体内基因治疗药物。2021年8月，信致医药（信念医药全资子公司）自主研发的BBM-H901注射液，一种用于预防血友病B成年男性患者出血的AAV基因治疗药物，获得NMPA的IND批准。这是国内第一个获批进入注册临床试验的血友病AAV基因治疗药物，也是国内第一个全身给药的罕见病基因疗法。然而，制造出一种安全有效的AAV疗法并不容易。其生产过程具有复杂性，开发人员首先生产包含所需DNA序列的AAV，利用细胞培养构建载体，然后经过提取和纯化病毒颗粒。另外，与AAV开发相关的质量问题也可能来自方方面面。首先，AAV载体培养过程通常无法产生足够的病毒滴度。其次，提取到的病毒颗粒可能含有残留的宿主细胞成分，例如蛋白质、核酸、细菌和其他病毒，以及来自血清和动物的细胞培养基中的蛋白质。最后，一些AAV衣壳可能不包含预期的序列，即它们可能是空的，或者包含错误包装的宿主细胞DNA。所有这些挑战都会给患者带来很大风险，但是有一个共同点，就是需要严格的质量控制。因此，确保所有AAV批次达到适当的病毒滴度，并且不含有害杂质和污染物，是十分关键的。➤ 病毒滴度只有当达到足够的病毒滴度，AAV基因治疗才能够有效地发挥作用。然而，传统上游工艺产生的病毒滴度，往往低于治疗患者所需。为了达到有效剂量，批次需要浓缩100到10,000倍。然而，许多已有的浓缩装置并不是针对AAV设计的，无法将AAV病毒浓缩到如此小的体积。此外，该过程还增加了批次中宿主细胞污染物的浓度，为污染物的检测和去除增加了难度。➤ 空衣壳空衣壳不具备治疗效果，是可能影响AAV基因治疗有效性的主要杂质。这些衣壳还会与完整衣壳竞争结合受体，空壳率高则使得达到治疗效果需要加大剂量，但这可能会增加副作用，特别对于靶向大脑、脊髓等体积较小的组织，将更具有挑战性。另外，空衣壳会带来不必要的免疫原性风险。虽然AAV被认为是一种免疫原性低的递送载体，并且AAV衣壳中不含工程化脂质体或其他化合物。但衣壳蛋白本身可以引发先天免疫反应，阻碍病毒感染人体细胞并降低治疗效果。▲ rAAV生产过程中产生的主要衣壳类型（图片来源：Molecular Therapy）总的来说，AAV在生产工艺上，对载体生产的纯度有很高要求。空衣壳不仅增加了AAV基因治疗的所需剂量，还会导致不必要的副作用，并引起针对病毒的不必要的免疫反应。因此，空壳病毒作为杂质需要采用经过验证的方法，进行有效检测并最大限度地去除，同时明确含量的测定。AAV空壳率的检测一直是难点，分析型超速离心技术（AUC）依据空壳病毒与全病毒颗粒沉降系数的不同，可以精确测定产物种AAV病毒载体的空壳率，同时可以检测中间产物、病毒载体碎片、基因组碎片、病毒聚集体等。AUC是业内公认的AAV空壳率检测 “金标准”。毛细管电泳（CE）具有分辨率高、操作自动化、样品量小等优点，近年来已成为生物样品分析中最先进的分析方法之一，也已经应用于了制药企业的药物申报和质控。CE是一类以毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力，依据样品组分之间电泳淌度和分配行为的差异而实现分离的新型液相分离技术。1. AAV药物开发不同阶段对于AAV专属性分析的要求AAV药物早期开发分为药物开发、工艺开发和中试生产三个阶段，不同阶段在测试分析需求上有所差异。在AAV药物相应控制的质量属性也存在较大的差异。三个阶段重点关注的测试分析重点见下表：2. CMC过程中AAV质量控制阶段的关键质量属性根据ICH Q8，除了一般特性外，还包括鉴别、含量及效价、纯度、杂质、安全性几个方面的关键质量属性。基于已上市的3款AAV药物及FDA等审评中心的发表意见，我们总结AAV在CMC过程中，AAV质量控制的关键属性一般的设置如下表。其中品种专属的质量属性空壳率、感染滴度、rcAAV检查分别代表了AAV在纯度、效价、安全方面的关键指标，、目前在CMC阶段受监管机构的重点关注。我们可以针对下列质量属性已开发约40多套平台检验方法，几乎全面覆盖CMC阶段表征和质控的要求，并能提供分析方法验证/确认，批放行等服务，助力企业提交IND申报。 