R-(-)-Gossypol Acetic Acid

引言：从差点倒闭的“小公司”到全球资本追捧的“小分子玩家” 如果把时间拨到今天，亚盛医药已经是一家“站在聚光灯下”的公司： 一边是在香港联交所主板挂牌，早在2019年就成为首批登陆港股的小分子创新药企之一； 一边是在2025年1月敲开纳斯达克的大门，拿下约1.26亿美元募资，成为首家“先港后美”双重上市的中国生物医药企业。 资本市场之外，2024年又与武田制药签下总金额高达13亿美元的全球合作，将核心产品耐立克的海外权益打包交给这家跨国巨头，刷新国产小分子肿瘤药的对外BD纪录。 产品线的“现实画面”同样不逊色。 第三代BCR-ABL抑制剂耐立克已在中国获批两项适应症，2023年进入国家医保目录后加速放量，2025年上半年贡献了2.17亿元销售收入，同比大增93%，一款单品就撑起了公司九成以上营收。 另一边，Bcl-2抑制剂利生妥也在2025年7月迎来首个上市许可，成为中国首个国产原研Bcl-2抑制剂、全球第二个同类产品，被普遍视作具备Best-in-class潜力的新一代重磅品种。 但如果把时间轴向回拨20多年，故事的开头却完全不是这样。亚盛医药的前身，是2003年三位海归科学家在美国创立的一家初创公司；真正改变命运的，不是某一款“一战成名”的神药，而是一款在临床中暴露出严重毒性、最终以失败收场的Bcl-2抑制剂AT-101，以及随之而来的资金链断裂、公司濒临破产。 今天被全球资本追捧的“小分子玩家”，其实起点是一场不折不扣的“失败创业”。 01亚生时代——从美国起步 时间回到2003年，亚盛医药的故事真正开始于美国宾夕法尼亚的一间小型办公室。那一年，三位在跨国药企和科研机构摸爬滚打多年的科学家——杨大俊、王少萌、郭明——决定一起创办Ascenta Therapeutics（亚生医药）。 在当时的全球创新药行业，细胞凋亡通路仍属于前沿、甚至带点冒险意味的方向，而三位创始人正是看中了“新靶点抗癌药”未来可能撬动的巨大空间，希望从Bcl-2等抗凋亡靶点切入，做出真正具有机制创新的药物。 两年后，研发需求迅速扩大，他们把眼光投向了中国。当时张江药谷刚刚起步，人才成本、实验设施与本地政策都对创新药研发更为友好。2005年，亚生医药在上海张江设立中国研发中心，中美“两地研发”由此形成雏形——这在当时的中国创新药企业中极为罕见。 这段时间里，公司最重要的押注，是一款名为AT-101的Bcl-2抑制剂。彼时全球范围内还没有成功的Bcl-2药物，AT-101被寄予厚望：如果能够安全有效地抑制Bcl-2抗凋亡通路，它有望成为细胞凋亡药物的领跑者。 然而，临床的严苛远超实验室。AT-101进入人体试验后，逐步暴露出多个严重安全性问题：肝毒性导致肝酶显著升高，血液学毒性引发血小板和中性粒细胞减少，胃肠道反应让不少患者难以耐受。随着这些问题在多个适应症的II期研究中愈发明显，试验不得不提前终止。 临床受挫本就足够打击一家公司，而更大的危机很快到来。2008—2009年，全球金融危机骤然爆发，资金链从“紧”变成“断”，亚生医药在美国的融资渠道几乎一夜冻结。核心产品AT-101的失败与突如其来的资本寒冬叠加，公司现金消耗迅速失控，账面资金枯竭，不仅美国团队难以为继，就连上海研发中心也面临被关闭的命运。 回头看，2009年几乎是亚盛医药历史上最黑暗的时刻：研发方向遭遇重大失败，全球资本环境急剧恶化，公司被迫走向破产边缘。很少有人会想到，正是这一段的挫折和打击，为后面那场更具传奇色彩的“二次创业”埋下了伏笔。 02寒冬里的裸泳 2009年，AT-101临床失败叠加金融危机使亚生医药走到崩溃边缘，美国母公司决定关闭上海研发中心、裁撤团队、就此收场。就在所有人都以为故事会以“破产”告终时，三位创始人做出了一个几乎没人愿意做、也没人敢做的决定——不回美国、不关门，他们选择以零元对价接下整个上海团队和部分管线，重新开始。这就是“亚盛医药”的起点，一家从废墟里站起来的公司。 创立后的头几年，公司唯一的目标就是“活下去”。2010年，团队从上海搬到泰州中国医药城，不是为了扩张，而是为了省下房租和实验室成本。同年初，公司账户里的现金见底，创始人主动停发工资，员工普遍领半薪，但仍有超过八成员工选择留下——他们说，“只要能继续做药，工资晚发多久都行”。 就在最艰难的阶段，转折出现了：三生制药的一笔300万美元投资落地，加上国家“重大新药创制”专项和江苏省重大创新团队的支持，硬是为公司续上了五年的存活时间。 资金危机暂缓后，团队开始反思最初失败的原因：AT-101的安全性问题暴露了早期Bcl-2抑制剂的结构缺陷，真正的挑战不是靶点对不对，而是“怎么让这类药物足够安全、能够长期使用”。 