Pegaspargase

聚乙二醇修饰是指通过聚乙二醇（PEG）修饰蛋白质和肽药物的技术，相较于未经修饰的药物，聚乙二醇修饰在物理化学性质和治疗效果方面具有诸多优势。本文旨在为读者提供有关聚乙二醇修饰的目标、方法及最终应用的详细见解。聚乙二醇修饰的化学相关内容，特别是聚乙二醇修饰的位点，是本文的核心主题。本文重点强调了影响聚乙二醇修饰过程及其结果的各种关键因素，如聚乙二醇的结构和大小。还详细讨论了聚乙二醇修饰在主动和被动靶向中的应用以及多种FDA批准的聚乙二醇修饰产品。 简介 现代生产、修饰和分析技术的进步在过去10年里显著推动了蛋白质和肽药物（PPD）的开发。天然和合成肽的无数治疗应用已被发现并得到探索。自1922年胰岛素分离以来，PPD作为治疗药物一直被视为应对多种疾病的有效策略。近年来，生物技术和制药科学，特别是重组技术的进展，使得将PPD商业化作为有前景的治疗药物成为可能。蛋白质和肽药物在药物研究中具有独特的魅力，因为与传统的化学合成药物相比，它们具有更好的疗效、较低的毒性和强大的特异性。 到目前为止，FDA已批准了240多种PPD。其他潜在的治疗性PPD候选药物正在进行临床试验。PPD已经通过生物和化学技术进行了合成和修饰。尽管蛋白质和肽药物在细胞和细胞外层面的疾病治疗中提供了无可匹敌的好处，但由于其分子结构的特点，它们并不是理想的治疗选择。这些大分子因其大尺寸、复杂结构、亲水性、免疫原性以及易受酶切割的特点，导致其半衰期较短，需频繁给药。 研究人员尝试采用各种方法重新设计这些PPD，以解决上述问题，这些技术可以显著提高其稳定性和安全性，改善其药代动力学特征，同时降低剂量和给药频率。新型的设计和递送技术有助于克服PPD的固有局限性，推动了这一行业的持续扩展。接下来的部分将回顾聚乙二醇修饰作为研究人员用来解决蛋白质和肽药物缺陷的策略之一。 PPD的临床与研究现状 从1980年代到1990年代，2至10个氨基酸的肽产品占据了多肽药物氨基酸成分的很大一部分。然而，随着肽合成和纯化技术在21世纪的进步，包含超过十个氨基酸的多肽产品逐渐出现，众多多肽药物也得以扩展。根据全球肽治疗行业的研究，2019年肽类药物销售额超过700亿美元；该研究预测从2016年到2024年复合年增长率（CAGR）将达到9.1%。超过100种肽类治疗药物已进入临床试验，超过400种基于肽的药物处于临床前研究阶段，全球已有70多种肽类药物获得商业化认证。研究这些已获批准的肽类药物的应用领域发现，最常见的靶向疾病群体是癌症和代谢性疾病。可以说，这一行业的强劲扩展可能与恶性肿瘤和代谢疾病的发病率预期上升有关。利拉鲁肽（Victoza）和类胰高血糖素肽1（GLP-1）是治疗代谢疾病的畅销肽药物，年销售额至少为20亿美元。像洛普隆（Lupron）、戈舍瑞林（Zoladex）和生长抑素类似物如奥曲肽和兰瑞肽等知名肽药物的销售额也超过了40亿美元。 相应地，蛋白质和肽治疗性分子靶点的种类也在增加。G蛋白偶联受体（GPCRs）是最重要的细胞外靶点，其次是利尿肽受体和细胞因子受体家族。这三大受体家族是临床研究中70%到90%的肽类药物的主要靶点。因此，药物研究目前主要集中在确定蛋白质和肽在疾病病因中的作用；这些蛋白质包括酶、病毒蛋白、受体和通道分子。因此，进行蛋白质和肽治疗靶点的深入分析对于开发这些新型药物至关重要。 影响PPD疗效短的因素 这些肽和蛋白质疗法的主要缺点包括生物利用度有限和更高的代谢敏感性。胃肠道对肽的消化及其无法跨越上皮限制了其口服生物利用度。这些PPD通常具有较高的分子量（MW）、较低的亲脂性和带电基团，这些因素都阻碍了其吸收。这些特性导致大多数口服给药的肽类药物具有低生物利用度（2%）和短半衰期（30分钟）。通过静脉（IV）或皮下（SC）递送这些治疗药物可以解决吸收问题，但其他因素，如系统性蛋白酶、快速清除、补体作用、结构重排、亚单位蛋白分子分离、与血液成分的结合以及易受侧基不稳定等，都会限制这些治疗药物的生物利用度。另一个挑战是，由于稳定性差，PPD的制造和储存非常困难。 此外，每种蛋白质疗法都有可能引起患者的免疫原性问题，抗体形成就是其中之一，它会带来严重的安全问题并降低PPD的疗效。最重要的是，PPD的短半衰期限制了它们的潜在应用。PPD短半衰期的常见原因如图1所示。肝脏、肾脏组织和血液中都含有大量的肽酶和蛋白酶，这些酶会迅速分解肽或蛋白质。肾脏过滤则导致分子量较低的PPD被迅速清除。肝脏代谢是影响PPD半衰期的另一个因素。