Pegaspargase

文章首发在“药理毒理开发”微信公众号，作者：曾子像，欢迎关注。40多年前，随着重组人胰岛素和人生长激素的出现，生物药物的研发开始起步。当时，这些药物主要用于替代治疗代谢或免疫疾病中涉及的天然蛋白质，其在人体内的循环半衰期仅为几小时，这一较短的半衰期在最初被当作生物学事实所接受。与传统小分子药物的药代动力学（吸收、分布、代谢和排泄，即ADME）相比，早年对蛋白质或肽类药物快速消除的生物学机制的研究相当有限。进入21世纪后，随着嵌合和人源化抗体特别是曲妥珠单抗等抗体药物的出现，它们具有长半衰期，可达1-3周（在小鼠中为6-8天），使人们对长半衰期生物药的研发兴趣大增。IgG及其融合蛋白的长半衰期不仅源于其“大块头”，还归因于FcRn介导的内质网循环机制，其循环时间比细胞因子和其他小到中等大小的生物药物长几个数量级。此外，聚乙二醇化（PEGylation）技术的发展，为延长传统蛋白质药物的半衰期，减缓肾脏消除，提供了另外一种路径。这些基本原理的广泛认可，激发了其他几种延长生物治疗药物半衰期的技术的发明。到目前为止，已有超过50种基于不同半衰期延长技术（Fc融合、PEG化、白蛋白融合等）的药物获批，并有大量药物处于临床前和临床不同研发阶段。如下表所示，*代表已撤市。本文拟对延长生物药物半衰期的策略进行详细介绍。聚乙二醇化技术聚乙二醇化是一种通过将药物与合成的亲水性高分子聚合物进行化学结合，以增加其水动力学体积，从而减缓肾脏清除、延长药物在体内的作用时间的技术。该技术的基本概念最早可追溯到20世纪50年代。在早期研究中，肽胺类药物甘氨酰-L-亮氨酰-美斯卡林与血浆扩容剂聚乙烯吡咯烷酮结合，以延长其在体内的停留时间，并实现药物的缓慢酶催化释放。尽管当时也提出了将这种方法应用于合成内源性肽激素（如催产素或加压素），但这一方法并未进入临床实践。20年后，在重组生物药物出现之前，研究发现将甲氧基聚乙二醇与牛血清白蛋白和牛肝过氧化氢酶结合，可以降低动物免疫反应，延长半衰期。这些研究的作者Frank Davis博士和他的博士生Abraham Abuchowski随后创立了Enzon制药公司，旨在将“聚乙二醇化”从实验室转化为临床应用。Enzon公司首批获得FDA批准的产品是非人类酶类药物：pegademase（Adagen®），一种聚乙二醇化的牛腺苷脱氨酶，用于酶替代疗法，于1990年获批；以及pegaspargase（Oncaspar®），一种聚乙二醇化的来自大肠杆菌的天冬酰胺酶（ASNase），用于治疗对天冬酰胺酶天然制剂产生过敏反应的急性淋巴细胞性白血病（ALL）患者，于1994年获批。这两款药物均是通过表面赖氨酸残基的ε-氨基基团与多个5 kDa的聚乙二醇链进行随机结合，有效地屏蔽了人体免疫系统，从而减少了抗体反应和蛋白降解，延缓了肾脏清除，使得pegademase可以每周给药一次，而pegaspargase可以每两周给药一次。Enzon公司开发的下一个产品是聚乙二醇化的重组干扰素α2b（IFNα2b）。通过将单个12 kDa的线性聚乙二醇以琥珀酰亚胺碳酸酯的形式与IFNα2b进行化学结合，得到了药物peginterferon alfa-2b（PegIntron®），该药物于2000年获得FDA批准用于治疗丙型肝炎。Peginterferon α2a（Pegasys®）采用了Shearwater技术，通过将分支的40 kDa N-羟基琥珀酰亚胺激活的聚乙二醇与干扰素α2a（IFNα2a）的赖氨酸侧链结合，于一年后获得FDA批准用于相同适应症。对这两种聚乙二醇化干扰素版本的比较表明，连接化学和聚合物结构都可以显著影响PK和PD特性。Peginterferon alfa-2b在人体内的血浆半衰期为27.2-39.3小时，而未修饰的IFN约为2小时，并作为异构体混合物在体外保持了28%的活性。相比之下，peginterferon α2a的半衰期为61-110小时，但其在体外的活性已降至仅7%。