Phenylephrine Hydrochloride

题目：Zebrafish in Cardiovascular Disease Research: from Model to Application 原文链接：https://www.ijbs.com 期刊：International Journal of Biological Sciences 摘要 心血管疾病（CVDs）仍是全球发病率和死亡率的主要诱因，但其复杂的病理生理学难以在传统哺乳动物模型中完全复现。与传统哺乳动物模型和体外系统相比，斑马鱼为心血管疾病研究提供了多项显著优势。其体型小、繁殖力高且发育迅速，特别适用于高通量筛选；而胚胎的透明性则可实现对心脏动态过程的实时无创成像。斑马鱼与人类的高度遗传同源性，加之便捷的基因编辑操作，进一步支撑了其在心血管疾病建模中的应用价值。此外，其独特的心脏再生能力为再生研究提供了宝贵平台。多种内源性和外源性斑马鱼模型已成功复现人类心血管疾病的关键特征，从而推动了机制研究及关键信号通路的鉴定。斑马鱼还支持低成本的表型筛选，为早期药物研发和心脏毒性评估做出了重要贡献。综上，尽管与哺乳动物存在解剖学差异，斑马鱼兼具遗传可操作性、表型真实性和筛选效率，凸显了其在推动心血管疾病药物研发与治疗手段创新方面的价值。 关键词：心血管疾病、疾病建模、药物发现、心脏、高通量筛选、斑马鱼 引言 心血管疾病（CVDs）是指影响心脏和血管系统的慢性疾病，包括心力衰竭（HF）、心肌病、心律失常、高血压、中风等。根据全球疾病、伤害与风险因素研究（GBD），全球有超过5亿人患有心血管疾病，这类疾病在2021年造成2050万人死亡，约占全球总死亡人数的三分之一。日益加重的心血管疾病负担对社会经济稳定和人类健康构成了重大威胁。临床前研究模型是基础研究与临床转化之间的重要桥梁。选择合适的临床前研究模型对于疾病研究和药物开发尤为重要。尽管啮齿类动物模型在心血管疾病（CVD）研究中应用广泛，但存在显著局限性，包括成本高昂、通量低、心率过快以及心脏修复机制差异显著（图1）。这些限制促使研究人员寻求更合适的模型，以更好地平衡生物学相关性与实验效率。 斑马鱼（斑马拟丽鱼）是一种热带淡水鱼类，最初被应用于发育生物学领域，随后在人类疾病研究中的应用日益广泛，包括心血管疾病和癌症相关研究[3-5]。斑马鱼的基因组已完成测序[6]，人类70%的基因都至少有一个可识别的斑马鱼同源基因[7,8]。斑马鱼模型在20世纪90年代开始普及，当时它被首次用于正向遗传学研究。此外，与其他模式生物和体外系统相比，斑马鱼在心血管疾病（CVD）研究中也具有显著优势。例如，秀丽隐杆线虫中与心血管疾病相关的基因和通路尚未被明确鉴定，这限制了其在相关研究中的深入应用。另一方面，果蝇（黑腹果蝇）的心脏结构黑腹果蝇）存在显著差异，这对功能评估造成了一定限制。此外，斑马鱼作为体内模型，在模拟疾病机制方面也优于类器官、细胞等体外系统。它们能够复制人类心血管疾病的关键特征，并实现实时成像，从而为机制研究和早期治疗评估提供便利。因此，本综述着重阐述了斑马鱼在心血管疾病研究中的价值，重点分析其遗传、发育和生理特性。这些特性助力构建可靠的疾病模型，推动高通量药物筛选与机制研究，最终促进心血管疾病治疗的发展。 图1：斑马鱼、啮齿动物与人类的对比 斑马鱼心血管系统生理学 了解斑马鱼心血管系统的形成过程与功能，对于建立合适的疾病模型至关重要。本部分阐述了斑马鱼心血管发育、斑马鱼心脏的结构与循环特征、血流动力学以及心功能评价指标，证实斑马鱼既适用于机制研究，也可用于高通量药物筛选。 斑马鱼的心脏发育 胚胎的透明性使得早期心脏形态能够被完全可视化（图2A、B）。斑马鱼心脏由静脉窦、心房、心室和动脉球组成，位于胸膜与胸腔之间中央腔的前腹侧区域。心室壁内的小梁网络与人类胚胎心脏具有显著的同源性。受精后5小时（hpf），心脏祖细胞在分裂期胚胎的侧边缘区出现。在原肠胚阶段，前侧板中胚层的细胞向中线迁移并分化为心室和心房心肌细胞。受精后24小时，心管形成、伸长并弯曲，使心室位于前方、心房位于后方。此时，跳动的线性心管开始驱动体循环，随后心脏发生环化、腔室形成和房室管形成。受精后48小时，静脉窦、心房和心室已完全发育，动脉球开始形成。 图2：斑马鱼心血管发育的表示。（A）斑马鱼发育图：从胚胎到幼虫和成体。（B）不同阶段胚胎斑马鱼心脏、成年斑马鱼心脏和成年斑马鱼鱼膀胱的代表性图像。（C）斑马鱼、小鼠和人类心血管发育的比较时间表。 心肌细胞发生重排，心脏发育基本完成，通过节律性的收缩与舒张实现泵血功能。值得注意的是，温度、水质等环境因素会影响斑马鱼的心血管发育，可能导致不同饲养条件下发育速率存在差异。 斑马鱼、小鼠和人类的心脏发育遵循一个广泛保守的序列（图2C），包括心脏前体细胞特化、心管形成、心脏环化、腔室和瓣膜形态发生、传导系统成熟以及后续的血管发育。