mRNA靶向研究|PD-L1靶向IL-15 mRNA肿瘤免疫治疗

2024-03-16

信使RNA免疫疗法临床研究

导读：基于PD-1/PD-L1的免疫检查点阻断（ICB）疗法可阻断肿瘤细胞的免疫逃逸，引发抗肿瘤免疫反应。但由于肿瘤内免疫效应细胞浸润不足，通过PD-1/PD-L1 ICB治疗实现的持久有效的免疫应答的患者数较少，因此，在肿瘤免疫微环境中动员免疫效应细胞是促进上述疗法的有效策略。2024年1月，国内学者在Journal of Controlled Release（影响因子10.8）发表文章：《A combination of PD-L1-targeted IL-15 mRNA nanotherapy and ultrasound-targeted microbubble destruction for tumor immunotherapy 》，研究人员开发了一种“DPPA/IL-15 NPs”纳米平台，利用超声靶向微泡破坏技术（UTMD）将白介素-15（IL-15）mRNA靶向递送至PD-L1。该平台通过诱导免疫原性细胞死亡（ICD）和IL-15表达，介导有效的抗肿瘤免疫治疗。01背景介绍白细胞介素-15（Interleukin-15，IL-15）可增殖、募集和激活细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和自然杀伤细胞（NKs），但半衰期短、毒副作用强。因此，将IL-15 mRNA靶向递送至肿瘤细胞可解决上述问题。脂质纳米颗粒（LNPs）是最有效的非病毒递送载体，免疫原性低、生物安全性高、易于合成，可通过优化脂质的组成和比例将mRNA靶向递送至特定器官，但血管畸形和细胞外基质密度高等肿瘤特征限制LNPs的深度渗透。超声（US）介导的药物递送显示出良好的临床前景，可暂时破坏血管内皮屏障促进细胞内化。超声靶向微泡破坏技术（UTMD）可通过增加细胞内活性氧（ROS）介导多种细胞反应，如自噬、上皮-间充质转化和逆转耐药性。已知ROS诱导的内质网（ER）应激是免疫原性细胞死亡（ICD）的前兆，释放的DAMPs显著促进树突状细胞（DCs）的活化和CTLs的募集，DCs激活是肿瘤免疫周期的初始阶段，UTMD有望成为这一步骤的有效刺激剂。基于以上背景，研究人员提出基于UTMD实现免疫检查点靶向的mRNA纳米疗法，研究将其命名为DPPA/IL-15 NPs。其递送系统的特色在于核心成分为全氟己烷（PFH），赋予其超声响应性和超声造影成像性能，同时脂质层存在抗PD-L1肽DPPA修饰。02DPPA/IL-15 NPs的制备、表征和回声性2.1 DPPA/IL-15 NPs的制备PD-L1靶向性LNP递送系统的制备：将100mg DSPE-PEG-NHS溶于3mL DMF中，加入DPPA肽和三乙胺，使其完全溶解并反应12h。将反应液在纯化水中透析24h，透析液冷冻干燥，得DSPE-PEG-DPPA。MC3和PLGA溶于DMF，DSPE-PEG-DPPA溶于无RNase水中（所有试剂使用前超声处理2min）。在pH3.5下，将固定比例的MC3和mRNA加入柠檬酸盐缓冲液中，混合并孵育20min，MC3-mRNA复合物，200μL PFH和250μg PLGA在冰浴条件下超声处理1min。将1mg DSPE-PEG-DPPA水溶液滴加到混合物中并超声处理3min。用无RNase水离心洗涤3次后，收集DPPA/IL-15 NPs并分散到PBS缓冲液中。通过评估发现在相同mRNA质量下，增加MC3可提高转染和翻译效率，当MC3/mRNA质量比为10达到饱和，后续实验MC3/mRNA=10。为探究DPPA/IL-15 NPs的最佳mRNA封装效率，制备分别含有2%、5%、10%、15%、20%和30% MC3的DPPA/IL-15 NPs，发现随MC3含量增加，包封效率逐渐提高，但伴随的溶血速率也增加，为保证生物安全性，后续实验使用10%的MC3。