Peginterferon alfa-2b从皮下注射部位迅速吸收（t1/2 = 4.6小时），而peginterferon α2a进入血液的释放显著延迟（t1/2 = 50小时）。此外，peginterferon alfa-2b的生物分布与自然IFN相似（VD = 31-73小时），而peginterferon α2a的平均表观分布容积减少到6-14 L，这很可能与更庞大的分支40 kDa聚乙二醇链有关。尽管如此，这两种生物药物在治疗丙型肝炎方面都显示出了疗效，其中peginterferon α2a达到了更高的总体持续抗病毒反应。聚乙二醇化技术在早期成功应用的基础上，多年来不断发展和完善。例如，在制备聚乙二醇化干扰素β-1a（Plegridy®）和聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子（G-CSF，商品名Neulasta®）时，采用了醛化学方法，在低pH条件下选择性地将20 kDa的线性PEG链与N末端肽氨基基团结合。而对于抗肿瘤坏死因子α（TNF-α）Fab片段certolizumab pegol（Cimzia®），则通过工程化的未配对巯基基团，使用马来酰亚胺化学方法位点特异性地结合了分支的40 kDa PEG。这两种方法都使得药物制剂更加均一。另一种实现PEG聚合物位点特异性结合的策略是通过引入非天然氨基酸。利用其专有的ReCODE™技术，Ambrx公司开发了ARX201，这是一种重组人生长激素（hGH），在35位通过琥珀终止密码子抑制引入了单个对乙酰基-L-苯丙氨酸残基。然后将30 kDa的PEG链与其正交反应基团结合，得到了单一的聚乙二醇化hGH。与WHO的hGH标准相比，ARX201在细胞增殖实验中的生物活性仅降低了约5倍，而在大鼠中的血浆半衰期增加了约9倍。然而，在2期临床试验后，由于临床前灵长类动物研究表明PEG成分在脉络丛上皮细胞中累积，开发被终止。另一种聚乙二醇化hGH（PHA-794428）采用N末端结合40 kDa分支PEG，显示出约20倍的受体亲和力降低，但在每周给药去垂体大鼠时，与每日给药的hGH相比，诱导了相似的体重增加。该产品由于在2期临床后期观察到注射部位脂肪萎缩而终止开发。最近，lonapegsomatropin（Skytrofa®），一种每周一次的聚乙二醇化hGH，获得了FDA批准。该分子是通过一个可自水解的所谓TransCon®连接子，将四臂PEG与hGH结合。除了由于其增加的水动力学体积而具有更长的循环时间外，这种修饰的hGH由于表面附着的双分支PEG的空间干扰而没有受体结合活性，从而也减少了受体介导的清除。然而，在血液pH和体温下，PEG连接子会稳定水解，导致生物活性激素的持续释放。因此，在临床开发期间未观察到注射部位的脂肪萎缩和PEG空泡化。同样的聚乙二醇化技术最近被应用于甲状旁腺激素（PTH，1-34残基）肽，以开发长效的palopegteriparatid（TransCon PTH），用于治疗成人甲状旁腺功能减退症，并于2024年获得FDA批准，商品名为Yorvipath®。为了减少黏度、进一步改善药代动力学或规避免疫识别，已经提出了几种创新的PEG衍生物，例如由Holger Frey博士最近合成的一种结构上“随机化”的、多分支的PEG链。另一个例子是来自Polytherics（后来与Antitope合并，现为Abzena）的PolyPEG™技术。这种聚合物将PEG链连接到聚甲基丙烯酸酯主链的重复单元上，从而形成类似梳子的结构。与线性30 kDa PEG结合物相比，70 kDa PolyPEG与IFNα2a结合后的黏度约降低了3倍，在大鼠中的终末半衰期延长了一倍。然而，在细胞培养实验中的效力比30 kDa PEG版本低约13倍，仅为天然IFN生物活性的0.5%。