在斑马鱼中，这些早期形态发生事件发生在极短的发育窗口期内，基本的心脏结构在受精后48-96小时内形成。这一时期大致对应小鼠的胚胎第9.5-14.5天，以及人类的妊娠早期第6-10周，不过此类对比应理解为发育阶段的对应关系，而非严格的时间等同。值得注意的是，斑马鱼很早就建立了血液循环，使得能够在哺乳动物胚胎难以触及的阶段直接在体内评估心脏结构和功能。发育保守性、光学可及性和早期功能检测的结合，使斑马鱼成为研究人类心脏发育机制以及探究与心血管疾病相关的发育过程的特别有用的模型。 斑马鱼心脏的结构与循环特征 与哺乳动物的四腔心脏和双循环系统不同，斑马鱼拥有一个两腔心脏（一个心房和一个心室）以及单循环系统[21]。在该系统中，缺氧血回流至静脉窦，进入心房，随后被泵入心室。心室收缩推动血液血液通过动脉球（这是一个弹性结构，功能上类似于哺乳动物的主动脉根）进入腹主动脉，随后流向鳃进行氧合。从鳃流出的含氧血液在返回心脏之前会直接进入体循环。在这种单循环结构中，含氧血与脱氧血在静脉窦处混合，导致整体循环效率低于哺乳动物的双循环系统。尽管这种解剖结构较为简单，但关键的血流动力学参数（包括射血分数和心室壁应力）在功能上与哺乳动物循环系统中的参数相当[28]。 重要的是，心脏功能背后的电生理机制具有高度保守性。钙离子调控[29]、动作电位传导[30]以及心脏发育调控网络（包括NKX2.5[31,32]、GATA4[33-35]和TBX5[36,37]等保守的转录因子）与哺乳动物的相关机制存在显著相似性。这种进化上的保守性，再加上解剖结构的易操作性，使得斑马鱼在研究心室重构、血流动力学应激反应以及药物诱导的心脏毒性方面具有独特优势。 斑马鱼的血管发育、细胞特化与血流动力学 斑马鱼的血管系统为研究血管生成、动静脉特化以及血流依赖性血管重塑提供了一种有价值的脊椎动物模型。斑马鱼的血管发育通过两个相关但不同的过程进行，包括血管发生和血管生成。血管发生是指由称为成血管细胞的内皮祖细胞从头组装血管的过程，成血管细胞起源于侧板中胚层。这些成血管细胞随后向胚胎中线迁移，并形成主要的轴状血管，包括背主动脉（DA）和后主静脉（PCV）]。内皮特化由主调控因子Npas4l（也称为钟形基因）启动，该因子作用于etsrp和tal1的上游。其中，etsrp是血管发生所必需的，因为etsrp的缺失会导致内皮特异性标志物显著减少。 在主要轴血管形成后，血管网络通过血管生成不断扩张。在躯干中，节间血管（ISVs）是研究体内出芽血管生成的经典模型。在受精后约19小时，单个内皮细胞背侧从背主动脉出芽于相邻体节之间形成节间血管，这一过程主要由 Vegfa 信号通过 Kdrl（Vegfr2）介导。在此过程中，内皮细胞会呈现出不同的顶端细胞和柄细胞行为。顶端细胞引领出芽并伸出丝状伪足以感知局部环境，而柄细胞则紧随其后并增殖以支持血管的延伸。Vegf 信号的增强会促进顶端细胞的特性形成，部分是通过诱导 Delta-like 4（Dll4）实现的]。随后 Dll4 激活邻近内皮细胞中的 Notch 信号，通过侧向抑制抑制顶端细胞命运，从而有助于出芽的有序排列和模式形成。 斑马鱼动静脉的特化受保守信号通路调控。脊索来源的音猬因子（Shh）诱导体节中血管内皮生长因子（Vegf）的表达，而Vegf又能激活背主动脉（DA）中的Notch信号，以促进动脉分化并抑制静脉特性。相反，骨形态发生蛋白（BMP）信号通路参与静脉内皮细胞的特化。此外，转录因子Prdm16在动脉内皮细胞中选择性富集，它能增强Notch信号并限制静脉谱系的特化，从而有助于预防动静脉畸形。这些信号通路共同在血管发育早期建立并维持动脉与静脉内皮细胞之间的分子差异。 血流动力学力量对于后续的血管重塑也至关重要。尽管主要轴血管的初始形成和定位在很大程度上由基因调控，且在无血流的情况下也可发生，但血管连接的后续优化以及动静脉身份的稳定在很大程度上依赖于血流动力学输入。这一点在节间血管（ISV）的发育过程中得到了充分体现。最初，初级节间血管源自背主动脉（DA），尚未有血液灌注。当后主静脉（PCV）发出的次级芽与初级节间血管相连时，便形成了功能性的循环通路，血液开始在该血管中流动。随后血流的出现会抑制额外静脉连接的形成，强化已灌注分支的动脉特征，并有助于躯干血管系统中典型的动静脉交替模式的建立。 斑马鱼心血管功能评价指标 用于评估斑马鱼心脏功能的关键参数包括心脏形态、心率、静脉窦-动脉球（SV-BA）距离、舒张末期和收缩末期心室容积、短轴缩短率、每搏输出量、射血分数等指标。此外，可通过心电图（ECG）以及检测心脏相关基因和蛋白质的表达水平来评估心脏功能。 由于胚胎具有透明性，可通过显微视频分析或转基因荧光报告系统对心动过速、心动过缓等表型进行无创定量分析。