Warfarin Sodium

她这次来就诊，并不是为了复查INR，而是觉得自己“过敏”了。 来源 | 医脉通 作者｜王玉伟 01 “INR 2.3，继续每天3mg华法林，下个月再来查吧。”两个月前，心内科医生王乂对张大妈这么说。 随着非维生素K拮抗剂口服抗凝药（NOAC）的广泛应用、集采降价，华法林的应用越来越少，有专家称更新一代的口服抗凝药XI因子抑制剂出血风险更低，有望在抗凝领域带来新的革命。 但是张大妈却无法享受NOAC带来的“福利”，如何讲？ 张大妈今年70岁，患有“风湿性心脏病、二尖瓣狭窄、心房颤动”，并于20多年前行“二尖瓣机械瓣置换手术”，不得不长期服用“华法林”治疗，需要每月复查“INR”并调整药物用量。 张大妈感觉不公平，就好比在手机遍地的时代她还得使用固定电话。 病当如此，这也没有办法。 接受心脏机械瓣膜置换、或合并中重度二尖瓣狭窄的房颤患者均应使用华法林进行抗凝治疗；瓣膜反流、生物瓣膜、瓣膜成形术后等其他瓣膜疾病的房颤患者可选择NOAC。 什么，你问具体原因？ 回答就是循证医学证据不足。 RE-ALIGN 研究评估了机械瓣膜置换术后房颤患者使用达比加群的有效性和安全性，由于达比加群组发生血栓栓塞和出血事件显著增加，研究提前终止；INVICTUS研究显示，在风湿性心脏病（82%合并中重度二尖瓣狭窄）合并房颤的患者中，应用华法林的主要心血管事件风险发生率显著低于利伐沙班。 所以，使用华法林虽然存在诸多不便，但还是无法被NOAC全面取代。 嗯，就像你们办公室还在使用固定电话一样。 02 不过，张大妈并没有在下个月如期复诊，她觉得自己已经使用华法林20多年，用药经验极其丰富，尤其是最近几年华法林的用量就没调整过，INR一向稳定，自己没必要每个月都来查血。 等到张大妈再找到王乂时已经是两个月之后，她这次来就诊，并不是为了复查INR，而是觉得自己“过敏”了。 原来，张大妈长期睡眠障碍，她在上次查完INR后去了“临床心理科门诊”，被诊断为“焦虑状态”，并服用“舍曲林、阿普唑仑”治疗。服药伊始并没有不良表现，睡眠障碍等症状均得到了改善，但是最近两周，张大妈的四肢开始出现红色“皮疹”，下肢更为明显。 张大妈觉得自己肯定是“过敏”了，便找到王乂，希望他能给开点抗过敏药物。 王乂查看了张大妈的“皮疹”，立刻意识到事情不妙。 这些“皮疹”并没有隆起于皮肤或脱屑，按压也不褪色，也没有引起患者瘙痒症状，这不像是过敏反应，更像是皮下出血！ 王乂二话没说，先让张大妈查INR。 不久，王乂就接到了检验科的危急值报告：INR 9.4！ 03 王乂告知张大妈停用华法林，立即安排维生素K1肌注，同时开始思考INR升高的原因。 难道是华法林服用过量？张大妈连忙否认，自己还是坚持每天服用华法林3mg，绝无过量服药。 难道是老鼠药中毒？张大妈说自己家里也没老鼠，不会接触老鼠药。 难道是药物相互作用？王乂知道，心内科常用的“胺碘酮、普罗帕酮、维拉帕米、氨氯地平、阿托伐他汀”可以导致INR升高；抗生素或抗真菌药物可能影响华法林使用者的INR水平，应在开始或停止使用任何抗生素或抗真菌药物时监测INR；使用阿司匹林等药物可增加出血风险，但不影响INR水平。 张大妈最近才用过的药物只有阿普唑仑和舍曲林，王乂对这两种药没多少印象，于是，他在医院his系统的用药版块打开了华法林的说明书。 华法林的说明书真是内容详尽，单“药物相互作用”一段竟然有将近两千个字。 王乂把这段内容复制到word文档中，用“查找”功能搜寻上述两种药物名称，竟然全部在列！ 阿普唑仑，属于“CYP3A4抑制剂”，有可能通过增加华法林的暴露量来增强华法林的活性，导致INR增加！ 舍曲林，属于“5-羟色胺再摄取抑制剂”，5-羟色胺参与帮助血小板聚集止血工作，属于“出血风险会增加”的药品！ 04 既然找到了INR升高的原因，我们应该如何使用华法林，又如何应对华法林使用期间出现的这种问题呢？ 近年来的指南、共识都建议在INR稳定后每月（或4周）复查1次。 但是，华法林启动后应如何监测INR，指南共识们却给出了“每周一测、每日一测、三天一测”的不同建议： 2019年《心房颤动基层诊疗指南》建议华法林起始剂量为1-3mg/d，稳定前应数天至1周监测1次；2023年《心房颤动诊断和治疗中国指南》建议华法林启动后每天检测1次INR（是的，你没有看错，是“每天监测1次”）；2024年《老年心房颤动诊治中国专家共识》建议，华法林起始剂量为每日1片，用药前须测定基础INR，用药后第3、6、9天复查，根据INR调整华法林剂量。 具体启动方案，还需要各位同道根据患者情况个体化选择。 如INR不在目标范围内，可升高或降低原剂量的10%-15%，《心房颤动基层诊疗指南》中华法林剂量调整标准见表1；如在华法林使用期间，出现INR明显升高的情况，《心房颤动诊断和治疗中国指南》也有处理意见，见表2。 表1 华法林剂量调整标准 表2 INR明显升高时华法林剂量调整标准 05 在张大妈接受“停用华法林、肌注维生素K1”治疗后6小时复查INR并无显著下降，于次日复查INR降低至3.4，第三日复查INR降低至1.9，并重启华法林治疗；一周后，皮肤瘀斑显著消退，仅留下部分色素沉着。 影响华法林的药物、食物有很多，实在记不住就常查说明书吧！ 参考文献： [1] 中华医学会心血管病学分会,中国生物医学工程学会心律分会.心房颤动诊断和治疗中国指南[J].中华心血管病杂志,2023,51(6):572-618.DOI:10.3760/cma.j.cn112148-20230416-00221. [2] 中华医学会老年医学分会心血管学组,中国老年保健医学研究会老年心血管病分会.