Ravulizumab-CWVZ

LALA 技术是抗体工程中的一个关键方法，主要用于改造抗体的 Fc 区域。Fc 区域是抗体与免疫系统其他组成部分（如补体系统和 Fc 受体）相互作用的部分。LALA 技术通过引入特定的突变来改变 Fc 区域的性质，从而调控抗体的功能。 技术细节 LALA 技术的核心在于对抗体 Fc 区域的两个关键氨基酸残基进行突变： Leu234Ala: 将位置 234 的亮氨酸（Leucine, L）突变为丙氨酸（Alanine, A）。 Leu235Ala: 将位置 235 的亮氨酸（Leucine, L）突变为丙氨酸（Alanine, A）。 这些突变位于 Fc 区域的 CH2 结构域，该结构域负责与 Fcγ 受体（Fc gamma receptors, FcγRs）结合。 FcγRs 是免疫细胞（如巨噬细胞、NK 细胞、中性粒细胞等）表面的受体，能够识别和结合抗体的 Fc 区域，从而触发免疫细胞的效应功能，例如抗体依赖的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖的细胞吞噬（ADCP）等。 LALA 技术的作用机制 LALA 突变通过改变 Fc 区域的结构，显著降低了抗体与 FcγRs 的结合能力。这意味着： 减少免疫细胞的激活：抗体不再能够有效地激活免疫细胞，减少了由此引发的炎症反应和组织损伤。 降低抗体的免疫原性：LALA 突变可以减少抗体被免疫系统识别和清除的可能性，从而延长其在体内的半衰期。 减少非特异性结合：降低抗体与非目标细胞的结合，提高其对目标抗原的特异性，从而减少免疫系统副反应，避免损伤血细胞，提升安全性。 历史上关于LALA技术的重要事件 2006年3月13日，六名健康男性在输注实验性抗体TGN1412后出现严重副作用，引发了危及生命的细胞因子风暴，导致部分志愿者永久性伤害。其中，TGN1412是一种针对免疫系统的IgG4抗体，用于治疗白血病和自身免疫性疾病。 科学家们调查后发现，TGN1412靶向T细胞上的CD28抗原，会诱导细胞增殖和炎症性细胞因子释放。它是一种“超级激动剂”，能向T细胞传递强烈信号。人类和食蟹猴CD28表达的差异可能是临床前研究未发现严重不良反应的原因。此外，细胞激活还需要抗体的Fc区参与，Fc受体的作用可能被低估了。由此，人们意识到了Fc功能的重要性，并开发了LALA技术。 抗体各亚型都有哪类Fc受体相结合？ 人类有四种IgG抗体亚类，其中IgG1、IgG2和IgG4被用于治疗性抗体。它们与至少三种不同类别的Fcγ受体相互作用，这些受体存在于免疫系统的多种细胞上，并且存在不同的亚型和等位型。 人类Fcγ受体的示意图 其中，IgG1结合能力最强，能够激活所有的人类Fcγ受体；IgG2主要与FcγRIIa相互作用，而IgG4则与FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIb相互作用。此外，IgG1与补体成分C1q的结合能力也是最强的，并且能够激活补体依赖性细胞毒性（CDC）。 知识点补充小栈 不同IgG亚型在各方面的差异 结构：IgG1和IgG4的铰链区较短，结构相对稳定；IgG2的铰链区更短，刚性更强；IgG3的铰链区最长，含有额外的二硫键和重复序列，灵活性最高。   不同IgG亚型在分子量方面：IgG1、IgG2、IgG4的分子量约为150 kDa；IgG3约170 kDa。 效应功能 ADCC：IgG1和IgG3与FcγRIIIa（CD16a）结合能力强，ADCC效应显著；IgG2和IgG4的ADCC效应较弱。 CDC：IgG1和IgG3与C1q结合能力强，CDC效应显著；IgG2的CDC效应较弱，IgG4几乎无CDC效应。 半衰期：IgG1、IgG2、IgG4的半衰期较长（约21天），因其与新生儿Fc受体（FcRn）结合能力强；IgG3的半衰期较短（约7天），因其与FcRn结合能力较弱。 生物学特性 IgG1：最常见的治疗性抗体亚型，兼具强ADCC和CDC效应，用于抗肿瘤、抗感染及自身免疫病治疗（如利妥昔单抗、曲妥珠单抗）。 IgG2：ADCC和CDC效应较弱，但稳定性高，适合靶向细菌多糖抗原（如肺炎球菌疫苗），在抗炎和抗感染中应用较多。 IgG3：ADCC和CDC效应最强，但半衰期短且易聚集，临床应用较少，主要用于研究或特定感染性疾病（如疟疾）。 IgG4：ADCC和CDC效应最弱，但抗炎作用显著，适合需要减少免疫激活的场景，用于过敏性疾病治疗（如奥马珠单抗）或双特异性抗体设计。 弱化ADCC效应能力，除了IgG4，IgG2是否可以成为一种选择呢？ IgG2因其较低的FcγR结合活性而具有“沉默”特性，但其二硫键交换导致的异质性和较短的半衰期限制了其应用。一种由IgG2的CH1结构域和铰链区与IgG4的CH2和CH3结构域组成的嵌合抗体比单独使用IgG2或IgG4更具“沉默”特性。这种构建体已被用于4个INN药物中，其中两种已获得市场授权，它们是依库珠单抗（eculizumab）和拉武利珠单抗（ravulizumab）。 其他弱化ADCC的技术方法 除此之外，还有其他弱化ADCC效应的手段。部分内容已在之前的文章中有所提及干货满满 | 一文掌握ADCC相关的抗体改造技术。 无糖基化抗体通过去除Fc区域的N-连接糖基化位点，显著降低了FcγR结合和免疫激活效应，但仍存在部分残留活性。尽管在临床试验中显示出一定的潜力，但其生产难度和稳定性问题限制了其广泛应用。