此外，微粒子图像测速技术（μPIV）和光声成像技术可实现血流动力学的实时分析，从而精准测量心室射血分数、心输出量以及血流剪切应力分布。光片显微镜技术能够实现高分辨率的心脏成像，助力心脏收缩的实时追踪以及动作电位和钙瞬变的精准检测。同时，高通量心电图（ECG）记录和钙敏感荧光探针的应用，有助于阐明QT间期延长、传导阻滞等心律失常的发生机制。这些定量指标为疾病模型的构建以及基于表型的药物筛选提供了直接支撑。 斑马鱼在心血管研究中的独特生物学优势 从历史上看，已有多种动物物种被用于心血管疾病（CVD）研究。鉴于斑马鱼与人类心血管系统的相似性以及关键基因的高度保守性，斑马鱼为心血管疾病研究提供了显著优势（图3）。 与人类的高度遗传同源性 斑马鱼约70%的蛋白编码基因与人类同源，80%以上的疾病相关基因具有保守性，其中包括与心血管疾病相关的基因，例如肥厚型心肌病相关的MYH7基因和长QT综合征相关的KCNH2基因。这种基因保守性使得在斑马鱼中观察到的分子通路和疾病表型具有极高的向人类转化的价值，从而提高了目标生物学特性和化合物反应转化至临床应用的可能性。在此遗传基础上，靶向扰动对于基因修饰的研究具有尤为重要的参考意义。 图3：斑马鱼用于心血管研究的优势 基因编辑的多功能性 斑马鱼的基因组已得到充分解析，这使得对基因功能和通路逻辑的精准剖析成为可能。得益于基因操作技术的简便性，正向和反向遗传策略均已成功应用于斑马鱼研究，用以鉴定新的信号通路及致病基因。 正向遗传学将表型与基因型关联起来。在斑马鱼中开展转座子介导的无偏正向遗传筛选，已成为系统性鉴定心肌病相关新基因的有效策略。例如，一项转座子筛选研究发现了bigheart突变体，该突变体因grin2bbART（一种调控钙稳态的长链非编码RNA）的破坏，表现出心动过缓与心房肥大的表型]。相比之下，反向遗传学是指对已鉴定基因进行操作，并研究其对生物体的影响。目前斑马鱼胚胎中的反向遗传学方法主要包括转基因技术、mRNA过表达技术、吗啉代修饰的反义寡核苷酸介导的敲低技术以及基因组编辑技术。近年来，锌指核酸酶技术的出现锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活子样效应物核酸酶（TALENs）以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas） 实现了精准高效的基因编辑，而CRISPR/Cas9系统凭借其操作简便、可规模化的特性，目前已成为主流的编辑平台。 关键的是，斑马鱼基因编辑技术能直接为人类心血管疾病（CVD）机制研究及治疗策略评估提供参考。在由人类受磷蛋白p.Arg14del突变引发的致心律失常性心肌病（ACM）中，研究人员通过CRISPR/Cas9技术将相同变异体引入斑马鱼，构建出了能重现该疾病关键特征的模型，这些特征包括脂质堆积、钙处理异常以及动作电位时程延长。在该模型系统中，用于急性心力衰竭的候选药物istaroxime能有效挽救细胞缺陷，这也体现了斑马鱼模型在早期治疗评估中的价值[64]。在另一项研究中，人类2057del2突变在斑马鱼心肌细胞中的特异性表达，导致了心肌壁变薄、脂肪细胞浸润和桥粒异常。研究人员用Wnt/β-连环蛋白进行治疗激动剂SB216763不仅在斑马鱼中改善了这些表型，在啮齿动物细胞和患者来源的心肌细胞中也同样有效[65]。这些例子表明，斑马鱼基因编辑的应用范围可超越疾病建模，为将致病变异与基于机制的治疗探索相联系提供了实用平台。 快速发育、胚胎透明性与动态成像 斑马鱼胚胎的体外发育速度很快，心脏组织在受精后24小时开始形成，到受精后48小时建立循环功能。它们在胚胎期和幼体早期（≤受精后7天）具有光学透明性，这使得能够通过共聚焦显微镜和光片显微镜对心脏形态发生和生理过程进行实时、无创的可视化观察。这一特性还支持对体内动态过程进行亚细胞水平追踪，包括心内膜垫形成和瓣膜原基迁移。 成像技术的最新进展极大拓宽了这些应用的范围。光场显微镜如今能够以细胞分辨率，以每秒高达200个体积的速度实时捕捉跳动的斑马鱼心脏体积图像。与基于深度学习的细胞追踪和虚拟现实辅助可视化相结合，该方法可实现对4D心室壁运动和收缩力的详细分析。集成光场与光片荧光显微镜的混合成像平台，能够以相当的时间分辨率同时采集心肌运动和心内血流数据，从而实现对单个血细胞的追踪和节段性室壁位移的定量分析。血流动力学成像也愈发具备定量特征。选择性平面照明显微镜结合微粒子图像测速技术（SPIM-μPIV）可在整个心动周期内进行3D时间分辨血流成像，并能测量净泵血量等参数。在电生理分析方面，采用电压敏感染料和钙指示剂的光学标测系统可同时记录心房和心室动作电位动态，揭示腔室特异性和频率依赖性的电生理特性。综上，这些进展极大提升了斑马鱼成像技术的实用价值，使其从以描述性观察为主，转向对心脏结构、功能和血流的定量评估，这与疾病建模和药物筛选直接相关。 