老年心房颤动诊治中国专家共识（2024）[J].中华心律失常学杂志,2024,28(2):103-124.DOI:10.3760/cma.j.cn113859-20240130-00012. [3] 中华医学会,中华医学会杂志社,中华医学会全科医学分会,等.心房颤动基层诊疗指南（2019年）[J].中华全科医师杂志,2020,19(6):465-473.DOI:10.3760/cma.j.cn114798-20191118-00838. 责编｜米子 亦一 封面图来源｜视觉中国 职称，是不是沦为“治下”手段？抗疫，该不该给予晋升优待？800多名医护留言揭露｜医起看热点 继续医学教育迎重磅改革，困于学分的医生有“救”了…… 医脉通是专业的在线医生平台，“感知世界医学脉搏，助力中国临床决策”是平台的使命。医脉通旗下拥有「临床指南」「用药参考」「医学文献王」「医知源」「e研通」「e脉播」等系列产品，全面满足医学工作者临床决策、获取新知及提升科研效率等方面的需求。 ☟戳这里，更有料！

摘要：缺血性中风（IS）在全球范围内导致严重的残疾和高死亡率。干细胞（SC）治疗展现出了与当前治疗方法不同的、对IS具有独特治疗潜力的特性。SC的细胞归巢、分化和旁分泌能力为神经保护带来了希望。近期对SC的改良研究增强了对IS的治疗效果，包括基因转染、纳米粒子修饰、生物材料修饰和预处理。这些方法提高了在缺血区域的生存率、归巢能力、神经分化和旁分泌能力。然而，在SC治疗可以临床应用之前，必须解决许多问题。这些问题包括生产质量和数量、运输和储存期间的稳定性，以及使用规定。在这里，我们回顾了IS的简要病理机制、SC治疗IS的“多机制”优势、各种SC改良方法和SC治疗挑战。我们旨在揭示使用SC治疗IS的潜力，克服挑战，并传达修改SC的创新思路。 干细胞微信群 扫描二维码，符合加群要求者， 即可加入干细胞治疗的微信群！ 1.引言 中风是全球第二大死亡原因，2019年约有655万人死亡。中风后30天内的死亡率可达24.6%，61.0%的中风患者在12个月内死亡或残疾，导致严重的社会经济负担。大约62.4%的中风患者经历了缺血性中风（IS），这通常发生在血管闭塞抑制了大脑的充足氧气和血液供应时。由于世界人口老龄化的延长，IS的发病率正在增加。高血压、高脂血症、高同型半胱氨酸血症、高血糖、吸烟和酗酒等风险因素都可能导致IS。 另一个严重问题是，IS越来越多地影响年轻成年人，约占总患者的10%。在IS之后，应尽快通过静脉注射组织型纤溶酶原激活剂或进行机械性血栓切除术以恢复受影响区域的血流。不幸的是，溶栓药物（尿激酶、链激酶和阿替普酶）在分布上特异性较弱，而机械性血栓切除术对患者的身体状况和医院设施有广泛的要求。此外，恢复脑血流可能导致大脑的二次再灌注损伤。这种反应将进一步加剧活性氧（ROS）的产生，破坏血脑屏障（BBB），并引起炎症，从而加重病情。 然而，大多数神经保护剂仅具有单一治疗效果，且对大脑的靶向能力有限。此外，BBB阻止了大多数药物进入缺血性脑实质。因此，迫切需要具有多靶点治疗效果和高靶向能力的新药物，以满足当前的临床需求。 干细胞（SCs）可以在特定条件下增殖、自我更新，并分化成各种功能细胞。目前有许多研究正在探索SCs治疗各种疾病（如IS、肺纤维化、肝衰竭和癌症）的潜力。在这些研究中，广泛开展了使用多种SC类型治疗IS的研究。SC的强烈归巢、细胞替代和分化以及旁分泌能力为IS引入了优越的治疗效果。迄今为止，SC治疗对IS的益处已在众多研究中得到证明，其显著的治疗价值引起了广泛关注。研究人员最近专注于改良SCs以提高治疗效果并减少毒性。这些改良通常增强了SC的能力，如归巢特性、神经再生和血管生成。SC治疗为IS治疗提供了新的机会。目前有65项正在进行或已停止的关于SC治疗IS的临床试验，但均未获批准用于临床（clinicaltrials.gov）。因此，研究人员必须取得非凡的突破以解决SC治疗的局限性。因此，本综述详细描述了IS的病理机制，承认了使用SC治疗IS的优势和挑战，并专注于改良SCs以获得更好的治疗效果。我们打算揭示SCs在治疗IS中的潜力和挑战，并传达设计各种SCs以有效治疗IS的创新思路。 2.IS概述 IS是由大脑中动脉突然阻塞引起的，引发了一系列风险，包括兴奋性毒性、炎症浸润、氧化应激和凋亡。由于药物和机械性血栓溶解的发展，IS治疗已大大改善。 2.1.病理机制 在IS后缺血区域会出现一系列级联反应。了解IS的病理过程有助于提高SC治疗的疗效。由于血管阻塞，大脑经历缺氧和血液供应不足，导致下游组织缺氧和葡萄糖缺乏。通常观察到两个区域：缺血核心区和缺血半影区。核心区域的血液供应不足以维持细胞生存，尽管有补偿性侧支循环。半影区的细胞可以短期存活，半影区的受损脑组织在迅速恢复血流后可以恢复。然而，半影区长期缺氧和葡萄糖缺乏将导致ATP供应不足，鼓励异常离子泵和膜去极化。从过量释放和细胞外积累的谷氨酸，长期的异常膜去极化导致明显的兴奋性毒性。具体来说，过度激活谷氨酸相关受体导致大量Ca2+内流。随后，Ca2+依赖性酶大大放大了ROS和活性氮物种（RNS）的产生，这反过来导致脂质过氧化和DNA损伤，刺激了众多炎症因子的释放。这个过程通常伴随着线粒体功能障碍，诱导细胞色素C的释放和凋亡（图1）。 图1 缺血性中风的病理过程。 2.2.