抗体蛋白药物产品质量的调节与优化策略

2024-07-10

在临床前CMC开发中，随着抗体蛋白分子结构的复杂化，质量属性指标受到了越来越多的关注。工艺开发过程中，最应该关注的质量属性包括糖基化、电荷异质性、聚体和片段等。糖基化糖基化是寡糖附着在蛋白质骨架上的复杂过程，发生在内质网和高尔基体中。糖基化的修饰形式有两种：Fc CH2区域Asn297连接的N-糖基化和Ser/Thr连接的O-糖基化。单抗中最常见的是N-糖基化修饰1。不同的糖基化形式会影响mAb的稳定性、体内药效、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC）活性、药代动力学、清除率和免疫原性。聚体和片段聚体的分类方式有很多种2，包括可溶/不可溶的，共价/非共价的，可逆/不可逆的。未配对的游离巯基之间的二硫键是共价聚集的常见机制。可逆蛋白质聚集通常是由相对较弱的非共价蛋白质相互作用引起的，例如疏水/亲水作用。有时，可逆的蛋白质结合会导致蛋白质溶液粘度增加3。聚体会引起免疫原性反应，甚至导致给药不良事件的发生。片段通常与自发或酶促反应导致的共价键破坏有关4。蛋白质骨架在生理条件下非常稳定，但可能由于以下原因容易出现碎片化：1.某些位点的氨基酸序列中包含促进切割的特定侧链 2.蛋白局部结构的柔韧性 3.溶剂条件（pH、温度） 4.金属或自由基的存在。片段会导致蛋白功能的丧失。电荷异质性电荷异质性对工艺变化很敏感，某些修饰特别是酸性变体对药物的安全性和有效性会产生不利影响。已经明确了电荷异质性的各种修饰来源和控制方法，这些知识可被用于设计适当的工艺控制策略，以保证一致的产品质量，降低药物安全性和有效性风险。常见的酸区来源包括天冬酰胺脱酰胺，唾液酸化和糖化，半胱氨酸相关的修饰如游离半胱氨酸、三硫键、半胱氨酸化和谷胱甘肽化也会引起酸区的形成。C-末端Lys的不完全去除和C-末端酰胺化，聚体，N-末端未环化的谷氨酰胺，天冬氨酸异构都是碱区形成的常见因素5。下文中，我们将从细胞系开发、工艺开发和培养基优化角度探讨对抗体蛋白药质量属性的优化策略。细胞系开发策略通过改变载体上目的基因排列6，调节抗体AB链比例，可以有效降低聚体含量。过表达糖基化转移酶可以改变糖型分布。案例1：针对某双抗分子（图1），蓬勃生物采用独特的双载体表达策略，通过优化载体配比显著降低了同源二聚体和半抗的含量，目标蛋白产量从0.1g/L提升至1.5g/L。图1 双载体表达策略示意图上游工艺开发策略降温可以降低聚体水平，特别是非共价聚体，也可降低半乳糖基化和唾液酸修饰水平，还可降低酸区含量。提高pH和渗透压可以降低聚体水平。提高渗透压还可以升高Man5水平。降低pH可以降低酸区比例。pCO2过高会使高尔基体pH下降，影响糖基化转移酶活性，导致G0F升高。此外，灌流培养通过不断移除代谢废物，更新细胞培养环境，也可以降低酸区和聚体含量。案例2:采用蓬勃生物的强化灌流工艺，可以大幅度（20.4%到2.0%）降低某双抗分子酸性变体的比例（图2）。虽然相比Fed-batch，其碱性变体有所升高，但经CPB（羧肽酶B）酶切后发现，主要来源为末端赖氨酸的不完全切除，不影响药物的效力。图2 Fed-batch和perfusion工艺下的电荷异质性培养基组分优化策略培养基作为细胞赖以生存的基质，为细胞生长及代谢提供所需的各种营养物质和非营养成分，包括水，碳源，氮源，氨基酸，脂肪酸，维生素，微量元素和无机盐等。在提供能量的同时，这些组分或作为合成反应的底物，或作为酶促反应的辅因子，或通过改变培养液的氧化还原环境，直接或间接地参与到目标蛋白的整个合成及分泌过程。因此，培养基成分对药物的质量属性有着极其重要的影响。表1列出了影响蛋白质量的常见组分及对应的调节策略。表1培养基组分对产品质量的影响质量属性培养基相关组分及调节方向电荷异质性酸区 Cu, 生物素, 生物类黄酮7, 氢化可的松, Se, 硫辛酸, 维生素C, Met 氯化钠, Fe, Mn, Ni, Cys8 碱区 Zn, 牛磺酸 Cu, 生物素, Arg, Lys9 糖型半乳糖基化/唾液酸化 N-乙酰氨基葡萄糖10, Se11, Asn 半乳糖, Mn, 尿苷, Thr, Pro和Gly 高甘露糖基化 Mn12 去岩藻糖基化 Mn, 霉酚酸13, 没食子酸聚体 GSH , Cys, 胱氨酸和 Cu14, 吐温15, DMSO 片段 EDTA 蓬勃生物针对自主研发的CHOK1-GenS宿主系统量身打造了fed-batch和perfusion培养基系列产品和定制化培养基开发平台。在绝大部分项目中，较商业化培养基，使用UproCHOTM可进一步提升产品的表达量：平均49%，最高117%。除UproCHOTM系列培养基产品，蓬勃生物还可以提供定制化培养基配方开发服务。凭借长期积累的培养基开发经验，辅以DoE、MVDA软件及LC-MS上清检测平台，能够根据分子和工艺的特性在最快2个月内开发出定制化培养基配方，7个月内完成工艺优化。案例3:使用蓬勃生物自主研发的UproCHOTM培养基表达某双抗分子，利用蓬勃LC-MS平台对培养周期的上清氨基酸水平进行检测后发现，Gly, Ser, Asn, Val及Tyr在培养后期被大量消耗，而Pro, Met, His和Lys大量积累，限制了产量的进一步提高。因此，采用Plackett Burman设计，对补料中的氨基酸浓度进行再平衡。结果显示，8号，15号和20号实验组相比Control组（原F01），不仅在产量上有极大提升，最高提升18%，同时这三组的细胞活率相比Control组也有所改善（图3到图5）。