多肽链的特定氨基酸序列也会显著影响它们进入肝细胞的速度和肝脏代谢它们的速度；这一过程至关重要，因为肝脏主要代谢这些药物。各种药物递送系统和给药途径可能影响药物的药代动力学（ADME）和代谢过程，最终影响PPD的半衰期。 图1. 影响蛋白质和肽药物半衰期的多种因素。 什么是聚乙二醇修饰？ 聚乙二醇修饰是利用聚乙二醇（PEG）对其他分子进行共价或非共价修饰的技术。聚乙二醇修饰在蛋白质和肽药物（PPD）中产生了有趣的效果，已经推出了一系列革命性的产品，并且其他产品也将很快推出。聚乙二醇修饰使得具有较差药代动力学的PPD能够具有临床应用的可能性。20世纪70年代末，Frank Davis的实验室开展了对PEG修饰蛋白质和酶的早期研究。如今的研究者为蛋白质的聚乙二醇修饰作为靶向递送机制奠定了基础。在Davis等人的一系列实验中，使用氰尿酸氯与蛋白质中的氨基酸偶联甲氧基-PEG。他们的研究表明，PEG修饰的蛋白质表现出更低的免疫原性和更长的循环半衰期。由于近年来发现了蛋白质在治疗中的应用，聚乙二醇修饰已成为靶向药物递送系统中广泛使用的技术。 在聚乙二醇修饰中，蛋白质、肽、抗体和囊泡通过聚乙二醇进行生化修饰，以赋予它们多种有利于细胞基因修饰或治疗的特性。然而，蛋白质的聚乙二醇修饰是一个复杂的过程，可以通过多种方法（酶法、包埋法、物理法和化学法）实现，具体方法取决于蛋白质的类型和预期应用。惰性PEG链通过共价或非共价方式与目标蛋白质结合。几种PEG修饰的药物用于治疗贫血、肾功能障碍、多发性硬化症、血友病和恶性肿瘤等疾病。 PEG-蛋白质共轭物的水动力体积增加，这源于PEG能够协调水分子的潜力以及PEG链的柔韧性，可以用来解释为什么在PEG与蛋白质偶联后，蛋白质的物理化学性质显著改善。因此，PEG蛋白共轭物的表观分子量大约是蛋白质名义分子量的五到十倍。此外，PEG链可以包裹蛋白质，遮蔽并保护其不受环境的影响。同时，PEG链也可能影响蛋白质与其他蛋白质的相互作用，从而影响蛋白质执行其生物功能的效果。通常，在生物系统中，这些不利影响会被它们所带来的重要积极后果所抵消，如增强的血液循环、通过避免消化系统增加的药物生物利用度、减少的毒性、降低的免疫原性以及增强的被动药物递送。 图2. 聚乙二醇修饰过程概览。 聚乙二醇（PEG）的理想特性 聚乙二醇（PEG）是惰性、长链的两性分子，通过连接乙烯氧化物重复单元合成而成。PEG分子可以通过不同的结构排列（如线性或分支结构）以及不同的分子量来合成。PEG修饰可以改变目标蛋白的免疫学、药代动力学和药效学特性，从而扩展蛋白质的应用范围。虽然PEG通常被认为是不可生物降解的聚合物，但一些研究表明，它可以通过多种酶（包括酒精脱氢酶、醛脱氢酶和CYP450依赖性氧化酶）进行氧化降解。有报告指出，酒精脱氢酶可以在体内将分子量低于400 Da的PEG链转化为有害代谢物。较长的PEG链（用于PEG修饰蛋白质）则依赖于其分子质量，且不易被代谢。肾脏滤过作用可清除分子量小于20 kDa的PEG及PEG-蛋白复合物。相反，含有较大PEG分子的蛋白复合物通过不同途径从体内清除，如肝脏摄取、免疫系统相互作用和蛋白质部分的蛋白水解代谢。 PEG有着长期作为非毒性、非免疫原性、亲水性、中性和不可降解聚合物的经验，且被美国FDA认证为“公认安全”（GRAS）。PEG及具有宽分散性的PEG试剂已被广泛使用；目前，30 kDa以下PEG试剂的接受标准为约1.05的多分散度指数。对于较高分子量形式，约1.1的多分散度可能是合适的，但当前的趋势是使用分布较窄的PEG。作为静脉治疗剂，高剂量的PEG已被证明会引起剂量依赖性和分子质量依赖性的系统性免疫毒性反应。PEG修饰治疗使用的PEG量通常比引起PEG毒性的剂量低10,000到1000倍。因此，PEG修饰药物的治疗剂量通常远低于引起PEG毒性的剂量。 在毒性研究中，已经证明极高剂量的PEG-蛋白共轭物可能导致肾小管空泡化，但不伴随功能性问题，并且在治疗结束后会自行消失。因此，PEG-蛋白共轭物继续被认为是无毒、安全且免疫学上无害的。研究还表明，较长且分支的PEG比短链线性PEG更适合减少蛋白质的免疫原性。PEG的最小免疫原性和PEG共轭物相对较低的剂量大大降低了免疫反应的可能性。 聚乙二醇修饰的优势 由于聚乙二醇修饰，PPD的物理化学特性发生了变化，包括其构象、空间位阻、电荷相互作用能力和亲脂性。本节总结了聚乙二醇修饰相较于未修饰产品在治疗效率上的提升。