Moderna:IL-12 mRNA-LNP蛋白替代疗法抗瘤作用机制

2024-03-28

信使RNA临床结果基因疗法

导读：2020年，Moderna研究团队在Clinical Cancer Research（1区, 影响因子11.5）发表文章：《Intratumoral IL-12 mRNA Therapy Promotes TH1 Transformation of the Tumor Microenvironment》。研究者开发了一种IL-12 mRNA-LNP瘤内注射制剂，用于治疗实体瘤，在细胞、多种小鼠模型和肿瘤患者立体培养物中证实了IL-12 mRNA-LNP IL-12 mRNA-LNP具有强效的抗肿瘤活性。上篇文章，菌菌对IL-12 mRNA-LNP的序列特征和体内外验证结果进行了详细解读：【耀文解读】Moderna:IL-12 mRNA-LNP蛋白替代疗法序列设计与验证、【耀文解读】一文读懂|IL-12 mRNA蛋白替代疗法实体瘤研究进展。今天，我们将继续剖析其抗肿瘤作用机制，包括同源肿瘤小鼠模型、人源异种移植小鼠模型和患者肿瘤切除样品。01背景介绍MEDI1191是Moderna与阿斯利康联合开发的一款IL-12 mRNA-LNP药物。MEDI1191的序列特征为：优化后的人源IL-12b 和 IL-12a 序列通过多肽连接，并且在IL-12 mRNA的3′ UTR 中掺入了一个 miR122 结合位点，以抑制肝细胞中IL-12的产生，而不影响癌细胞的水平。研究人员先后将IL-12 mRNA-LNP转化结直肠MC38肿瘤细胞、以及负荷不同肿瘤（A20、MC38-S 和 MC38-R）的小鼠模型，验证了IL-12的抗肿瘤活性。另一点需注意的是，由于人源IL12p70在小鼠体内没有生物学活性，因此研究者设计了小鼠(m) IL12 mRNA用于小鼠模型。紧接着，研究者剖析了MEDI1191抗肿瘤的作用机制，结果见下文所述：02IL-12mRNA-LNP的抗肿瘤机制研究2.1 CD8+T细胞对于mIL-12 mRNA最佳抗肿瘤活性是必需的在MC38-R荷瘤小鼠中，给药 7 天后，mIL-12 mRNA 诱导肿瘤浸润 CD8+T细胞呈剂量依赖性增加。mIL-12 mRNA 不会改变肿瘤 FoxP3-CD4+细胞或 FoxP3+ CD4+（Treg）细胞数量。因此，在单剂量 0.05 μg 或 0.5 μg mIL-12 mRNA 后 7 天，观察到 CD8+T细胞与 Treg 细胞比例呈剂量依赖性增加。为了进一步研究 mIL-12 mRNA 对 MC38-R TME 的影响，转录组数据显示，给药后 7 天与 T 细胞谱系丰度相关的转录产物显著增加。与免疫系统完整的小鼠相比，CD8+T细胞耗竭显著降低了mIL-12 mRNA 在MC38-R荷瘤小鼠中的抗肿瘤活性。mIL-12 mRNA 仍然延迟 CD8+T细胞耗竭耗竭小鼠中的肿瘤生长，但 mIL-12 mRNA无法诱导任何的CR。相反，CD4+T 细胞耗竭对mIL-12 mRNA 抗肿瘤活性没有影响。这些数据表明，CD8 +T 细胞依赖性适应性免疫是 mIL-12 mRNA 在MC38-R荷瘤小鼠模型中发挥最佳抗肿瘤活性所必需的。2.2 mIL-12 mRNA 抗肿瘤免疫依赖于IFNγIL-12 的许多已知作用都依赖于激活的 NK 和 T 细胞释放的IFNγ。在注射mIL-12 mRNA 24小时内，激活的NK和NKT细胞（激活标记物CD69增加百分比）呈现剂量依赖性，相反，没有观察到MC38-R 肿瘤内 CD4 +或 CD8+T 细胞的早期激活。给药后7天，肿瘤中的NK细胞数量没有变化，相反，NKT细胞数量出现轻微但显著的增加。MC38-R 荷瘤小鼠中，给药后 24 小时内肿瘤 NK 激活，肿瘤和血浆 IFNγ 水平呈剂量依赖性增加。在 A20 荷瘤小鼠中也观察到类似的 IFNγ 水平的剂量依赖性增加。为了更直接地确定 IFNγ 在 mIL-12 mRNA 抗肿瘤免疫反应中的作用，在给予单次瘤内剂量的 mIL-12 mRNA 之前，用 IFNγ 阻断抗体治疗 MC38-R 荷瘤小鼠。阻断 IFNγ 完全消除了该模型中 mIL-12 mRNA 的抗肿瘤活性。