一文读懂|如何增强自复制RNA(saRNA)疫苗的免疫效应

2024-06-15

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信使RNA疫苗上市批准临床结果

导读：目前全球已批准50 多种新冠疫苗，大体上可分为四大类：灭活病毒疫苗、基于重组病毒蛋白的亚单位疫苗、非复制病毒载体疫苗和mRNA疫苗。新冠mRNA疫苗凭借快速的研发生产优势和强效的免疫保护效果掀起了新一轮的医药革新浪潮，人们开始不断拓宽mRNA技术的应用范围，例如，肿瘤疫苗，病毒疫苗，蛋白疗法，基因编辑等等。目前，根据RNA分子的特征，可将mRNA疫苗划分为常规线性mRNA疫苗、自复制RNA(saRNA)疫苗以及环状RNA(circRNA)疫苗。在新冠病毒疫苗研发的早期，Moderna公司和BioNtech公司开发的mRNA1273和BNT162B2采用的编码S蛋白的常规线性mRNA疫苗，随后，开始有公司（例如，Gristone, HDT bio）尝试开发新冠自复制RNA疫苗，最终，由Arcturus Therapeutics和澳大利亚CLS合作开发的全球首款自复制RNA疫苗在日本获批上市。在往期内容中，菌菌对自复制RNA的骨架序列及其递送系统做了详细的论述。本期内容，菌菌将和大家一起探讨如何增强saRNA疫苗的免疫效果，具体策略包括多抗原编码序列设计、抗原编码序列优化、不良免疫刺激降低、与免疫激活因子融合、异源接种等。 01 编码多抗原的自复制RNA疫苗为应对未来可能出现的新冠病毒新型变异株，人们希望设计合成出能够针对多种新冠病毒变异株的多抗原疫苗，从而触发更加广泛的中和抗体反应和细胞免疫反应。针对保守抗原（例如 N 蛋白）的细胞免疫反应可以增强免疫系统对其他变异株的免疫保护，特别是在抗体反应减弱的情况下。 ZIP1642是一种采用LNP包封的双抗原新冠saRNA疫苗，两个独立的saRNA各自编码新冠病毒原始株S-RBD和N抗原。在以 21 天间隔的初免-加强疫苗接种方案中，用 1 µg ZIP1642（每种 RNA 的比例为 1:1）免疫小鼠时，该疫苗能够诱导针对四种新冠变异株的nAb，扩增S抗原和 N抗原特异性的 CD4 (+) 和 CD8 (+) T 细胞，并诱导 Th1 细胞因子谱。此外，用1ug 或 5 µg ZIP1642按照初免-加强方案免疫仓鼠可诱导产生显著的中和抗体反应。在用新冠病毒原始株攻毒四天后，与未接种疫苗的对照组相比， ZIP1642免疫组仓鼠的肺部病毒载量显着降低，并且最高剂量能够保护仓鼠免受病毒引起的肺部病变。当仓鼠受到 Beta B.1.351变异株攻毒时，ZIP1642也能够减少肺部的病毒载量并保护它们免受体重减轻，尽管与对照组相比，仓鼠肺部病理学没有改善。在这种情况下，ZIP1642没有引发针对 Beta B.1.351 变体的显著中和抗体反应，这说明其针对变异株的免疫保护反应是通过增强细胞免疫或非 nAb 功能来发挥作用的。图片来源：A dual-antigen self-amplifying RNA SARS-CoV-2 vaccine induces potent humoral and cellular immune responses and protects against SARS-CoV-2 variants through T cell-mediated immunity. 02 优化自复制RNA疫苗编码抗原据报道，在SARS-CoV-2感染后，机体内诱导产生的90%以上的中和抗体都是靶向S蛋白的RBD。基于此，有人设计开发了表达可溶性 RBD 或膜锚定RBD 的 saRNA 疫苗。在小鼠的初步实验中，与编码分泌型RBD的saRNA疫苗相比，RBD-TM-saRNA疫苗诱导了明显更高的抗体滴度以及针对几种 VoC变异株的细胞反应。随后，表达 RBD-TM 的 saRNA 疫苗在仓鼠和 NHP 中进行了测试，具有更高的免疫原性并可防止病毒攻击。为了增强免疫原性并扩大该疫苗的免疫保护范围，研究者设计合成了一种编码融合TM区域的SARS-CoV-2 Gamma RBD的新型saRNA疫苗，并在仓鼠中进行测试。