3. AAV的鉴别项目AAV的鉴别项目通常采用SDS PAGE或者CE-SDS可以实现AAV结构蛋白VP1、VP2、VP3的鉴别，采用Sanger测序对特征序列进行测序鉴别。作为CDMO公司，我们同时可能会进行数个产品的生产，对于血清型的鉴别我们还采用包括液相质谱平台对血清型结构蛋白序列进行鉴别。 4. AAV定量分析的方法在检测AAV的含量时，通常采用基因组滴度或者衣壳滴度作为单位。基因组滴度一般采用荧光定量PCR、ddPCR、染料法、UV/Vis等方法来测定基因组滴度；衣壳滴度主要是通过ELISA、HPLC、SEC MALS等方法来测定衣壳滴度。qPCR和ddPCR这两种方法使用较多。qPCR的缺点是对PCR抑制剂敏感，同时存在引物扩增效率偏好，方法精密度较差的特点。基因组滴度检测采用ddPCR（微滴式数字PCR）在精密度上获得较为满意的结果，且该方法绝对定量，无需标准品，精密度良好、回收率高，也可用于裂解液中间品。实验室采用了qPCR和ddPCR对不同的靶基因进行了检测，结果表明ddPCR具有更好的精密度，可获得较为稳健的结果。 5. 工艺开发过程中的杂质研究一般包括宿主细胞DNA大小分布及残留、宿主细胞蛋白残留、质粒DNA残留、核酸酶残留、特定工艺相关残留（如亲和配基、BSA）、去污剂残留。对于宿主细胞DNA残留，还需关注衣壳内外残留水平差异。 6. 质控空壳率的意义及如何检测AAV空壳率在AAV载体生产过程中，有空衣壳的病毒颗粒、填充了部分基因的病毒颗粒、基因组DNA过度装载的病毒颗粒的产生。空衣壳在安全上的不确定性已经引起了FDA和专家的重点关注。作为创新药物，通过生产体系优化，尽量降低缺乏目的基因的空壳颗粒、包含片段化或者部分基因组的病毒载体颗粒，以尽可能纯化获得更多高质量的包含完整基因组的病毒载体颗粒也是监管趋势所期待的。经过工艺的优化，生产的AAV空壳率经过AUC检测可控制在3%左右的水平。对多种形态进行分析的金标准方法是分析型超速离心（analytical ultracentrifuge,AUC）。通过不同形态AAV的沉降系数不一样从而通过超速离心达到分离检测获取不同形态AAV的比例信息。我们建议工艺开发过程为了获得更清晰的AAV表征采用分析型超速离心技术（AUC）测定空壳率，采用离子交换色谱法（AEC）进行工艺批次放行测定。 7. 建立AAV体外效价的评价方法目前一般采用感染滴度、目的基因表达量、目的蛋白生物学活性来作为AAV的效价方法。感染滴度TCID50是判断病毒感染性滴度的金标准。针对TCID50感染滴度方法重复性不稳定的问题，派真开发了一系列控制措施，主要措施有：建立均一的辅助病毒库、建立检定用细胞工作库、基于qPCR反应的反应体系优化、人员的培训。基因治疗药物的CMC阶段为了更好地评价AAV药品的有效性、一致性，通常需要建立体外生物学活性的方法。但AAV的体外效价开发有较高的挑战，靶细胞的选择具有较高的难度：需考虑评估AAV血清型对靶细胞的感染效率、启动子是否有效表达、与靶基因生物学的相关性及作用机制、内源性靶蛋白表达的影响等。多个血清型和体外用靶细胞株的选择和感染已经形成了平台化经验，可以加速效价方法开发。 8. 复制性完整型AAV的检验方法复制性完整型AAV检验是AAV药物安全性的重要指标。目前药典或文献未有可实践的复制完整型AAV检测方法，其开发难点在于需要用到经过标定的辅助病毒和野生阳性病毒，可接受标准限度低，一般方法的灵敏度不满足要求，验证难度大。通常是在P2实验室条件下采用检定用的wtAAV和样本在辅助病毒辅助下经过多轮感染靶细胞，并提取样品进行qPCR检测。可以开发特有的rcAAV PackRich技术，在低至5-10 IU的阳性对照病毒下仍然能检出，同时重现性和稳健性更高。目前已经成功帮助客户提交IND申报受理。嘉宾阵容以及授课话题已曝光，点击图片查询，合作热线：王晨 180 1628 8769