双特异性T细胞接合剂（如mosunetuzumab和tarlatamab）尽管经过无糖基化改造，仍可能引发严重的CRS，表明无糖基化并不能完全消除炎症反应。 通过下铰链区突变（如L235E）来实现Fc沉默，也是减少抗体与FcγR结合的有效策略。尽管这类突变显著降低了免疫激活效应，但仍可能引发输注相关反应。 通过亚型间残基交换（如E233P/L234V/L235A）和组合突变（如D265A），研究人员开发了更有效的Fc沉默抗体。尽管这些变体显著降低了FcγR活性，但仍存在热稳定性降低和半衰期缩短等问题。 LALA家族 迄今为止，下铰链区组合变体中使用最广泛的是IgG1的L234A/L235A突变，通常称为“LALA”。该突变完全消除了补体活性，并将与FcγRI和FcγRII的结合降低了100倍。而F234A/L235A仍然是IgG4中最受欢迎的变体。 LALA家族的扩展 尽管LALA变体广受欢迎，但IgG1的LALA变体并未完全沉默。它们显示出与可溶性FcγRI和FcγRIIIa的158V等位基因的显著结合，以及与除FcγRIIIa的158F等位基因外的所有受体的高水平ADCP（抗体依赖性细胞吞噬作用）和ADCC（抗体依赖性细胞毒性）。此外，与野生型IgG1相比，突变的CH2结构域热稳定性降低。因此，一些研究人员添加了额外的突变以使沉默更完全，并可能恢复热稳定性。 最早的方法之一是在下铰链区添加额外突变，创建L234A/L235A/G237A变体。该变体成功消除了与FcγRI和FcγRIII的结合，并恢复了热稳定性，但矛盾的是，它增加了与FcγRIIa的131H等位基因和FcγRIIb的细胞激活。 之后，由研究人员将L234A/L235A/G237A与N297A结合。通过在下铰链区添加突变到无糖基化抗体中，Fc效应功能被完全消除，但代价是稳定性和聚集潜力显著降低。 2000年和2001年，人类IgG1 Fc与FcγRIII可溶性结构域复合物的晶体结构被发表。P329作为一个广泛保守且重要的接触残基的鉴定，促使研究人员探索其提供更完全沉默的潜力。单点突变P329A或P329G消除了与C1q的结合，并将与所有Fc受体的结合降低了一个数量级。LALA与P329G的组合几乎完全消除了与Fcγ受体的结合，且未检测到ADCC。而LALA与P329A的组合效果较差。近年来，L234A/L235A/P329G变得越来越受欢迎。 LALA家族的更多远亲 一种包含L235A/G237A突变的抗体在很大程度上消除了与FcγRI、FcγRIIIa和FcγRIIa的131R等位基因的结合，但仍保留了与131H等位基因和FcγRIIb的ADCP（抗体依赖性细胞吞噬作用）活性。 有研究人员将L234F/L235E突变与P331S突变结合，但其表现不如其他变体，与所有这些受体结合时仍显示出可测量的ADCP和ADCC水平，且热稳定性降低。 L234F/L235E还可与D265A结合，应用该技术的抗体药物附有CRS风险的黑框警告，51%的患者出现了CRS。L234F/L235E/D265A比L234F/L235E/P331S更完全沉默，但与野生型IgG1相比，热稳定性降低。 其他变体 通过结合多种突变（D265A/P331S和L235R/G236R/S239K/A327G/A330S/P331S），研究人员开发了更有效的Fc沉默抗体。尽管这些变体显著降低了FcγR结合和补体活性，但仍可能存在残留的ADCP活性。 一种具有更优特性的新变体 下铰链区是Fc沉默最常见的靶向位点，但许多改变会损害热稳定性。它也是对基质金属蛋白酶（MMP）降解最敏感的区域，可能导致生物活性丧失。 通过将234和235位点突变与G236R结合，研究人员发现了一组在所有结合或功能测定中完全沉默的变体——甚至超越了之前可用的变体，如L234A/L235A/P327G。其中最好的之一是L234S/L235T/G236R（“STR”）。它不仅完全沉默，其热稳定性至少与野生型IgG相当（甚至更好），并且对基质金属蛋白酶的抵抗力也更强。世界卫生组织已将该变体采纳为Fc沉默的“金标准”。它不仅对人类IgG1有效，还对所有人类亚型以及小鼠、兔子和猴子的IgG有效，并能有效沉默与这些不同物种Fc受体的结合，使其在临床前和临床研究中特别有用。 Fc修饰是否会带来免疫原性？ 众所周知，免疫球蛋白恒定区的单点突变可能具有免疫原性。尽管Fc修饰可能引发抗药抗体反应，但现有研究表明，大多数Fc沉默突变（如LALA和STR）在临床应用中未显示出显著的免疫原性。然而，许多其他因素也会影响免疫原性风险，例如聚集。因此，通过计算机模拟和体外方法评估突变风险，并结合差示扫描荧光法（DSF）筛选变体，可以进一步降低免疫原性风险。 使用哪种变体？ 熟悉的“LALA”变体在与所有人类Fcγ受体的ADCP和ADCC中仍然具有活性。大多数其他变体以及野生型IgG2和IgG4具有与野生型IgG1相似的FcγRI和/或FcγRII受体的ADCP活性。只有两种变体在所有功能测定中完全沉默：IgG1 L234A/L235A/P329G和IgG4 E233P/F234V/L235A/D265A。不幸的是，与野生型IgG1相比，这两种变体的热稳定性显著降低，大多数其他变体也是如此，特别是缺乏Fc糖基化的N297A和N297G。沉默的必要程度取决于多种因素：临床适应症、抗体形式、靶抗原、剂量、给药途径等。 我们能从抗PD-1和抗PD-L1抗体中学到什么？ 