心脏结构与功能的相似性 尽管斑马鱼的心血管系统具有双腔结构，但其在解剖结构和生理功能上与哺乳动物仍存在显著相似性[69]。斑马鱼的心脏由一个心房和一个心室组成，二者通过瓣膜分隔，其发育调控机制和基因表达谱也与人类相似[70]。此外，与啮齿动物相比，斑马鱼的心脏电生理特性与人类更为接近，这一点从其心电图形态中可得到证实[71,72]，这为心血管疾病的研究提供了独特的优势。 损伤后的心脏再生 与再生能力极为有限的成年哺乳动物不同，成年斑马鱼是少数能实现心脏完全再生的脊椎动物模型之一[53, 54]。这一特性使斑马鱼成为研究心肌修复细胞和分子基础、探索促再生治疗策略的宝贵模型系统。在受到物理损伤或病理性损伤（包括心尖切除、冷冻损伤或心肌细胞基因消融）后，成年斑马鱼的心脏可在30-60天内完全再生，恢复结构和功能的完整性。心脏再生的潜在机制包括不同细胞类型中多种信号通路的依次激活、表观遗传编程、冠状动脉血运重建、关键发育转录因子的激活，以及心肌细胞肌节结构的解离与重塑[71, 72]。 单细胞测序（scRNA-seq）技术的最新进展进一步加深了人们对支持斑马鱼心脏再生的细胞动态变化的理解。例如，Hu等人将单细胞测序与时空分析相结合，确定了参与再生反应的主要细胞贡献者，并发现表达胶原蛋白12的成纤维细胞是重要的促再生细胞群[73]。最近，Lu等人构建了斑马鱼心脏再生过程中八个再生阶段的空间分辨分子和细胞图谱，鉴定出tpm4a是心肌细胞再分化的关键调控因子，并证实ifrd1和atp6ap2的激活是再生心脏的显著特征[74]。此外，表达经典神经嵴标志物sox10的心脏神经嵴来源细胞是成年斑马鱼心脏正常再生所必需的[75]。综合来看，这些研究成果不断完善斑马鱼心脏的再生机制框架，为研究心脏修复机制提供了新的切入点，这些机制可能与哺乳动物的心脏疾病相关。 3.6 高通量研究潜力 高繁殖力（每对斑马鱼每周可产生200至300枚胚胎）[69] 以及极小的胚胎尺寸（直径约1毫米），使其能够开展基于培养板的高通量药物筛选或基因型-表型分析[76, 77]。关键在于，相关筛选是在完整的脊椎动物机体中进行的，能够捕捉到全机体的药效动力学、毒性以及脱靶效应，而这些效应在基于细胞的实验中往往会被忽略[76]。总而言之，遗传可操作性、活体成像、再生能力以及规模化养殖等特性的结合，使斑马鱼成为从作用机制研究到药物发现这一过程中效率极高的独特桥梁。 4. 心血管疾病斑马鱼模型及其在药物研发与毒性评估中的应用 上述概述的实验优势已将斑马鱼确立为转化心血管研究中重要的脊椎动物模型。基于这些特性，斑马鱼模型可通过两种主要策略重现人类心血管疾病的关键特征。首先，脊椎动物心脏发育与调控网络的保守性使得研究人员能够通过靶向基因操作构建遗传模型（表2），从而在体内探究心肌病、心力衰竭及相关疾病患者中发现的疾病相关变异所产生的影响。其次，斑马鱼的适用性可控的外部干预可诱导获得性疾病状态（表3），包括再生研究中使用的药物诱导损伤和心脏损伤模型。总体而言，这些互补的方法使斑马鱼成为研究疾病机制、评估候选治疗药物以及检测心脏毒性的实用平台（图4），从而为体外研究结果与哺乳动物临床前研究之间搭建起有效的桥梁。 4.1 遗传模型及其在机制与治疗研究中的应用价值 正向和反向遗传学方法已在斑马鱼胚胎中得到成熟应用[9]。通过对心肌病进行正向遗传筛选，研究发现层粘连蛋白α4、肌联蛋白和整合素连接激酶的突变与心力衰竭相关[78]。此外，近期有研究通过在斑马鱼中利用转座子介导的诱变技术开展无偏正向遗传筛选，将SORBS2鉴定为心肌病相关基因[79]。相比之下，反向遗传学则是对已知基因进行操作，以观察生物体层面的表型结果。两项大规模遗传筛选已鉴定出数百种与发育和胚胎形成不同方面相关的突变体表型[80,81]。这些突变体为研究复杂疾病过程提供了新的见解，且无需预先了解相关基因。对这些突变体的表征及其致病基因的鉴定，阐明了多种人类疾病的发病机制[82]。 图4：斑马鱼模型在心血管疾病药物研发中的应用 目前的反向遗传学方法包括转基因技术、mRNA 过表达技术、吗啉代修饰的反义寡核苷酸介导的敲低技术以及基因组编辑技术，其中基因组编辑技术涵盖锌指核酸酶技术、转录激活子样效应物核酸酶技术和成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白系统。在这些技术中，基于CRISPR/Cas9的基因组编辑可在单细胞阶段胚胎中实现高效的定点突变。与Tol2转座子系统结合，能够快速构建心肌特异性过表达或条件性敲除品系。例如，CRISPR/Cas9介导的heg1基因敲除揭示了heg1在心力衰竭和血栓形成中的调控作用，并凸显了其在心血管药物筛选中的潜在应用。同样，CRISPR/Cas9介导的nexilin基因缺陷会损害斑马鱼的心脏收缩功能。