在临床前CMC开发中,随着抗体蛋白分子结构的复杂化,质量属性指标受到了越来越多的关注。工艺开发过程中,最应该关注的质量属性包括糖基化、电荷异质性、聚体和片段等。
糖基化
糖基化是寡糖附着在蛋白质骨架上的复杂过程,发生在内质网和高尔基体中。糖基化的修饰形式有两种:Fc
CH2区域Asn297连接的N-糖基化和Ser/Thr连接的O-糖基化。单抗中最常见的是N-糖基化修饰1。不同的糖基化形式会影响mAb的稳定性、体内药效、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)活性、药代动力学、清除率和免疫原性。
聚体和片段
聚体的分类方式有很多种2,包括可溶/不可溶的,共价/非共价的,可逆/不可逆的。未配对的游离巯基之间的二硫键是共价聚集的常见机制。可逆蛋白质聚集通常是由相对较弱的非共价蛋白质相互作用引起的,例如疏水/亲水作用。有时,可逆的蛋白质结合会导致蛋白质溶液粘度增加3。聚体会引起免疫原性反应,甚至导致给药不良事件的发生。
片段通常与自发或酶促反应导致的共价键破坏有关4。蛋白质骨架在生理条件下非常稳定,但可能由于以下原因容易出现碎片化:1.某些位点的氨基酸序列中包含促进切割的特定侧链 2.蛋白局部结构的柔韧性 3.溶剂条件(pH、温度) 4.金属或自由基的存在。片段会导致蛋白功能的丧失。
电荷异质性
电荷异质性对工艺变化很敏感,某些修饰特别是酸性变体对药物的安全性和有效性会产生不利影响。已经明确了电荷异质性的各种修饰来源和控制方法,这些知识可被用于设计适当的工艺控制策略,以保证一致的产品质量,降低药物安全性和有效性风险。常见的酸区来源包括天冬酰胺脱酰胺,唾液酸化和糖化,半胱氨酸相关的修饰如游离半胱氨酸、三硫键、半胱氨酸化和谷胱甘肽化也会引起酸区的形成。C-末端Lys的不完全去除和C-末端酰胺化,聚体,N-末端未环化的谷氨酰胺,天冬氨酸异构都是碱区形成的常见因素5。
下文中,我们将从细胞系开发、工艺开发和培养基优化角度探讨对抗体蛋白药质量属性的优化策略。
细胞系开发策略
通过改变载体上目的基因排列6,调节抗体AB链比例,可以有效降低聚体含量。过表达糖基化转移酶可以改变糖型分布。
案例1:针对某双抗分子(图1),蓬勃生物采用独特的双载体表达策略,通过优化载体配比显著降低了同源二聚体和半抗的含量,目标蛋白产量从0.1g/L提升至1.5g/L。
图1 双载体表达策略示意图
上游工艺开发策略
降温可以降低聚体水平,特别是非共价聚体,也可降低半乳糖基化和唾液酸修饰水平,还可降低酸区含量。提高pH和渗透压可以降低聚体水平。提高渗透压还可以升高Man5水平。降低pH可以降低酸区比例。pCO2过高会使高尔基体pH下降,影响糖基化转移酶活性,导致G0F升高。此外,灌流培养通过不断移除代谢废物,更新细胞培养环境,也可以降低酸区和聚体含量。
案例2:采用蓬勃生物的强化灌流工艺,可以大幅度(20.4%到2.0%)降低某双抗分子酸性变体的比例(图2)。虽然相比Fed-batch,其碱性变体有所升高,但经CPB(羧肽酶B)酶切后发现,主要来源为末端赖氨酸的不完全切除,不影响药物的效力。
图2
Fed-batch和perfusion工艺下的电荷异质性
培养基组分优化策略
培养基作为细胞赖以生存的基质,为细胞生长及代谢提供所需的各种营养物质和非营养成分,包括水,碳源,氮源,氨基酸,脂肪酸,维生素,微量元素和无机盐等。在提供能量的同时,这些组分或作为合成反应的底物,或作为酶促反应的辅因子,或通过改变培养液的氧化还原环境,直接或间接地参与到目标蛋白的整个合成及分泌过程。因此,培养基成分对药物的质量属性有着极其重要的影响。表1列出了影响蛋白质量的常见组分及对应的调节策略。
表1培养基组分对产品质量的影响
质量属性
培养基相关组分及调节方向
电荷异质性