聚乙二醇修饰扩大了PPD的尺寸和分子质量，增加了其水溶性，并改善了药代动力学和药效学。PEG聚合物与每个乙二醇亚单元结合时，与两个或多个水分子相互作用。这一特性形成了一个庞大的亲水性屏蔽，有效地隐藏了共轭蛋白，避免其受到免疫检测和酶解的影响。 图3. 蛋白质和肽聚乙二醇修饰的优势。 此外，聚乙二醇修饰的蛋白质比等效的可溶性蛋白质大五到十倍，且更具溶解性。PEG部分及其连接的水分子所形成的屏障显著减少了肾脏清除作用。这一特性对于较小的蛋白质和肽尤其有益，因为这些物质通常会被肾脏迅速过滤。为了延长在体内的停留时间，可以通过连接单个较大的PEG分子或多个较小的PEG分子来实现聚乙二醇修饰，PEG的分子质量一般为40–50 kDa。 聚乙二醇修饰增加了蛋白质的血浆半衰期，并通过产生空间障碍来防止吞噬系统清除。PEG通过阻碍蛋白酶的作用，增强了蛋白质对蛋白水解降解的抗性。通过这种方式，聚乙二醇修饰可以保持蛋白质的结构和功能。此外，聚乙二醇修饰能够掩盖外源蛋白的抗原区域，防止对这些区域产生抗体，从而降低其免疫原性。腺苷脱氨酶成为首个被FDA批准的PEG修饰PPD，用于治疗免疫缺陷疾病。此后，许多共轭物获得批准并投入市场，包括用于治疗肾功能衰竭的Epoetin蛋白、用于治疗丙型肝炎的PEG修饰干扰素，以及用于治疗中性粒细胞缺乏症的粒细胞刺激因子。 体内较短的半衰期限制了生物药物的巨大潜力，这一现象在体外实验中也得到了验证。对于这些短效药物，尤其是针对慢性疾病的治疗，通常需要频繁给药，限制了它们在临床上的应用。为了提供更好的生物治疗，延长半衰期的方法已在临床上得到应用。目前最成熟的半衰期延长技术是聚乙二醇修饰，且这种技术在人体中已安全应用超过二十年。它还帮助减少了药物的剂量和给药频率，从而提高了患者的依从性。尽管如此，它仍将在未来20年成为最前沿的系统之一。 聚乙二醇修饰过程的各代技术 低分子量线性PEG的特征定义了第一代PEG修饰治疗蛋白质。PEG在与蛋白质结合之前需要激活。这一激活过程是通过PEG末端的功能团与蛋白质上可用活性位点（通常是氨基）相互作用来实现的。PEG的激活可以通过与适当的引发剂或终止试剂反应来完成。由于能够创建反应性PEG来避免合成交联聚肽，单甲氧基PEG（mPEG）更适合用于与蛋白质的共轭。假设PEG的两性特性、与水分子的结合能力以及骨架链的柔韧性与其引发蛋白质沉淀、减少免疫原性和抗原性、避免蛋白质和细胞与表面的接触以及防止酶活性或哺乳动物细胞降解相关。 此外，为了实现第一代聚乙二醇修饰的主要目标，需要进行不可逆的共轭。由于PEG涂层的去除，该方法的广泛应用受到限制。尽管有这些限制，监管机构仍批准了几种第一代PEG修饰药物。PEG修饰的天冬氨酸酶（Oncaspar）用于治疗白血病，PEG修饰的腺苷脱氨酶（Adagen）用于治疗重症联合免疫缺陷病（SCID），至今仍在使用。 第二代聚乙二醇修饰技术在第一代的基础上发展而来，采用了位点特异性的聚乙二醇修饰技术，以增强不同蛋白部分与PEG之间的特异性。通过共价聚乙二醇修饰在位点特异性地形成稳定的化学键，这是一种最理想且潜在经济的方法。一些用于执行位点特异性聚乙二醇修饰的技术包括硫醇、N端和组氨酸标记。不断可逆的共轭是位点特异性聚乙二醇修饰的主要方法，这种方法不妨碍共轭物的活性。因此，由于使用可裂解连接体，可以按预定时间释放共轭物，从而临时固定PEG分子。然而，共价方法有显著的缺点，它可能并不总是实际可行，且开发周期较长。 与随机聚乙二醇修饰类似，分子中可能会形成多个靶向特定位点的PEG修饰物，具有不同的修饰程度和异构位置。第二代聚乙二醇修饰技术的一个总体目标是创造更大的PEG聚合物，以增强相对低分子量PEG所观察到的药代动力学和药效学影响。其中一些变化非常显著，例如对白细胞介素-6（IL-6）的PEG修饰，导致其半衰期增加了100倍，血小板生成素活性增加了500倍。 使用分支结构代替第一代PEG中仅有的线性结构是第二代PEG聚合物的另一项进展。已经开发出具有显著更高分子量（最高可达60 kDa或以上）的分支PEG，而第一代PEG的分子量通常为12 kDa或更低。分支PEG比分子质量相同的线性PEG要大得多。 此外，分支PEG在保护连接的多肽药物免受免疫细胞和消化酶的侵害方面更为有效，降低了其抗原性，减少了其被破坏的可能性。为了提高药效和循环半衰期，重点放在快速起效、位点特异性和较低剂量上，第三代聚乙二醇修饰正在开发中。