整合性生物分析在mRNA药物DMPK研究中的应用

2024-02-18

信使RNA上市批准免疫疗法疫苗核酸药物

前言信使RNA（Messenger RNA，mRNA）是一种由DNA转录的单链核糖核酸，其携带编码蛋白质合成的编码信息可以翻译成各类功能性蛋白/肽段。最早将体外转录的mRNA在鼠肌肉细胞中成功表达相关蛋白的实验，成功奠定了mRNA治疗的基础[1]。mRNA治疗药物理论上可以通过核糖体表达系统翻译成任何蛋白/肽段。相对于基于DNA的基因治疗药物，因为mRNA治疗药物无需进入细胞核发挥疗效，其转染效率相对更高并且毒性更低，更重要的是其没有潜在插入诱变或感染的风险，无需担心对非靶DNA序列的修改而造成的脱靶毒性。并且相对于传统蛋白疗法，mRNA治疗药物可以持续翻译成编码的蛋白质，具备更好的疗效和潜力。mRNA药物的发展历程及作用机理mRNA药物的发展可以分成三个阶段，第一个阶段为1961-1990年，关键发现包括mRNA的发现、mRNA加帽加尾机制、mRNA体外合成、mRNA翻译机制以及早期核酸递送系统的构建等。这个阶段为mRNA的结构与机理的研究奠定了坚实的基础，并且开发出早期基于鱼精蛋白或脂质体的递送系统。第二个阶段为1990-2019年，伴随着对mRNA机制了解的越发深入，专注于mRNA疗法的公司相继成立，基于mRNA的实验性癌症免疫疗法、激活抗肿瘤T细胞、针对流感/RSV的实验性疫苗、个性化癌症疫苗等纷纷涌现。第三个阶段，即从2019至今，伴随mRNA-1273（Moderna）和BNT162b（Pfizer）COVID-19疫苗获批上市，mRNA药物进入了百花齐放的新阶段，各类治疗形式纷纷涌现，载体以及mRNA修饰、编码技术快速迭代。mRNA药物的发展历程和关键发现见图1。图1. mRNA药物发展历程和关键发现[2]广义上而言，mRNA疗法可以分成mRNA疫苗和mRNA治疗性药物。mRNA疫苗主要通过表达致病原相关蛋白（通常是致病原外部易被免疫细胞识别的蛋白，例如病毒衣壳蛋白等），诱导机体免疫细胞生成相应抗体。具体而言，分成三个阶段，首先是载体运送的mRNA进入抗原呈递细胞（antigen-presenting cells），从胞内体（endosome）中逃逸进入细胞质中，通过核糖体翻译成抗原蛋白，抗原蛋白通过蛋白酶体降解为多肽抗原片段并由MHC I呈递给CD8阳性的胞毒T细胞（Cytotoxic T cell），另外表达的抗原蛋白也会被分泌到细胞外，再通过内化，水解后形成多肽抗原片段由MHCII呈递给CD4阳性的辅助T细胞（Helper T cell），最终激活B细胞分化成浆细胞产生相应抗体。如图2，mRNA疫苗同时激活了细胞免疫和体液免疫，相对传统的灭活疫苗/抗原蛋白疫苗只激活体液免疫，mRNA疫苗具备更强的免疫激活潜力。图2. mRNA疫苗起效机理示意图，包括脂质体包裹的mRNA进入细胞，表达后通过作为内源性抗原和外源性抗原分别激活体液免疫和细胞免疫[3]COVID-19 mRNA疫苗的巨大成功让大家认识到了mRNA疫苗的潜力，各类新型mRNA疫苗不断涌现，据NextPharma数据库，目前全球共有超过500款mRNA疫苗在研，包括针对感染类的疾病如流感（Influenza）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人乳头状瘤病毒（HPV）、EB病毒（EBV）以及人类免疫缺陷病毒（HIV）等的mRNA疫苗。另外值得注意的是，得益于mRNA疫苗在激活体液免疫（MHC II）的同时也可以激活细胞免疫（MHC I），目前在癌症疫苗方面有很多的尝试。并且mRNA疫苗具备多重编码的优势，可以同时编码数十个肿瘤抗原以及细胞因子等调节蛋白，可以很好的应对肿瘤个体异质性以及肿瘤微环境抑制等挑战。并且得益于研发周期短、可编程以及运载系统成熟等优点，相对于传统蛋白/肽段类抗原的癌症疫苗，mRNA疫苗在个性化定制（Personalized vaccines）上具备突出的优势。mRNA治疗性药物简单而言就是表达有功能的效应蛋白，达到治疗性的目的，通常又被称为蛋白替代疗法（Protein replacement therapy）。在各个疾病研究领域均有探索，包括癌症、心血管疾病、肺病、血液病、代谢疾病、神经疾病以及肌肉萎缩症等。