Nature重磅！EMT靶向药 — 全新视角改善肿瘤耐药

2023-10-13

临床结果临床2期

哈喽大家好，今天分享一篇近期发表在Nature（IF：64.8）的文章，该文章主要展示了在鳞状细胞癌小鼠模型中，NP137介导的netrin-1抑制降低了发生上皮细胞间质转化的细胞比例，减少了转移灶的数量，并增加了肿瘤细胞对化疗的敏感性。借助NP137处理对小鼠身上移植的人上皮细胞癌的差异，表明netrin-1阻断抑制了人类中癌细胞的上皮间质转化。一、背景上皮间质转化（EMT）与肿瘤的发生、进展、转移、耐药性息息相关，尽管EMT在癌症中的作用及调节机制研究取得实质性进展，但临床上尚未开展有效的靶向EMT的治疗策略，该研究发现在小鼠鳞状细胞癌的EMT机制中，存在一类重要蛋白Netrin-1，阻断Netrin-1抑制癌细胞的上皮-间充质转化。通过单细胞RNA测序显示，鳞状上皮细胞癌中混杂着EMT的不同发育状态，给于阻断Netrin-1抑制后，能够阻止癌细胞向晚期EMT状态进展。为进一步评估这一发现与人类癌症的相关性，作者用NP137治疗移植了人类癌细胞系的小鼠，这些癌细胞系在TGFβ1给药后经历EMT，而Netrin-1抑制降低了移植癌细胞的EMT。总之，作者的研究结果确定了靶向EMT治疗癌症的药理学策略，为抗癌治疗开辟了新的治疗干预措施。二、结果1.Netrin-1在皮肤SCC的EMT中过表达已知上皮细胞粘附分子（EPCAM）在多种上皮组织中表达，上皮来源的癌细胞中高表达EPCAM分子，由此区分肿瘤细胞为间充质瘤细胞和癌细胞。为寻找靶向肿瘤中上皮间充质化的药物靶点，该研究探索小鼠SCC模型中分离的上皮癌细胞和间充质肿瘤细胞转录组测序数据发现，与EPCAM+癌细胞相比，EPCAM-间充质瘤 EPCAM-间充质瘤细胞优先分泌一些细胞分子，即编码netrin（Ntn1）及其受体UNC5B的基因在EPCAM-间充质瘤 EPCAM-间充质瘤细胞中表达增高（图a，b），此外，针对netrin的特异性治疗在药物研发早期阶段被证实有用，目前应用于癌症治疗早期临床试验，具体试验药物为NP137,人类癌症临床试验的netrin-1阻断单克隆抗体(ClinicalTrials.gov识别符NCT02977195)。2.Netrin-1过表达增加EMT为了评估Netrin-1过表达的作用，作者构建了Netrin-1过表达的SCC肿瘤 Netrin-1过表达的SCC肿瘤小鼠模型（LKPR- NTN1），在netrin-1过表达后，作者观察到与对照小鼠相比，过表达Netrin-1小鼠的肿瘤数量增加(图1c)，发生EMT的肿瘤细胞比例增加(图1d）。上皮间质转化过程并不是一蹴而就的，EMT过程中存在上皮状态（KRT14+ VIM−），上皮-间质混合状态（KRT14+ VIM−），完全间质状态过程（KRT14−VIM+）。通过组织学分析和免疫荧光，作者评估了netrin-1过表达对该模型中先前描述的不同肿瘤EMT状态的影响。结果表明，netrin-1的过表达导致具有完整EMT的肿瘤比例显著增加(70%)，具有上皮表型的SCCs比例显著减少(3%)(图1e,f)，这与荧光激活细胞分选(FACS)对EPCAM表达的量化结果完全一致(图1d)。这些数据表明，netrin-1的过表达促进了皮肤SCC原发性模型的肿瘤起始和EMT。 3.靶向Netrin-1抑制EMT先前研究已经表明，Netrin-1在多种癌症中上调，药物抑制Netrin-1对体内EMT的影响尚未被研究。作者给予他莫昔芬诱导SCC小鼠模型Netrin-1表达上调后，连续4周给小鼠喂药NP137，观察Netrin-1抑制对肿瘤形成和EMT的影响。结果示：每周给3次药NP137导致每只小鼠SCCs数量减少50%(图1g)。FACs量化YFP+ EPCAM+(上皮源)肿瘤细胞和YFP+ EPCAM -(间质转化的)肿瘤细胞的百分比显示，NP137降低了自发性EMT的原发性皮肤SCCs中发生EMT的EPCAM -肿瘤细胞的比例(NP137处理小鼠为41%，对照组为77%)，表明在LKPR小鼠模型中，靶向netrin-1能够抑制肿瘤细胞的EMT（图h）。为了确定Netrin-1抑制是否对不同EMT状态有不同的影响，作者使用免疫荧光来评估肿瘤状态的比例，NP137增加了上皮状态的比例(NP137处理小鼠为54%，对照小鼠为31%)，而混合EMT的比例保持不变(NP137处理小鼠为16%，对照小鼠为12%)，晚期EMT状态的比例下降(NP137处理小鼠为30%，对照小鼠为56%)(图1i,j)。