基于VHH的胞内抗原CAR-T疗法：一种潜在的癌症治疗方法

2022-05-28

免疫疗法细胞疗法抗体基因疗法

摘要细胞内抗原虽然占肿瘤抗原的90% ,但已获FDA批准并上市的药物几乎都是针对细胞外抗原的。细胞内抗原的CAR-T疗法（也称为TCR样抗体CAR-T疗法）则能扩展单克隆抗体的应用范围，将治疗领域拓展到大多数未开发的肿瘤抗原，即细胞内抗原。本文论述了针对细胞内抗原的部分TCR样CAR-T疗法的现状和局限性，特别强调了单域抗体（纳米抗体）对优化TCR样CAR-T疗法治疗效果所具有的潜力。图1 T细胞受体(TCR)和TCR样抗体示意图1.TCR抗体对胞内抗原的靶向作用胞内抗原在细胞内产生，然后被蛋白酶体降解，并在肿瘤表面以MHC或肽复合物的形式呈现在MHC-I信号通路中。为了靶向这些胞内抗原，在临床前过程中已经开发出一组称为T细胞受体（TCR）样或模拟抗体的特异性抗体。它们能够识别MHC或肽复合物以及真正的T细胞受体，随后在有效的共刺激信号下触发T细胞活化和增殖。TCR受体的开发与使用有望拓宽单克隆抗体的应用范围，并为未来的研究提供方向。为了挖掘TCR样抗体在免疫治疗中的潜力，从2001年起，与CAR-T治疗相关的TCR样抗体的研究就开始出现，但迄今为止，基于TCR样抗体的CAR-T疗法并没有得到普及（表1）。表1：在人类疾病中应用的细胞内抗原CAR-T疗法CAR设计依赖于细胞外抗原结合域、铰链区、跨膜域和传递激活信号的细胞内域。这些分子分为三代，共刺激区的数量也各不相同。众所周知，第一代仅包含CD3z，第二代在第一代的主干上添加一个共刺激域，例如4-1BB（CD137）、CD28或OX40（CD134），并且在第三代中添加了多个共刺激域。对CAR结构任何部分的微小修改都可能产生重大影响。对细胞内抗原的CAR-T疗法来说也是如此，无论是噬菌体展示或杂交瘤衍生的各种抗原结合模块还是各种共刺激域，都可在一定程度上提高治疗效果。因此，这一领域具备很大的发展潜力，值得进行深入挖掘。2.细胞内抗原CAR-T疗法现状与局限性 (一）细胞内抗原CAR-T疗法优势细胞内抗原CAR-T疗法与表达细胞外抗原的传统CAR-T疗法相比显示出一些优势。细胞内抗原的CAR-T疗法（TCR-like antibody CAR-T therapy）将治疗领域扩展到大多数未开发的肿瘤抗原，即细胞内抗原。细胞内抗原已被证明占肿瘤抗原的90%。尽管如此，针对细胞内抗原的治疗药物的数量仍然远低于针对细胞外抗原的常规CAR-T治疗药物。由于TCR样抗体的特异性以及成功的CAR-T细胞活化和肿瘤溶解，治疗效果已经得到验证。细胞内抗原的CAR-T疗法克服了肿瘤细胞表面特异性生物标记物的不足这一难点，在实体瘤治疗方面取得了一些突破。（二）细胞内抗原CAR-T疗法局限性01特异性难以保持据报道，由于聚集CAR的高亲和力，任何与人类白细胞抗原（HLA）的结合都可能让CAR失去特异性，因此保持TCR-like CAR 识别MHC/肽复合物的特异性是很复杂的。Maus等人已经证实，低亲和力DN-28z CAR（试图保持特异性）会触发T细胞活化和细胞毒性。02肿瘤破坏效率不足TCR样抗体介导的肿瘤破坏效率还不够。免疫抑制环境可能是原因之一。一旦T细胞进入肿瘤细胞，肿瘤细胞就会迅速隐藏自己，并分泌免疫抑制性细胞因子，从而触发自然T细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞的耗尽或死亡。分泌的细胞因子包括白细胞介素10（IL-10），它可能促进T调节细胞（Treg）的抑制活性或增加免疫抑制分子如HLA-G的表达。最终，由于肿瘤细胞表面MHC/肽复合物的表达缺失或下调，肿瘤细胞可能逃避免疫监视。然而，有证据表明，一些细胞因子和化学物质通过激活MHC信号通路和上调MHC的表达可以逆转这种情况，在某种程度上，上述问题可以解释细胞内抗原的CAR-T疗法为何如此稀少，也表明在开创CAR-T疗法上迫切需要进一步举措。综上所述，细胞内抗原CAR-T疗法疗效有限的原因是多方面的。生产抗体的杂交瘤技术昂贵，过程复杂也是其中一大原因，不过随着噬菌体展示技术的出现，这一问题正在逐步得到解决。3.细胞内抗原CAR-T疗法优化方案图2 针对细胞内抗原的TCR样 CAR-T细胞疗法降解并以MHC/肽复合物的形式呈现在肿瘤表面。三种可能的方法。