大部分的mRNA治疗性药物都在临床前阶段，目前仅有少数几款mRNA治疗性药物进入临床阶段[4]，包括表达血管内皮生长因子A（VEGF-A）治疗心衰的mRNA药物，表达人囊性纤维化跨膜调节蛋白（CFTR）治疗肺部囊性纤维化疾病的mRNA药物，以及表达甲基丙二酰辅酶A变位酶（MUT）治疗甲基丙二酸酸血症的mRNA药物等。mRNA药物的DMPK研究可以简单分成两类，mRNA疫苗的DMPK研究以及mRNA治疗性药物的DMPK研究。可以参考之前发表的公众号文章: mRNA药物临床前药代动力学评估策略。简单而言，对于mRNA疫苗，主要是对mRNA本身以及新型载体辅料等的组织分布研究。对于mRNA治疗性药物，除组织分布研究外，系统循环中的mRNA，表达蛋白以及新型载体辅料也需要进行研究，并且相应的免疫原性和PK/PD研究也需要纳入考察范围中。这些多样的DMPK研究策略和考察内容需要相应的生物分析支持，我们建立了一套针对mRNA药物的整合性生物分析平台。这里以代表性的脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles，LNPs）包裹的mRNA药物为例，包括有对于mRNA本身分析，对表达蛋白、新型载体辅料（阳离子脂质或PEG脂质）、免疫原性以及生物标志物的分析等。下面我们将详细介绍每类成分具体的生物分析内容，以及相应的内部验证实验。图3. mRNA药物（以LNP-mRNA药物为例）整合性生物分析内容及相应生物分析平台mRNA整合性生物分析内容及平台1mRNA生物分析平台mRNA的生物分析主要通过两类平台进行，第一类是基于逆转录和扩增的RT-qPCR平台，另一类是基于信号放大的配体结合分析（Ligand Binding Assay, LBA）原理，B-DNA（branched-DNA）或者RNA-scope平台。具体原理见图4，简单而言RT-qPCR首先将mRNA逆转录成cDNA，cDNA进行qPCR扩增，通过SYBR green或Taqman荧光探针指示扩增量，由达到特定阈值的qPCR循环数指征mRNA的绝对量。而B-DNA则是基于核酸探针杂交（hybridization）和信号放大的原理，通过互补序列的核酸探针捕获mRNA于固相载体上，通过多重检测核酸探针放大信号，由信号值指征mRNA的绝对量。具体两个分析平台RT-qPCR和B-DNA的对比与优劣势将在后续的文章中详细介绍，欢迎持续关注。图4. RT-qPCR和B-DNA分析mRNA原理流程示意图[5]值得注意的是，除了基于绝对定量的RT-qPCR和B-DNA分析平台，mRNA药物早期组织分布研究也可以使用RNA Scope显微成像分析，虽然RNA-Scope是半定量的分析，但是其可视化以及可提供更精细的空间/细胞分布的优势使其广泛应用于mRNA 疫苗/药物的早期的组织分布研究中，例如Moderna在研究mRNA LNP疫苗的组织分布上，使用的是RNA-Scope的平台（如图5）。RNA Scope技术的原理也和B-DNA类似，也是基于核酸探针杂交（hybridization）和信号放大的原理。图5. Moderna使用RNA-Scope技术分析肌肉注射的模拟mRNA LNP疫苗组织分布（表达GFP蛋白的mRNA）[6]目前mRNA药物的生物分析，特别是用于IND申报的定量分析仍主要使用RT-qPCR平台，目前监管机构没有针对mRNA RT-qPCR生物分析的指导原则，我们根据行业白皮书以及GCC（Global CRO Council）共识[7]制定了我们自己的RT-qPCR方法开发/验证的接受标准。方法验证包括但不限于：标准曲线、灵敏度、批内/批间精密度和准确度评估、选择性、稳定性以及提取回收率等内容。我们使用模拟的mRNA药物（EGFP mRNA）验证RT-qPCR分析平台，考虑到肝脏通常是LNP mRNA药物组织分布的重要器官并且是主要的靶向和代谢组织，我们选取了SD大鼠肝组织和全血进行qPCR方法的完整验证。我们在NCBI Blast网站上设计EGFP mRNA的扩增引物和相应Taqman探针，RT-qPCR线性范围1pg/mL-1000ng/mL。全血和肝组织的qPCR定量标准曲线如下图所示。图6. 全血和肝脏中EGFP mRNA绝对定量标曲示意图，纵坐标是循环数阈值（Ct），横坐标是log10后的mRNA浓度（pg/mL）在方法验证阶段，我们分别进行了RT-qPCR方法的批内/批间精密度和准确度考察，选择性考察以及稳定性考察。