于是亚盛确立了日后十多年始终坚持的技术路线——做更安全、作用窗口更大的细胞凋亡药物，这为后来的利生妥（APG-2575）、APG-1252和APG-115埋下了技术种子。 可以说，2009–2014年的亚盛医药，是在寒冬中裸泳、在泥地里爬行，但正是这段几乎所有创新药企业都会回避的黑暗时期，塑造了亚盛此后十多年在TKI（酪氨酸激酶抑制剂）与细胞凋亡两个赛道上的坚持，也为未来“耐立克”和“利生妥”的出现打下了真正的底色。 03走出生存线 走出最艰难的生存期后，亚盛医药终于在2015年迎来了真正意义上的“第一缕曙光”。这一年，公司获得9600万元A轮融资，这是自零元接盘以来首次真正获得外部资本的认可，也让公司第一次从“活下去”转向“可以继续往前走”。 随后的两年更是步入了加速度：2016年，公司拿下5亿元B轮融资，不仅金额在当时的创新药行业里相当亮眼，也意味着亚盛的科研路线得到了更广泛的机构背书；2018年的10亿元C轮融资更将投后估值推至约40亿元，多家头部创投、产业资本密集入场，亚盛正式进入行业视野的中心。 伴随资金和团队逐步成熟，公司的技术平台和产品体系也真正成形。过去几年打下的基础，终于发展出两条清晰且互为补充的主线： 一条是TKI方向，覆盖BCR-ABL、FAK、ALK、ROS1等多个高价值靶点，也为后来耐立克（奥雷巴替尼）的出现做好铺垫。酪氨酸激酶负责细胞信号传导，被肿瘤“劫持”后能驱动无限增殖，因此抑制TK的TKI药物成为治疗CML（慢性粒细胞白血病）、NSCLC（非小细胞肺癌）、GIST（胃肠间质瘤）、RCC（肾细胞癌）等肿瘤的一线/二线标准方案。 但TKI治疗肿瘤永远绕不开一个词——耐药。从伊马替尼（一代）到达沙替尼和尼洛替尼（二代），再到波纳替尼、奥希替尼（三代），每一代TKI都是被耐药“逼出来”的新解决方案。 另一条则是围绕细胞凋亡通路的创新药，包括Bcl-2、MDM2等关键节点，最终孕育出利生妥（APG-2575）、APG-1252和APG-115等后续核心产品。肿瘤细胞为了逃避死亡，会通过Bcl-2、MDM2-p53等机制关闭“自杀程序”，因此Bcl-2抑制剂、MDM2抑制剂具有明确的抗肿瘤潜力。 2019年，亚盛走到了一个新的里程碑。10月，公司在港交所主板挂牌上市，募资约4.2亿港元，成为当时第一家在港股上市的小分子创新药企。上市不仅补足了公司冲刺后期临床所需的资金，也让亚盛真正从“早期团队”迈入“公司化、体系化研发”的阶段。 随着组织扩张和平台搭建推进，总部和研发中心最终落地苏州工业园区，一个面积147,000 平方米的现代化综合体成为新的大本营。自此，经历多年寒冬的亚盛医药终于走出生存线，站上了能够支撑更大研发雄心的平台。 04耐立克诞生与十三亿美元选择权 耐立克的故事，是亚盛医药真正走向行业中心的转折点。耐立克诞生之初瞄准的，是白血病治疗中最棘手的难题之一——第三代BCR-ABL抑制剂的“卡脖子”突变T315I。T315I突变对于既往一代、二代TKI几乎呈现全面耐药，让很多CML患者在复发后陷入无药可用的境地。也正因为如此，全球真正进入临床并跑到上市节点的三代药物极少。 耐立克一开始就不是在“红海里卷”，而是在一块临床上长期存在、却迟迟无法解决的空白地带“破门而入”。正是基于对T315I的精准设计和差异化靶点活性，这款药最终在2021年获得中国药监部门批准，成为中国首个、全球第二个获批上市的第三代BCR-ABL抑制剂，成功填补国内T315I相关CML治疗的空白。从实验室走向临床，它直接将亚盛推入了主流创新药公司的竞争格局。 真正让耐立克成为“现象级单品”的，是上市之后的商业表现。纳入国家医保后，药物可及性大幅提升，放量速度明显加快。到2025年上半年，耐立克销售收入达到2.17亿元，占公司总收入的九成以上，一款药托起了整家公司，彻底改变了亚盛的收入结构，也证明公司正式迈入“商业化驱动研发”的新阶段。 在中国市场的扩张上，信达生物成为亚盛最重要的战略伙伴。双方达成总金额2.45亿美元的合作，在耐立克的共同开发与商业化上深度绑定，并在包括Bcl-2抑制剂APG-2575在内的多个项目上展开临床协同。这个合作不仅给耐立克带来了更强的市场执行力，也为后续管线的临床推进搭建了资源基础。 如果把耐立克放回第三代BCR-ABL抑制剂的全球对比赛道，就能更清楚地看到它的差异化位置。全球最早上市的泊那替尼因严重心血管事件风险背负“黑框警告”，虽有效但安全性掣肘了其广泛使用；而另一款变构抑制剂阿思尼布则以创新机制著称，但在不同突变背景下的疗效与安全性仍在持续验证。 相比之下，耐立克在T315I等关键突变上的活性、在临床不良反应上的可控性，为它赢得了“疗效+安全性”双维度的稳健口碑。正是这样的特点，使它成为亚盛医药能够与武田签下13亿美元里程碑合作的核心产品，也成为亚盛故事里最具代表性的明星单品。 