这些数据表明，netrin-1的药理学靶向制剂NP137可以抑制癌症小鼠模型中的EMT。图14.靶向Netrin-1抑制肿瘤转移由于EMT和肿瘤转移密切相关，研究人员继续检测了NP137处理对肿瘤转移的影响。通过评估NP137用药后过表达Netrin-1的小鼠模型发现，NP137的施用大大减少了LKPR小鼠肺转移的数量(图2a)。为排除这一因果关系是原发肿瘤数目下降干扰产生的，作者给在尾静脉注射FACs分离的LKPR小鼠的YFP+肿瘤细胞后，NP137仍然表现出显著减少肿瘤肺转移的数量，这一结果表明Netrin-1靶向药物抑制直接抑制转移的形成（图2b）。5.NP137使癌细胞对化疗敏感SCC的标准化疗方案为顺铂联合5-氟尿嘧啶（5-FU），研究人员还发现联合使用NP137增强了SCC标准化疗药物顺铂和5-FU的治疗效果，也说明了NP137处理降低了肿瘤细胞的耐药性(图2c)。这些数据表明，Netrin-1的药理学靶向可以降低与EMT相关的癌症特征，包括转移和对化疗的耐药。图26.NP137对基质细胞的影响进一步的，作者研究了NP137对基质细胞的影响，通过对两种对照SCC小鼠和两种NP137处理的原发性皮肤SCCs的肿瘤上皮细胞及其相关基质细胞进行单细胞RNA-seq ，发现NP137处理降低了肿瘤细胞的数量，增加了肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的数量，其它细胞数量未发生变化。使用单细胞组成数据分析(scCODA)进行差异丰度分析，研究者们发现在两个对照和两个np137处理的小鼠之间，不同CAF亚群的比例及不同CAF簇间的基因表达没有显著性差异。并且随后用免疫组化染色证明NP137处理后增加了CAFs的数量。7.NP137对肿瘤细胞状态的影响探索单细胞测序结果，具体地评估Netrin-1抑制对肿瘤状态的影响。结果同上文FACs一致，单细胞分辨率下，作者发现了不同EMT细胞状态对应的细胞簇，包括上皮细胞（KRT14+VIM-）、早期杂交EMT (EPCAM-Krt14+ Vim+)、晚期杂交EMT (EPCAM-Krt14-Krt8+ Vim+ Pdgfra−)和晚期EMT (EPCAM-Krt14−Krt8−Vim+Pdgfra+)（图3a）。与对照组相比，NP137给药与上皮肿瘤细胞状态比例增加、早期EMT比例相似、晚期混合型EMT比例下降以及晚期EMT大幅下降相关(图3b,c）。免疫荧光实验证实，NP137给药后上皮状态的增加和晚期EMT肿瘤状态的减少（图3d）。使用10x Visium的空间转录组学分析揭示了scRNA-seq鉴定的肿瘤状态的空间定位，并显示它们定位于不同的生态位，如先前报道。NP137增加了上皮状态(Epcam+ Krt14+)的比例，抑制了晚期EMT状态(Krt14-Krt8-Vim+)的发生，阻断了混合EMT状态(Krt8+ Vim+)的EMT进展（图3e,f）。为了进一步了解NP137抑制EMT的机制和信号通路，作者使用MSigDB Hallmark基因集进行了通路富集分析，结果表明，在药物靶向作用下Netrin-1抑制后，肿瘤细胞中与EMT、缺氧、血管生成和炎症反应相关的基因表达均显著降低（图3g）。图3拟时序细胞轨迹分析发现，在对照肿瘤中可以识别出两种不同的谱系轨迹，一条轨迹从上皮细胞转化为混合EMT，另一条轨迹从上皮细胞状态转化为晚期完全EMT(图4a)。NP137处理的肿瘤细胞具有不同的谱系轨迹，表达高水平Aqp1的晚期EMT状态轨迹消失，出现两个新的上皮状态轨迹(Epithelial-B1和Epithelial-B2)，以及两个混合EMT轨迹(图4b)。Epithelial-B1的特征是Krt15的高表达，对属于Epithelial- B2状态的细胞的标记基因进行GO富集分析显示糖酵解上调，角化增加(图4b,c)。对SCC小鼠对照组和NP137处理的LKRP小鼠皮肤SCCs进行YFP免疫染色和RNA原位杂交实验证实，NP137给药后以aqp1表达为代表的EMT晚期轨迹的抑制减少和Krt15表达代表的上皮状态的增加(图4e)。图48.UNC5B轴促进EMT研究人员进一步检测了Netrin-1的受体Unc5b的作用。作者发现在细胞系中Ntn1和Unc5b敲除都会抑制EMT过程，而且这种抑制作用不会被NP137处理加强，说明Netrin-1是通过UNC5B来发挥其促EMT作用的（图5a,b）。