此外，Cre-loxP系统可实现基因表达的时空特异性调控，为精准解析心脏再生通路提供了可能。 具有心脏特异性荧光蛋白的斑马鱼遗传模型 带有心脏特异性荧光报告基因的转基因斑马鱼可在荧光显微镜下直接观察药物或基因对心血管系统的作用[88]。目前已培育出多种转基因斑马鱼品系，其中数种常用于评估心脏功能。Tg(myl7:eGFP)品系借助myl7启动子驱动增强型绿色荧光蛋白（eGFP）在心肌细胞中表达，已广泛应用于多种心脏疾病的研究]。同样，Tg(-5.1myl7:DsRed2-NLS)品系利用myl7启动子指导核定位红色荧光蛋白（DsRed2）在心肌细胞中表达，与Tg(myl7:eGFP)相比，其核信号和光谱特性更为独特。此外，nkx2.5基因是脊椎动物心肌发育过程中表达最早的转录因子，也是心脏祖细胞在进化上保守的标志细胞在心脏发育中发挥关键作用。TgBAC(-36nkx2.5: ZsYellow)品系利用nkx2.5启动子调控心管中黄色荧光蛋白的表达，是研究心肌细胞分化的重要工具。此外，经典的转基因斑马鱼品系Tg(cmlc2: eGFP)携带心脏特异性cmlc2启动子，可在心脏中特异性发出绿色荧光，被广泛用于评估心脏安全性和心脏保护活性。 这些荧光报告基因品系在表型筛选和心脏毒性评估中尤为有用，因为胚胎的透明性使得心脏能够被直接成像，并支持对多种功能读数进行自动化分析。研究人员利用此类品系可快速量化心率、腔室大小、射血分数、心包面积和血液循环等参数，因此这些模型非常适用于规模化的比较筛选流程。例如，Tg(cmlc2:EGFP)斑马鱼已被用于证明70和80微克/毫升的原儿茶醛会诱导心包水肿和心动过缓。同样，异甘草素在12.37和16.31毫摩尔/升的浓度下，也会在该品系中引发浓度依赖性的心脏毒性。在另一项研究中，基于Tg(fli1:EGFP)胚胎的高内涵平台实现了对体长、血液循环、心率、心包面积和节间血管面积的自动化测量，与人工分析相比，该平台能更快、更可重复地完成化学品评。 心肌病与心力衰竭的遗传模型 心力衰竭（HF）是指心脏无法泵出足够的血液以满足身体需求的病症。超过1%的成年人患有心力衰竭，其5年死亡率超过50%。随着人口老龄化，其患病率持续上升，预计到2030年将达到3%。研究人员已利用基因编辑技术建立了多种斑马鱼心力衰竭模型。心肌肥厚可由多种心血管疾病（CVDs）引发，并最终导致心力衰竭（HF）。首个被报道的斑马鱼心脏肥厚和功能障碍的遗传模型是沉默心脏（sih）和匹克威克m171（pikm171）突变体，它们分别携带tnnt2和ttn基因的突变。Tnnt2基因编码心肌肌钙蛋白T（cTnT），其突变与家族性肥厚型心肌病（HCM）及心肌梗死相关。Tnnt2基因敲除的斑马鱼会出现肌节紊乱和心肌肥厚。Ttn基因编码肌联蛋白（titin），其突变也与心肌梗死和肥厚型心肌病相关。携带ttn基因突变的心脏因肌联蛋白缺乏，会出现收缩功能受损、心室扩张以及胚胎致死的现象。溶酶体相关膜蛋白2（Lamp2）是定位于溶酶体和内体的膜蛋白，与肥厚型心肌病及自噬相关。缺乏lamp2基因的斑马鱼会表现出心肌肥厚、心室射血分数降低、运动能力下降、β-肾上腺素能收缩反应减弱以及心房扩大。Bcl2相关的永生基因3（Bag3）是热休克蛋白家族中的辅助伴侣蛋白，与人类扩张型心肌病（DCM）相关。在斑马鱼胚胎中，敲低bag3基因会导致心脏收缩功能受损和心包水肿]。在成年斑马鱼中，敲除bag3基因会引起心腔扩张、射血分数降低，并激活mTOR信号通路。抑制mTOR信号通路可改善心脏功能，因此mTOR可能成为bag3基因突变所致扩张型心肌病的潜在治疗靶点。 更多的遗传模型持续拓展我们对心肌病发病机制的认知。Septins（ septins 蛋白）在细胞骨架组织中发挥关键作用，且与肌动蛋白丝相关联。在斑马鱼中敲除 sept7b 会导致肌动蛋白表达下降和肌节结构紊乱，进而引发心室容积减小与收缩功能降低。RBFOX1 是出生后心脏成熟过程中 RNA 剪接的关键调控因子。敲低 rbfox1 会降低射血分数，并诱发心包水肿。此外，HEG1 是参与细胞间黏附的关键核蛋白，在胚胎发育过程中维持心血管功能。斑马鱼 heg1 突变体表现出严重的心力衰竭症状]，而 heg1 基因敲除的斑马鱼则出现心房和心室扩大、心动过缓、血流异常以及心包水肿。神经嵴细胞迁移至胚胎心脏中，并分化为少量心肌细胞。在斑马鱼心室中，源自神经嵴的心肌细胞表达 Notch 配体 jag2b。在胚胎发生过程中对这类心肌细胞进行基因消融，会导致胚胎型 jag2b 的表达水平下降并进一步导致成体鱼出现严重的肥厚型心肌病、心肌细胞大小改变、心脏功能下降以及心力衰竭。成年 jag2b 突变斑马鱼也表现出类似的心肌病。此外，研究表明斑马鱼 mybpc3 基因敲除会引发心脏肥大、舒张性心力衰竭和心包水肿。 