聚乙二醇化技术的局限性主要体现在可能导致药理学活性的降低，且带来一些安全性风险，比如注射部位脂肪萎缩和细胞质空泡化等。还有一点需要注意，聚乙二醇化的最初想法是降低免疫原性，特别是对于非人类来源的蛋白质，但近年来越来越明显的是，PEG本身可以触发免疫反应。这可能导致通过抗PEG抗体加速聚乙二醇化药物的血浆清除，或激活补体系统。这点是在COVID-19大流行之后开始受到关注，因为大多数疫苗使用PEG屏蔽的脂质纳米颗粒（LNPs）进行mRNA递送，并且报告了几例与COVID-19 mRNA疫苗Corminaty®和Spikevax®接种相关的PEG相关过敏性反应。事实上，PEG特异性抗体可以通过这种mRNA疫苗接种被诱导或增强，这可能会影响其他基于PEG的药物的清除。聚乙二醇的替代品近年来，已有多种其他天然或化学合成的聚合物被提议作为PEG模拟物。这些大分子与PEG具有相似的生物物理特性，例如分子量大、在水性环境中溶解度高，且有望克服PEG的一些缺陷，如免疫原性和组织蓄积性。其中一个例子是线性或超支化聚甘油（PG），它通过乙氧基乙基缩水甘油醚的阴离子开环聚合获得。一种40kDa的聚甘油与IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra，阿那白滞素）结合后，其半衰期与聚乙二醇化蛋白相似，且在动物中表现出比聚乙二醇化更低的免疫原性和更长的血浆半衰期。不过，聚甘油一般不能被体内的内源性酶降解。聚肌氨酸可能是一种很有前景的可生物降解合成聚合物。肌氨酸（N-甲基甘氨酸，Sar）是一种非蛋白氨基酸，在哺乳动物体内作为胆碱代谢的中间产物存在。有研究显示，聚肌氨酸-干扰素较PEG类似物具备相似的半衰期，但药效更强，且免疫原性更低。还有些其他类型的人工多肽样聚合物，与聚乙二醇化生物制剂相比，具有可生物降解性、更好的药代动力学特性并降低免疫原性。例如，人工α-螺旋多肽L-P(EG3Glu)——基于聚谷氨酸，其γ-羧酸盐基团被修饰为带有短PEG链的（不带电荷的）酯，这种修饰被称为PEPylation；还有所谓的高两性离子密度多肽，如羧基甜菜碱功能化多肽（PepCB）。L-P(CB-EG3Glu)是一种带有羧基甜菜碱侧链的L-P(EG3Glu)，用于修饰细菌L-天冬酰胺酶II，形成类似海胆的大分子结构。这种结合物的流体动力学大小与随机偶联5kDa甲氧基聚乙二醇（mPEG）的天冬酰胺酶相似，与未修饰的酶相比，在大鼠中的血浆半衰期增加了约20倍。与聚乙二醇化版本相比，L-P(CB-EG3Glu)-天冬酰胺酶在反复给药后几乎不会引发抗天冬酰胺酶或抗聚合物抗体。虽然这些方法在合成聚合物设计领域确实令人关注，但它们都涉及复杂的化学合成过程，且到目前为止均未进入临床阶段。合成聚合物与生物药物成分的化学偶联需要额外的加工和纯化步骤，这会降低产量并增加生产制造成本，而且对于产品分析（特别是对于具有多分散组成的聚合物）所需的额外工作也是挑战。与这些合成方法相比，天然多糖提供了另一类有趣的亲水性聚合物，可用于增加治疗性蛋白质的分子大小或对其进行屏蔽。事实上，某些细菌病原体合成的荚膜碳水化合物在结构上与哺乳动物体内的多糖相似甚至相同，这有助于它们逃避免疫系统。这类非免疫原性、可生物降解的碳水化合物包括多唾液酸、硫酸乙酰肝素前体、透明质酸和软骨素，它们都已被评估为PEG的替代品，不再逐一细表。高糖基化天然糖蛋白上的碳水化合物部分不仅会影响溶解度和稳定性等生物物理特性，还会通过调节受体亲和力和外周清除率对生物活性产生显著影响。以人促红细胞生成素（EPO）为例，天然EPO含有3个N-连接和1个O-连接糖基化位点，由不同糖型的异质混合物组成，糖链末端的唾液酸残基数存在差异。通过在30位和88位引入两个额外的含唾液酸碳水化合物的N-连接糖基化位点，研发出了高糖基化EPO类似物——darbepoetinalfa（阿法达贝泊汀，Aranesp®）。