在用 Gamma 变异株攻毒后，接种疫苗的仓鼠可以防止体重减轻，其免疫效果优于基于 Wuu-Hu-1 序列的原始RBD-TM-saRNA 疫苗。修改 RBD 序列足以更新 saRNA-RBD-TM 疫苗，以应对新出现的 VoC，从而有可能简化新疫苗的开发过程。图片来源：saRNA vaccine expressing membrane-anchored RBD elicits broad and durable immunity against SARS-CoV-2 variants of concern. 尽管大多数新冠mRNA 疫苗都是基于全长 S 蛋白或其 RBD 结构域设计而成，但一些研究小组提出，作为替代方案，可使用S 蛋白的一些表位来生成新的候选疫苗。这些表位可以根据其触发 B 或 T 细胞反应的能力进行选择，并且可以适应人群中最常见的 HLA 等位基因。基于表位设计的疫苗的另一个优点是，与完整的 S 蛋白相比，其要表达的抗原多肽可能要小得多，这可能会提升其表达水平，从而允许使用较低剂量的 saRNA。有两项不同的研究使用了这种方法来设计新冠病毒saRNA疫苗，研究人员均使用免疫信息学来预测 S 蛋白的免疫显性区域，选择三个大约 100 个残基的中心区域，每个区域覆盖最大数量的B 和 T 细胞重叠表位，或者使用 12 个不同的融合有小接头的B-和 T 细胞表位，从而产生 196 个残基的疫苗多肽。尽管作者进行了计算机预测来评估这些疫苗的安全性、稳定性和免疫原性，但他们没有对它们进行体内测试，其临床免疫效果还是未知的。 03 降低自复制RNA免疫原性从早期自复制 RNA 疫苗的临床试验数据来看，相比较常规 mRNA 疫苗，自复制 RNA 疫苗触发的中和抗体水平较低，免疫效果不佳，这可能是自复制 RNA 会触发强烈的 I 型干扰素反应，抑制 RNA 复制和抗原表达过程。人们尝试过一些降低自复制 RNA 免疫原性的方法，例如，序列演化，共表达病毒抑制性蛋白，递送载体优化等，但是，这些方法并不具备通用性。要说最通用的降低 RNA 免疫原性的方法，还是要当属修饰核苷。吊诡的是，许多课题组均发现，使用 N1-甲基假尿苷合成的自复制 RNA 会抑制蛋白表达活性。当前，较为合理的解释是 RNA 序列中修饰核苷的引入，改变了自复制 RNA 的序列结构，导致 RdRp 无法正常识别关键元件，例如，末端的保守序列元件（CSEs）或者 SGP（基因组启动子）。然而，最近的一项发现可能构成 saRNA 疫苗开发领域的重大突破，即saRNA也可以使用修饰核苷酸来降低免疫原性。波士顿大学 Grinstaff Lab 在 BioRxiv 上传文章：Complete substitution with modified nucleotides suppresses the early interferon response and increases the potency of self-amplifying RNA，首次筛选到与自复制 RNA 相兼容的修饰核苷酸，从而抑制了干扰素反应，相比未修饰自复制 RNA，掺入修饰核苷酸的自复制 RNA 可数倍提升蛋白表达水平，完全颠覆了当前主流的观念—自复制 RNA 中使用修饰核苷酸抑制表达活性。他们采用 27 种修饰核苷酸，合成 mcherry-saRNA，利用阳离子脂质转染 HEK293 细胞，以荧光蛋白信号作为转染效率的评估指标，筛选到 3 种转染效率最高的修饰核苷酸，分别是 5-羟甲基胞苷 (5OHmC)、5-甲基胞苷(5mC) 及 5-甲基尿苷(5mU)。与 N1mΨ-mcherry-saRNA 相比，转染效率分别提升 14 倍、10 倍及 8 倍。与未修饰的 WT-mcherry-saRNA 相比，筛选出的 3 中修饰核苷的转染效率也有显著提升或者相当。此外，我们可以明显看到，与未修饰的 WT-mcherry-saRNA 相比，一旦使用 N1mΨ，会导致 mcherry-saRNA 的转染效率坠崖式下降。此外，VLP Therapeutics公司创始人 Wataru Akahata 团队在 medrxiv 上传文章：Safety and immunogenicity of VLPCOV-02, a SARS-CoV-2 self-amplifying RNA vaccine with a modified base, 5-methylcytosine, in healthy individuals，他们在自复制 RNA 疫苗中掺入了修饰核苷 5-甲基胞嘧啶以减少先天反应，降低反应原性。