Vezf1是一种调控血管生成和血管发生的转录因子，在患病人类和小鼠的心肌组织中表达水平降低[113]。在斑马鱼中，vezf1基因敲除会阻碍心脏生长以及对β-肾上腺素能刺激的收缩反应，表明vezf1在心脏重构中发挥作用]。在ENU诱变筛选中鉴定出的斑马鱼突变体tr265/tr265，因slc4a1a基因突变导致红细胞畸形，进而引发贫血和高输出量心脏压力。tr265/tr265突变体的心脏在受精后4周出现肥大，16周时发生增生，提示肥大与增生均对心脏重构有贡献]。非综合征性二尖瓣脱垂（MVP）是一种常见的心脏瓣膜病，以二尖瓣反流和心力衰竭为特征。全基因组关联研究已确定了MVP的候选基因，其中包括lmcd1，它是在心脏组织中高表达的转录辅因子，也是小鼠中Gata6的直接调控因子。在斑马鱼中敲低lmcd1会显著增加室间隔缺损的发生率。另一个候选基因为tns1（张力蛋白1），其编码的蛋白参与细胞骨架功能。tns1基因突变与罕见的X连锁型二尖瓣脱垂相关。有研究表明，在斑马鱼中敲低tns1会引发与瓣膜流出道异常相似的表型。 获得性疾病模型：表型筛选与毒性评估的整合平台 虽然遗传因素在心脏病中占很大比例，但非遗传因素也会导致心血管病变（表3）。这些模型不仅能重现人类疾病表型以用于药物筛选，还可作为药物毒性评估的重要平台（表4）。 获得性心肌病的斑马鱼模型 已有研究表明多种物质可诱导斑马鱼发生心肌损伤。抗肿瘤药物多柔比星（DOX）在使用后会损害心脏功能，造成心肌损伤，进而引发心脏畸形、心率下降、每搏输出量减少、心输出量降低，以及分数缩短率降低。此外，有研究报道乌头碱会降低斑马鱼的心率、延长SV-BA距离，并诱导心包水肿。其作用机制涉及活性氧生成、氧化应激以及线粒体凋亡由Nrf2/HO-1和JNK/ERK信号通路介导。此外，有研究表明特非那定和硝唑尼特可通过促进细胞凋亡并激活氧化应激反应，在斑马鱼体内诱发心肌损伤。 获得性心力衰竭的斑马鱼模型 心力衰竭（HF）是心血管疾病（CVD）进行性恶化的终末期阶段。维拉帕米是一种钙通道阻滞剂，已被用于在斑马鱼中诱导心力衰竭，可导致胚胎出现心包水肿、静脉充血，同时心输出量和血流速度下降]。此外，多柔比星（DOX）可用于建立剂量依赖性急性心力衰竭模型，该模型以心肌细胞凋亡和收缩功能障碍为特征。在该模型中进行的3000种化合物筛选还将维斯纳金鉴定为心脏保护剂，其保护作用随后在啮齿动物心力衰竭模型中通过调节新型靶标苹果酸脱氢酶2（MDH2）得到证实。此外，马兜铃属植物中含量丰富的马兜铃酸据报道可通过炎症介导机制导致斑马鱼出现心脏水肿和结构畸变，其作用与在哺乳动物体内的效应相似]。异丙肾上腺素（ISO）作为β-肾上腺素能受体激动剂，也可促进心肌损伤、心室重构、心腔扩张、心肌肥大、收缩力下降、正性肌力作用减弱以及炎症反应增强，最终进展为心力衰竭。此外，去氧肾上腺素、盐酸苯肼等药物可在斑马鱼中诱导心肌肥大。另外，托特罗定、链脲佐菌素、苯并(a)芘、舒尼替尼和乙醇均被证实可诱导斑马鱼发生心力衰竭。 重要的是，鉴于心脏损伤通路之间具有高度保守性，这些模型可作为直接的筛选平台。斑马鱼与人类。例如，一项以心率为主要终点的100种小分子筛选研究显示，已知会延长人类QT间期的药物在斑马鱼中均能持续诱发心动过缓与房室传导阻滞，23种化合物中有22种检测结果呈阳性。红霉素与西沙必利、西咪替丁与特非那定之间的经典药物相互作用也得到了验证。 利用这些已建立的模型，心脏毒性评估得到了进一步简化。有研究报道，11-氧代-β-乙酰乳香酸（AKBA）会诱导斑马鱼胚胎和幼鱼出现心包水肿，增大SV-BA间距，降低心率，扩大心包面积，并减慢血流速度，这为发育毒性评价提供了依据。同样，普纳替尼作为美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗白血病的酪氨酸激酶抑制剂，其在斑马鱼中引发的严重心血管不良事件与临床发现一致，凸显了斑马鱼模型在检测药物诱导心脏毒性方面的实用性。环境污染物也会在斑马鱼体内产生可检测的心血管毒性，这使得该模型可用于评估发育过程中的化学危害。例如，溴苯胺暴露会损害斑马鱼胚胎的心血管及心脏功能]。同理，除草剂喹禾灵会导致发育中的斑马鱼出现心脏结构和功能异常，并破坏心脏发生相关基因的表达。这些研究结果进一步拓展了环境风险评估的应用范围。 用于研究再生的斑马鱼心脏损伤模型 心肌梗死（MI）每年导致约900万人死亡，仍是全球范围内的主要致死原因。心肌梗死会造成心肌细胞不可逆性损失，最终引发心力衰竭（HF）。与人类及其他哺乳动物的心脏不同，成年斑马鱼的心脏在遭受严重损伤或组织破坏后，展现出强大的再生能力。构建心脏损伤与再生的斑马鱼模型，有助于阐明心脏再生的生物学机制，同时推动人类心脏疾病治疗方法的研发。目前的斑马鱼心脏再生模型包括心室尖切除模型、冷冻损伤模型、遗传性心肌细胞消融模型以及缺氧-复氧模型。 