（a）传统的TCR样抗体CAR-T细胞疗法，使用单链抗体识别MHC/肽复合物，然后触发T细胞活化和增殖。（b）纳米抗体替代传统抗体作为TCR样纳米抗体CAR-T细胞治疗的细胞外抗结合域。（c）纳米抗体除被设计成细胞外抗原结合域之外在肿瘤内免疫环境中同时分泌，用于TCR样纳米抗体CAR-T细胞治疗。（一）靶向TCR-like CARs的单域抗体为了提高具有更高抗原结合特异性和生产效率的TCR样抗体CAR-T的治疗效果，同时寻找耗时昂贵的常规抗体的替代品，单域抗体上引起了研究人员的兴趣。骆驼的单域抗体(sdAb)，或者说重链可变区（VHH）指的是纳米抗体（图3）。骆驼重链抗体（HCAbs）由两条重链组成，每条重链都有一个可变结构域（VHH）和一个缺少CH1的恒定区域，这两条重链通过二硫键连接形成均聚物，在某种程度上，纳米抗体作为骆驼重链抗体最小的抗原结合域，其结构特征显示出优越性，包括较长的互补决定区3（CDR3），能延伸到传统抗体无法结合的凹表位。此外，疏水性氨基酸参与CDR1和CDR2的副作用域，甚至更多的残基与框架区（FR）中的抗原发生反应。图3 各种抗体的形式。（a）单克隆抗体。（b）骆驼重链抗体。（c）单链抗体片段。（d）骆驼重链抗体衍生的单域抗体或纳米抗体。纳米抗体的主要优势在于其体积小，其分子量约为12-15kDa，这一特点能让纳米抗体穿透肿瘤样致密组织，通常使用方法简单、成本低廉的噬菌体展示技术生产纳米抗体。此外，基于上述结构特征，纳米抗体还具有高亲和力和特异性的特征，能够处理普通抗体无法达到的隐蔽表位。纳米抗体的其他优点在于低免疫原性、良好的溶解性以及在不同温度和pH值下的高稳定性。因此，纳米抗体参与了连续的实验和临床试验，尤其是在新兴的CAR-T治疗领域。然而，有限的基于纳米抗体的CAR-T工程主要针对细胞外抗原，如肿瘤相关标记物如MUC1和CD38，很少针对细胞内抗原。据报道，特异性识别gp100 209–217 /HLA-A2的TCR样纳米抗体GPA7被导入GPA7-28z CAR，并在GPA7-28z CAR转导至T细胞后与HLAA2一起介导对人类黑色素瘤细胞的有效细胞毒性。即使可能性很小，这一假设的可能性仍然得到了证实。为了克服抗原逃逸变体的生长，HER2和CD20特异性的两个纳米抗体串联构成双特异性CAR，诱导T细胞活化和肿瘤溶解。同时，基于纳米抗体的CAR靶向肿瘤基质标记物，如PD-L1和VEGFR2，它们直接影响肿瘤微环境并延缓肿瘤生长，上述研究为细胞内抗原的CAR-T疗法提供了信息，该疗法由两个TCR样纳米抗体串联而成，两个TCR样纳米抗体对特定类型的癌症具有特异性，或者添加了针对特定类型免疫检查点抑制剂的纳米抗体，它为细胞内抗原的CAR-T疗法中基于纳米抗体的抗原结合域的改进提供了一种选择。（二）潜在的单域抗体分泌TCR-like CARs。细胞内抗原的CAR-T疗法介导的肿瘤杀伤效率低下可能与免疫抑制环境和肿瘤免疫逃逸有关，也可能阻碍相关研究。例如，肿瘤免疫抑制微环境在体外和体内模型中的不完全复制可能是实体瘤研究成功的一个挑战。为了克服这一问题，在第二代或第三代CAR序列中添加基因修饰的armored CAR-T可导致细胞因子和促炎配体分泌到肿瘤微环境中，并提高CAR-T的疗效和持久性。IL-12、CD40L、4-1BBL通常被认为是增强树突状细胞（DC）和巨噬细胞的潜能或抑制肿瘤微环境中Treg抑制的可能靶点。例如，Pegram等人报道了在一个带有武装的抗CD1928ζ/IL-12 CAR-T细胞的同基因小鼠模型中增强的肿瘤根除。在同一研究中，证明分泌的IL-12通过CAR-T细胞上的IL-12受体参与对Tregs的耐药性，这是一种自分泌模式，因此，适度的细胞因子释放可能有助于提高细胞内抗原CAR-T疗法的效果。图4 新表位生成和靶向作用除了CAR分泌的细胞因子和促炎配体外，CAR-T还可以分泌单域抗体（VHH或纳米抗体），改变肿瘤内免疫环境，从而促进CAR-T细胞的良好功能。Yushu等人证明，与全身应用相比，CAR-T分泌的抗CD47 VHH系统性地刺激巨噬细胞吞噬，并且分泌的抗CD47 VHH Fc融合物局部增强了安全性。同时，分泌的抗PD-L1或抗CTL-4 VHH有助于CAR-T细胞的持久性。由于CAR-T可能分泌纳米抗体，这表明TCR样 CAR-T同样可能会分泌纳米抗体，来特异性识别MHC/肽复合物，从而减弱肿瘤免疫抑制微环境的影响，并增强先天免疫系统。