批内/批间精密度和准确度考察显示两位分析人员跨越三天时间三个分析批的批内%CV和%Bias以及批间%CV和%Bias，数据显示不同分析批的标曲和质控样品都具备良好的批内/批间%CV和%Bias，三个分析批重复性良好，方法稳健（表1和表2）。选择性考察选取了三个不同浓度的加标质控样品（ULOQ, HQC, LLOQ），结果超过80%的加标质控样品（17/18）满足%CV和%Bias接受标准，方法具备良好的选择性。同时高浓度和低浓度加标质控样品的短期稳定性考察均通过。表1. 标准曲线样品批内/批间精密度准确度评估表2. 质控样品批内/批间精密度准确度评估总体而言，使用RT-qPCR平台定量分析mRNA药物具备良好的灵敏度、特异性以及稳健性，是目前常用的分析mRNA的平台。除了肝脏组织外，我们为其他基质类型例如全血、血清/血浆、难匀浆组织（肌肉、大脑等）都建立及优化了样品前处理方法，可以满足mRNA药物PK和组织分布的研究需求。2新型脂质生物分析脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles，LNPs）通常由4类成分组成：胆固醇、中性辅助磷脂、可离子化阳离子脂质、PEG脂质。胆固醇和中性辅助磷脂比较常见，通常已在其他相似载体中并获得FDA的批准，往往不需要进行额外的药代动力学考察以及相应的生物分析。而不同的LNP的可离子化阳离子脂质可能差异较大，不同的可离子化阳离子脂质决定了LNP本身的靶向性以及药代动力学特征，是LNP载体常用的结构优化单元。通常这些新型的脂质成分并未应用在已获批的上市药物中，需要进行完整的体内外ADME考察，同时也涉及到相应的生物分析。阳离子脂质决定LNP递送系统的递送效率和转染效率，它有三个重要的结构区域，分别是极性头部（Head Group）、连接链（Linker）、疏水尾部（Hydrophobic tail）。其中极性头部影响脂质带电情况，在溶酶体逃逸过程也起主要作用，连接链决定了阳离子脂质体的化学稳定性和生物可降解性，疏水尾部影响脂质行为，其既为脂双层提供足够的流动相，又能促使阳离子脂质体在体内的脂质融合。脂质体的新型脂质成分的生物分析主要使用LC/MS平台进行，但是由于LNP成分复杂、同分异构体多，在进行体内分析时，易受到体内内源性成分的干扰，对方法提出的挑战较大。在分析过程中需要格外注意其因自身特殊结构可能导致的非特异性吸附、与色谱柱结合强及提取回收率差等问题。药明康德DMPK在新型脂质分析方面具有丰富经验，将在未来的公众号中与大家详细分享。3表达蛋白生物分析根据研究目的和研究阶段的不同，表达蛋白的分析可以使用基于显微成像的IHC，也可以使用传统Western blot或基于LBA平台的绝对定量方法（ELISA或MSD等）。如下表列出相应平台的优缺点。目前基于LBA平台检测可以根据待测蛋白的大小以及关键试剂的可获取性，开发夹心法ELISA或者竞争法ELISA绝对定量各类体液和组织中的表达蛋白。并且药明康德DMPK目前有基于Hamiltion移液平台的自动化ELISA工作站，可以全天候24小时工作，可快速筛选抗体对及优化抗体工作浓度。表3. 不同分析平台对于mRNA表达蛋白分析的优缺点4免疫原性分析由于mRNA药物的成分相对比较复杂，免疫原性的产生可能由于不同的组分引起，因此需要考虑不同组分的不同免疫原性。这里以LNP载体的mRNA药物为例，免疫原性的考察通常包括如下三个部分，对表达蛋白的免疫原性分析，对mRNA本身的免疫原性分析，以及对于载体（特别是PEG）的免疫原性分析。普遍认为mRNA本身的免疫原性很低，较难引起抗药抗体的产生，但是其序列可能引起特定TLR的激活，可能造成特定免疫通路的激活，通常可在临床前阶段留样待测，并无法规强制要求考察。载体的免疫原性根据载体的不同通常差异较大，目前常用的LNP载体通常认为是免疫原性很低的载体，以LNP本身制备ADA阳性对照（Positive control）比较困难，一般情况下不考察LNP总体的免疫原性。但是值得注意的是LNP上通常有PEG脂质，其中的PEG修饰成分是潜在的引起免疫原性的物质，并且机体可能存在预存anti-PEG抗体（pre-existing anti-PEG antibodies）也会造成药物清除速度加快等情况。因此通常对于LNP载体的mRNA药物，会建议考察其PEG成分的免疫原性。还有一个很重要的潜在免疫原性来源是mRNA药物表达的蛋白，mRNA药物表达蛋白由于蛋白序列和折叠方式可能与内源性蛋白存在差异，因此会有潜在的免疫原性风险。