2.2 IL-15 mRNA纳米颗粒的表征IL-15 NPs和DPPA/IL-15 NPs均带负电荷，平均流体动力学尺寸分别为290.8±9.8 nm和325.9±9.4 nm，PDI分别是0.169±0.015和0.139±0.016，表明均匀性高；透射电镜（TEM）显示，DPPA/IL-15 NPs分散良好，粒径主要分布在300nm处；AFM和SEM图像显示DPPA/IL-15 NPs具有完整的球形结构；纳米复合物中mRNA不易被RNase降解，稳定性好；在含10% FBS的培养基中储存48h的DPPA/IL-15 NPs的血清稳定性好，在血液循环过程中可保持稳定。2.3 回声性给药后24h对Cy5-DPPA-NPs和Cy5-NPs的生物分布进行成像和定量，其主要通过肝肾系统代谢。为评估DPPA/IL-15 NPs作为超声造影剂的回声性，使用灰度和CEUS模式获取体外和体内超声图像，静脉注射DPPA/IL-15 NPs后，荷瘤小鼠的US图像在CEUS模式下表现出回声信号和对比增强（p＜0.01），治疗性超声暴露后，肿瘤灌注面积和造影剂强度均较照射前增加（p＜0.05）。因此，DPPA/IL-15 NPs有望在实时超声成像引导下确定肿瘤位置、监测治疗过程和评估治疗效果，实现诊断和治疗的整合。图1 DPPA/IL-15 NPs合成及特征03mRNA递送至肿瘤细胞进行蛋白质翻译免疫细胞分泌的IFN-γ可上调黑色素瘤细胞中的PD-L1，DPPA-NPs与肿瘤细胞上的PD-L1结合效率实验结果发现：PD-L1在IFN-γ处理的B16F10细胞中高表达(83.6%)，经游离DPPA和DPPA-NPs处理后，PD-L1分别下降至24.6%和26.4%，故DPPA-NPs表面的DPPA与PD-L1具有良好的结合能力。进一步探究Cy5-DPPA-NPs的细胞内化及其在US下的增强作用。相较NPs组，DPPA-NPs+US组中cy5阳性细胞比例比DPPA-NPs组高1.15倍，比NPs+US组高1.21倍，表明DPPA-NPs可通过DPPA介导的主动靶向和UTMD介导的超声加工被肿瘤细胞内化。高翻译效率是mRNA有效治疗的基础，研究人员探究DPPA-NPs联合UTMD的翻译效率，与NPs相比，DPPA-NPs介导的主动靶向增强mRNA翻译。DPPA-NPs组与DPPA-NPs+US组观察结果表明增强的mRNA表达受益于US暴露。DPPA-NPs+US组中GFP阳性细胞的数量最多、百分比最高为9618±191#s，96.2±1.9%，DPPA-NPs组和NPs+US组分别为7671±547#s（76.8±5.5%），7220±688#s（72.2±6.8%），荷瘤小鼠模型体内翻译效率与细胞实验结果一致，综上，DPPA/IL15 NPs与UTMD组合可提高翻译效率。图2 UTMD介导的DPPA-NPs mRNA的体外递送IVIS光谱成像系统结果表明UTMD增加了肿瘤部位的药物富集，对肿瘤组织进行解剖发现DPPA-NPs联合UTMD可深度穿透肿瘤。图3 UTMD介导的DPPA-NPs mRNA的体内递送04UTMD诱导ER应激驱动的ICD增强肿瘤免疫原性对于激活抗肿瘤免疫反应至关重要，肿瘤免疫原性可能由死亡的肿瘤细胞引起，称为ICD。采用膜联蛋白V-FITC/PI染色测定UTMD的细胞毒性，单独用US、NPs和DPPA-NPs（无超声）无法诱导显著的细胞凋亡，NPs＋US和DPPA-NPs+US组诱导的细胞凋亡水平明显高于其他组，且出现细胞膜破裂、细胞内容物渗漏和明显的内质网扩张，表明UTMD的声毒性导致细胞凋亡。