在透析患者中静脉注射后，这种修饰后的人EPO终末半衰期延长了3倍（26.3小时vs 8.5小时）。半衰期延长很可能是由于分子大小增加以及额外唾液酸残基带来的负电荷升高，导致其与带负电荷的肾小球基底膜相互排斥，从而延缓肾脏过滤。人绒毛膜促性腺激素（CG）是另一种带强负电荷的天然糖蛋白，在人体中的血浆半衰期异常长，为32-33小时。其循环时间延长是由β亚基富含脯氨酸/丝氨酸的羧基末端肽（CTP）介导的，该肽包含28个残基，带有4个O-糖基化位点，且均带有末端唾液酸基团。通过将促卵泡生成素（FSH）的β链与1个CTP肽融合，得到了长效FSH类似物corifollitropinalfa（促卵泡素α，Elonva®），于2014年在美国上市。与CTP融合不会干扰FSH与受体的结合，但会使人体内的半衰期延长2-3倍，这对接受体外受精的女性来说是一个优势，无需每天注射7次，单次皮下注射即可满足卵巢刺激需求。最近，长效人生长激素somatrogon-ghla（Ngenla®）已获批作为每周一次的治疗药物，用于患有生长激素缺乏症（GHD）的儿科患者。在该药物中，人生长激素与多个CTP肽融合，N端1个，C端串联重复1个，与常规重组人生长激素相比，在GHD儿童中半衰期延长5-10倍。因此，对于希望适度延长半衰期且高负电荷不构成问题的生物药物，高糖基化似乎颇具前景。特别是CTP融合技术，由于患者耐受性良好，可能具有更广泛的应用。然而，与所有糖蛋白一样，这些融合蛋白需要使用真核表达系统生产，且最终得到的药物制剂具有异质性，附着的碳水化合物数量和组成存在差异，这就需要在纯化和产品分析方面投入更多精力。基于重组氨基酸的生物聚合物作为聚乙二醇的另一类替代物，近年来出现了多种利用基因编码多肽的方法。这类方法均由天然蛋白源L-氨基酸的特定子集组成，旨在设计出与PEG具有或多或少相似生物物理特性的重组生物聚合物。原则上，治疗性蛋白质或多肽与这类结构无序多肽的基因融合，可直接得到具有固定氨基酸序列和长度的均一制剂，无需化学修饰或偶联步骤。这一特性使这些基因编码生物聚合物有别于其它所有天然或（半）合成大分子。PASylation®技术是将药物与由天然小分子氨基酸脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）和/或丝氨酸（Ser）组成的特定重复多肽序列进行基因融合（或化学偶联），该序列在生理缓冲条件下形成无规卷曲，与PEG的生物物理特性高度相似。与PEG一样，这种无结构、生化惰性、强亲水性但不带电荷的生物聚合物能增大蛋白质或多肽的流体动力学体积，从而显著延缓肾脏和眼部清除，并增强体内药物效力。与PEG不同的是，PAS生物聚合物已被证明在动物体内可生物降解且无免疫原性，并且能在微生物表达系统中以每升数克的产量高效生产，形成链长可达1200个残基的单分散多肽——其中PAS（800）的特性与40kDa PEG大致相当。PAS技术应用已经比较广泛。例如，瘦素与600个残基的PAS序列（PAS600）融合后，在小鼠体内的血浆半衰期延长了45倍（从26分钟延长至20小时），这使其穿过血脑屏障后，在下丘脑引起的STAT3磷酸化显著增强且持续时间延长。尽管受体亲和力降低了7倍，但在Lep ob/ob小鼠中，注射4次PAS（600）-瘦素后，体重减少了40%以上，代谢状态也恢复正常，且无任何不良反应；相比之下，在该小鼠疾病模型中，以相同摩尔剂量注射未修饰的重组瘦素，与溶媒组相比几乎无效。除了这些临床前研究外，一种PAS化天冬酰胺酶（JZP-341）已经进入实体瘤1期临床试验。此外，一种PAS化的89Zr标记抗HER2 Fab片段被用于一名转移性乳腺癌患者的正电子发射断层扫描（PET）成像，成功识别出先前未检测到的小原发肿瘤病灶。另一种基于更多种天然氨基酸（P、E、S、T、A、G）的氨基酸聚合物，称为XTEN™，被设计为无二级结构的非重复多肽，带有多个负电荷（由于谷氨酸残基含量高）。