当前治疗方法 目前，IS的临床治疗主要包括以下方法：中风后使用抗血栓药物或机械性取栓术来恢复血管通畅；使用神经保护剂保护神经元免受缺血或再灌注后引起的死亡（表1）。 抗血栓药物主要包括抗血小板药物、抗凝药物和溶栓药物。由于血小板在形成血栓中起着关键作用，抗血小板治疗可以有效预防血栓形成。抗血小板药物，如氯吡格雷和阿司匹林，通常用于治疗动脉或静脉血栓的血小板粘附和聚集。相比之下，包括肝素和华法林在内的抗凝药物通常用于治疗血栓性疾病，预防血栓形成并改善预后。此外，在医生监督下，符合条件的患者可以给予尿激酶和阿替普酶溶栓药物。与抗血小板治疗和抗凝治疗不同，溶栓药物激活纤溶酶原，形成纤溶酶，直接促进血栓溶解。此外，机械性血栓切除术可以增强溶栓治疗的效果。研究已证实，将机械性血栓切除术和溶栓药物结合起来，比单独使用溶栓药物具有更好的疗效和安全性。 神经保护剂在治疗IS中至关重要。尽管它们不能恢复脑血流以减少缺血性脑损伤，但神经保护剂可以抵消缺血区域的有害分子事件。由于兴奋性毒性、氧化应激和炎症介质对IS进展至关重要，它们为神经保护治疗策略提供了广泛的靶点。神经保护剂，包括人尿激酶原、牛脑苷肽和依诺金、依达拉奉、他汀类药物和铁没食子酸配位聚合物纳米点，通过各种靶点机制发挥不同的神经保护效果。 尽管抗血栓药物和神经保护剂在临床实践中广泛使用，但它们仍有一定的局限性，并可能导致不良后果。例如，溶栓药物在分布上特异性差，出血转化风险高，治疗患者再入院率高。另一方面，大多数神经保护剂半衰期短，分布特异性差，难以穿越BBB。这些挑战阻碍了它们实现最佳治疗效果的能力。许多研究目前正在致力于确定更安全、更有效的IS治疗方法以满足临床需求。 3.SC治疗IS的现状 在过去几十年中，SC治疗的临床应用取得了显著进展，SC的增殖和分化能力为再生医学奠定了基础。尽管许多研究已经证明了SCs在治疗IS中的好处，科学家们仍在寻求改良以增强它们的治疗效果。 3.1.用于治疗的不同SC类型 各种SC已被广泛研究用于IS治疗。尽管这些SC具有不同的治疗机制，但它们在治疗IS中至关重要（表2）。 3.1.1.间充质干细胞 间充质干细胞（MSCs）可以从多种组织类型中获得，如骨髓、外周血和脂肪组织。目前，MSCs是用于治疗IS和其他疾病最广泛研究的SC群体。MSCs可以自我更新，表现出多向分化，并分化成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。然而，大量证据表明，MSCs的主要有益效果并不是因为它们能够分化成受损组织中的组织细胞；相反，它们的价值在于它们的旁分泌效应，这对IS具有强大的治疗效果。此外，MSCs可以用于自体或异体移植。移植的MSCs通过旁分泌途径产生许多治疗性生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）和肝细胞生长因子（HGF）。有趣的是，在这一过程中，MSCs还分泌富含各种治疗性微小RNA（miR-133b和miR-184）和生长因子的细胞外囊泡（EVs）。这些因子和EVs随后发挥多靶点治疗效果，如抗炎、抗凋亡、促血管生成和神经生成。 MSCs的易于培养和低免疫原性使它们成为最常用的SCs。然而，需要几周的体外培养才能获得用于免疫系统治疗所需的MSCs数量。对于体外扩增的MSCs，冷冻保存可以维持它们的活性和功能。不幸的是，MSCs的冷冻保存和复苏可能会损害它们的活力、膜完整性和体内持久性，特别是在静脉注射后。由于其他SC的应用也遇到这些问题，MSCs仍然相对更接近临床应用的成功。 3.1.2.神经干细胞 神经干细胞（NSCs）源自中枢神经系统，它们能够自我更新并分化成多种配置，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。由于它们能够分化成神经元，NSCs对缺血性卒中（IS）患者发挥着重要的神经保护作用。此外，NSCs通过旁分泌途径分泌各种神经营养因子，这有助于它们的治疗效果。例如，NSCs可以在大脑中动脉闭塞（MCAO）的小鼠模型中增强脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。同时，杨等人证明，NSCs的条件培养基改善了神经缺陷，减少了脑梗死体积，同时保持了线粒体的超微结构。这些发现表明，NSCs可以通过分泌各种营养因子来进行治疗。在移植到恶劣的微环境中后，只有少数外源性NSCs能够存活。这种情况是SC治疗中的一个常见问题，设计适当的方法以提高缺血区域各种SC存活率是一个关键的探索领域。然而，使用NSCs的潜在伦理问题也限制了它们的应用。令人兴奋的是，研究表明NSCs没有肿瘤形成的风险。从鼠、大鼠或其他动物胚胎干细胞（ESC）系中获得的NSCs在移植到正常裸鼠动物后不会形成肿瘤。 3.1.3.胚胎干细胞 胚胎干细胞（ESCs）源自胚胎或胚泡，具有强大的分化潜力。ESC移植是治疗神经系统疾病，如缺血性卒中（IS）的理想方法，主要是因为它们可以分化成三个神经系统：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。基于ESCs的细胞治疗可以促进神经再生，减少小鼠IS的梗死区域，并改善中风后的感觉和行为恢复。此外，源自ESCs的小外泌体（ESC-sEVs）对IS过度激活的免疫微环境具有强大的免疫调节能力。ESC-sEVs可以显著减少IS后的炎症细胞因子、白细胞浸润和神经元死亡表达。所有这些特性表明ESCs是IS的潜在治疗剂。然而，一些研究表明，人类ESCs衍生的神经细胞有发展成畸胎瘤的风险。