（三）肿瘤抗原的选择细胞内抗原占肿瘤抗原的90%以上，根据不同的特征可分为三类：肿瘤病毒抗原、新抗原（肿瘤特异性抗原）、癌-睾丸抗原（肿瘤相关自身抗原）。源于EB病毒（EBV）的肿瘤病毒抗原如潜伏膜蛋白1（LMP1）、LMP2和EB核抗原1-3（EBNA 1-3）以及源于肝炎病毒（HBV）的乙肝病毒X蛋白（HBX）定位于细胞质，通过抗原呈递途径呈现在细胞表面，专门针对肿瘤特异性高的肿瘤病毒。新抗原或肿瘤特异性抗原是在肿瘤细胞发生基因或染色体突变时产生的，这些突变，如染色体易位、重复或基因每个区域的丢失，会导致如肺癌中的α-肌动蛋白-4 K122N这样的新抗原产生。癌-睾丸抗原或肿瘤相关自身抗原，如黑色素瘤抗原-1（MAGE-1），不仅能在肿瘤细胞中表达，而且在正常组织（如胚胎或生殖细胞）中也有部分表达。在所有潜在的靶向抗原中，癌-睾丸抗原（肿瘤相关自身抗原）在现有的实验结果中脱颖而出。一旦识别出潜在的靶向抗原，它们就有可能被加工并以肽的形式呈现在细胞表面。从20世纪90年代首次利用T细胞表位克隆鉴定人类肿瘤抗原MAGE-1，到利用重组cDNA表达文库（SEREX）的血清学分析鉴定NY-ESO-1等高免疫原性抗原，科学家们主要关注免疫学方法。然而，肿瘤抗原的鉴定还有很长的路要走。而其他技术，如色谱和质谱、DNA微阵列和反向免疫学也得到了发展，而质谱在直接识别肿瘤抗原肽方面显示出了优势。（四）关于CAR的其他新颖方法为了限制抗原逃逸并将毒性降至最低，引入了可切换的通用CAR，该CAR包含肿瘤特异性抗体的靶模块（TM）和对肿瘤无特异性但对标记在TM上的短肽有特异性的UniCAR-T。正是TM为UniCAR提供了特异性，一旦肿瘤不在周围，UniCAR就会保持不活动状态。在将UniCAR应用于二价表皮生长因子受体（α-EGFREGFR）的过程中，将UniCAR-T重新定位到EGFR低表达的肿瘤 EGFR低表达的肿瘤细胞的TM被证明是有效的，一个分离的、通用的和可编程的（超）CAR系统被设计成一种有效的工具，用于治疗基因不稳定或高度异质性的肿瘤类型，包括两部分：（1）一种zipCAR，几乎与CAR的传统结构相同，但在胞外区有一个亮氨酸拉链；（2）一种zipFv，在外部添加有配体结合域，并融合到zipCAR上的第二个亮氨酸拉链上,在抗原结合特异性方面发挥重要作用。因此，zipCAR的效率可能因输入ZIPFv的数量和质量而异，从而拓宽了可治愈恶性肿瘤的范围。已经观察到，通过亮氨酸拉链降低zipFv输入或zipFv和zipCAR的结合亲和力将减少干扰素-γ（IFN-γ）的产生和肿瘤溶解。生物工程的非凡突破为CAR-T的进展提供了新的思路，扩大了细胞内抗原治疗的可能性。结论基于TCR样抗体的CAR-T细胞疗法目前虽尚未进入临床试验，然而该疗法的局限之处一旦得到解决，以细胞内抗原为靶点的CAR-T的进展将会得到理想改善。特别是，纳米抗体成本低廉和易于生产的优势有利于其进入生产。而在CAR-T中工程分泌的纳米抗体也可能会增强识别MHC/肽复合物的特异性，并改善免疫抑制环境。参考文献1.Zhu, L., Yang, X., Zhong, D., Xie, S., Shi, W., Li, Y., Hou, X., HuaYao, Zhou, H., Zhao, M., Ding, Z., Zhao, X., Mo, F., Yin, S., Liu, A., & Lu, X. (2020). Single-Domain Antibody-Based TCR-Like CAR-T: A Potential Cancer Therapy. Journal of immunology research, 2020, 2454907. https://doi.org/10.1155/2020/24549072.He, Q., Liu, Z., Liu, Z., Lai, Y., Zhou, X., & Weng, J. (2019). TCR-like antibodies in cancer immunotherapy. Journal of hematology & oncology, 12(1), 99. https://doi.org/10.1186/s13045-019-0788-4