并且由于mRNA蛋白的表达量和持续表达时间等因素，可能也会增加潜在的免疫原性风险。对于mRNA以及载体的免疫原性，通常使用ADA直接法（ADA direct assay）检测，表达蛋白的免疫原性检测则通常使用ADA桥接法（ADA bridge assay）检测。检测形式示意图如下所示。图7. mRNA免疫原性分析检测形式示意图，通常针对mRNA本身以及载体的免疫原性分析使用ADA direct assay format，而针对mRNA表达蛋白免疫原性使用ADA bridge assay format5mRNA药物生物标记物分析mRNA药物临床前的生物标志物分析主要包括：免疫反应分析（其中包括免疫细胞分型分析、细胞因子/免疫因子分析以及免疫球蛋白亚型分析）、效应蛋白相关通路生物标志物分析等。对于mRNA疫苗或mRNA治疗性药物，其生物标志物的分析侧重点不同。总体上生物标志物的分析主要集中在对于mRNA药物的药效和安全性的评估、生物标志物的选择以及分析方法的确证内容上，遵循以研究目的为导向（fit for purpose）的设计。DMPK目前针对常见的免疫细胞分型分析、细胞因子/免疫因子分析以及免疫球蛋白亚型分析等都有成熟的确证后的方法可以直接使用。并且针对效应蛋白相关通路生物标志物分析等，可以设计开发并且确证高灵敏度的LBA分析方法，灵敏度低至1pg/mL。图8. mRNA药物相关生物标志物分析示意图，包括免疫反应分析和效应蛋白下游通路生物标志物分析等结语mRNA药物理论上可以通过核糖体表达系统翻译成任何蛋白/肽段，具有开发各类mRNA疫苗或治疗性药物的可能，并且具有发展个性化药物（Personalized medicine）的潜力。随着COVID-19 mRNA疫苗的大获成功，对于mRNA疫苗或治疗性药物的研发热情也在不断高涨，相对于传统的大分子药物，mRNA药物结构更加复杂，其ADME、有效性以及安全性的研究内容相对更加复杂，涉及到的生物分析平台和策略也更多，考虑到mRNA药物设计之间的差异，不同的mRNA药物也需要为其量身定制合适的生物分析方法。参考文献：[1] Sahin, Ugur, Katalin Karikó, and Özlem Türeci. "mRNA-based therapeutics—developing a new class of drugs." Nature reviews Drug discovery 13.10 (2014): 759-780.[2] Qin, Shugang, et al. "mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases." Signal transduction and targeted therapy 7.1 (2022): 166.[3] Palmer, Michael, and Sucharit Bhakdi. "The Pfizer mRNA vaccine: pharmacokinetics and toxicity." Letsbfree. Com (2021).[4] Vavilis, Theofanis, et al. "mRNA in the Context of Protein Replacement Therapy." Pharmaceutics 15.1 (2023): 166.[5] Henderson, Neil, and Amanda Wilson. "Measurement of mRNA therapeutics: method development and validation challenges." Bioanalysis 11.21 (2019): 2003-2010.[6] Moderna 2022 Science Day presentation.[7] Wissel, Mark, et al. "Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC." Bioanalysis 14.12 (2022): 853-863. （下滑查看更多）作者：周毛天，颜欢，卢金莲，宋苗苗，刘欢（SD），邢丽丽编辑：钱卉娟设计：倪德伟，张莹莹免责声明“药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！👇👇