Efanesoctocog alfa（ALTUVIIIO®）基于B结构域缺失的单链重组凝血因子VIII（rFVIII），是首个（也是迄今为止唯一一个）XTEN融合蛋白，于2023年获美国FDA批准，用于治疗遗传性A型血友病。最近，XTEN被用于暂时屏蔽抗体片段的结合位点，并构建包含蛋白酶可切割连接子的前药蛋白。通过这种方式，Amunix公司开发了一种新型双特异性T细胞连接器（TCE）融合蛋白，包含两个单链可变片段（scFv），一个靶向CD3，另一个靶向肿瘤相关抗原。在这种方法中，融合蛋白在健康组织和血液中被XTEN部分功能性阻断——同时介导延长循环——但一旦进入肿瘤微环境，通过细胞外基质中局部激活的蛋白酶切割XTEN而被激活。凭借基于这种条件激活生物制剂的免疫肿瘤学研发管线，Amunix公司于2021年被赛诺菲收购。考虑到XTEN序列的高内在负电荷会降低药理活性成分的结合活性，并阻碍组织穿透（由于细胞表面和细胞外基质对阴离子的排斥），研究人员构建了一种相关的无结构但不带电荷的多肽，称为PsTag。为此，排除了谷氨酸（E），并使用重复序列单元，这与XTEN不同，但与PAS化相似。将成纤维细胞生长因子（FGF）21与这种600个残基的PsTag序列融合后，FGF21在小鼠体内的血浆半衰期从0.34小时延长至12.9小时。这种分子的衍生物PsTag-FGF21（V169L）在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型中显示出疗效。PsTag也被用于屏蔽蛋白酶可激活的双特异性T细胞衔接器。遗憾的是，尚未公开PsTag与XTEN的直接对比数据。另一种方法是基于缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-Xaa-甘氨酸五肽重复序列构建人工弹性蛋白样多肽（ELP），其中Xaa可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。ELP的独特之处在于其会发生可逆的温度依赖性相变，这由Xaa位置的残基决定。因此，ELP经过工程设计后在室温下可溶，但在体温下会聚集，形成凝胶状状态。这种相分离特性不仅可用于纯化融合蛋白，还为治疗应用中的短暂储库制剂提供了可能。基于这项技术，PhaseBio制药公司开发了多种长效肽，并进入临床阶段，包括Vasomera™——一种ELP化血管活性肠肽（VIP），以及Glymera™。一种称为EKylation的方法涉及将药理活性蛋白或多肽与由谷氨酸和赖氨酸组成的交替电荷（两性离子）氨基酸序列进行基因融合。最初，β-内酰胺酶及其不稳定突变体TEM-19的C端与10kDa和30kDa EK多肽融合。虽然保留了催化活性，并观察到热耐受性和耐盐性显著增强，但尚未公布此类或其他类似类型融合蛋白的药代动力学参数。Fc融合蛋白首个带有免疫球蛋白（Ig）Fc片段的融合蛋白是由DanielJ.Capon博士于1989年首次提出的，当时是为了设计一种针对HIV感染中病毒包膜蛋白gp120的阻断剂，其中Fc融合的作用包括：1）溶解易聚集的受体胞外区；2）利用Fc部分的同源二聚体特性改善亲和力；3）提高在哺乳动物细胞培养中的产量；4）通过蛋白A亲和层析便于纯化；5）实现更长的半衰期。此后，Fc融合技术成为继PEG化之后，改善药理活性和肽类药代动力学特性的第二大成功策略。Fc融合蛋白的循环延长主要通过内体回收介导，这是一种自然机制，使IgG1、IgG2和IgG4亚类抗体在人类中的血浆半衰期极长，约为21天。与抗体类似，Fc融合蛋白通过胞饮作用被内皮细胞内化，但并非在溶酶体中降解，而是在酸性内体环境（pH≤6.5）中，Fc部分与FcRn结合；随后，融合蛋白被转运回细胞表面，在生理pH（≈7.4）下复合物解离，再次释放到血液中。