偶联时代：新技术齐头并进，ADC优化大有可为

2022-12-14

抗体药物偶联物临床结果

摘要：保罗埃尔希在100年前提出的“魔法子弹”在抗体药物治疗领域掀起了一场革命。ADC设计概念就承载着研究人员对癌症治疗药物的美好期许：用抗体子弹特异性的“瞄准”抗原，同时不会对周围细胞造成毒性影响。为了提升这一“魔法子弹”的威力，目前对ADC的开发现主要集中在三个大的领域：改进现有抗体药物结合物，发现新的靶点，以及开发新的结合物形式。本文着重于总结这三个领域的临床前研究，以及改善临床前发展的技术进展。前言：ADC优化策略药物结合物（Drug conjugates）是一种具有理想效用的癌症治疗物，主要是将有效载荷（毒素）与抗体通过连接子连接起来，抗体将有效载荷特异性的输入到肿瘤中，从而抑制肿瘤生长。临床使用最广泛的药物结合物就是ADC，目前已有12种ADC药物获得FDA批准（表1）。表1 FDA批准的DC药物(截至2022年3月）本文将新的临床前开发分为三个方面：(1)ADC成分的改进，如抗体、连接物和有效载荷；(2)ADC和其他药物结合物的新靶点的鉴定；(3)新靶向方法(X-药物结合物)的评价，其中X可以是小分子、肽、配体、ScFv或纳米抗体。将在下文详细介绍。一、新型抗体技术ADC的抗体部分能识别并与靶肿瘤抗原特异性结合，从而形成靶向给药系统。近几年对ADC的抗体进行了诸多优化，主要是集中在细胞内化率和肿瘤渗透率上。（一）双特异性抗体内化是ADC开发的标准流程之一，但具有理想内化特征的靶点很少。图1展示了ADC的抗体选择流程，突出了内化方面的差异。图1 优化内化率的ADC抗体工程改善内化效应的一种思路是将内化较差的抗原与内化迅速的抗原配对，这样快速内化的抗原就能促进内化较差抗原的吸收作用。其中一个范例是靶向白细胞粘附分子的双特异性抗体，这种双特异性抗体可与非内化肿瘤抗原(激活的白细胞黏附分子)和快速内化抗原(肾上腺素受体A2)结合，当二者都在白血病细胞表面表达时，双特异性抗体在体外和体内都具有更高的内化率和细胞毒性。目前有超过85种双特异性抗体正在临床开发中，其中86%正在癌症患者身上进行评估(二）迷你抗体ADC在特定的肿瘤组织中聚集，但药代动力学方法的缺陷阻碍了他们在肿瘤中的进一步分布。其中一个重要参数是组织渗透率。内化率和组织穿透之间存在着复杂的关系，内化率越高，可能肿瘤穿透率越小。最近在研究前列腺相关ADC时发现组织渗透率与疗效直接相关。这项研究同时发现，体积较小的抗体和较慢的内化过程，可在体内实现更高的组织渗透率和更强的细胞杀伤力。迷你抗体是天然抗体的衍生物，这些抗体片段不仅保留了抗体的抗原结合能力，还能凭借更小的体积来增加肿瘤穿透性。纳米抗体就是一种理想的“迷你抗体”代表。因纳米抗体体积仅为正常抗体的1/10，组织穿透性有着显著优势，同时纳米抗体开发简便、理化性质优越，目前在ADC的开发中已得到了越来越多的关注，同时基于纳米抗体的恩沃利单抗已获FDA批准，为提高ADC药效、改善实体瘤治疗效果带来了新希望。（三）均质抗体异质性通过影响释放率来影响ADC毒性载荷，因此ADC抗体的均质性非常重要。但要做到这一点是非常有挑战性的，因为不同的偶联方法会让抗体和毒性载荷在不同位点偶联。另一种方法是将天然氨基酸编码成抗体，改善位点修饰作用，从而提高均质性的一种方法是将一些非天然氨基酸(unAAs)编码到抗体中。(unAAs)含有很多能促进蛋白质特异性结合的基团，一般通过抑制琥珀终止密码子发挥作用。此外，抗体的定向位点突变也能提高均质性。比如将额外的半胱氨酸残基插入单抗重链时就可以利用半胱氨酸的反应性。蛋白质的半合成，如表达蛋白配体是另一种生产位点特异性修饰ADC的策略，在此方法中，多肽可以通过二硫键连接到抗体的特定位置，而最近发表的文章还提到了一种抗体自组装方式。在重链和与毒性载荷偶联的轻链生产后，重链和轻链可以通过自组装形成折叠形式正确的抗体，从而生成均质的ADC。（四）Acid Switchable 抗体最近报道的一类“acid-switched”抗体在血浆和细胞外环境（接近生理PH环境）中都表现出了高靶点亲合力，这种抗体在肿瘤细胞或溶酶体（酸性环境）中的亲合力要弱250倍，在异种移植模型中，它提高了溶酶体转运效率、降低了外排率，还改善了有效载荷的释放情况，展示了更高的治疗效率。这一设计灵感来源于人表皮生长因子受体2(HER2)靶向抗体pertuzumab的亲合力伴随pH变化。