2024年，是耐立克真正走向全球的关键年份，也是亚盛医药从“国内强势产品公司”迈向“国际化创新药企业”的分界线。6月14日，亚盛与武田制药达成了一笔在业内引发强烈震动的合作交易，总金额最高可达13亿美元（约93.6亿元人民币），直接刷新了中国小分子创新药对外授权的纪录，也被市场视作亚盛发展史上最重要的里程碑之一。 这笔交易的结构可谓层层嵌套、张力十足。首先，武田先付1亿美元选择权金，以此锁定耐立克除大中华区以外的全球独家商业化权益；如果未来产品在关键节点成功推进，亚盛还将获得最高12亿美元的里程碑付款，覆盖研发、注册和商业化多个阶段。除此之外，药物上市后，亚盛仍能从全球销售中获得12%–19%不等的分成。更重要的是，武田还以7500万美元、溢价25%认购亚盛7.73%的股份，直接成为公司第二大股东——这不仅是资金支持，更是属于“站队级别”的战略背书。 交易公布后的首个交易日（6月17日），资本市场的反馈迅速而热烈。亚盛股价开盘即跳涨超过20%，全天收盘上涨约17%。市场的理解非常一致： 第一，耐立克的全球商业价值被彻底重估，从“国内强势单品”直接跃升为“具备全球竞争力的第三代BCR-ABL核心药物”； 第二，这笔交易极大缓解了亚盛此前承受的阶段性资金压力，债务到期风险明显下降，公司现金流安全边际提高； 第三，更深层的意义在于，亚盛“出海模式”的可行性得到了头部跨国药企的直接证明。武田的加入相当于是为亚盛的全球化路径盖上了一枚重量级的“认证章”。 对亚盛来说，这不仅是一场交易，更是一道真正意义上的“分水岭”：从深耕中国市场走向拥抱全球竞争，从持续投入的研发型公司转向“研发+商业化+全球合作”的新阶段，也为后续利生妥等产品的海外布局提供了清晰模板。 05从一个爆款到一个“细胞凋亡矩阵” 进入2024–2025年，亚盛医药的故事从“靠一款耐立克撑起公司”真正迈向了“细胞凋亡矩阵”的时代，而其中最具象征意义的，就是利生妥的成功上市。 这款药物的出现，某种程度上是对15年前AT-101失败的一次“技术复仇”。 AT-101当年因为肝毒性与血液学毒性倒在了II期，而亚盛团队在重启创业后，始终没有放弃对Bcl-2靶点的执念。他们在结构优化、选择性调控、给药窗口等方面做了系统性的升级，让利生妥在保留强抑制能力的同时，显著改善了安全性。 这也是为什么，当它在2025年获批上市时，不仅成为中国首个国产原研Bcl-2抑制剂、还成为全球仅次于Venetoclax的第二款Bcl-2产品，更被临床与产业界普遍认为具有Best-in-class的潜力——一次真正意义上的“从失败中走出的反杀”。 而利生妥只是亚盛“细胞凋亡矩阵”的第一块拼图。随着商业化基础逐渐稳固，亚盛的多管线系统也快速成型。 从拥有9项FDA孤儿药资格、叠加儿童罕见病与快速通道认证的MDM2-p53抑制剂APG-115；到国内首个进入临床的FAK抑制剂、同时覆盖ALK/ROS1的APG-2449；再到具备First-in-class或Best-in-class潜力的EED抑制剂APG-5918以及Bcl-2/Bcl-xL双靶点抑制剂APG-1252…… 亚盛逐渐从“有明星产品”变成“有明星产品、也有明星管线”的公司。 截至2025 年，公司已累计获得478项授权专利，其中342项来自海外；4个核心在研产品获得合计16项FDA孤儿药资格与1项欧盟孤儿药资格，并收获2项FDA快速通道与2项儿童罕见病资格。更重要的是，这条覆盖Bcl-2、MDM2、EED、Bcl-xL、FAK等靶点的组合，构成了业内公认“全球最全的细胞凋亡靶点药物管线”的雏形，也意味着亚盛从一家“有爆品的公司”，真正成长为一家“有体系的公司”。 06双重上市 走过耐立克爆发式增长与13亿美元BD的关键节点后，亚盛医药在2024–2025年正式迈入“站上全球舞台”的阶段，而这一幕的标志性事件，正是双重上市的完成与国际合作网络的全面铺开。 2024年6月，公司向美国SEC提交F-1文件，启动美股上市进程；不到半年后，2025年1月24日，亚盛医药成功登陆纳斯达克，募资约1.26亿美元，正式成为全球第一家“先港股再美股”的中国生物医药企业。港股+纳斯达克的双资本平台，意味着亚盛不仅被国内投资者验证，也被全球资本市场重新定价，真正从“区域性创新药公司”走向“全球创新药资产”。 商业化的成熟也在反哺公司进入新的增长曲线。2025年上半年，公司实现2.34亿元收入，其中耐立克收入同比增长93%至2.17亿元，现金储备超过30亿元。这让亚盛第一次具备了“研发靠产品输血、商业靠研发驱动”的双轮结构——从早期的纯研发公司，演进为可以持续进行全球布局、具备自我增长能力的创新药企业。 