在临床 1 期剂量递增研究中，接种 1、3、7.5 及 15 ug 5-甲基胞嘧啶修饰的自复制 RNA 新冠疫苗新冠疫苗的免疫者血清中的抗体滴度在第 28 天会增加 3 倍左右，证实了修饰自复制 RNA 临床应用的安全性和有效性。 2017年，Ugur Sahin为减少saRNA对于胞内模式识别受体的刺激，解除saRNA翻译的抑制效应，首次将编码免疫逃逸蛋白E3/K3/B18的非复制mRNA组合与编码Luciferase荧光蛋白的saRNA共同递送，这种方法能够显著抑制细胞内的PKR和IFN途径，极大增强saRNA编码的Luciferase荧光蛋白在小鼠体内的翻译效率。 2021年，Robin J. Shattock构建顺式编码天然免疫反应抑制蛋白（innate inhibiting proteins，IIPs）的saRNA文库，筛选增强saRNA靶标蛋白表达和免疫原性的IIPs。他们发现saRNA通过顺式作用编码产生的副流感病毒PIV5蛋白和MERS ORF4a蛋白能够提升靶标蛋白在细胞水平和小鼠体内表达量以及编码狂犬病毒G糖蛋白saRNA在兔子中的免疫原性。非常有意的是，他们还发现ruxolitinib（JAK/STAT抑制剂）会显著提升saRNA体内靶标蛋白翻译效率。Robin的工作说明在saRNA骨架序列中直接插入编码IFN信号通路抑制蛋白的基因能够显著增强saRNA蛋白表达水平，降低saRNA免疫原性。 04 与免疫刺激分子结合疫苗与可激活免疫细胞表面的免疫刺激受体（如 OX40、CD137 或 CD40）的分子或可阻断免疫检查点（如 PD-1、PD-1、CTLA-4）的分子相结合，可增强疫苗诱导的免疫反应。除了体液反应外，有效的抗原特异性 T 细胞反应对于诱导持久的抗病毒免疫记忆很重要。CD4 和 CD8 T 细胞通常会遇到活化的抗原呈递细胞 (APC) 呈递的外来抗原，接种发生扩增、收缩，最后作为记忆细胞持续存在。如果宿主再次感染病原体，这些记忆 T 细胞可以快速做出反应。人们发现有些共刺激分子是产生强烈记忆 T 细胞反应所必需的，而且，还有研究组发现OX40 激动剂不仅可以增强效应 T 细胞的激活，还可以增加长期持续存在的记忆 T 细胞的数量。 OX40 属于 TNF 受体家族 (TNFRF) 的成员，当识别抗原后，OX40 在 CD4 T 细胞表面的表达上调（在 CD8 T 细胞表面的表达也有较小程度的上调）。一旦在 T 细胞表面表达，OX40 与其位于活化APC细胞表面的配体 OX40L 相结合，增强 T 细胞的扩增、效应器功能以及存活时间。OX40 在体内与激动剂抗体或融合蛋白的结合可提升 T 细胞细胞因子水平，有助于病毒清除，并增强抗肿瘤 T 细胞反应。此外，受OX40刺激的T细胞还会与Tfh细胞上表达的ICOS协同作用，增强体液免疫反应，从而导致产生更高亲和力的抗体和长寿命的记忆 B 细胞，有助于在未来遇到病原体时维持抗体的产生。因此，在持续的免疫反应过程中使用 OX40 可以增加 CD4 和 CD8 T 细胞以及抗体反应。延长疫苗诱导的免疫反应的持续时间，Duhen 及其同事采用了 OX40 激动剂 OX40 激动剂和编码 S 蛋白的 saRNA（配制在 LNP 中）来对小鼠进行免疫。这项研究发现，OX40 激动剂增加了蛋白质疫苗和 saRNA 疫苗的特异性 CD4 + T 细胞反应。有趣的是，与基于蛋白质的疫苗接种相比，基于 saRNA 的疫苗产生了更强的 S 特异性 CD8 + T 细胞反应(表达高水平的GrzmB、IFN-γ和TNF-α)。此外，这些反应通过 OX40 激动剂的共同给药进一步放大。图片来源：OX40 agonist stimulation increases and sustains humoral and cell-mediated responses to SARS-CoV-2 protein and saRNA vaccines. 05 异源接种由于新冠疫苗的快速研发及其在大流行爆发期间的供应有限，很容易出现个人在初始免疫和加强免疫时接种不同疫苗的现象。