此外，由于ESCs的来源是胚胎，因此存在潜在的破坏胚胎的伦理问题。尽管ESCs具有出色的治疗效果，但这些恶性转化风险和伦理问题限制了它们的应用；因此，它们在治疗IS中的应用将非常有限。 3.1.4.牙髓干细胞 牙髓干细胞（DPSCs）是围绕牙髓血管的多能SCs，源自神经嵴，可以分化成神经元、肌肉和软骨。一些研究报告称DPSCs可用于治疗IS，包括促进认知功能恢复，鼓励神经元分化和血管生成，减少梗死区域，并发挥抗炎作用。DPSCs对IS的巨大治疗效果可能归因于它们的神经系统起源。尽管先前的研究已经验证DPSCs可以分化成神经元并与脑组织整合，但只有少数DPSCs能在缺血区域存活，大多数分化成星形胶质细胞。因此，IS治疗更可能通过旁分泌途径而非细胞替代和分化来整合DPSCs。DPSCs还可以通过抑制过度激活的T细胞反应发挥有效的免疫调节特性。由于从废弃牙齿中分离DPSCs的便利性，伦理问题不是问题。此外，DPSCs由于分化能力较弱，没有肿瘤形成的风险。从牙齿中提取DPSCs及其外泌体用于IS治疗是有希望的未来治疗选择。然而，需要进一步研究DPSCs治疗IS及其早期临床转化。 3.1.5.诱导多能干细胞 诱导多能干细胞（iPSC）技术指的是重新编程终末分化因子，最初由Takahashi和Yamanaka在2006年开发。他们发现，通过重新编程人类和小鼠的成纤维细胞，可以生成类似于ESCs的iPSCs。这项研究的结果揭示了基础研究、药物研究开发和SC治疗中充满希望的多能SC潜力。iPSCs在治疗IS方面表现出多种效果，包括迁移到缺血性脑组织，分化成神经元，促炎因子下调，抗炎因子上调，最终改善运动功能。同时，iPSCs增强了低剂量组织型纤溶酶原激活剂的溶栓效果。最近的一项研究发现，源自iPSCs的小外泌体可以恢复老年小鼠的血脑屏障，预防IS的发生。有趣的是，从iPSCs衍生的NSCs（iNSCs）可以分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，展现出显著的神经保护效果。此外，从iPSCs衍生的其他SCs在MCAO大鼠模型中显示出相同的治疗效果，包括调节炎症和免疫反应，促进神经分化。iPSCs直接源自患者，行为类似于ESCs，克服了免疫排斥和伦理问题。不幸的是，有报道称MCAO大鼠在iPSC移植后四周形成了畸胎瘤，这是限制其临床应用的主要原因。近年来，移植前使用多能细胞特异性抑制剂可以显著抑制畸胎瘤形成，提高iPSC在未来IS治疗中的安全性。目前，有65项SC治疗IS的临床试验，其中一半以上的临床试验集中在中国和美国（图2A）。其中，有15项正在进行或即将进行的临床试验，包括11项针对MSCs和2项针对NSCs，这进一步说明了实施MSCs和NSCs治疗IS的科学兴趣和优势（图2B）。然而，大多数关于其他SCs的临床试验已经完成或撤回，需要进一步调查以确定它们的效果。（来源：https://ClinicalTrials.gov） 图2  干细胞治疗缺血性中风的临床试验。(A) 通过搜索“stem cell | ischemic stroke”找到的65项研究的地图。来源：https://ClinicalTrials.gov。（注：由于网络原因，无法解析上述网页内容，可能是链接问题或网络连接问题，请检查链接的合法性并适当重试。）(B) MSCs、NSCs或其他SCs的临床实验状态和数量。 3.2.SCs在IS中的治疗机制 许多研究已经调查了SCs对IS的神经保护效果，主要涉及细胞迁移、细胞分化、细胞替代、旁分泌效应等方面，以及其他方面，如促进线粒体转移。 3.2.1.迁移 干细胞（SCs）在治疗缺血性卒中（IS）中被广泛研究，因为它们自然地靶向缺血损伤区域。SCs首先必须穿过血脑屏障（BBB）才能到达这些缺血区域。BBB由基底层、外周细胞和星形胶质细胞组成，能够维持大脑的稳定微环境。SCs穿过内皮细胞层并被招募到缺血组织中的确切机制尚未建立。尽管如此，越来越多的证据表明，基质细胞衍生因子1α（SDF-1α）与其受体趋化因子受体C-X-C趋化因子受体4（CXCR4）之间的相互作用对于控制细胞迁移至关重要，CXCR4在SCs表面高度表达。中风后，大量SDF-1α在缺血区域释放，对表达CXCR4的SCs具有强大的招募效应，并实现目标结果。有趣的是，研究发现缺氧诱导因子-1（HIF-1）可以调节SDF-1基因表达。增加HIF-1α的表达可以提高SCs在缺血区域的存活率，这在一定程度上解释了为什么某些缺氧预处理可以增强SC归巢。 目前，许多针对IS的靶向治疗基于SDF-1α-CXCR4轴。不幸的是，通过SDF-1α-CXCR4轴，中性粒细胞和巨噬细胞也被招募到缺血区域，加剧炎症浸润。因此，史等人将SCs与Fe3O4共孵育，增强SC膜上CXCR4的表达，用于构建仿生载体。CXCR4过表达的仿生载体同时实现了靶向治疗并切断了缺血区域炎症细胞的招募。其他信号影响SC归巢，如c-MET信号。此外，大脑炎症降低了BBB紧密连接完整性的保护，允许SCs通过细胞间隙途径通过形态变化穿过BBB。 总之，积极归巢到缺血区域是SCs发挥治疗效果的前提和关键因素。此外，增强SCs的归巢能力将扩大它们的治疗能力，这是SC修饰的一个重要课题。 3.2.2.分化和替代 SCs的神经修复功能直接体现在它们分化成新的神经细胞和替代受损神经组织上，这确保了神经传导路径的完整性。