这一时期，亚盛的“朋友圈”也变得前所未有地国际化：跨国药企中有武田、默沙东、阿斯利康、辉瑞；中国创新药梯队里有信达；学术端则联合了梅奥医学中心、丹娜法伯癌症研究院、美国国家癌症研究所（NCI）、密歇根大学等全球顶尖机构。几乎所有合作都围绕着细胞凋亡的主线展开，让亚盛的研发从“公司内部的创新”升级为“全球体系内的创新”。 临床上，亚盛已经在中国、美国、澳大利亚、欧洲多地同步推进40余项临床试验，并拥有一支约700人国际化团队，覆盖研发、医学、临床运营、质量与监管、商业化等全链条环节。站在这一节点，亚盛医药第一次具备了真正意义上的全球运营能力，也迈向了比“单个产品成功”更高维度的发展路径。 尾声：亚盛的下一幕 把故事讲完整之后，投资者真正关心的问题才刚刚开始浮现。未来几年，亚盛的价值主线可能集中在四个方向： 第一，耐立克的真实渗透速度——中国市场能走多快？武田推动下的全球市场能走多远？ 第二，利生妥能否在CLL/SLL（慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤）等适应症中实现差异化放量，并在全球范围真正具备Best-in-class的竞争力。 第三，APG-115、APG-1252、APG-2449和APG-5918等后续管线是否具备复制“耐立克+利生妥”组合的潜力，让亚盛从“双品驱动”迈向“多矩阵驱动”。 最后，双重上市后，资本开支、临床投入与商业化收入之间的平衡如何把握，也将成为决定公司能否持续加速的关键变量。 对一家曾经在“寒冬中裸泳”、却一步步走到全球细胞凋亡舞台中央的公司而言，接下来要如何在更加拥挤、更加内卷、也更加竞争激烈的全球创新药赛道上继续讲好它的“下一故事”？ 让我们拭目以待。 - END - 本文所提及的任何资讯和信息，仅为作者个人观点表达或对于具体事件的陈述，不构成推荐及投资建议。投资者应自行承担据此进行投资所产生的风险及后果。

三阴性乳腺癌（TNBC）作为最致命的乳腺癌亚型，靶向治疗匮乏，紫杉醇耐药是治疗关键瓶颈，关联不良预后，现有疗法难以突破这一困境。匹伐他汀（Pitavastatin，PITA）已获批用于治疗高脂血症，以往研究发现PITA 对多种癌症中癌细胞增殖、凋亡及肿瘤生长有显著影响，但其发挥抗癌作用的具体机制尚未完全阐明。 近期，韩国大学团队借助TNBC患者来源肿瘤类器官（PDTOs），首次揭示了PITA是抗凋亡蛋白髓系细胞白血病1（Mcl-1）的直接抑制剂，明确其可通过靶向Mcl-1、抑制癌症干细胞（CSC）来作用于三阴性乳腺癌（TNBC）的细胞异质性；更直击临床痛点，证实PITA可阻断肿瘤细胞转移、逆转紫杉醇耐药。传统二维细胞培养无法模拟肿瘤微环境和肿瘤异质性，动物模型难以匹配人类遗传背景，而PDTOs的出现为解决这些难题提供了方案，该研究验证了PDTOs在精准模拟肿瘤、加速药物筛选中的价值，为TNBC研究与治疗提供新范式。该成果于2025年10月发表在《Experimental Hematology & Oncology》（IF 13.5）上。 01 研究亮点 Research Highlights 1. 首次证实匹伐他汀（PITA）为Mcl-1直接抑制剂，明确其抗TNBC新机制：PITA可通过多重化学键结合Mcl-1，还能促进Mcl-1泛素化降解，诱导线粒体功能障碍及胱天蛋白酶介导的凋亡，为TNBC治疗提供新靶点与机制。 2. 以TNBC类器官（PDTOs）为核心模型验证PITA临床转化潜力：构建PDTOs模拟体内肿瘤微环境与异质性，结果显示PITA可剂量依赖性抑制PDTOs生长，与紫杉醇联用呈强协同效应，解决传统细胞系局限，为其转化提供关键体外证据。 3. 突破紫杉醇耐药瓶颈，多维度抑TNBC耐药与转移：PITA可下调P-糖蛋白（P-gp）、清除CSCs、抑制STAT3/AKT通路；在耐药细胞及动物模型中，显著降低细胞活力、减少肺转移结节，为耐药TNBC治疗提供新策略。 4. 兼顾疗效与安全性，成为药物重定位理想候选：PITA作为获批降血脂药，安全性经临床验证；动物实验中，其具有抑制瘤生长且不影响体重、不损肝肾功能，在紫杉醇耐药TNBC模型中疗效优于Mcl-1抑制剂S63845和AT101，具备“安全可及、疗效明确”，加速了临床转化进程。 02 研究结果 Research results 1. 匹伐他汀（PITA）直接抑制Mcl-1 Mcl-1在TNBC中的表达与预后关联 GENT2公共数据集分析显示，Mcl-1的mRNA表达存在乳腺癌亚型差异：雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体2（HER2）均阳性的乳腺癌中Mcl-1表达较低，TNBC患者中Mcl-1表达最高（图1A、B），体现其在TNBC中的特异性高表达。