利用FCM和荧光显微镜评估细胞内ROS的产生，NPs和DPPA-NPs在US照射后均在细胞内产生超氧化物水平的ROS，表明UTMD可诱导氧化应激，且UTMD组中观察到的GRP78高表达表明UTMD在肿瘤细胞内诱导ER应激。内质网中ROS诱导的氧化应激是ICD的先决条件。产生ICD通常伴随着DAMPs的释放，促进DCs的募集和激活，从而触发针对肿瘤细胞的CTLs。进一步探究发现UTMD可诱导内质网应激以触发ICD并驱动多种DAMPs释放，如CRT暴露、HMGB1释放和HSP70增加，综上，UTMD增加了药物向肿瘤部位的递送及肿瘤微环境（TME）中的抗肿瘤免疫反应。图4 UTMD诱导的内质网应激提高DAMPs释放05UTMD联合DPPA/IL-15NPs在体外进行免疫激活为进一步证明UTMD与DPPA/IL-15 NPs在细胞水平上诱导免疫反应的功能，提取小鼠BMDCs，通过门控CD80/CD86阳性细胞评估UTMD联合DPPA/IL-15 NPs对DCs成熟的影响。DPPA/IL-15 NPs+US组的B16F10细胞与BMDCs共培养后成熟DCs（CD11c+CD80+CD86+）的百分比达29.9±0.4%，高于DPPA-NPs+US组（15.0±1.3%）和DPPA/IL-15 NPs组（19.8±1.6%），表明DPPA/IL-15 NPs联合UTMD有效促进DCs成熟。细胞因子分泌对免疫激活很重要，DPPA/IL-15 NPs与UTMD结合后产生的肿瘤细胞碎片触发BMDCs分泌高水平细胞因子（包括IL-6和TNF-α），增强免疫反应。IL-15（促炎细胞因子）可促进T细胞增殖并维持其存活，DPPA/IL15 NPs+US组中的T细胞增殖率高于DPPA/IL-15 NPs组（p＜0.05），与UTMD高效转染IL-15 mRNA有关。NK细胞在无抗原刺激的情况下通过自发裂解肿瘤细胞来消灭它，DPPA/IL-15 NPs+US组NK细胞细胞毒性最高，其次是DPPA/IL-15 NPs组，表明IL-15 mRNA翻译的IL-15在NK细胞中具刺激作用。综上，DPPA/IL-15 NPs与UTMD的结合足以诱导DCs成熟、T细胞增殖并增强NK细胞毒性，具有增强抗肿瘤免疫力的潜力。图5 UTMD联合DPPA/IL-15 NPs的体外免疫激活06UTMD联合DPPA/IL-15 NPs在小鼠体内的免疫作用为评估UTMD与DPPA/IL-15 NPs在B16F10荷瘤小鼠中的联合作用。在第14d切除肿瘤，与对照组相比，DPPA-NPs +US组和DPPA/IL-15 NPs组表现出中度抑制作用，DPPA/IL-15 NPs+US组几乎完全抑制B16F10肿瘤生长，表明联合疗法抑制肿瘤生长。H&E和TUNEL染色评估B16F10肿瘤内的坏死和凋亡，对照组肿瘤细胞结构完整，DPPA-NPs+US、DPPA/IL-15 NPs、DPPA/IL-15 NPs+US组细胞结构丧失、细胞核萎缩及细胞坏死碎裂，DPPA/IL-15 NPs+US组的坏死区明显大于其他组。PD-L1靶向IL-15 mRNA纳米疗法与UTMD联合使用可有效协同，提高抗肿瘤疗效。生物安全是纳米疗法临床应用的前提，UTMD和DPPA/IL-15 NPs组合未引发显著全身毒性及明显病理损伤和炎症浸润，表明组合疗法对活体动物的高度生物安全性。图6 体内原发性B16F10肿瘤的抑制效果07UTMD联合DPPS/IL-15 NPs诱导体内抗肿瘤免疫应答DCs是激活抗肿瘤免疫反应的桥梁，与体外结果一致，DPPA/IL-15 NPs+US组中成熟DCs（CD11c+CD80+CD86+）水平最高（50.0±1.5%），DPPA-NPs、DPPA-NPs+US、DPPA/IL-15 NPs组和对照组分别为26.7±0.9%、31.3±1.7%、38.3±2.3%和22.2±0.6%，表明可能由于UTMD增强IL-15表达，IL-15与死亡肿瘤细胞释放的DAMPs协同作用，启动抗肿瘤免疫反应。