首个用于研究心脏再生的模型是心室尖切除术。在该模型中，切除10%-20%的心室尖后60天，心脏恢复了完整的收缩功能，且呈现出完全再生的状态]。损伤部位会依次经历血凝块形成、纤维组织沉积阶段，最终被再生的心肌细胞替代。 另一种模型是冷冻损伤模型。在哺乳动物中，冠状动脉结扎是诱导心脏损伤的金标准。然而，斑马鱼心脏体积较小，使得该方法在技术上不可行。作为替代方案，冷冻损伤模型应运而生，以解决切除模型的局限性。在该模型中，通过将心室与经液氮预处理的金属丝接触来诱导损伤，并通过向金属丝与心室的接触面滴加温水来终止损伤。这会导致约25%的心室快速冻融，从而引发局部损伤。损伤区域可形成纤维瘢痕，与哺乳动物心肌梗死的表型相似。但与哺乳动物心肌梗死后纤维化持续存在不同，斑马鱼的瘢痕是暂时性的，不会阻碍再生。 另一种模型是冷冻损伤模型。在哺乳动物中，冠状动脉结扎是诱导心脏损伤的金标准。然而，斑马鱼心脏体积较小，使得该方法在技术上不可行。作为替代方案，冷冻损伤模型应运而生，以解决切除模型的局限性。在该模型中，通过将心室与经液氮预处理的金属丝接触来诱导损伤，并通过向金属丝与心室的接触面滴加温水来终止损伤。这会导致约25%的心室快速冻融，从而引发局部损伤。损伤区域可形成纤维瘢痕，与哺乳动物心肌梗死的表型相似。但与哺乳动物心肌梗死后纤维化持续存在不同，斑马鱼的瘢痕是暂时性的，不会阻碍再生。通过myl7启动子驱动的心肌细胞。第二个转基因品系（β-actin2: loxp-mCherry-STOP-loxp-DTA）通过4-羟他莫昔芬（4-HT）注射，在表达CreER的细胞中表达具有细胞毒性的DTA（白喉毒素A链）。该模型造成了超过60%的心室心肌损伤和严重的心力衰竭。然而，受损的心肌细胞在数天内便完全再生，使心脏的解剖、生理及功能结构得以恢。 此外，低氧复氧模型通过将成年斑马鱼置于低氧环境后再进行复氧，模拟人类心肌梗死。尽管该方法能部分模拟冠状动脉栓塞，但全身性低氧会影响多个器官，从而限制了心脏特异性损伤分析。 近期研究进一步加深了对斑马鱼心脏再生微环境中细胞和分子相互作用的理解。有一项研究对氧化磷酸化抑制再生这一主流观点提出了挑战。通过对斑马鱼品系和洞穴鱼进行比较分析，研究人员证实氧化磷酸化实际上是心肌细胞再分化和长期成功再生所必需的。在此过程中，糖酵解通过苹果酸-天冬氨酸穿梭为再生提供支持，而增殖峰值后氧化磷酸化的进一步升高则是完成修复的必要条件。另一项研究表明，通过甲状腺激素受体αa（thraa）传递的甲状腺激素信号会影响斑马鱼心脏的再生，其机制涉及对代谢、炎症、组织修复的调控以及与hif3α的相互作用。此外，对损伤边缘区的详细分析发现，边缘区心肌细胞与巨噬细胞协同调控细胞外基质（ECM）的重塑，巨噬细胞分泌的信号分子和心肌细胞表达的mmp14b均是细胞外基质降解以及心肌细胞向受损组织突起所必需的。这些研究结果进一步表明，斑马鱼心脏的成功再生依赖于代谢程序、免疫细胞、心肌细胞和细胞外基质之间的协同相互作用。 讨论 在过去几十年里，斑马鱼已成为研究心血管发育、疾病、再生及治疗的重要脊椎动物模型。其优势包括体型小、发育快、胚胎透明以及高斑马鱼与人类关键心脏基因及信号通路具有保守性，且基因编辑操作简便。这些特性结合无创成像技术，使研究人员能够获取心率、心室动力学、电传导和血流等一系列心脏功能指标。因此，斑马鱼在疾病机制研究、大规模基于表型的筛选以及毒性评估中展现出独特的价值。目前，大量基于斑马鱼胚胎和成体的内源性和外源性模型已成功模拟出人类心血管疾病，为揭示病理机制和鉴定关键信号通路提供了重要依据。值得注意的是，斑马鱼心脏受损后能够再生，这为分析心肌修复机制提供了在哺乳动物中难以获得的独特研究体系。 基于累积的研究经验，目前有几项原则指导着斑马鱼的心血管研究。其中，严格的表型分析至关重要，包括区分心肌细胞的肥大与增殖、量化心腔大小和功能，以及整合电生理学等多维终点指标，以避免因依赖单一参数而可能出现的误判。此外，模型的选择也十分关键：遗传模型可实现基因型与表型的关联分析，而后天获得模型则能大规模验证药理学和毒理学相关假设。同时，标准化的成像与分析技术——包括光片显微镜或高速显微镜、微粒子图像测速/光声技术、心电图以及钙指示剂——为可重复且定量的评估提供了支撑。最后，将主表型检测与平行对照检测、早期机制研究相结合的筛选流程，相较于仅聚焦于目标靶点的研究，往往能产出更高质量的研究成果，同时还能保留整个生物体的药理学特征。 当将机制见解与转化性研究结果相结合时，斑马鱼的整合价值便能得到充分体现。其保守的心脏发育特征与电生理特征，能够精准模拟血液循环、腔室特化、兴奋-收缩耦联以及节律产生等过程。因此，斑马鱼出现的心律失常、QT间期异常或心力衰竭样扩张等表型，往往可以预测人类对药物的反应。