Kaplan-Meier生存分析表明，Mcl-1高表达与乳腺癌患者预后不良相关（图1C、D）：所有乳腺癌人群中，Mcl-1高表达组总生存期短于低表达组；TNBC亚组中，Mcl-1高表达组虽未达统计显著阈值，但仍呈预后较差趋势，提示Mcl-1或为TNBC进展关键调控因子。 PITA对TNBC细胞的细胞毒性作用 PITA为他汀类药物，核心喹啉环及含庚烯酸、氟苯基、环丙基的侧链结构，有助于提升药代动力学性能（图1E）。MTS法检测显示，PITA能以剂量和时间依赖方式显著降低人、小鼠TNBC细胞系活力（图1F）。 PITA与Mcl-1的分子相互作用验证 分子对接模拟显示，PITA可精准结合Mcl-1的BH3结合凹槽（图1G-H），通过多重分子间作用力稳定结合（图1I）。表面等离子体共振（SPR）分析（图1J）证实，PITA与Mcl-1结合亲和力随PITA浓度增加呈剂量依赖性升高，且亲和力高于已知Mcl-1抑制剂AT101。 图1. 匹伐他汀（PITA）直接靶向髓系细胞白血病1（Mcl-1）。A. 利用公开可用的GENT2数据库数据，比较ER/PR/HER2阳性与阴性乳腺癌肿瘤组织样本中Mcl-1的mRNA表达水平。B. 分析不同亚型乳腺癌患者中Mcl-1的mRNA表达水平。C、D. 利用GENT2和TCGA数据库队列，绘制Mcl-1 mRNA高表达与低表达的所有乳腺癌患者 [C 图] 和TNBC患者 [D 图] 的Kaplan-Meier总生存曲线。E. PITA的化学结构。F. 用不同浓度的 PITA或对照溶剂（DMSO）处理BT549细胞和4T1细胞48小时和72小时，通过MTS法检测细胞活力并计算半数抑制浓度（IC₅₀）。G-I. PITA与Mcl-1（PDB：5FC4）的计算机分子对接分析：G. Mcl-1活性结合腔的亲脂 / 亲水特性表面图（红色：疏水，蓝色：亲水），PITA以棒状模型（紫色）显示；H. PITA（粉色棒状模型）在Mcl-1的B细胞淋巴瘤2同源（BH）结构域（蓝色丝带模型）中的结合构象；I. PITA 与Mcl-1分子间相互作用的二维图谱分析，结合口袋内的关键氨基酸残基以球棍模型展示，氢键（<5.0 Å）用绿色虚线表示。J. PITA与Mcl-1相互作用的表面等离子体共振（SPR）结合曲线，计算得出PITA与Mcl-1蛋白的动态相互作用（平衡解离常数，K_D）为3.91 µM。K. 用5 µMPITA 处理BT549细胞48小时后，对Mcl-1（绿色）、Tom 20（红色，线粒体标志物）及DAPI（蓝色，细胞核标志物）进行免疫荧光分析，使用卡尔・蔡司软件中的直方图工具分析荧光强度，白色虚线表示100个强度单位，y 轴为0-250单位的范围刻度。L. 不同浓度 PITA（0-5 µM）处理BT549细胞48小时后，对Mcl-1、cleaved-Bak、caspase-9及cleaved-caspase-9表达的影响，右侧定量图表显示蛋白相对含量。 2. 线粒体功能障碍与PITA诱导TNBC细胞凋亡 PITA对TNBC细胞周期与凋亡表型的影响 流式细胞术检测显示，PITA以剂量依赖方式显著增加TNBC细胞凋亡特征性的Sub-G1期比例（图2A-B），证实其可诱导细胞凋亡。Annexin V/PI双染色法显示，PITA处理后早期、晚期凋亡细胞比例均上升，总凋亡率随浓度升高而增加，且早期凋亡细胞占比更高，提示其主要启动早期凋亡通路（图2C-D）。 PITA激活caspase级联反应与PARP切割 Western blot检测发现，PITA处理后细胞中caspase家族关键成员的活性形式（切割型）表达量呈剂量依赖性升高（图2E、F）；同时cleaved-PARP表达量显著增加，表明PITA通过激活caspase级联反应触发凋亡程序。 PITA诱导TNBC细胞线粒体功能异常 荧光探针检测显示，PITA以剂量依赖方式增加BT549细胞总ROS水平（图 2G）；线粒体特异性ROS探针共聚焦成像证实，ROS主要来源于线粒体（图2H）。双重免疫细胞化学染色显示，PITA处理后细胞色素c从线粒体释放至细胞质（图2J）；JC-1染色显示线粒体膜电位丧失，且Bak蛋白在线粒体外膜积累，提示线粒体功能受损（图 2I）。 PITA导致TNBC细胞ATP含量耗竭 检测发现，PITA处理后BT549细胞ATP含量显著下降，且随浓度增加而降低（图2K），证实其通过破坏线粒体功能影响能量代谢，协同促进细胞凋亡。 图2. 线粒体功能障碍与匹伐他汀（PITA）诱导的细胞凋亡相关。A、B. 用不同浓度PITA（0-5 µM）处理BT549细胞（A 图）和4T1细胞（B 图）48小时后，分析 Sub-G1 期细胞比例（A 图）。C-D. 