比如依那西普（Etanercept，Enbrel®），一款肿瘤坏死因子（TNF）-α受体（TNFR2，又称p75）与IgG1 Fc的融合蛋白，于1998年获批用于类风湿性关节炎（RA）治疗。RA患者中其血浆半衰期约为4天（70小时），可每周给药1-2次。但其半衰期（4天）显著短于完整重组IgG1抗体（如同样阻断TNF-α的阿达木单抗，半衰期15-19天），原因可能是FcRn结合位点（靠近抗体铰链区）的构象变化或空间位阻，导致受体亲和力降低，内体回收效率下降。事实上，依那西普与FcRn的亲和力约为阿达木单抗的1/4，且与靶标TNF-α结合后，对FcRn的亲和力会进一步降低。已知抗体Fc区中，在酸性（而非中性）pH下增强FcRn亲和力的突变可改善工程化IgG的药代动力学。比如，人α1-抗胰蛋白酶（AAT）-Fc融合蛋白INBRX-101（SAR447537）通过工程化提高FcRn亲和力，在AAT缺乏症成人中，其末端消除半衰期可达15.7-18.2天，与天然IgG接近。索塔西普（Sotatercept，Winrevair®），一款近期获批用于肺动脉高压（PAH）治疗的药物，是由人激活素受体IIA（ActRIIA）胞外区与IgG1 Fc连接的同源二聚体Fc融合蛋白，在健康人中半衰期约23天，这也得益于Fc工程化改造。此外，还要考虑目的蛋白与Fc之间连接子的重要性，主要影响蛋白活性。以度拉糖肽（Dulaglutide，Trulicity®）为例，DPP-IV保护的GLP-1（7-37）类似物与IgG4 Fc的融合蛋白，获批用于II型糖尿病治疗。当GLP-1衍生物通过天然铰链区与IgG1 Fc融合时，体外活性较游离肽降低95%；而通过优化连接子长度和序列，选择IgG4亚型的Fc，效力提升4倍。其在人体中的血浆半衰期为4.7天，可每周给药一次。还要注意的是，连接子还可能导致Fc融合蛋白对蛋白水解敏感。例如，依那西普对克罗恩病无效，因这类患者体内激活的基质金属蛋白酶上调，会切割铰链区的IgG和Fc融合蛋白。Fc融合蛋白已经有很多技术平台。比如Genexine的hyFc技术平台，通过人IgD的高柔性铰链区将治疗性蛋白与IgG4的Fc连接，避免因空间位阻导致的结合活性损失。又如Hamni的LAPSCOVERY™技术，使用合成PEG连接子共价连接Fc部分与药理活性成分，以防止活性或FcRn结合能力损失，并最小化免疫原性。另外，Fc融合蛋白不只有同源二聚体，Syntonix Pharmaceuticals开发了Fc融合单体技术，很多Fc偶联凝血因子，如依特诺凝血素α（rFIX-Fc，Alprolix®）、依莫凝血素α（rFVIII-Fc，Eloctate®）等均属此类。白蛋白融合蛋白与偶联物人血清白蛋白（HSA）是肝细胞大量合成的66.5kDa蛋白（每日约14g），是血液中最丰富的蛋白，浓度为35-50mg/mL。在血浆中，它不仅作为两性电解质和渗透剂，还充当多种生理相关化合物的载体，如激素（孕酮、睾酮、甲状腺激素等）、胆红素，尤其是多种脂肪酸。HSA在人体具有极长的血浆半衰期（19天），部分原因是其较大的分子量和生理pH下的净负电荷（等电点5.9）减少了肾脏清除；更重要的原因是内体回收机制——HSA与FcRn的结合方式类似免疫球蛋白，但结合界面与Fc部分不同。白蛋白融合蛋白延长半衰期的案例很早就已经出现。1992年发现，CD4胞外区与HSA融合后，在兔子中的消除半衰期延长140倍。但首个重组白蛋白融合蛋白阿必鲁肽（albiglutide，Eperzan®/Tanzeum®）直到20多年后才获批，用于2型糖尿病治疗——它由两个DPP-4抗性GLP-1类似物串联偶联于HSA的C端，将GLP-1拮抗剂的半衰期从几分钟延长至6-8天，实现每周给药。该药物最初被证实安全且能有效控制血糖，甚至降低心血管事件风险，但因竞争不过Fc融合蛋白度拉糖肽和脂肪酸偶联物利拉鲁肽、销售不佳，且叠加FDA对过敏反应和甲状腺C细胞肿瘤风险的警告，于2017年停产。