实验表明，与Fcγ受体的结合会削弱抗PD-1抗体的抗肿瘤活性，但会增强抗PD-L1抗体的抗肿瘤活性。 通过直接比较一种具有野生型IgG4 Fc（可结合FcγRI和FcγRII）的抗PD-1抗体和一种具有E233P/F234V/L235A/D265A突变（完全沉默结合）的抗PD-1抗体。沉默抗体在体外表现出阻断活性，而野生型抗体则具有激活作用。 抗体学会列出了18种已获批用于临床或正在接受监管审查的抗PD-1抗体。其中包括四种具有“沉默”突变的IgG1（LALA或LALA加G237A），13种野生型IgG4（带有S228P以稳定结构）和替雷利珠单抗。 在这一免疫检查点轴的另一端，抗体学会列出了10种已获批或正在审查的抗PD-L1抗体。其中包括四种野生型IgG1，一种野生型IgG4和五种不同的Fc变体。 其他免疫刺激性抗体 除了PD-1和PD-L1，其他还有针对CD47、CD40和4-1BB等的抗体。对于像PD-1或LAG-3这样的抑制性受体，选择完全Fc沉默的拮抗剂是一种趋势。 ADC与LALA技术 据估计，ADC通常只有大约0.1%被肿瘤吸收——其余的ADC去了哪里？严重的副作用，包括淋巴细胞减少症、中性粒细胞减少症、血小板减少症和神经病变，在所有ADC中都很常见。至少其中一些非靶向效应可能是由Fcγ和/或FcRn受体介导的细胞摄取引起的，而Fc沉默将提供更可靠的解决方案。 总结 很多时候，选择缺乏科学依据，知识产权是重要的影响因素之一。Fc修饰的专利格局复杂，截至2019年，IgG4抗体专利被总结，其他亚类未有类似分析。LALA家族中有效沉默突变（如L234A/L235A/P329G、L234F/L235E/D265A）专有，使用受限于所有者，其他变体专利申请仍在进行。这可能促使一些人探索Fc领域的奇特区域。STR变体可能已达到既完全又不损害Fc区域结构完整性的Fcγ沉默极限，但抗体工程研究人员仍有很大发挥空间。 总之，LALA 技术是一种重要的抗体工程方法，通过对 Fc 区域的精准改造，调控抗体的免疫功能。它在提高抗体药物的安全性、有效性和特异性方面发挥着关键作用，为治疗多种疾病提供了新的可能性。 参考资料|DOI: 10.1111/imr.13379 我们已经建立了医药交流群，群里有各大著名企业和重点高校的研究人员。大家可以一起讨论医药热点，分享经验，共同进步。想加入的话，扫码或添加小编微信（VX：chirouzhenxiang666），拉您进群！ 推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。 原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。 ©2021 医药速览 保留所有权利 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版） 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Dosing is central to Dianthus Therapeutics\' plans to differentiate its candidate in a competitive market. \n Dianthus Therapeutics is advancing its challenge for the increasingly competitive generalized myasthenia gravis (gMG) market, outlining plans to move into phase 3 on the back of hits in a midphase study.The phase 2 trial compared two doses of claseprubart, an antibody engineered to selectively target the classical pathway, to placebo in 65 adults with AChR-positive gMG. Patients received claseprubart every two weeks via subcutaneous injection. While the primary endpoint looked at safety and tolerability, the secondary endpoint data provided a glimpse of the efficacy of the drug candidate. At the low dose, Dianthus reported a 4.6-point improvement on MG-ADL, a scale that measures the impact of gMG on daily functions. The improvement rose to 5.4 points on the high dose. Adjusted for placebo, the improvements on the low and high doses were 1.8 points and 2.6 points, respectively.Dianthus shared the results