由于它们强大的分化能力可以恢复正常的神经传导，NSCs可以替代受损的神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。外源性SC移植也可以通过补偿分化引起的神经细胞损失来实现这种神经保护效果。此外，先前的研究已经证明，SCs归巢到缺血区域将分化成成熟的神经元，形成新的神经回路。这种强大的神经元分化通过移植后两个月超过50%的SCs表达神经元表型得到证明。 在分化成神经元的同时，位于缺血区域的SCs还可以通过与外周细胞、内皮细胞和星形胶质细胞相互作用修复受损的BBB，以加速神经回路重建。尽管SCs的确切神经分化机制尚未得到普遍认可，但Wnt/β-Catenin信号可能是SC自我分化的突出因素。这条途径可以促进NSCs分化成神经元而不是星形胶质细胞。 总之，由细胞分化引起的神经发生和细胞替代引起的神经回路重建可能是SCs改善IS后神经功能机制。SCs不能用于治疗IS的主要原因之一是它们神经分化能力不足。 3.2.3.旁分泌 SCs可以通过分泌各种治疗因子，包括外泌体、生长因子、趋化因子和细胞因子，加速神经功能的恢复。SC旁分泌功能体现在以下几点： 1.SCs可以通过分泌神经营养因子促进神经发生，如神经生长因子（NGF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和BDNF。例如，BDNF可以通过与酪氨酸激酶受体相互作用促进神经发生。 2.SCs可以通过分泌促血管生成因子，如Notch 1、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血管生成素-1（Ang-1）、Ang-2和VEGF，促进血管生成。例如，VEGF可以通过促进未成熟血管的形成和内皮细胞的迁移和增殖来促进血管生成。 3.SCs可以通过改善炎症因子分泌发挥重要的免疫调节和炎症调节效应[110]。研究表明，SCs可以分泌关键的转化生长因子-β（TGF-β），减轻缺血脑组织中的免疫反应，降低因细胞死亡引起的梗死区域单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平，并抑制BBB损伤引起的大量CD68+免疫细胞浸润。此外，SCs可以通过上调抗炎细胞因子和下调促炎细胞因子来调节炎症环境。例如，SCs通过增加IL-10表达和减少肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6表达来调节炎症环境。有趣的是，调节性T细胞（Tregs）刺激缺血区域SCs的增殖，但阻断抗炎细胞因子IL-10将影响这一过程。 4.SCs通过上调抗凋亡（即Livin）和下调促凋亡（即Caspase-3）蛋白分泌，在缺血区域抑制神经元凋亡。同时，研究表明SCs也可以通过分泌粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、B淋巴细胞-2（Bcl-2）和其他分子来抑制凋亡。其中，造血生长因子GM-CSF可以提高细胞存活率。除了直接的抗凋亡效应外，SCs还分泌多种神经营养因子，如BDNF、VEGF和前面提到的神经营养因子，以增强神经元存活。 SCs的旁分泌功能进一步确立了它们作为治疗IS的有利“药物”。因此，研究人员一直在追求提高SCs的旁分泌能力，以最大化它们的治疗优势。 3.2.4.线粒体转移 除了上述机制，干细胞（SCs）还可以通过线粒体转移来促进神经功能恢复。中风后，神经细胞中的大量线粒体将受损，触发线粒体自噬以确保线粒体质量。通过线粒体吞噬作用去除受损线粒体将减少活性氧（ROS）的产生，并改善缺血区域的恶劣微环境。ROS指的是体内的含氧活性物质，过量的ROS会诱导脂质过氧化和细胞损伤。尽管这部分改善了微环境，但过度的线粒体自噬可能导致受损神经元的消化和死亡。基于这些观察，将健康的线粒体转移到受损细胞是一种有前景的潜在治疗方法。许多研究已经证实，SCs可以作为线粒体供体来维持细胞线粒体平衡。SCs的线粒体转移依赖于形成Cx43调节的间隙连接通道。Cx43表达增强的SCs的线粒体转移效率几乎是正常SCs的两倍，而Cx43基因表达沉默的SCs几乎不发生。总之，将健康的线粒体传递到缺血区域的受损细胞是一种有前景的治疗技术，SCs具有出色的线粒体传递能力。然而，关于如何扩大SCs的线粒体传递效果的研究仍处于初期阶段。因此，确定SCs线粒体传递的多个信号通路是必要的。3.3.修饰方法 3.3.1.基因转染修饰 基因转染已广泛纳入基因组功能和基因治疗研究。这种技术通过将特定基因转移到细胞中来调节基因表达，最终增强或抑制特定功能。SCs的基因转染主要用于提高其治疗能力。例如，VEGF基因转染可以增强SCs的血管再生能力。一些miRNA，如miR-124，也通过促进它们分化为成熟的神经元来提高SC的治疗功能。此外，可以在SCs上进行CXCR4基因转染以增强它们的归巢能力。使用生物响应材料作为基因载体来增强SC治疗效果也已被广泛实践。例如，我们使用ROS响应材料聚[(2-丙烯酰氧基)乙基(对硼酸苯甲酸苄基)二乙基铵溴化物]（B-PDEA）作为BDNF基因载体来转染NSCs（图3A）。BDNF随后与酪氨酸激酶受体相互作用以促进神经元存活。结果表明，B-PDEA转染增加了SCs分泌的BDNF（图3C）及其在脑匀浆中的含量（图3D）。杨等人生产了一种非病毒基因载体，钙金属有机框架（Ca-MOF），并将其用于SC miRNA传递以获得更好的IS治疗效果（图3B）。