通过膜联蛋白 V / 碘化丙啶（Annexin V/PI）染色法，鉴定有无 PITA 处理时的早期和晚期凋亡细胞。E、F. 用不同浓度 PITA（0-5 µM）处理 BT549 细胞（E 图）和4T1 细胞（F 图）48小时后，分析其对PARP、cleaved-PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-7及cleaved caspase-8）表达的影响；定量图表显示上述蛋白的含量比值。G、H. 用不同浓度PITA（0-5 µM）处理BT549细胞3小时：通过二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCF-DA）染色检测细胞内活性氧（ROS）生成（G 图），通过二氢乙锭（DHE）染色检测线粒体 ROS 生成（H 图）。I. 用不同浓度PITA（0-5 µM）处理BT549细胞48小时后，通过JC-1检测法评估细胞线粒体膜电位（MMP，ΔΨm）。J. 用 5 µM PITA处理BT549细胞24小时后，对细胞色素c（Cyto C，绿色）和Tom 20（红色，线粒体标志物）进行免疫染色，同时用DAPI（蓝色，细胞核标志物）染色；采用强度分析工具对细胞色素c的信号强度（绿色曲线）及其亚细胞定位（黄色箭头标注）进行分析。K. 用不同浓度PITA（0-5 µM）处理BT549细胞48小时后，分析细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平的变化。 3. Mcl-1在CSC样亚群中上调且PITA可有效清除该细胞群 临床样本层面：Mcl-1与CSC标志物及预后相关 CSCs以高ALDH1活性、CD44高表达/CD24低表达为特征，是肿瘤发生、侵袭和转移的关键驱动因素。公共数据集分析TNBC患者发现，Mcl-1与ALDH1A1 mRNA显著正相关（图3A）。Kaplan-Meier分析显示：Mcl-1与ALDH1A1均高表达的乳腺癌患者，总生存期比二者低表达患者更差；Mcl-1高表达且CD44 高表达/CD24低表达的患者，总生存期显著更低。（图3B-D）。 细胞层面验证：ALDH1+CSC样亚群Mcl-1上调 从具有自我更新能力的4T1乳腺球中分离出ALDH1阳性细胞，检测Mcl-1的表达水平。（图3E）：免疫荧光证实 ALDH1+细胞（即CSCs特征细胞）Mcl-1表达显著升高，证实 Mcl-1在CSC样细胞中特异性上调（图3F）。 PITA对CSC样特性的抑制效应 PITA处理48小时后，CSC标志物阳性细胞显著减少（图3G），PIT处理可显著抑制ALDH1活性与球状体形成（图3H-I），还使4T1球状体中Mcl-1、CSC标志物及多能因子剂量依赖性下降，且caspase-3、PARP切割水平升高，PITA有效靶向CSC并诱导凋亡（图3J）。 图3. 匹伐他汀（PITA）破坏癌症干细胞（CSC）特征。A. 乳腺癌患者中Mcl-1与ALDH1A1的mRNA表达相关性。B-D. 基于Mcl-1与ALDH1A1、CD44或CD24的mRNA表达水平绘制的Kaplan-Meier总生存曲线：B. Mcl-1与ALDH1A1的mRNA 表达水平组合；C. Mcl-1与CD44的mRNA表达水平组合；D. Mcl-1与CD24的mRNA表达水平组合。E-F. 从分散的4T1细胞球状体中分选ALDH1阳性（+）和ALDH1阴性（-）细胞，分别对ALDH1（E 图，绿色）和Mcl-1（F 图，绿色）进行免疫染色，同时用DAPI（蓝色，标记细胞核）和Tom 20（红色，标记线粒体）染色。G-J. PITA对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中CSC样特性的影响：G. 用不同浓度PITA（0-5 µM）处理BT549细胞和4T1细胞48小时，通过流式细胞术检测CD44高表达/CD24低表达（BT549细胞）和CD49f高表达/CD24高表达（4T1细胞）细胞亚群比例，定量图表显示各亚群百分比；H. 用不同浓度PIT处理BT549细胞球状体和4T1细胞球状体3天，检测醛脱氢酶阳性（Aldefluor-positive）细胞比例，定量图表显示阳性细胞占比（贴壁细胞（Ad.）vs 球状体（Mammo.）；I. 将BT549细胞和4T1细胞在无血清悬浮条件下培养2天，随后用10 µM PITA或对照溶剂处理3天，通过光学显微镜定量细胞球状体的数量和体积；J. 用不同浓度PIT处理4T1细胞球状体3天，检测Mcl-1、ALDH1A1、CD49f、Nanog、Oct4和Sox2的表达变化。 