二、连接子优化通常来说，连接子主要由三大部分组成：① 抗体-连接子接头② 有效载荷释放结构（可分割连接子）③ 连接子、有效载荷接头。近年来，连接子的化学结构得到了优化，而优化主要集中在改善连接速度、血浆稳定性、亲水性和有效载荷释放率上。N-丁二酰亚胺-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯是ADC中抗体与连接子连接时最常用的接头。但Dovgan等人。(2016)提出用2-(马来酰亚胺甲基)-1，3-二氧杂环乙烷连接子作为替代方案。这种连接子亲水性更高，血浆稳定性更优（3%/120h）,前者为（38%/120h）。在商业化ADC中，使用了三种酸可裂解连接子。但对这种连接子来说要达到较高的DAR不容易，因为高DAR通常意味着高清除率。此为，酸可裂解连接子的半衰期通常短于3天。鉴于此，王（2019）等人设计了一种硅基醚酸可裂解连接子。在它与抗体和MMAE结合生产ADC后发现，由此生产的ADC半衰期低于7天，平均DAR为5.5，酸性条件下MMAE释放率更高，同时在体外表现了很强的肿瘤吸收效应，在动物血液学实验中也很安全。酶-可裂解型连接子，如缬氨酸-瓜氨酸（Valine-Citrulline）和缬氨酸-丙氨酸（valine-alanine）二肽连接子是运用最广泛的可裂解连接子。在已获批的ADC中，Adcetris,Polivy, Padcev,和Tivdak都应用的是前者，而Zynlonta应用的是后者。但多肽连接子通常具有两大缺陷，一是因为血浆中的Ces1C hydrolase 酶无法稳定存在，这限制了它们在临床上的应用。二疏水性会阻碍毒性载荷与抗体的连接。为了解决这一问题，Bargh等人（2020）报告了一种含有arylsulfate的连接策略。这种连接子可以被溶酶体的硫酸盐酶切，在小鼠血浆中稳定存在，同时水溶性稳定。三、新靶点发现药物结合物的开发得益于新的肿瘤特异性靶点的发现。目前已发现了不少新靶点（表2）它们原始基因型、在人类组织中的分布、内吞作用都在不同水平上进行了研究。为ADC和靶向治疗药物的开发提供新的基础。（一）靶点选择原则（1）肿瘤表面表达抗体：为了避免脱靶效应，靶点应该只在（或大部分在）肿瘤细胞表面表达，在正常组织低表达靶点最好是胞外抗原比如HER2在肿瘤细胞中是表达是正常细胞的一百倍以上。（2）靶点非分泌：靶点应该是非分泌的，避免在循环中将ADC结合物带往别处（3）理想内化作用：靶点在与相应抗体结合后应有较为理想的内化作用。而随着免疫学的不断进步，ADC靶点又从肿瘤靶点扩展到肿瘤微环境中的靶点（如间质细胞和血管）越来越多证据表明新生血管系统成分、内皮下胞外基质和肿瘤基质都可能暗含可开发的靶点。（二）新的药物结合靶点（1）临床前研究中发现的新靶点开发靶向新靶点的药物至关重要，因为目前的药物没有广泛的癌症类型覆盖范围。如正在临床使用的靶向HER2的ADC，如（Kadcyla 、Enhertu），但HER2+型乳腺癌 HER2+型乳腺癌仅占全部乳腺癌的25%左右，HER3可能能用来扩大靶向治疗的癌症范围。但目前临床上还没有相关的；疗法。很多靶向HER3的ADC正在进行临床开发，如U3-1402和EV20（表2）。他们都显示出了有希望的治疗前景，如在小鼠模型中持续较长时间的肿瘤衰退（300天以上）。表2 部分新靶点的临床前研究及相关ADC研究进展三阴性乳腺癌与其他类型乳腺癌相比，缺乏三种主要的受体（如雌激素受体、孕激素受体和HER2）。TNBC侵略性更强，更容易释放，所以更需要得到有效的靶向治疗。（纳米抗体与三阴性乳腺癌）He等人（2020）生产了一种核酸适体药物偶联物(Aptamer Drug Conjugate,ApDC)（2）将广泛表达的抗原作为靶点很多类型的抗原都会直接暴露在细胞表面。针对这些抗原的ADC可以作为广谱抗肿瘤药物来治疗多种肿瘤。表2列出了已在肿瘤细胞系和动物模型中经过验证的ADC。例如，已经在几个耐药肿瘤克隆和多种癌症类型中发现了酪氨酸激酶Axl。最近生产了一种靶向AXL的ADC—AXL-107-MMAE，在25例患者来源的异种移植瘤中，有18例显示出强大的抗肿瘤活性和肿瘤消退，如黑色素瘤、肺癌、胰腺癌和宫颈癌（3）新靶点发现方法新靶点、肿瘤生长机制和耐药性仍然是研究热点，它们都可用于开发ADC。