图3上清氨基酸残留检测图4 Plackett Burman实验产量对比图5 Plackett Burman实验细胞活率对比案例4:在某单抗的开发中，遇到了酸区过高的问题，蓬勃生物培养基平台开发出了4款添加剂（ASs-1,2,3 and 4），在提升主峰的同时，大幅降低酸区，最高可降低23%。除降低酸区外，这4款添加剂还可以不同程度地提升蛋白产量，最高提升达28%（表2）。表2 ASs (酸区调节剂)对电荷变体和产量的影响关于蓬勃生物蓬勃生物是国内领先的抗体蛋白CDMO。我们提供从抗体发现、成药性研究到工艺开发和GMP生产的DNA-to-Market一站式解决方案。我们是业界领先的细胞系和工艺开发专家: 在细胞系平台，我们的CHOK1-GenS宿主系统（悬浮驯化CHO-K1和高表达质粒）交付的细胞株最高产量达到14.5g/L，单抗平均产量超过5g/L，从DNA序列到单克隆快达12周；针对双抗和重组蛋白等难度分子，我们开发了强化流加和灌流工艺平台、UproCHO™平台培养基和ProBox™难度分子智库，成功交付了细胞因子、融合蛋白、凝血因子、抗体片段、KIH双抗、Duobody双抗等多样化抗体蛋白分子。作为蓬勃生物抗体蛋白CDMO业务的重要版图，蓬勃生物打造了工艺优化、表征平台和商业化生产GMP设施。我们的工艺优化经验涵盖国产化物料替代、工艺模式切换、工艺参数优化等，最高节约70%生产成本。在商业化生产上，镇江抗体蛋白药商业化生产中心原液总产能17,250L（包含多个50L、200L、500L和2000L生物反应器），年产能124批次，灌装量高达1,700万瓶/年。质量体系符合NMPA、FDA、EMA GMP规范。镇江抗体蛋白药GMP商业化生产中心灵活的生产规模、全国产化原液生产能力和一线进口品牌的全自动灌装线，为抗体、蛋白类药物的III期临床和商业化生产打造高质量和极致性价比。参考文献： 1. Liu LM. Antibody Glycosylation and Its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins. 2. Cromwell EM, et al. Protein aggregation and bioprocessing. 3. Va´zquez-Rey M. Aggregates in Monoclonal Antibody Manufacturing Processes. 4. Vlasak J. Fragmentation of monoclonal antibodies. 5. Beck A. Risk-Based Control Strategies of Recombinant Monoclonal Antibody Charge Variants. 6. Ho, S. C. L., et al. Control of IgG LC:HC ratio in stably transfected CHO cells and study ofthe impact on expression, aggregation, glycosylation and conformational stability. 7. Hossler P. Cell Culture Media Supplementation of Bioflavonoids for the Targeted Reductionof Acidic Species Charge Variants on Recombinant Therapeutic Proteins. 8. Prade E. Cysteine in cell culture media induces acidic IgG1 species by disrupting the disulfide bond network. 9. Zhang X. Elucidating the effects of arginine and lysine on a monoclonal antibody C-terminal lysine variation in CHO cell cultures. 10. Kildegaard HF. Glycoprofiling Effects of Media Additives on IgG produced by CHO Cells in Fed-Batch Bioreactors. 11. McCracken NA. Control of Galactosylated Glycoforms Distribution in Cell Culture System. 12. Pacis E. Effects of Cell Culture Conditions on Antibody N-linked Glycosylation—What Affects High Mannose 5 Glycoform. 13. Zhang A. Identifying the Differences in Mechanisms of Mycophenolic Acid Controlling Fucose Content of Glycoproteins Expressed in Different CHO Cell Lines. 14. Mary E.M. Protein Aggregation and Bioprocessing. 15. Dengl S. Aggregation and Chemical Modification of Monoclonal Antibodies under Upstream Processing Conditions.