第三代聚乙二醇修饰旨在为治疗性药物提供更长的作用时间，寻求在效率和循环半衰期之间找到更好的平衡。可释放的PEG共轭物（由Enzon Pharmaceuticals发明）是一种策略。药物在体内给药后，由于PPD活性分子与PEG之间的专门设计链接器，药物可以转化为其活性形式。另一种减少API空间障碍的策略是通过像Ambrx的ReCODE和EuCODE技术，在蛋白质上构建可修改的聚乙二醇修饰区域，从而支持具有问题药代动力学特征的治疗候选物。 聚乙二醇修饰的化学原理 蛋白质和适当激活的聚乙二醇修饰试剂通常通过化学相互作用与PEG发生反应，从而实现蛋白质的PEG修饰。氨基酸侧链上有许多化学基团可以与PEG相互作用，包括二硫化物（-S-S-）、-NH2、-NH-、-COOH、-OH和-SH等基团。蛋白质上附着的位置、键的性质、连接体的大小和形式以及PEG试剂等因素，都必须在讨论聚乙二醇修饰时加以考虑，特别是在考虑其修饰后的性质时。 随机聚乙二醇修饰 在1970年代，“随机”聚乙二醇修饰试剂的历史背景开始于PEG-氯三嗪，随后发展为PEG-苯并三唑碳酸酯、PEG-托辛酸盐、PEG-硝基苯基碳酸酯、PEG-羰基咪唑、琥珀酰亚胺琥珀酸盐（SS-PEG）以及琥珀酰亚胺碳酸酯PEG试剂（SC-PEG）。尽管SS-PEG试剂与蛋白质形成强的酰胺键，但后续的PEG-蛋白质加合物由于聚合物骨架中的额外酯链接而容易水解。除了与赖氨酸残基反应外，SC-PEG试剂还会与组氨酸残基反应，形成氨基甲酸酯链接，从而导致水解弱键。虽然这些弱键在设计控释或前药组合物时可能是有利的，但如果不希望共轭物不稳定，这可能会成为严重的缺点。 回顾聚乙二醇修饰的发展，可以明显看出，直到最近，聚乙二醇修饰试剂主要针对蛋白质中赖氨酸残基侧链上的氨基，这被认为是随机聚乙二醇修饰。赖氨酸是蛋白质表面上相对较多的极性氨基酸残基，使它们容易与PEG试剂发生化学相互作用。因此，这些反应迅速进行，产生不同数量和位置的PEG链的共轭物。这些反应不仅限于赖氨酸残基的氨基；它们还与某些其他蛋白质亲核体发生反应，如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸残基的侧链、氨基端氨基和组氨酸残基的咪唑氮。尽管介质的pH值在一定程度上会影响反应，但这些共轭过程通常会导致复杂的聚乙二醇修饰混合物。此外，第一代高分子量、纯单功能PEG试剂的构建较为困难，并且对于蛋白质共轭无效，因为它们的二醇浓度最高为15%。 位点特异性聚乙二醇修饰 位点特异性聚乙二醇修饰化学已经避免了二醇污染、限制于低分子量mPEG、不稳定的连接、旁反应和缺乏选择性替代等问题。N端、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和半胱氨酸聚乙二醇修饰是传统的、广为人知的位点特异性聚乙二醇修饰反应方法。 氨基共轭 mPEG-丙醛是第二代化学反应的最早实例之一。由于PEG乙醛易于二聚化，mPEG-丙醛较容易制造和使用。由于N端α-氨基的pKa低于其他亲核体，因此在酸性条件下（pH约为5）优先选择mPEG-丙醛。每个氨基酸残基的亲核性在将电负性PEG附着到蛋白质氨基酸残基上时起着关键作用。只有当溶液中蛋白质的pH值接近或高于残基的pKa时，亲核攻击才会发生。因此，每个残基的反应性也受到其相邻氨基酸残基的影响。尽管未观察到完全的选择性，但赖氨酸化学中常见的异质性大大降低。在这些情况下，PEG-肼基比PEG-氨基更具优势。蛋白质中的氨基在酸性环境中（约pH 5）大多是质子化的，但由于PEG-肼基的碱性较弱（pKa约为3），反应选择性地合成PEG-肼。使用N端丝氨酸或苏氨酸，它们可以通过高碘酸盐氧化成羟乙基衍生物，也是另一种位点特异性共轭策略。 半胱氨酸共轭 由于已经开发出优先与半胱氨酸反应的试剂，并且蛋白质表面上自由半胱氨酸残基远少于赖氨酸残基，因此针对蛋白质中自由半胱氨酸的聚乙二醇修饰是位点特异性修饰的主要方法。基因工程可以将一个或多个自由半胱氨酸插入到不含自由半胱氨酸的天然蛋白质中。此方法可使蛋白质在特定区域进行位点特异性聚乙二醇修饰，最小化生物活性的损失，并减少免疫原性。然而，这一策略也有几个缺点。例如，当基因工程插入自由半胱氨酸时，可能会增加不适当的二硫键生成和蛋白质二聚化的可能性。 开发了多种PEG衍生物，每种具有独特的优缺点，其中一些使用半胱氨酸残基。首先，PEG-乙烯基磺酰（PEG-VS）在温和的碱性条件下（pH 7-8）与硫醇反应，形成稳定的硫醚键。