与同源免疫相比，异源免疫呈现不同的安全性或功效特征。考虑到世界上很大一部分人口已经通过疫苗接种或感染获得了针对 SARS-CoV-2 的抗体，因此，异源加强免疫可能是在预先存在 SARS 免疫力的情况下增强免疫反应的最有效方法。实际上，关于ChAd-mRNA 异源疫苗接种的临床研究表明，与同源接种相比，该异源接种方案可以诱导更高频率的 S 特异性 T 细胞和针对不同 VoC 的更高 nAb 滴度。人们对采用saRNA疫苗进行异源免疫的优势也进行了评估。与接种单剂 ChAd 或 saRNA 的小鼠相比，使用 ChAd 或 saRNA 初免和替代加强疫苗（即 ChAd-saRNA 或 saRNA-ChAd）或两剂 saRNA 进行异源疫苗接种可诱导最高的 IgG 反应。在所有疫苗接种组中均检测到了相当数量的 SARS-CoV-2 刺突特异性 IgM，而与单次疫苗接种相比，使用 saRNA-ChAd 异源疫苗接种可诱导更高的血清 SARS-CoV-2 刺突特异性 IgA。在接受异源免疫的小鼠中，ELISpot检测到最高的IFNγ 反应，但是仅当单次接种 saRNA或 saRNA-ChAd 与 BALB/c 小鼠中的 ChAd 相比时，ELISpot检测数据才具有显著的统计学意义。与 CD4 + T 细胞反应相比，所有疫苗组中都观察到更高水平的 IFNγ 和 TNFα（除了 CD107a 的上调），疫苗接种后细胞介导的反应主要由 CD8 + T 细胞主导。此外，在异源疫苗接种后，无论疫苗顺序如何，在远交和近交系小鼠中均测量到抗原特异性 T 细胞的最高数量，同时，抗原特异性 CD8 + T 细胞主要表现出 Teff 表型。图片来源：Heterologous vaccination regimens with self-amplifying RNA and adenoviral COVID vaccines induce robust immune responses in mice. 类似地，在恒河猴中测试了 ChAd 初免，然后使用编码融合前S 蛋白的 saRNA-LNP 进行加强。该方案触发了强大的 T 细胞和 nAb 反应，提供了针对 SARS-CoV-2 攻击的保护功效，从而使得上呼吸道和下呼吸道中的病毒复制减少。图片来源：Low-dose self-amplifying mRNA COVID-19 vaccine drives strong protective immunity in non-human primates against SARS-CoV-2 infection. 有趣的是，另一项研究表明，以相反的顺序使用 saRNA 和腺病毒疫苗可增强免疫反应，即用 saRNA 初始免疫并用腺病毒疫苗加强。作者观察到采用这种异源方案的小鼠中特异性 CD4 (+) 和 CD8 (+) T 细胞反应增强，表明 saRNA 疫苗的初免可能促进高效的 CD4 (+) T 细胞反应，为腺病毒疫苗加强免疫后的触发强效的CD8+T细胞反应创造条件。 06 总结事实上，早在 1998 年，瑞典卡罗林斯卡研究所的 Peter Liljeström 团队就表明可以用源自 SFV 的裸露 saRNA 来免疫小鼠。saRNA相对于传统mRNA的优势之一在于其自我复制特性，这可以减少疫苗接种所需的RNA剂量，因为即使只有一个或几个saRNA分子进入细胞，它们也可以在很短的内在细胞内快速扩增几个数量级。相反，对于传统的线性mRNA，每个细胞可能需要多个mRNA分子才能实现合理的抗原表达。总结来说，要想优化自复制RNA疫苗的免疫效果，一方面需要提升递送系统的效率和靶向性，另一方面则需要改善自复制RNA分子本身的免疫原性、抗原选择、编码序列等，从而实现高效的抗原表达。此外，自复制RNA疫苗与其他种类的疫苗进行异源接种，例如，病毒载体疫苗或者蛋白亚单位疫苗，可进一步增强免疫反应。与常规线性mRNA疫苗相比，自复制RNA疫苗可视为首个获批上市的下一代RNA疫苗，未来还需要不断拓宽自复制RNA疫苗的应用范围和治疗效果。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。