由于 NK 细胞激活有可能导致 IFNγ 释放和肿瘤细胞细胞毒性，因此，在 MC38-R 模型中研究了 NK 和 NKT 细胞耗竭对 mIL-12 mRNA 诱导的 IFNγ 表达和抗肿瘤活性的影响。用抗 NK1.1 消除 NK 和 NKT 细胞导致小鼠外周 IFNγ 对 mIL-12 mRNA 的反应小幅但显著降低。然而，NK细胞和NKT细胞的消耗对该模型中的mIL-12 mRNA抗肿瘤活性没有统计学上的显著影响。MC38-R 荷瘤小鼠给药后 7 天，mIL-12 mRNA 诱导 TH1 TME 转化，表现为TH1 免疫反应基因上调，成熟DC细胞的早期增加（包括 CD103+ 和 CD8 + 交叉呈递 DC 亚群）以及与 DC 丰度和抗原呈递相关的基因表达增加。重要的是，对照 mRNA 不会诱导非特异性 DC 激活。对 MC38-R 肿瘤转录组数据的其他通路分析揭示了 mIL-12 mRNA 给药后 7 天 TME 转化的广泛程度，涉及T细胞和NK细胞激活基因、细胞因子和趋化因子、补体因子以及与细胞外基质（ECM）调节和脂质代谢相关的基因表达增加。给药后 7 天，MC38-R 肿瘤转录组的广泛变化与 mIL-12 mRNA 在该时间点诱导的肿瘤生长的显著抑制密切相关。2.3 mIL-12 mRNA 与PD-L1阻断剂联用，增强抗肿瘤效果IFNγ 是肿瘤和骨髓细胞上 PD-L1 表达的有效诱导剂。因此，研究者试图确定肿瘤内 mIL-12 mRNA 是否会在同源小鼠肿瘤模型的肿瘤微环境中诱导 PD-L1 表达。事实上，给药后 7 天，mIL-12 mRNA会使得MC38-R 肿瘤中免疫浸润细胞的 PD-L1 表达增加。流式细胞术分析显示，肿瘤浸润性 CD11b+骨髓细胞和 CD11b+Ly6C hi单核细胞上的 PD-L1 表达增加，但是，在任何时间点均未检测到 MC38-R 肿瘤细胞上的PD-L1 表达发生显著变化。在肿瘤总 CD11b +骨髓细胞中，低剂量 mIL-12 mRNA 仅在给药后 24 小时和给药后 72 小时诱导 PD-L1，并且这些细胞上的 PD-L1 水平在药后 7 天已恢复至基线。相反，0.05和0.5μg mIL-12 mRNA均增加了肿瘤中Ly6Chi单核细胞上的PD-L1表达，并且这种增加从给药后24小时持续到7天。CD11b +骨髓区室包括中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、MDSC 和一些 DC。与其他 CD11b + 骨髓细胞群体相比，Ly6Chi 单核细胞/mMDSC 亚群上的 PD-L1 表达更持久，这可能反映了 mMDSC 更强的抑制功能。在 MC38-R 荷瘤小鼠的血液中，给药 24 小时后，mIL-12 mRNA 也会诱导 Ly6Chi 单核细胞上的 PD-L1 表达，并且这种对 PD-L1 的诱导表达在 IFNγ- 阻断抗体存在下会被显著抑制。由于 PD-L1 与 PD-1 的相互作用可以抑制抗肿瘤免疫，因此在携带已建立的 MC38-R 肿瘤的动物中研究了 PD-L1 阻断剂对 mIL-12 mRNA 抗肿瘤活性的影响。与单独使用相同剂量的 mIL-12 mRNA 相比，PD-L1阻断剂与单剂量 0.5 或 5 μg mIL-12 mRNA 的联用可显著改善总体存活率并增加了 CR 小鼠数量。此外，与单剂量 mIL-12 mRNA +抗 PD-L1 组合相比，每周三剂 mIL-12 mRNA +抗 PD-L1 组合的生存率改善趋势不显著。与抗 PD-L1 +单剂量 mIL-12 mRNA 组合（8/15 CR，80%）相比，抗 PD-L1 +三剂 mIL-12 mRNA 组合也导致更多 CR（12/15 CR，80%）。接下来，研究者对抗 PD-L1 增强 MC38-R 荷瘤小鼠 mIL-12 mRNA 抗肿瘤活性的机制。通过用 MC38 免疫显性逆转录病毒抗原肽 p15E 重新攻击脾细胞来量化脾肿瘤肽反应性 T 细胞的频率。给药后 7 天，单独的 mIL-12 mRNA 扩增了脾脏中的肿瘤反应性 T 细胞，但与 mIL-12 mRNA 单一疗法治疗的动物相比，抗 PD-L1 与 mIL-12 mRNA 联合并没有进一步扩增这些细胞。