如果pH升高，反应会更快。尽管PEG-VS在水溶液中稳定，但在高pH下可能会与赖氨酸残基反应。 与PEG-VS不同，PEG-马来酰亚胺（PEG-MAL）在水中不稳定，可能会引发开环反应或与水分子加成。PEG-MAL与蛋白质之间的硫醚键稳定，但水解可能会慢慢切断其中一个酰胺链接。然而，它在硫醇中即使在略微酸性的pH 6-7条件下也更加活跃。通过亲核取代，PEG-碘乙酰胺（PEG-IA）逐渐与自由硫醇反应，形成持久的硫醚键。为了防止生成自由碘并与其他氨基酸反应，反应应在暗容器中进行，并使用少量过量的PEG-IA。最后，为了与蛋白质形成二硫键，可以使用邻吡啶二硫化物-PEG（PEG-OPSS），它可以在酸性和碱性环境中（pH 3-10）与硫氢基反应。这些二硫键稳定，除非在还原环境中转变为硫醇。 丝氨酸、苏氨酸和色氨酸共轭 通过高碘酸盐氧化反应，可以通过靶向丝氨酸和苏氨酸的N端位置产生羧基醛基。1, 2-氨基醇对高碘酸盐氧化的易感性影响这一过程。先前，N端丝氨酸残基经历了一种位点特异性聚乙二醇修饰程序，该程序涉及氨基氧和肼基PEG衍生物的氧亚胺配位和过氧化钠氧化。聚乙二醇修饰后，白细胞介素-8（IL-8）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和IL-1r仍保留其生物活性。 强反应条件，通常会导致蛋白质变性或降低反应产率，是共轭协议中的主要问题。最近，越来越多的关注集中在生物正交改变芳香氨基酸的侧链。特别是酪氨酸由于其相对稀有性（与赖氨酸等某些其他敏感内源氨基酸相比）和可改变性而成为蛋白质修饰的理想目标。钯催化的酪氨酸残基烷基化反应是一种修改蛋白质的技术。这一过程在室温下使用亲电中间体，如由烯丙基醋酸酯和氨基甲酸酯前体生成的π-烯丙基，在水相中修改PPD。 选择性聚乙二醇修饰的酶工具 酶具有特殊的选择性、特异性和催化特性。迄今为止，酶在化学领域的应用尚未得到充分发挥，但这一方法很快可能取得巨大进展。关于酶用于选择性聚乙二醇修饰的应用，转谷氨酰胺酶（TGase）已经取得了显著成果，并激发了多个聚乙二醇修饰研究。最近，PEG链通过转谷氨酰胺酶（TGase）酶与谷氨酰胺（Gln）蛋白残基的羧酰胺基团共价连接。TGase是一种能够催化两个蛋白质之间的酰基转移的酶，使用谷氨酸的谷氨酰基作为酰基供体，使用主要氨基（通常是赖氨酸的ε-氨基）作为酰基受体。重要的是，谷氨酰胺不能不标记其他残基或破坏蛋白质的结构进行化学修改。由于TGase对氨基酸序列和底物的灵活性有严格要求，因此这种酶促共轭具有选择性。因此，蛋白质中仅有一两个谷氨酰胺通常符合TGase催化的要求。 目前，还提出了一种被称为糖基聚乙二醇修饰的新方法，用于通过糖基转移酶将PEG连接到O-糖基上。这一方法通过基因工程在大肠杆菌中生产的无糖基化蛋白在指定的丝氨酸和苏氨酸残基上进行酶促GalNAc糖基化。然后，与PEG结合的唾液酸被酶促转移到GalNAc残基。这一方法已经在三种临床使用的治疗性多肽中得到应用：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、干扰素-α2b（IFN-α2b）和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。 蛋白质聚乙二醇修饰的关键参数 结合亲和力 聚乙二醇修饰可能对蛋白质的结合亲和力产生不同的影响，可能是增加、减少或没有影响。例如，聚乙二醇修饰的胰蛋白酶和氨基氧化酶在使用低分子量底物时表现出更高的活性。这些发现归因于PEG所产生的两性分子改变了蛋白质的三维结构或改善了其对底物的亲和力。Pegaptanib是一种靶向血管内皮生长因子（VEGF）的适体，VEGF导致眼部的病理性新生血管形成和血管通透性增加，是某些类型黄斑变性的原因。首次用于结合VEGF的抗VEGF适体显示出典型的适体缺点，即因核酸酶降解和快速的肾脏清除率导致半衰期较短。通过与40 kDa分支PEG的共轭，聚乙二醇修饰延长了其血浆半衰期并增加了组织滞留，同时使其结合亲和力降低了四倍。聚乙二醇修饰使玻璃体液扩散延迟，增强了效果并降低了全身暴露。 此外，靶向抗肿瘤坏死因子（TNF）的单克隆抗体certolizumab pegol是一种聚乙二醇修饰的Fab片段，它可以结合并中和膜结合型或可溶性膜TNF。在此情况下，与分支PEG的共轭保持了识别能力，延长了血液循环时间，并可能降低了免疫原性。