Ca-MOF保护目标基因（图3E）并帮助miRNAs指导SC神经分化（图3F）。在SC基因转染过程中应仔细考虑条件。研究强调细胞形态影响转染效率。细胞形态的扩展和延伸有利于转染，且扩展良好的SCs具有更高的转染效率。粘附面积越大，转染效率越高。相比之下，细胞扩散面积对转染效率的影响相对较小。此外，载体的选择显著影响SC基因转染。病毒介导的转染是临床实践中广泛使用的基因修饰方法。尽管病毒载体具有高转染效率和使用方便的优势，但免疫原性和细胞毒性限制了它们的应用。非病毒载体已被广泛研究以避免安全问题，包括基于介孔硅和基于硅的金纳米颗粒。这些材料缺乏突变原性，但会引起促炎反应和低转染效率。这些因素在选择转染载体时需要权衡，科学家们预计将取得进一步突破，以实现高转染效率，同时避免细胞毒性。 图3 SCs的基因转染。(A) 用于BDNF转染的ROS响应型B-PDEA作为基因载体的示意图。(B) 用于miRNA-124转染的核酸酶保护型Ca-MOF作为基因载体的示意图。(C) 使用B-PDEA或PEI转染的NSCs中BDNF的累积表达。(D) 不同干细胞治疗后MCAO小鼠脑匀浆中BDNF的总量。版权所有2019 Wiley-VCH。(E) 在模拟核酸酶降解过程中Ca-MOF@miR-124或裸露miR-124的miR-124表达。(F) 在不同处理下5或10天NSCs的神经元分化标记和胶质细胞分化标记的表达。版权所有2022美国化学会。数据以均值 ± 标准差的形式呈现。 3.3.2.无机纳米颗粒修饰 已经开发了许多基于纳米颗粒的药物/基因传递系统。使用纳米颗粒修饰SCs以获得更好的IS治疗效果已得到许多研究的证实。关于纳米颗粒修饰SCs的研究主要集中在提高SCs的归巢能力。中风后，SCs上CXCR4的过表达将通过SDF-1α-CXCR4轴提高细胞归巢效率。各种基于铁的磁性纳米颗粒（MNPs）已积极增强CXCR4表达（图4B和4C）；然而，通常需要外部磁场优化以增加SC对这些基于铁的MNPs的吸收。基于这一限制，我们发明了类似磁小体的1D铁磁性氧化铁纳米链（MFION）（图4A），这是一种链状非病毒载体，有利于细胞吸收，无需外部磁力。同时，MFION在SCs上过表达CXCR4，增强SC在缺血区域的归巢（图4D-4F）和治疗效果。此外，用MNPs处理的SCs可以通过外部磁吸引靶向缺血区域。这些基于铁的纳米颗粒也可以用作基因转染的基因载体，包括超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）和MFION。纳米颗粒还被修饰以增强SC的其他能力。例如，唐等人开发了一种黑色素纳米颗粒，通过上调抗氧化防御和抑制凋亡，增强MSCs对抗缺氧缺血损伤的治疗能力。有趣的是，纳米颗粒修饰的SCs可以增强在IS治疗期间的生存和神经分化能力。其中，通过功能肽和SPION自组装形成的纳米颗粒被传递到细胞内，功能肽上调HIF-1α并诱导更高的NSC存活率。此外，Fe3O4纳米颗粒被用作“桥”连接抗氧化层与SCs，实现更高的SC存活率。 图4 通过纳米颗粒修饰SCs。(A) 基于MFION工程化MSCs用于缺血性中风治疗的示意图。(B) MSCs表面受体在与IO MNPs共孵育2小时后有无表达情况。(C) MSC CXCR4在不同浓度的IO MNPs孵育不同时间后的表达情况。版权所有2014美国化学会。(D) 不同纳米颗粒处理后MSC CXCR4的表达情况。(E) 用不同纳米颗粒处理的MSCs对SDF-1α的迁移能力。(F) 用不同纳米颗粒处理的MSCs对缺血性大脑的归巢能力。版权所有2019 Wiley-VCH。 了解移植的干细胞（SCs）在体内的迁移、分布和存活对于基础研究和临床干细胞转化至关重要。纳米颗粒也被广泛用于长期追踪治疗缺血性卒中（IS）的SCs。例如，磁共振成像（MRI）可以准确监测用基于铁的磁性纳米颗粒（MNPs）标记的间充质干细胞（MSCs）的体内行为。最近，铁氧体纳米环被报道作为一种追踪器，通过局部诱导热增强膜通透性有效地标记MSCs，用于MRI追踪和靶向IS治疗。此外，徐等人设计了一种动态增强的双模追踪系统，以改善高ROS微环境并监测长期IS治疗期间MSCs的体内命运。与其他纳米颗粒修饰不同，这项研究中的纳米颗粒锚定在SC膜上，而不是被SCs内化。此外，SCs的动态命运可以被监测长达28天。磁性纳米气泡（MNBs）可以用于长期SC追踪。李等人将MNPs组装成MNBs，然后被NSCs内化，实现MRI和超声成像监测。同时，MNPs可以通过上调BMP2/Smad信号通路指导NSCs分化为神经元表型。 总之，各种纳米颗粒增强了SCs的治疗能力，并使其在体内的行为得以追踪。预计功能性纳米颗粒的进一步开发将增强SCs在IS治疗中的治疗效果。 3.3.3.生物材料修饰 一些研究已经验证了生物材料可以调节SC行为，如多肽和水凝胶。用天然或合成的特殊功能材料修饰活细胞表面，在生物医学领域开辟了新的研究前景。目前，生物材料修饰旨在加强SC在缺血区域的归巢能力或存活率。某些生物材料可以增强SCs的归巢能力。例如，我们的研究表明，将棕榈酸肽涂覆在MSCs上可以改善导向，增加缺血组织中的MSC数量，并减少在周围组织的分布（图5）。在另一项研究中，脂质-PEG（lipo-PEG）链接的重组CXCR4非侵入性地覆盖在MSCs表面，以治疗缺血性心肌病。尽管这种表面修饰尚未应用于IS治疗，但它改善了MSCs对SDF-1的梯度迁移，表明其有可能增强对IS的治疗能力。