酸区
Cu, 生物素, 生物类黄酮7, 氢化可的松,
Se, 硫辛酸, 维生素C,
Met
氯化钠,
Fe, Mn, Ni, Cys8
碱区
Zn, 牛磺酸
Cu, 生物素,
Arg, Lys9
糖型
半乳糖基化/唾液酸化
N-乙酰氨基葡萄糖10,
Se11, Asn
半乳糖,
Mn, 尿苷,
Thr, Pro和Gly
高甘露糖基化
Mn12
去岩藻糖基化
Mn, 霉酚酸13, 没食子酸
聚体
GSH
, Cys, 胱氨酸和 Cu14, 吐温15,
DMSO
片段
EDTA
蓬勃生物针对自主研发的CHOK1-GenS宿主系统量身打造了fed-batch和perfusion培养基系列产品和定制化培养基开发平台。在绝大部分项目中,较商业化培养基,使用UproCHOTM可进一步提升产品的表达量:平均49%,
最高117%。除UproCHOTM系列培养基产品,蓬勃生物还可以提供定制化培养基配方开发服务。凭借长期积累的培养基开发经验,辅以DoE、MVDA软件及LC-MS上清检测平台,能够根据分子和工艺的特性在最快2个月内开发出定制化培养基配方,7个月内完成工艺优化。
案例3:使用蓬勃生物自主研发的UproCHOTM培养基表达某双抗分子,利用蓬勃LC-MS平台对培养周期的上清氨基酸水平进行检测后发现,Gly,
Ser, Asn, Val及Tyr在培养后期被大量消耗,而Pro,
Met, His和Lys大量积累,限制了产量的进一步提高。因此,采用Plackett
Burman设计,对补料中的氨基酸浓度进行再平衡。结果显示,8号,15号和20号实验组相比Control组(原F01),不仅在产量上有极大提升,最高提升18%,同时这三组的细胞活率相比Control组也有所改善(图3到图5)。
图3上清氨基酸残留检测
图4
Plackett Burman实验产量对比
图5
Plackett Burman实验细胞活率对比
案例4:在某单抗的开发中,遇到了酸区过高的问题,蓬勃生物培养基平台开发出了4款添加剂(ASs-1,2,3
and
4),在提升主峰的同时,大幅降低酸区,最高可降低23%。除降低酸区外,这4款添加剂还可以不同程度地提升蛋白产量,最高提升达28%(表2)。
表2
ASs (酸区调节剂)对电荷变体和产量的影响
关于蓬勃生物蓬勃生物是国内领先的抗体蛋白CDMO。我们提供从抗体发现、成药性研究到工艺开发和GMP生产的DNA-to-Market一站式解决方案。我们是业界领先的细胞系和工艺开发专家: 在细胞系平台,我们的CHOK1-GenS宿主系统(悬浮驯化CHO-K1和高表达质粒)交付的细胞株最高产量达到14.5g/L, 单抗平均产量超过5g/L, 从DNA序列到单克隆快达12周;针对双抗和重组蛋白等难度分子,我们开发了强化流加和灌流工艺平台、UproCHO™平台培养基和ProBox™难度分子智库,成功交付了细胞因子、融合蛋白、凝血因子、抗体片段、KIH双抗、Duobody双抗等多样化抗体蛋白分子。
作为蓬勃生物抗体蛋白CDMO业务的重要版图,蓬勃生物打造了工艺优化、表征平台和商业化生产GMP设施。我们的工艺优化经验涵盖国产化物料替代、工艺模式切换、工艺参数优化等,最高节约70%生产成本。在商业化生产上,镇江抗体蛋白药商业化生产中心原液总产能17,250L(包含多个50L、200L、500L和2000L生物反应器),年产能124批次,灌装量高达1,700万 瓶/年。质量体系符合NMPA、FDA、EMA GMP规范。镇江抗体蛋白药GMP商业化生产中心灵活的生产规模、全国产化原液生产能力和一线进口品牌的全自动灌装线,为抗体、蛋白类药物的III期临床和商业化生产打造高质量和极致性价比。
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