此外，由于Fab片段的聚乙二醇修饰位点位于远离抗原结合位点的位置，这使得该化合物保持生物活性，并表现出与原始抗体相同的TNF亲和力。PEG2马来酰亚胺（分子量40 kDa）作为试剂，单个自由巯基半胱氨酸残基进行共轭。在2008年4月，FDA批准certolizumab pegol用于治疗中度至重度克罗恩病。 生物活性的改变 聚乙二醇修饰有时会改变蛋白质的生物特性。例如，聚乙二醇修饰的胆固醇氧化酶和酯酶的特异性由总胆固醇转变为HDL胆固醇。这一概念被用来开发用于HDL胆固醇检测的商业化试剂盒。聚乙二醇修饰的 IL-15与其他配体竞争受体结合的能力表明聚乙二醇修饰可以改变生物特性。Pegfilgrastim的自我调节药代动力学体现了聚乙二醇修饰如何改变生物特性。同样，生长激素的聚乙二醇修饰将其从激动剂转变为拮抗剂。 物理化学修饰 聚乙二醇修饰会引起生物分子的一系列物理化学变化。由于PEG由吸水三分子水的环氧乙烯单元组成，导致其水动力体积增大。此外，电荷改变（如酰化）可能导致聚集，这在较高温度下孵育后更为明显。当聚乙二醇修饰后保留α-氨基的电荷时，聚集较少。聚乙二醇修饰还可能隐藏电荷和糖基化能力，减少巨噬细胞系统（RES）和肝细胞的吞噬作用，从而减少蛋白质的免疫原性和蛋白水解降解。 PEG大小 多年来唯一使用的聚合物是5 kDa大小，末端被甲氧基和羟基封端。尽管显而易见，聚合物的大小对PEG共轭物的生物行为有显著影响，但在很多年里并未意识到这一点。这一决定的做出是因为该聚合物易于激活，共轭不仅可以由专业的聚合物科学家进行，还可以在生物实验室中完成。此外，已知附着PEG的质量在决定其在血液中的停留时间上至关重要。可以通过添加一个大的PEG链或多个小的PEG链来实现所需的质量。由于样品中存在强的多分散性和大量的二醇污染，长期以来共轭一直存在麻烦，导致最终产品的异质性。随着1990年代后期商业化了纯化、低多分散性、激活的极高分子量聚合物（30–40 kDa），这一问题得以解决。考虑到对于单分散产品多分散度的值为1.00，药用PEG的多分散度应为1.01（对于5 kDa产品）到1.1（对于50 kDa产品）。 PEG结构 PEG可以采用线性、分支、Y型几何形状或多臂结构。研究发现，连接蛋白的形状与其生物功能一样重要，甚至比其分子量或结合化学性更为重要。Y型分支PEG显著增强了其在蛋白质表面的屏蔽功能，使其更有效地保护共轭蛋白免受蛋白水解酶和抗体的攻击。增加的空间位阻防止PEG到达酶的活性位点或其他不易接近的重要生物活性位点。酶的活性位点通常隐藏在不易接触的大分子裂缝中。通过使用受限的分支PEG，可以利用这一特性防止活性位点在聚乙二醇修饰过程中被修改。与线性PEG相比，分支PEG由于其结构限制了对埋藏位点的接触，从而有助于保持酶功能。此外，分支PEG的“伞状”设计在更大程度上保护了蛋白质免受降解，并为每个附着点提供更高水平的表面保护。 聚乙二醇修饰蛋白质的纯化 聚乙二醇修饰的蛋白质必须经过纯化，以从复杂的混合物中提取最终产品。需要将特定的PEG-蛋白质共轭物与未反应的蛋白质、过度聚乙二醇修饰的的蛋白质、未反应的PEG试剂以及最终会被加入聚乙二醇修饰混合物中的其他试剂分开。通常，构建生物分离方法时需要利用物理化学特性的差异。通过电荷、流体动力半径、疏水性，甚至在某些情况下通过亲和力的差异，可以分离目标的PEG-蛋白质。聚乙二醇修饰混合物的复杂性通常决定了纯化过程能否有效地提供所需的产品均一性。 大多数聚乙二醇修饰的蛋白质的纯化采用柱层析法，特别是尺寸排阻层析（SEC）和离子交换层析（IEC）。SEC基于溶质大小的差异，具有可加载样品量小和流动相流速低的限制，因此通常用于分析分离。IEC则基于电荷差异，随着聚乙二醇修饰水平的增加，未带电的PEG能更好地保护蛋白质的固有电荷。遗憾的是，基于多孔颗粒层析的柱式IEC由于扩散限制，分离速度较慢。聚乙二醇修饰的蛋白质在IEC介质上的结合能力通常比原生蛋白弱。电荷屏蔽作用和流体动力半径的增加（导致扩散性降低）常被用来解释这一现象。尽管这使得分离原生蛋白和聚乙二醇修饰的蛋白质相对简单，但分离多种聚乙二醇修饰的形式仍然具有挑战性。 聚乙二醇修饰的蛋白质样品的纯化面临两类不同的难题。第一类是将PEG-蛋白质与其他反应产物（如未反应的PEG和蛋白质）分离。第二类问题则是根据位置异构体和聚乙二醇修饰量对PEG-蛋白质进行亚分级。这种分离看似简单，但与PEG聚合物相关的几个问题可能使得这一过程变得更加困难。 