总体而言，用生物材料修饰SCs已被证明可以改善SCs对缺血区域的靶向能力。同时，SCs的生物材料修饰可以提高它们在缺血区域的存活率。最近，徐等人通过设计脂质微胶囊来诱导自噬，解决了NSCs在缺血区域的低存活率问题。脂质微胶囊为NSCs提供了物理屏障，并增强了NSCs的自噬流，减少梗死体积，减轻脑水肿，并最终提高模型小鼠的存活率。许多最近的研究集中在抗ROS材料上，以保护SCs免受损害。例如，设计了一种可降解ROS的可注射PEG水凝胶，以增强SCs的保留和抗氧化保护。已经开发了各种生物材料以增强SCs的归巢能力和在缺血区域的存活率。预计开发更多功能性生物材料以增强SCs的治疗能力。 图5 通过生物材料修饰SCs。版权所有2017 Elsevier。 3.3.4.预处理修饰 不同的处理条件和培养环境可以改变SCs的特性和体外及体内的治疗作用。最近，有许多关于三维（3D）培养和各种SCs预处理的研究。与传统培养方法相比，3D培养显著提高了SCs对IS的治疗作用。与2D培养最显著的区别是，3D使用定制的3D人工基质来模拟SCs的自然环境，更好地反映细胞内环境。最直接的表现是，3D培养中整个细胞表面会发生细胞吸附，而2D培养中只有与培养表面接触的细胞侧面发生细胞吸附。研究表明，与2D培养的SCs相比，通过尾静脉注射的3D培养SCs显著降低了促炎细胞因子水平、小胶质细胞和脑梗死体积，同时增加了缺血区域的SCs。同时，对损伤部位小胶质细胞的RNA测序证明，3D培养的MSCs对IS的治疗作用更大，可能通过抑制小胶质细胞激活（图6L）。此外，将SCs组装成3D多细胞球体可以改善它们的旁分泌效应，有利于移植细胞的存活和治疗效果。徐等人证明，将MSCs和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）组装成3D球体显著提高了细胞活性和保留。与MSCs/HUVECs悬浮液相比，移植的3D球体具有显著的神经保护、促血管生成和抗瘢痕能力。这种3D球体促进了旁分泌因子的表达和分泌水平，最终在MCAO小鼠中实现了显著的大脑结构和运动功能恢复（图6R）。通常涉及缺氧的SC预处理，在移植前已被广泛研究以提高治疗效果。例如，缺氧预处理MSCs（HP-MSCs）最直接的影响是增加与迁移相关的蛋白表达（如CXCR4）。与在正常氧气中培养的MSCs相比，HP-MSCs显示出增强的迁移能力到缺血区域，并在感觉-运动功能测定的粘附去除测试中表现更好。胡等人列出了不同氧气含量的缺氧培养环境对SCs的影响，包括1%氧气含量以防止MSCs凋亡和2%氧气含量以减少MSCs的肿瘤潜力。 图6 SCs的预处理。SCs在3D培养或3D球状体中的潜在作用。(左) 3D-MSC发挥更强治疗效果的潜在机制。经许可转载。版权所有2021 Springer Nature。(右) (a) MSCs（红色）和HUVECs（绿色）混合的3D细胞球状体的代表性共聚焦Z堆叠图像。(b) BDNF、(c) VEGF和(d) IGF-1在细胞悬浮液（cell sus.）或3D细胞球状体（3D cell sph）中的浓度。(e) 在正常条件或缺氧和葡萄糖剥夺条件下培养的cell sus.和3D cell sph的细胞活性。比例尺，100微米。版权所有2021 Elsevier。 同时，研究表明0.1%至0.3%的氧气会促进生长因子的分泌，包括VEGF、GDNF和BDNF，促进神经发生和神经功能恢复。我们最近的工作发现，神经干细胞（NSCs）的低氧预处理可以通过调节外泌体中miRNA的表达水平来增强缺血性卒中（IS）治疗的益处，进一步展示了低氧预处理干细胞（SCs）的广泛治疗优势。除了低氧预处理，缺血性脑组织预处理也会调节体内SC的行为，包括促进CXCR4的表达以促进归巢和生长因子的释放（图7B和7C）。 图7 SCs的预处理。(A) 用或不用阿托伐他汀预处理的MSC CXCR4的流式细胞术结果。经[22]许可转载。版权所有2022 Springer Nature。(B) 未经预处理的MSCs（FBS-MSCs）、用正常脑组织预处理的MSCs（N-MSCs）和用缺血脑组织预处理的MSCs（S-MSCs）表面上CXCR4的表达。比例尺：50微米。(C) FBS-MSCs、N-MSCs和S-MSCs各种旁分泌因子的表达。版权所有2022 MDPI。 用某些药物预处理SCs也能提高它们的治疗效果。例如，用阿托伐他汀预处理间充质干细胞（MSCs）可以通过调节miR-124a/CXCR4信号通路来增强它们的归巢能力（图7A）。同样，一些细胞因子预处理，包括IL-1β，可以通过增加MSCs中各种细胞因子（TNF-α）、趋化因子（CXCL1）和粘附分子（细胞间细胞粘附分子-1（ICAM1））的表达来改善MSC的迁移。尽管一些药物或细胞因子预处理尚未应用，这些预处理方案可能会改善IS治疗。 总之，SC预处理（如缺血、低氧、药物和细胞因子，可能是治疗脑缺血损伤的有效策略。 4.挑战与展望 随着SC治疗IS的深入研究，提高SC产品的生产效率、质量和安全性的重要性也必须被强调。 4.1.生产挑战 由于细胞疗法的快速发展，对SC的需求前所未有，每年MSC的使用量接近3000万亿。提供的数据表明，成功的SC治疗需要大约1×10^9个细胞，但原始收集的SC数量有限。收集SC是一个成熟的工业项目；因此，必须通过充分的体外扩增来获得大量的SC以满足临床应用所需的细胞需求。然而，这种体外扩增耗时且需要数周时间。因此，开发新的培养技术以加快SC的体外扩增对于有效的临床治疗应用至关重要。 