然而，与单独使用抗 PD-L1或 mIL-12 治疗相比，mIL-12 mRNA 与抗 PD-L1 组合确实显著增加了浸润肿瘤的 CD8+T细胞数量。特别是，在给药后 7 天，在用 0.5 μg mIL-12 mRNA 加抗 PD-L1 治疗的 8 只动物中，有 4 只在完全坏死的肿瘤核心周围检测到密集的 CD8+ 免疫浸润。在大多数具有 mIL-12 mRNA +抗 PD-L1 的 CR 动物中，在动物的另一侧再次植入 MC38-R 细胞后，没有观察到肿瘤生长。总之，这些数据表明，PD-L1 阻断增强了 CD8 +T 细胞向 MC38-R 肿瘤的募集，以及 CD8 +T 细胞介导的 mIL-12 mRNA 响应的肿瘤裂解。B16F10-AP3 模型是一种具有最小免疫浸润的 PD-L1 阻断抗性黑色素瘤 PD-L1 阻断抗性黑色素瘤肿瘤模型。在此模型中，单剂量的 mIL-12 mRNA 转化了 TME，激活 NK 细胞和 DC，增加 CD8+T 细胞浸润和 CD8 +T 细胞与 Treg 的比率，诱导 IFNγ 释放，并另外增加肿瘤、骨髓和细胞上的 PD-L1 表达。在B16F10-AP3 模型中，与对照 mRNA 相比，注射单剂量 0.5 μg mIL-12 mRNA 显著提高小鼠存活率。与 mIL-12 mRNA 相比，注射mIL-12 mRNA +抗 PD-L1 对小鼠存活率和 CR 数量有着非常明显的增加趋势。然而，在 B16F10-AP3 模型中，无论是单独的 mIL-12 mRNA 还是 mIL-12 mRNA+αPD-L1 组合都不能扩增脾肿瘤肽反应性 T 细胞（Trp2 或 p15E 肽），这表明相比在MC38-R 荷瘤小鼠中， mIL-12 mRNA 在B16F10-AP3小鼠模型中诱导抗肿瘤免疫的效率较低。2.4 膜结合型mIL-12 mRNA抗肿瘤活性在MC38-S 双侧肿瘤小鼠中，注射单独使用肿瘤内 mIL-12 mRNA 或者与抗 PD-L1 联合使用，可以促进远端未治疗肿瘤的消退。与注射同种型抗体+ 5 μg 对照 mRNA 治疗的小鼠比，单次注射 0.5 μg 较低剂量的 mIL-12 mRNA 可诱导 3/20 只动物中治疗和远端肿瘤发生完全消退（双侧 CR），并显著提高总体存活率。与 0.5 μg mIL-12 mRNA 相比，较高的 5 μg mIL-12 mRNA 剂量可显著诱导更高的总生存率和更多数量的 CR。相比之下，与单独使用相同剂量的 mIL-12 mRNA 相比，注射αPD-L1 抗体+0.5 或 5 μg mIL-12 mRNA 的组合显著改善小鼠总体存活率。在同源荷瘤小鼠中，瘤内注射mIL-12 mRNA会诱导局部肿瘤mIL-12p70表达，并且外周mIL-12p70会有所增加。为了研究局部IL-12p70单独驱动远端肿瘤部位消退的能力，我们使用编码膜结合型mIL-12p70的mRNA来限制外周mIL-12p70的分泌。相对于分泌型IL-12mRNA，膜结合型mIL-12-mRNA编码的12p70释放到Hela细胞培养物上清液中的量非常低，并且同样会刺激共培养的小鼠 CD8 +T 细胞的 IFNγ 释放。在携带双侧 MC38-S 肿瘤的小鼠中，通过瘤内递送栓系 mIL-12 mRNA，导致 4/20 只小鼠接受治疗的肿瘤和远端肿瘤完全消退（双侧 CR）。与用分泌型 mIL-12 mRNA 处理的动物相比，在注射膜结合型mIL-12 mRNA 小鼠中，检测到循环 mIL-12p70 的增幅最小，同时，血浆中IFNγ诱导也大大降低。这些数据表明，在循环 mIL-12p70 水平不增加的情况下，局部肿瘤 mIL-12p70 表达可以诱导远端肿瘤部位的消退。2.5 MEDI1191在PDX模型中编码分泌人L12p70MEDI1191 编码人源L12p70 蛋白，诱导人单核细胞来源的巨噬细胞和 16 种人肿瘤细胞系中剂量依赖性的 hIL-12p70 释放。体外肿瘤细胞系之间分泌释放的hIL-12p70 产量差异显著，而来自不同供体的单核细胞来源的巨噬细胞之间的 hIL-12p70 产量非常一致。