PK曲线分析 影响PEG修饰治疗药物在血液循环中浓度的两个最关键因素是分子量和注射部位。从注射部位的清除速率为腹腔注射（IP）>皮下注射（SC）>肌肉注射（IM）。肌肉注射药物会在注射部位形成一个储存池，并逐渐扩散进入血液；皮下注射的药物也有类似的效应，但程度较小。随着PEG的分子质量增加，皮下注射和肌肉注射的清除速率减少。PEG结合物的药代动力学特性显著受到给药方式的影响。 生物分布的双室模型表明，相对小的PEG可以通过扩散轻易地在血液和外周细胞之间转移。而大分子PEG则转移得相对较差。另一方面，相对高分子量的PEG在血液中循环时间较长，同时尿液清除率降低。无论分子量如何，PEG会在组织和器官中积累（如肌肉、皮肤、骨骼和更大程度上的肝脏）。当分子量达到50 kDa时，库普弗细胞对PEG的摄取增加。小而线性的PEG分布在整个身体，具有较高的分布体积，而分支PEG的分布较小，主要集中在肝脏和脾脏。 蛋白质修饰，特别是聚乙二醇修饰的主要动力是调节蛋白质的药代动力学特性，重点是消除和半衰期的延长。通常用于初步筛查药代动力学特性的啮齿类动物，尤其是大鼠，它们足够大，可以提供确定药代动力学曲线所需的时间采样。为了准确和满意地量化PEG蛋白共轭物在血清中的浓度，需要一种通用的分析方法来识别复杂生物材料中的共轭物。因此，蛋白质特异性的ELISA仍然是首选技术，这些试剂盒通常是商业化的，并且针对共轭蛋白具有抗体。由于这些ELISA只能检测蛋白质部分，因此对聚乙二醇修饰的蛋白的敏感度低于未聚乙二醇修饰的蛋白的ELISA。敏感度降低是它们的基本限制之一。 敏感度的降低源于PEG掩蔽了与受体结合的关键氨基酸位置，减少了受体与目标抗体之间相互作用的强度。大PEG和多个PEG与蛋白质连接时，通常会减少与抗体的亲和力，从而使得剂量-反应曲线变得不那么陡峭。为了防止PEG-蛋白共轭物浓度测定中的误差，使用相同的纯PEG-共轭物进行标准曲线是至关重要的。因此，应使用从纯化的PEG-共轭物得到的标准曲线来计算血清中PEG-共轭物的最终量，而不应使用未聚乙二醇修饰的的蛋白质作为对比。 被动和主动靶向 聚合物治疗性PPD的靶向机制可能是被动的，也可能是主动的。这一特性主要在癌症治疗中得到应用。被动靶向通过EPR诱导PEG修饰药物在可渗透肿瘤中的积累来实现。EPR的被动靶向效果可以通过主动靶向增强，主动靶向还提高了选择性。通过受体介导的内吞作用，附着在聚合物骨架上的靶向基团可以进一步区分健康细胞和恶性细胞。 被动靶向药物递送技术的有效性主要取决于细胞内外区域之间的浓度梯度。由于血管通透性增加和淋巴排泄不足，PEG共轭物利用肿瘤表现出的增加的渗透和滞留现象（EPR），并在肿瘤血管的病理生理微环境中积累。这个依赖于分子大小的效应无法通过低分子量蛋白质来探索，因为低分子量蛋白质会迅速逸出血管并导致全身毒性。聚乙二醇修饰提高了溶解度、分子质量、大小和血清稳定性。正因为这些原因，聚乙二醇修饰被认为是被动靶向递送抗癌治疗中最显著的技术之一。 主动药物靶向的思路是将药物分子与靶向剂（抗体、配体等）结合，以特异性地与细胞表面的结构结合，并将抗癌药物递送到需要的地方。前药上的靶向分子和连接子分子决定了它在体内的行为。此外，根据连接子分子的不同，药物可以通过两种方式进入肿瘤细胞：一种是受体介导的内吞作用，这涉及将整个前药内化，然后通过内体/溶酶体途径进行降解；另一种是受体非依赖的内化，这发生在前药的细胞外解离后。 图4展示了聚乙二醇修饰的 PPD的内化机制。 PEG蛋白结合物和PEG试剂的表征分析方法 在聚乙二醇修饰的治疗药物的开发过程中，针对PEG蛋白结合物和PEG试剂的分析技术在不同的阶段都是必不可少的，以确保开发出安全且有效的聚乙二醇修饰的治疗方案。成功开发聚乙二醇修饰的治疗药物时，正确表征PEG试剂（作为关键原材料）是至关重要的。PEG试剂的质量可能会因分子量、多分散性、杂质存在和活化程度的不同而有显著差异。核磁共振（NMR）常用于定性和定量地确定功能基团，并且是所有制造商用来确定活化PEG末端活性的释放方法。由于大多数PEG试剂对紫外线透明且不具荧光，必须通过衍生化过程来获得紫外吸收。例如，反相高效液相色谱（RP-HPLC）可用于在用4-氨基苯甲酸衍生化后测试甲氧基-PEG醛。 使用反相色谱和大小排阻色谱相结合的电晕检测模式可以确定PEG链的分子质量变化，从而检测最终PEG试剂中的杂质。