CTLs（CD8+ T细胞）是抗肿瘤免疫疗法中的关键效应细胞。DPPA/IL-15 NPs+US组CD8+ T细胞的浸润率(24.1±2.3%)比DPPA-NPs+US组(11.7±1.0%)高2.05倍，比DPPA/IL-15 NPs组(17.6±2.0%)高1.37倍。表明UTMD和DPPA/IL-15 NPs的协同作用导致CTLs有效浸润到B16F10肿瘤中。与其他组相比，DPPA/IL-15 NPs+US组CD8+CD44+ T细胞百分比显著增加，大量肿瘤浸润CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及NK细胞，表明联合治疗可系统增强T细胞免疫。与对照组相比，DPPA/IL-15 NPs+US组中IFN-γ、IL6和TNF-α分别高出6.10、3.83和5.42倍，进一步支持联合疗法诱导有效的抗肿瘤免疫反应。综上，UTMD联合DPPA/IL-15 NPs重塑肿瘤免疫微环境，促进免疫杀伤反应。图7 体内全身抗肿瘤免疫分析08UTMD联合DPPS/IL-15 NPs诱导免疫记忆进一步使用转移性肿瘤模型验证抗复发能力。在实验终端收集肺部，对照组观察到大量转移性结节，DPPA/IL-15 NPs+US组中仅观察到散发性转移灶，结合H&E图像结果表明UTMD联合DPPA/IL-15 NPs显著增强抗转移作用。免疫记忆反应是成功适应性免疫的重要标志，采用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD8+CD44highCD62Llow效应记忆T细胞(TEM)和CD8+CD44highCD62Lhigh中枢记忆T细胞(TCM)，DPPA/IL-15 NPs+US组CD8+ TEM(28.2±0.5%)和TCM(17.4±0.6%)的百分比高于DPPA-NPs+US组(分别为20.0±0.2%和11.1±0.5%)和DPPA/IL-15 NPs组(分别为25.5±0.8%和12.9±0.8%)，证实联合治疗可诱导稳健的T细胞记忆。综上，UTMD与DPPA/IL-15 NPs联合有利于建立针对复发肿瘤的免疫记忆，作为新的肿瘤治疗途径。图8 免疫治疗转移性B16F10肿瘤的体内研究09小结本研究建立的PD-L1靶向性递送系统DPPA/IL-15 NPs不仅保护了mRNA，还表现出US响应性和CEUS成像能力。当与UTMD联用时，DPPA/IL-15 NPs实现了PD-L1最佳靶向，促进IL-15 mRNA的递送，并在体外和体内显示出更高的mRNA转染和翻译效率。UTMD可显著增加细胞内ROS，诱导ER应激驱动的ICD，作为启动抗肿瘤免疫的第一步。且UTMD与DPPA/IL-15 NPs组合可增加免疫效应细胞的募集及免疫刺激细胞因子的产生，从而有效抑制肿瘤生长和肿瘤复发。该联合疗法具有通过增强免疫疗法进行临床转化的潜力，并提供实时超声成像指导。参考文献 [1] Wang X, Li F, Zhang J, Guo L, Shang M, Sun X, Xiao S, Shi D, Meng D, Zhao Y, Jiang C, Li J. A combination of PD-L1-targeted IL-15 mRNA nanotherapy and ultrasound-targeted microbubble destruction for tumor immunotherapy. J Control Release. 2024 Jan 24;367:45-60. doi: 10.1016/j.jconrel.2024.01.039.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。END