在制造SC时必须考虑质量。良好的生产实践（GMP）确保了药品生产的质量管理并最小化风险。一些学者已经详细描述了用于治疗的GMP级SC的生产。这个过程主要包括细胞鉴定、活性、生长活性、纯度、均匀性、异常免疫反应、致瘤性、生物效力测试、无菌测试以及检测支原体、细胞内外病原体、内毒素、培养基及其他添加剂的残留量。GMP级SC生产耗时且成本高；然而，它显著提高了SC治疗的质量和安全性。这一要求需要考虑如何在快速SC生产中降低生产成本并确保质量。 最近出现了许多SC企业，包括贝克生物和中源协和细胞技术有限公司。这些公司管理细胞收集、处理、储存和分销，形成了完整的SC产业链。此外，各种大型SC企业已经开发出基于3D微载体的大规模SC制备工艺，以满足高质量和大规模SC生产的需求。SCs在由3D微载体形成的模拟生理微环境中培养，这确保了细胞的基本质量属性和制剂稳定性。然而，在大规模制备过程中如何完全去除3D微载体，同时遵守临床应用的安全标准，仍然是一个问题。 4.2.稳定性挑战 SC的储存和运输条件将显著影响其稳定性。生产的SC将在4-10°C的冷链中运输以维持其活力，这增加了成本。大多数医院可能会在临床试验期间现场准备SC。然而，如果SC作为标准治疗方法的需求增加，医院可能无法维持自给自足的生产SC，因此仍需要外部制造商供应特定产品，使SC的运输变得不可避免。 尽管在-70°C至-196°C的冷冻保存可以维持SC的活性和功能稳定性，但使用液氮在极低温度下运输它们成本高昂，冷冻保存试剂DMSO可能具有毒性。 在环境条件下运输可能是一个可行的解决方案。先前的研究表明，哺乳动物细胞直接悬浮在培养基中，在从英国运输到中国超过36小时的环境温度下保持高活性。这些结果比使用冰袋运输的结果要好得多。有趣的是，形成SC球体可以保护SC活性，并促进在环境温度下长期储存和运输。然而，SC球体的形成需要大量的时间、财政资源，并在使用前增加处理成本。因此，需要进一步优化SC的储存和运输条件，以建立较低的运输成本并确保SC的稳定性。 4.3.使用挑战 4.3.1.使用前的预处理 即使克服了上述限制，SC治疗仍需要特定的专业操作。例如，低温储存的SC在使用前必须重新加热以恢复活性。不幸的是，冷冻保存和使用前的复苏会破坏SC的活力和细胞膜，可能减少静脉注射后体内持久性。此外，在此操作中应特别注意重新加热速率，以确保冷冻SC的存活。一般来说，重新加热速度越快越好。最终，提高SC在处理过程中的存活率和活性仍然是一个需要讨论的问题。 4.3.2.给药途径 尽管大多数IS治疗研究的方法是静脉注射，但对SC给药途径尚无统一看法。与其他给药途径相比，静脉注射是最简单、最安全的方法，侵入性最低。然而，通过这种方法只有少数细胞能够到达大脑的缺血区域，细胞在非靶器官中的积累成为一个问题。研究已经证明，颅内注射可以直接将SC输送到缺血区域，并对IS有良好的治疗效果。尽管如此，其相当大的侵入性和造成额外脑损伤的风险限制了其使用。此外，一些研究已经证明，动脉注射在将细胞输送到缺血半球方面比静脉注射更有效。然而，如果细胞团块阻塞动脉，将发生额外的缺血损伤。必须注意，不应低估注射操作的副作用，因为SC可能因注射过程中用力过猛而立即死亡。优化给药途径或加强SC的“保护”应该是研究的重点。 4.3.3.剂量 “移植的干细胞越多越好”的观点是错误的。研究已经证明，移植额外的干细胞并不能改善细胞在微环境中的存活或产生显著的治疗效果。此外，单剂量过大可能会导致血管栓塞风险。尽管移植数量不应尽可能高，但需要考虑产生目标治疗效果所需的特定干细胞浓度。值得注意的是，不同的间充质干细胞（MSCs）剂量可能会对缺血性卒中（IS）产生不同的治疗效果。与其他剂量相比，低剂量（1×10^6个细胞）更能恢复神经功能，高剂量（2×10^7个细胞）则更能抑制小胶质细胞激活。此外，由于患者个体差异和病程不同，给所有患者相同数量的干细胞是不可能的。这一观察提醒我们，移植的干细胞浓度既不宜过低也不宜过高，需要优化个体化治疗剂量，并建立更精确的剂量关系。 4.3.4.治疗时间窗 控制时间对于干细胞治疗的效果也是至关重要的。一方面，离开库后12小时内的新鲜干细胞将保持良好活性。另一方面，IS治疗的时间窗是紧凑的。在局灶性缺血后24小时内进行干细胞移植可以显著减少损伤体积并改善运动功能障碍。相比之下，在IS后24小时进行干细胞移植会减少潜在的治疗效果。此外，在此时间框架之外进行干细胞移植与MCAO组相比，在梗死大小上没有显著差异。尽管干细胞治疗的干预时间窗比组织型纤溶酶原激活剂的静脉注射时间窗更长，但它仍然面临时间框架不可控的挑战。无论是对于干细胞本身还是卒中患者，这些时间框架都是非常具有挑战性的。因此，延长维持干细胞活性的时间框架和优化干细胞治疗IS的时间窗是至关重要的。 5.结论 干细胞治疗IS的能力已被广泛报道，并显示出与传统方法相比的卓越优势，特别是在实施各种机制时。其中，修改干细胞以实现更好的治疗效果无疑是研究者目前的焦点，并且已经取得了一些突破。然而，尽管干细胞治疗存在一些共同问题，但在临床转化方面仍面临许多挑战。3D微载体技术等技术已迅速发展，以克服干细胞临床应用的限制。我们期待新兴技术加速干细胞治疗的临床转化，并使干细胞能够应用于患者。此外，我们期望揭示干细胞在治疗IS中的潜力，为干细胞转化提供新思路，并期待这些挑战尽快得到解决。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。