PEG的分子量直接影响蛋白质的最终半衰期，并且直接影响聚乙二醇修饰的药物的生物利用度，这是需要仔细管理的PEG方面之一。同样的技术也用于识别PEG的多分散性和主要峰值分数。 在聚乙二醇修饰的治疗产品的生产过程中，对PEG蛋白结合物的完全表征是一项非常具有挑战性的工作。从评估聚乙二醇修饰的反应混合物开始，接着在纯化过程中分析每个分馏，最终以彻底的最终产品表征结束。聚乙二醇修饰的 PPD的表征受到PEG显著改变蛋白质特性的影响。如前所述，聚乙二醇修饰最明显的影响是较高的水动力体积和较大的分子大小。许多技术，包括大小排阻色谱（SEC）、电泳技术、光散射和质谱，可用于测量蛋白质和PEG蛋白结合物的分子量。肽图谱分析和质谱（MS）被用来通过分析聚乙二醇修饰的和未聚乙二醇修饰的的对照物来识别和定量聚乙二醇修饰位点，并且用于表征那些不易通过更简单的技术解决和检测的杂质。 FDA批准的聚乙二醇修饰的产品 聚乙二醇修饰的药物用于治疗癌症、慢性肾病、肝炎、血友病和胃肠问题等疾病。FDA于1990年3月批准了Enzon制药公司生产的聚乙二醇修饰的蛋白ADAGEN的上市。自ADAGEN发布以来，许多聚乙二醇修饰的 PPD已跟随其步伐，许多其他产品正在进行临床试验或其他研究阶段。Neulasta和Cimzia是FDA批准的两种药物，2019年的销售额分别达到了32.21亿美元和19.53亿美元。需要注意的是，所有获得FDA批准的药物都涉及到甲氧基聚乙烯醇。 聚乙二醇修饰的障碍与挑战 聚乙二醇修饰作为一种后期生产修饰技术，近年来在提高蛋白质治疗药物的生物效能和理化特性方面获得了广泛应用。考虑到该方法的有效性和安全性，已有多个商业药物在过去10多年中证明了其有效性，因此预计聚乙二醇修饰将在更多潜在治疗蛋白的修饰中得到应用。然而，随着使用分支和高分子量PEG的趋势，PEG的非生物降解性可能会对后续使用高浓度并且持续时间较长的蛋白质治疗药物产生显著的制约。 蛋白质聚乙二醇修饰已从第一代发展到第二代，目前正在尝试使用第三代聚乙二醇修饰以提高疗效。PEG聚合物的大小和与蛋白质结合物的方向性会显著改变最终产品的特性。多分散性值、位点特异性聚乙二醇修饰和聚乙二醇修饰程度等问题也是其不足之处。同样，主要用于阻止蛋白质被蛋白水解酶降解的方法，可能会妨碍底物接触蛋白的活性位点。因此，活性位点保护剂被用于避免这种问题。然而，聚乙二醇修饰仍然可能发生在保护区域附近。 聚乙二醇修饰治疗可能对患者产生不利影响，进入血管后可能导致皮炎、口腔黏膜炎和手足综合症等副作用。生物技术和纳米医学系统中也报告了其他不利影响，其中PEG链的无序排列所造成的空间阻碍降低了受体相互作用。在体内试验中，像酒精脱氢酶和细胞色素P450等酶可能逐渐缩短PEG链的长度。目前，40 kDa分支型PEG是用于蛋白质结合的最大分子量PEG。 尽管聚乙二醇修饰修饰的药物提高了生物利用度、热稳定性和物理稳定性，降低了免疫原性，延长了半衰期，优化了药代动力学和药效学特性，这些化合物在生物医药领域表现出巨大的潜力。然而，由于抗PEG免疫反应、与PEG相关的空泡等问题，聚乙二醇修饰的广泛应用仍受到一定的制约。另一方面，这一方法应该更加频繁和恰当地应用。为了解决这些问题，我们首先需要研究不同PEG的修饰过程参数，以确定理想的修饰水平和最终产品的分子量。 总结 本文讨论了聚乙二醇修饰技术的多个方面，包括PEG试剂的制备、聚乙二醇修饰过程、纯化以及PEG-蛋白结合物的研究。聚乙二醇修饰是一项已建立且经过验证的技术，已经生产出多种FDA批准的药物，证明了其可行性和安全性。自其诞生以来，聚乙二醇修饰主要用于控制已存在的治疗蛋白的生命周期。由于每种蛋白质都是独特的，每个PEG基团必须根据所需的治疗分子量身定制。PEG基团的长度和形态对药代动力学和药效学特性的影响非常大。此外，聚乙二醇修饰的药物必须符合均匀性和致热原要求，并且激活和结合方法必须是可重复的。尽管存在这些困难，蛋白质和肽的聚乙二醇修饰方法近年来已大大改进。我们可以预见并真诚希望，学术界和商业研究人员进行的众多研究将成功解决PEG-小分子药物结合物的问题，最终将这些新型产品推向市场。 参考文献：N.Akojwar, A.Mishra, P.Mishra, et al., PEGylation of Therapeutic Proteins and Peptides. PEGylated Nanocarriers in Medicine and Pharmacy, 2025.