大规模基因筛选与靶向性基因编辑研究，已阐明了肌节相关基因以及蛋白质稳态相关基因在人类机体中的作用心肌病，而化学和环境刺激则成功复现了与肿瘤学、环境卫生学及内科学相关的获得性疾病。 斑马鱼还通过支持基于表型的策略来助力药物发现过程。与基于靶点的检测方法相比，在胚胎和幼体中开展的基于表型的体内筛选能更好地捕捉药物的多效性、急性毒性以及全身疗效。高内涵成像技术结合射血分数、心室-心房距离、房室传导等指标的自动化定量分析，可在维持脊椎动物生理环境的前提下快速筛选候选药物。值得注意的是，长期以来一直是研究失败主要原因的心脏毒性风险，可通过转基因荧光系统、心率和心电图进行早期检测。此外，斑马鱼可作为人诱导多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CM）平台的补充。斑马鱼为高通量筛选提供了完整的生物体生理背景，而hiPSC-CM则能在细胞水平上对人类特异性遗传变异和药物反应进行机制探究。当候选阳性药物在哺乳动物细胞和啮齿动物模型中得到独立验证后，斑马鱼便成为一座高效的桥梁，可缩短从机制研究到候选药物筛选的迭代周期。 尽管斑马鱼模型具有诸多优势，但也存在一些局限性。从解剖结构来看，斑马鱼拥有两腔心脏和单循环系统，动脉球可对血液流出起到缓冲作用。尽管其许多功能和电生理特征具有保守性，但部分评价指标仍需谨慎应用。例如，心室损伤后的血流动力学可能会受到再生能力的影响。此外，温度依赖性和变温特性使得斑马鱼与恒温哺乳动物在心率、代谢率和药代动力学方面的对比变得复杂。同时，由于药物的溶解度、稳定性以及经皮肤和鳃的吸收方式，药物递送和暴露量量化面临挑战。另外，有限的血容量使药代动力学采样和血浆生物标志物分析变得复杂，而斑马鱼特异性抗体和试剂的稀缺进一步加剧了分子分析的难度。微量取样结合LC-MS分析可实现简便的药代动力学表征，而模拟建模则能将浓度-效应关系拓展至哺乳动物。此外，在可行的情况下，CRISPR敲入或碱基编辑变异复制技术相较于敲除技术具有更高的构建效率。 展望未来，技术的持续进步有望进一步强化斑马鱼在转化心血管研究中的作用。在高通量表型筛选领域，人工智能（AI）和深度学习显著提升了自动化表型识别的效率。例如，Mask2Former 能够从心跳视频中量化心脏功能参数，其性能已接近人工分析水平，从而同时提高了筛选通量和结果的可重复性。同样，基于注意力机制的 RECNet 模型在斑马鱼幼鱼表型分类中准确率超过94%，为毒理学和药物筛选中的大规模异常检测提供了有力支撑。此外，新技术正让研究人员对疾病机制的理解更为深入。单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和空间转录组学技术如今可实现损伤与修复过程中器官水平的细胞反应分析。一项近期研究结合空间转录组学与 scRNA-seq 技术，构建了斑马鱼心脏再生八个阶段的时空图谱，重建出由569,896个细胞/斑点组成的4D“虚拟再生心脏”，并明确了心肌细胞状态转变的轨迹。基因组工程技术的进展也在拓展模型构建能力。在斑马鱼变异基因敲入实验中，先导编辑技术的效率高于同源定向修复，为构建人类疾病相关突变模型提供了更具实用性的方法。与此同时，光学与生物物理学领域的突破持续推动功能分析技术的发展。光场显微镜现已能以单细胞分辨率对跳动的斑马鱼心脏进行实时体积成像，以每秒200个体积的速率捕捉心肌细胞和血细胞的动态变化。结合基于深度学习的细胞追踪和虚拟现实可视化技术，该技术可实现从收缩末期到舒张末期的4D心脏收缩功能详细分析。 综合来看，这些进展为斑马鱼研究构建了一个更整合的实验框架。空间组学、精准基因组编辑、基于人诱导多能干细胞的验证以及人工智能辅助成像技术的结合，正开始以更直接、可规模化的方式将分子事件与整个生物体的生理机能关联起来。斑马鱼不再仅仅是一个用于描述性观察的系统，正日益被定位为用于机制导向疾病建模、治疗筛选以及心血管再生研究的实用平台。 结论 总之，斑马鱼具有体型小、繁殖能力强、发育速度快、胚胎透明、基因编辑通用性强、损伤后心脏可再生以及可进行无创活体成像等优势。这些特性有助于通过高通量筛选快速、低成本地发现有效的治疗药物。尽管存在一定局限性，但遗传学、成像技术和信息学领域的持续进步将进一步推动斑马鱼在心血管疾病研究中的应用。未来，斑马鱼模型无疑将与其他哺乳动物模型和体外模型协同使用，加深我们对疾病发病机制的理解，最终推动心血管疾病的治疗。 关于木芮生物 ABOUT MURUIBIO 苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。 木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。 木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。 敬请关注