在人CD8+T细胞 IFNγ 释放测定中，MEDI1191编码的hIL-12p70 活性与重组异二聚体 hIL-12p70 的活性相当。左图: MEDI1191诱导16种人肿瘤细胞系中剂量依赖性的 hIL-12p70 释放右图: 用重组重组异二聚体hIL-12p70或者源自MEDI1191转染Hela细胞上清中的hIL-12p70刺激人CD8+T细胞，测定IFNγ分泌水平在ME12057黑色素瘤和HN5111 HNSCC（头颈鳞状细胞癌）PDX 模型中，瘤内 MEDI1191诱导肿瘤和血浆 hIL-12p70 浓度呈剂量依赖性增加。在所有四种 PDX 模型（2种黑色素瘤模型ME12057/ME12058和2种头颈鳞状细胞癌HN5111/HN5116）中，0.5 μg MEDI1191 给药6 小时后，肿瘤或血浆 hIL-12p70 水平没有观察到显著差异，给药24 小时后，HN5116 HNSCC 荷瘤小鼠肿瘤和血浆中的 hIL-12p70 水平显著低于其他模型。2.6 MEDI1191改变肿瘤微环境收集手术切除后的患者肿瘤新鲜样本进行振动切片，并在存在 MEDI1191 或对照 mRNA 的情况下在空气/介质界面处进行体外培养。在所有测试患者肿瘤切片培养物中，MEDI1191 编码释放的hIL-12p70呈现剂量依赖性。同时，MEDI1191 还诱导剂量依赖性分泌IFNγ 和 CXCL10 。虽然 MEDI1191 诱导每个测试患者肿瘤释放 hIL-12p70，但患者肿瘤切片之间的 IFNγ 和 CXCL10 释放变化更大。对来自接受过治疗的结直肠腺癌(CRC)、结直肠肝转移(CRLM)和子宫内膜癌(UCEC)患者的离体培养肿瘤切片上清液中的IL-12p70 (A)、IFNγ(B)和CXCL10(C)进行定量。对振动切片后立即固定的患者肿瘤切片中的 NK 细胞和 T 细胞密度通过 IHC 进行定量。未观察到患者肿瘤切片 IFNγ 释放与T 细胞浸润基线之间的相关性。然而，患者肿瘤切片急性IFNγ释放和NK细胞浸润基线之间呈现正相关。用 MEDI1191 处理的患者肿瘤切片的 NanoString 转录组分析显示，与对照 mRNA 处理的肿瘤切片相比，TH1 反应基因的表达显著增加。值得注意的是，在 MEDI1191 治疗的患者肿瘤切片和 mIL-12 mRNA 治疗的 MC38-R 肿瘤中，IFNG、STAT1 和 GBP2 表达均上调。03总结在多种肿瘤模型中，单次瘤内剂量的鼠源IL-12 mRNA诱导肿瘤消退。这既是 CD8 +T 细胞依赖性的，也是IFNγ依赖性的，并且与特征TH1免疫反应基因的上调相关，从而与TH1 TME转化相关。在PD-L1耐药模型中，PD-L1阻断增强了小鼠 IL-12 mRNA诱导的抗肿瘤免疫。小鼠IL-12 mRNA 也驱动未注射的远端病变消退，抗 PD-L1增强了这种反应。在循环 IL-12 没有增加的情况下，编码膜系小鼠IL-12的mRNA的瘤内递送诱导了未经治疗的病变的消退，支持了局部 IL-12 可以诱导针对远端病变的全身抗肿瘤免疫反应的假设。最后，他们还发现在离体患者肿瘤切片培养中，人IL-12 mRNA （MEDI1191）诱导剂量依赖性 IL-12 产生、IFNγ表达和TH1 TME 转化。总之，这项研究为MEDI1191 (IL-12 mRNA-LNP) 的开发提供了支持，使其可作为一种潜在的新型治疗方法，无论是单独使用还是与PD-L1/PD-1 检查点抑制剂联合使用，用于治疗浅表和深层实体瘤。参考文献：Hewitt SL, Bailey D, Zielinski J, et al. Intratumoral IL12 mRNA Therapy Promotes TH1 Transformation of the Tumor Microenvironment. Clin Cancer Res. 2020 Dec 1;26(23):6284-6298. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-047.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。