4. PITA抑制TNBC类器官及CSC富集异种移植瘤生长 体外层面：PITA剂量依赖性抑制TNBC患者来源肿瘤类器官（PDTOs）生长 将TNBC患者来源肿瘤类器官（PDTOs）培养于模拟肿瘤微环境的培养基中，经PITA处理后连续监测15天（图4A）。结果显示，PITA处理组类器官体积呈剂量依赖性显著减小（图4B）；实验终点用CellTiter-Glo 3D法检测，类器官细胞活力显著降低，与体积减小趋势一致（图4C），证实PITA体外可有效抑制TNBC类器官生长。 体内层面：PITA抑制CSC富集异种移植瘤生长且安全性良好 PITA显著抑瘤且无明显毒性 构建致瘤性、转移性CSC接种异种移植模型（图4D），肿瘤体积达约50mm³时给予PITA或对照溶剂处理。25天观察期内，PITA显著抑制肿瘤生长（图4E）、降低肿瘤负荷（图 4F），且对小鼠平均体重无显著影响（图4G）；检测小鼠血清肝功能、肾功能指标，均无显著变化（图4H），表明PITA抑瘤同时安全性良好。 PITA降低增殖、促进凋亡 PITA抑瘤伴随Ki-67指数（细胞增殖标志物）显著降低（图4I），肿瘤组织凋亡水平显著升高（图4J），补充实验显示凋亡关键分子caspase-3 切割表达量显著增加，证实PITA通过抑增殖、促凋亡发挥作用。 PITA抑制肿瘤血管生成 CSC接种异种移植瘤小鼠血清VEGF水平（促血管生成因子）较健康小鼠显著升高，PITA处理可显著降低；且PITA处理后肿瘤内、肿瘤周围区域CD31阳性微血管数量均显著减少（图4K、L），表明其通过抑血管生成进一步抑瘤。 图4. 匹伐他汀（PITA）抑制4T1细胞球状体来源异体移植肿瘤的生长。A-C. PITA对三阴性乳腺癌（TNBC）类器官生长的影响：A. 用5 µM PITA处理后，第1天至第15天TNBC类器官生长情况的代表性图像；B. 用光学显微镜测量并定量经不同浓度PITA处理15天后TNBC类器官的体积；C. 采用CellTiter-Glo 3D检测法评估类器官的细胞活力。D-H. PITA在体内对肿瘤生长的影响；D. 将从4T1细胞球状体中分离得到的1×10⁵个细胞，原位注射到BALB/c雌性小鼠的第4对乳腺脂肪垫中；给小鼠分别施用PITA（5 mg/kg，隔日一次）或对照溶剂，持续31 天（每组n=5），随后评估肿瘤生长情况（E图）、肿瘤重量（F 图）和小鼠体重（G图）；H. PITA对肝损伤和肾损伤相关血清生化指标的影响：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和血尿素氮（BUN）水平均无显著变化。I-J. PITA在体内对Ki-67表达及细胞凋亡的影响：对肿瘤组织切片进行Ki-67（I图，红色）和DAPI（蓝色，标记细胞核）免疫染色，并对Ki-67阳性细胞百分比进行定量；通过TUNEL检测法测定PITA诱导异体移植肿瘤发生凋亡的情况（J图）。K-L. PITA对肿瘤血管生成的影响：对肿瘤组织进行CD31（红色，标记血管内皮细胞）和DAPI（蓝色）免疫染色，分别定量肿瘤内区域（K 图）和肿瘤周围区域（L 图）的微血管密度（MVD）。 5. PITA抑制TNBC原发灶转移 PITA在体内下调移植瘤中Mcl-1表达 分子对接模拟与SPR分析已证实PITA是Mcl-1抑制剂，体内研究进一步显示，PITA处理后异种移植瘤中Mcl-1表达水平显著下调（图5A），为其抑制转移效应奠定分子基础。 PITA在体内下调移植瘤中CSC标志物表达 体外研究表明PITA可靶向CSC特征，体内免疫组化分析验证：PITA处理的小鼠异种移植瘤中，乳腺干细胞标志物ALDH1A1、CD44及CD49f表达均极显著下调（图5B-D），证实其在体内可有效抑制作为肿瘤转移关键驱动因素的CSC特性。 PITA剂量依赖性抑制TNBC细胞迁移 动力学分析显示，PITA处理后BT549细胞和4T1细胞的迁移能力均呈剂量依赖性显著降低（图5E-F），从转移关键环节阻断进程。 PITA在体内减少TNBC肺转移 CSC富集异种移植模型中，生物发光成像显示PITA组小鼠肺部发光强度显著降低（图5G）；H&E染色证实其肺部转移结节数量显著减少（图5H），直接佐证PITA可阻断TNBC肺转移。 PITA下调转移相关蛋白表达 异种移植瘤中，PITA显著下调促转移的p-STAT3和EMT相关vimentin表达（图5I）；且能降低转移对照组小鼠血清中MMP-2、MMP-9水平（图5J-K），从蛋白层面佐证抗转移效应。 图5. 匹伐他汀（PITA）抑制三阴性乳腺癌（TNBC）转移。A- D. 对异体移植肿瘤中的Mcl-1（A 图）、ALDH1A1（B图）、CD44（C 图）和CD49f（D 图）进行免疫组织化学分析，并对荧光强度进行定量。