目前唯一上市的白蛋白融合蛋白：albutrepenonacogalfa（Idelvion®）于2016年获FDA批准，用于血友病B治疗。通过白蛋白融合，其半衰期延长至102小时，是传统重组FIX的4.3倍。那么，为什么白蛋白融合蛋白临床转化成功率那么低呢？原因主要包括：1）生产难度大：HSA结构复杂（含17个二硫键和1个暴露的游离半胱氨酸），需毕赤酵母等真核表达系统实现正确折叠；若融合的活性蛋白本身也有复杂的二硫键结构，情况会更糟；2）种属差异影响临床前评价：小鼠FcRn不结合人HSA，而内源性小鼠白蛋白在pH6时与人FcRn的亲和力约强5倍。因此，即使表达人FcRn的转基因小鼠，也因小鼠白蛋白的竞争而不适合作为人HSA融合蛋白的临床前模型。需构建同时表达人FcRn和白蛋白的转基因小鼠，以开展药代动力学研究；3）内源性HSA的竞争：融合蛋白对FcRn的结合仅受轻微影响，但内源性HSA浓度（至少高三个数量级）远高于治疗性融合蛋白，因体内受体数量有限，未结合的白蛋白最终在溶酶体降解，可能阻碍融合蛋白的内体回收。例如，G-CSF-HSA融合蛋白balugrastim在III期临床试验中的终末半衰期仅35.5小时，甚至短于PEG化G-CSF（45.3小时）。改善白蛋白融合蛋白半衰期的策略之一是工程化HSA变体提高FcRn亲和力。例如，三重突变（E505Q/T527M/K573P）使HSA与多种蛋白（如broculizumab、GST、rFVII）的融合蛋白在pH5.5时对人FcRn的亲和力提高168-353倍。其中，rFVII融合蛋白在转基因小鼠中的半衰期是普通白蛋白融合蛋白的3.6倍。策略之二是与白蛋白的非共价结合。部分生物药与白蛋白共价融合后会出现活性损失，例如FIX、IFNα2b和GLP-1，原因主要是白蛋白的体积较大导致空间位阻，或干扰蛋白折叠。为解决这一问题，研究人员开发了非共价结合白蛋白的策略，而非共价连接，具体包括两种方式：1）通过化学连接脂质烃链，利用白蛋白的天然脂肪酸结合位点；2）与具有白蛋白结合活性的小蛋白结构域进行基因融合。先看下脂质化（Lipidation）方式。脂质化即通过化学酰化将脂肪酸连接至肽或蛋白药物，使其与白蛋白短暂结合，从而延长血浆半衰期。目前已有多种脂质化疗法获批，主要包括胰岛素衍生物、GLP-1类似物、hGH等。比如，每日给药一次的脂质化GLP-1类似物利拉鲁肽（liraglutide，Victoza®），其N端可被DPP-4切割，但与白蛋白形成复合物后，空间位阻部分保护其免受DPP-4降解，从而延长生物活性。此外，长链酰化肽可在皮下注射部位自发寡聚化，延缓吸收。每周给药一次的GLP-1类似物司美格鲁肽（semaglutide，Ozempic®）通过两点优化实现长效：用2-氨基异丁酸（Aib）替代Ala-8以避免DPP-4切割；连接比利拉鲁肽更长的C18脂肪酸（利拉鲁肽为C16），增强与HSA的复合物形成。但其开发需平衡脂肪酸和连接子的组合，以最大化白蛋白结合能力同时保留对GLP-1受体（GLP-1R）的亲和力，过程颇具挑战。再看下与白蛋白结合域（ABD）的基因融合。除脂质化外，另一种非共价结合HSA的策略是将药理活性成分与具有白蛋白结合活性的小蛋白结构域进行基因融合。链球菌蛋白G的ABD最初作为细菌表面蛋白被发现，可通过结合血浆蛋白为病原体提供“伪装”。ABD首次被用于延长血浆半衰期的研究，是与可溶性补体受体1型、抗Her2 Fab片段及单链双抗体融合，在动物模型中验证了效果。如靶向PCSK9的Anticalin®蛋白与ABD融合后，在大鼠中的血浆半衰期延长24倍，并进入I期临床试验。当然，还有一些其他非共价结合策略，比如抗HSA纳米抗体技术、蛋白支架等，篇幅所限，不再一一赘述。药理毒理开发1-6群已满，7群还有名额，进群的加微信，备注姓名+企业名称+专长领域。比如王**+A企业+注册或毒理。名额有限，已经在1-6群的朋友就不要跨群了。