①如通过RNA测序技术，发现了GPC2。通过测序研究发现该蛋白在神经母细胞瘤中差异性表达，而在正常组织中不表达，同时GPC2是神经母细胞瘤生长不可或缺的要素。基于此，开发了靶向GPC2的ADC—D3-GPC2-PBD，这种ADC展示出对神经母细胞瘤细胞的强大细胞毒性。②研究肿瘤基因调控的机制也是寻找新靶点的一种方法。③靶向具有生物学功能的肿瘤抗原一些肿瘤抗原在癌细胞中具有抵抗肿瘤、免疫抑制甚至肿瘤转移功能，优化ADC可能通过多种机制抑制肿瘤生长，达到协同作用。例如，酶b-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶参与了内皮生长因子诱导的TNBC中程序性死亡配体1(PD-L1)及其受体程序性死亡蛋白1(PD-1)的相互作用。下调b-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶可增强细胞毒性T细胞介导的抗肿瘤免疫。在此基础上，设计了一种针对b-1，3N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶的ADC-scPDL1-dm1，以加强对TNBC的免疫检查点治疗。④靶向基质目前在与癌细胞表面的靶向内化受体结合时，ADC可能会带来胞毒性。而非内化ADC有望解决这一问题。此外，非恶性间质细胞在肿瘤微环境中运输营养物质支持肿瘤的生长，同时阻止药物进入，从而导致治疗耐药性。这些细胞会在90%以上的实体瘤中出现。不同类型的间质细胞可能会有一些相同的标志物，因此以基质细胞为靶点的ADC可能对多种肿瘤类型有潜在治疗效应。因此开发靶向基质细胞的ADC是很有前景的一个方向。a.靶向肿瘤微环境中间质细胞过表达的特定蛋白。比如可以调节肿瘤的增殖的活化纤维原细胞。b.在肿瘤微环境的细胞外基质中也发现了其他靶点，如纤连蛋白。纤连蛋白在许多癌症类型中大量存在，但不会健康细胞中表达。c.同时由于免疫细胞也是肿瘤微环境的一部分，还有一种策略是使用ADC来靶向它们，以改善肿瘤的输送。四、新型药物结合物近年来，ADC与其他研究领域的重叠催生了一些有趣的新方向，如ADC纳米粒子、X-药物结合物和肿瘤治疗的可视化。ADC纳米颗粒在负载大量有效载荷的能力以及携带多种抗体或多种有效载荷的能力方面具有优势（一）XDC许多临床前研究都致力于提高ADC的临床前疗效，这些研究启发开发新型药物结合物形式。包括SMDCs（小分子药物结合物）、抗体片段药物结合物（antibody fragment drug Conjugates）, PDCs（多肽药物偶联物）、两亲性多肽、药物结合物、两亲性抑制剂-药物结合物、抗体-聚合物-药物结合物、抗体光敏剂偶联物(APC)、配体药物结合物(LDCs)（图2）。图2 临床前研究中测试的一些新型药物结合物的示意图和特征。这些都是基于“神奇子弹”概念和ADC临床的新药结合物。（二）低pH胞外肿瘤靶向药物结合物除了基于抗体-抗原结合的递送外，其他肿瘤特性还可以用于药物偶联递送，例如利用低pH环境中的一些肿瘤组织。低PH插入肽(PHLIP)是一种pH依赖的递送系统，可在低pH组织中蓄积并插入肿瘤细胞膜，它能形成跨膜螺旋，并将有效载荷转移到肿瘤细胞中（图3）Phlip已被成功地用于从小分子到大分子的各种药物的靶向递送图3 PHLIP-药物结合物(PhDc)的作用机理示意图。总结与展望科学家们不再满足于现有的ADC和ADC结构，而是希望通过解决ADC市场化中面临的问题，对ADC进行改进，扩大ADC的应用范围，开发新型药物结合物。近年来，ADC与其他研究领域的重叠催生了一些有趣的新方向，如ADC&纳米抗体（参见：ADC开发下一站：NDC）。总之，药物偶联物是很有前途的肿瘤治疗方法，随着每个新思路的出现，对其特性的研究越来越深化，给更多癌症患者带来希望。参考文献：Jin Y, Edalatian Zakeri S, Bahal R, Wiemer AJ. New Technologies Bloom Together for Bettering Cancer Drug Conjugates. Pharmacol Rev. 2022 Jul;74(3):680-711. doi: 10.1124/pharmrev.121.000499. PMID: 35710136; PMCID: PMC9553120.