为了评估NP137对EMT的调节和促上皮状态的促进是否是直接调节EMT状态的旁分泌或自分泌netrin-1 - UNC5B信号轴被破坏的结果，作者对体外培养的对照、Ntn1-KD和UNC5B - kd肿瘤细胞的EPCAM+肿瘤细胞进行了大量rna测序，结果示，在Unc5b敲低后下调或上调的基因中，超过50%的基因也受到Ntn1敲低的差异调节(图5c)，这表明Netrin-1和Unc5b调节着相似的信号通路和转录程序。Ntn1敲低和Unc5b敲低促进了与上皮状态相关的基因(Krt14、Krt15、involucrin和claudin)的表达(图5d)，并降低了与EMT和促EMT相关的基因(Aqp5、Nrp1、Nr2f2、Twist1和Twist2)的表达(图5e-g)。总之，这些数据表明，在肿瘤细胞中靶向netrin-1-UNC5B信号轴可减少EMT，并以独立于肿瘤微环境的细胞自主方式促进皮肤SCC维持上皮状态。图59.NP137阻止人类癌症的EMT最后，研究人员分析了TCGA数据库中的临床样本，发现在肺SCC、肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）以及皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma, SKCM）中，UNC5B和EMT评分之间存在正相关关系（图6a,b）。为探索功能的相关性，作者构建人类癌症细胞系A549移植小鼠，同时给予TGFβ1引发EMT状态（图6c,d），紧接着利用NP137治疗，结果表明抑制Netrin-1显著降低肿瘤生长，提高上皮细胞标志物表达（图6e,f）。正反回复实验表明Netrin-1抑制能够降低体内人类癌细胞的EMT。图6三、结论 1、使用NP137的药理学靶向netrin-1是一种安全有效的靶向肿瘤EMT的策略,可以减少肿瘤的转移，并且增加肿瘤对化疗的敏感性。2、作者揭示了netrin-1调节EMT并促进EMT晚期分化轨迹的分子机制，即Netrin-1的抑制诱导肿瘤细胞谱系分化的开关，将肿瘤分化转向上皮肿瘤状态，这种状态对化疗更敏感。Netrin-1通过向UNC5B发送信号发挥其促EMT功能，UNC5B可促进间充质转录程序的表达，下调控制细胞-细胞粘附和促进上皮分化程序的基因的表达。3、NP137给药后肿瘤细胞对化疗的敏感性表明，抗Netrin-1抗体与其他抗癌药物联合使用可能对具有EMT特征的癌症患者有益。文章结尾对该发现在临床的应用进行展望道，这些结果对EMT癌症患者联合Netrin-1抑制的抗癌治疗策略的发展以及新型生物标志物的开发具有重要意义，这些生物标志物将有助于更好地对癌症病例进行分层，以确定那些更有可能对抗Netrin-1治疗产生反应的癌症。四、思路衍生耐药EMT的新靶点，正如17年前，发现了VEGF抑制剂能够治疗年龄相关性黄斑，进而改变了年龄相关性黄斑注定失明的结局，VEGF靶点药物在2006年被《科学》杂志评为年度10大科技突破之一，随后大量先关研究高分频发。新的靶点出现，必定意味着新一波研究的接踵而至！ NP137抑制Netrin-1已经明确证实，药物开发前阶段，这个抑制剂是不是可以用来治疗不同类型癌症呢，寻找生物标志物就意味着，临床患者有效分层，有望写入治疗指南，具有重大意义。思路一：基于Netrin-1差异，分析癌症EMT耐药的生物标志物：划重点啦！！肿瘤届大名鼎鼎的“致密纤维化癌”还包括胰腺癌、肝内胆管癌、肾细胞癌、结直肠癌等这些常见的肿瘤！！根据不同肿瘤EMT及转移特点，分析Netrin-1 -Unc5b轴的差异表达情况，根据化疗耐药队列情况，构建耐药相关Signature，建模型，验证模型准确性。3分文章这不就到手了！思路二：基于靶器官差异，分析不同的癌种介导的EMT中Netrin-1-Unc5b信号的肿瘤微环境的异同：易于转移高EMT原发灶微环境分析（小泛癌）这不就来啦！每个癌种都需要Netrin-1染色吗？当然不需要，HPA数据库就可以直接查询HE的染色结果！再结合公共数据库的转录组，单细胞数据分析，直冲5分+的SCI。当然，皮肤鳞癌不是唯一的硬骨头！肺部、胰腺、胆管、肾脏同样有着类似的难啃的骨头的属性！也是易于发生转移的大户！以上两种思路，小编总结好了思路，可以冲！思路三：不同上皮间质转化状态对Netrin-1抑制剂的敏感性:已知肿瘤上皮细胞进展过程中，会发生间充质转化，并且多数是由于肿瘤细胞产生细胞因子介导！这就转化成我们熟悉的分析思路了！1）不同状态的间充质状态的对应肿瘤分期划分；2）Netrin-1-Unc5b信号在不同状态EMT肿瘤细胞中信号强弱，分析不同表型分组之间的差异细胞、通路、关联预后和耐药等等。