alongside data on QMG, a physician\'s score of disease severity. QMG scores improved 4.4 points and 4.5 points, respectively, on the low and high doses. Scores improved by two points in the placebo arm. Dianthus also reported statistically significant improvements on other measures of gMG. The biotech shared cross-trial comparisons to show how claseprubart performed against AstraZeneca’s Soliris and Ultomiris and UCB’s Zilbrysq. Claseprubart outperformed the competition in the data shared by Dianthus, with the caveat that such cross-trial comparisons can be unreliable. The company found the drug candidate was generally well tolerated, giving it a data set to inform talks with the FDA and preparations for phase 3. Dianthus plans to test two regimens of the low dose in phase 3, with patients receiving the study drug every two or four weeks. Dianthus didn’t test four-week dosing in the phase 2 study, but the lack of statistical difference between the low and high doses, coupled with evidence such as half-life data, led it to speculate that a less-frequent regimen could work. The two-week dose is Dianthus’ target product profile, but CEO Marino Garcia sees an opportunity to go beyond the base case.“Why not go further? Why not push that differentiation? I don\'t see much of a downside to be honest,” Garcia said on a call with investors to discuss the data. Dosing is central to Dianthus’ plans to differentiate its candidate in a competitive market. The company said more than 80% of patients with AChR-positive gMG have yet to switch to a biologic, despite the availability of C5 inhibitors such as Ultomiris and FcRn drugs, including argenx’s Vyvgart. Dianthus has identified intravenous and high-volume subcutaneous dosing as a barrier to uptake of rival drugs.That thinking led Dianthus to develop an autoinjector. The overarching goal is to combine the efficacy of C5 inhibitors such as Ultomiris with the safety of C1 blockers such as Enjaymo and the convenience of Dupixent. Analysts at Evercore ISI said in a note to clients that: “Both doses clearly met all the bull case efficacy bars” the firm had discussed in preview ahead these data. They added that the biotech “convincingly” matched the C5s. It didn’t see a dose response, thus “opening the door to a longer Q4W dosing interval.”