E、F. PITA对细胞迁移的影响：用不同浓度PITA分别处理4T1细胞（E 图）和BT549细胞（F 图）后，对细胞迁移进行动力学分析；定量图表分别显示30小时和48小时时的相对伤口密度（右）。G. PITA在体内对远处转移的影响：对照组（CTL 组）和PITA处理组转移情况的代表性生物发光成像（BLI）结果。H. 对照组和PITA处理组小鼠肺组织的H&E染色结果：黄色虚线区域标注转移灶，并对转移灶面积进行定量。I. 对异体移植肿瘤中vimentin的免疫组织化学分析。J- K. PITA在体内对血清中MMP-2 和 MMP-9 水平的影响：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测对照组和PITA处理组小鼠血清中的MMP-2（J 图）和MMP-9（K 图）水平。 6. PITA克服TNBC紫杉醇耐药性 成功构建紫杉醇耐药4T1细胞系（PacR-4T1） 以4T1细胞为亲本，从紫杉醇逐步递增浓度，交替用含药与新鲜培养基培养6个月，获可在1μM紫杉醇下存活增殖的PacR-4T1细胞系。MTS细胞增殖检测显示，其紫杉醇耐药性（ IC₅₀）为亲本细胞的48 倍（图 6B）；1μM紫杉醇处理12小时后，亲本4T1细胞G2/M 期比例升至82.1%，而PacR-4T1细胞仅增至31.2%（图 6C），且G2/M期标志物p-His H3 在亲本细胞中显著升高（图6D），佐证耐药细胞逃逸周期阻滞。 解析PacR-4T1细胞耐药分子机制 明确核心耐药机制：P-gp在PacR-4T1 细胞膜过表达，且随耐药浓度升高表达递增（图 6E、G）；JAK2/STAT3通路激活，磷酸化JAK2、STAT3上调，伴随CSC 标志物及vimentin表达升高（图6G）；Mcl-1表达显著上调，且耐药浓度越高表达越强（图6F-G），GEO数据集证实紫杉醇耐药患者MCL1转录本水平更高，具临床相关性。 PITA对PacR-4T1细胞的抗耐药效应 MTS法显示，PITA以剂量依赖方式降低亲本与耐药细胞活力，二者无差异（图6H）；其IC₅₀在多细胞系中均低于S63845、AT101。分子对接模拟显示，PITA与Mcl-1结合亲和力略高于S63845，显著高于AT101，相互作用能达-39.8kcal/mol。 PITA克服耐药的分子机制 Western blot证实：PITA下调耐药与抗凋亡分MDR1、Mcl-1、Bcl-2表达，抑制AKT/STAT3通路激活（图6I-L）；降低STAT3靶基因survivin、cyclin D1表达（图6I-J）；激活caspase-3、-7、-9，增强PARP切割（图6M），并降低vimentin表达、抑制迁移，诱导凋亡并阻断扩散。 图6. 匹伐他汀（PITA）对紫杉醇耐药三阴性乳腺癌（TNBC）细胞发挥强效抗增殖作用。A. 紫杉醇耐药4T1细胞（PacR-4T1 细胞）的构建：通过6个月逐步提高紫杉醇浓度的诱导方式，建立对紫杉醇耐药的4T1细胞系。B- G. 4T1细胞获得性紫杉醇耐药特征的鉴定：B. 将亲本4T1细胞与PacR-4T1细胞用不同浓度的紫杉醇处理48小时，采用MTS法检测细胞活力并计算半数抑制浓度（IC₅₀）。C. 用1 μM紫杉醇处理亲本4T1细胞与PacR-4T1细胞12小时后，分析两者的细胞周期分布。D. 用1 μM紫杉醇处理亲本4T1细胞与PacR-4T1细胞12小时后，p-His H3（绿色）、F-actin（红色）及DAPI（蓝色）进行免疫荧光分析。E、F. 对亲本4T1细胞与PacR-4T1细胞中的P-gp（E图）和Mcl-1（F图）进行免疫细胞化学分析。G. 检测亲本4T1细胞与PacR-4T1细胞中P-gp、Mcl-1、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、AKT及p-AKT的表达变化。H. 用不同浓度的PITA（0.1–40 μM）处理亲本4T1细胞与PacR-4T1细胞48小时，采用MTS法检测细胞活力并计算 IC₅₀。I. 用不同浓度的匹伐他汀（0–10 μM）处理PacR-4T1细胞48小时，检测其对P-gp、Mcl-1、Bcl-2、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、survivin、AKT 及p-AKT表达的影响。J. 定量图表显示上述蛋白的相对含量。K、L. 用10 μM匹伐他汀处理PacR-4T1细胞24小时后，对细胞中的P-gp（K 图）和Mcl-1（L 图）进行免疫荧光分析。M. 用不同浓度的匹伐他汀（0–10 μM）处理PacR-4T1细胞48小时，检测其对PARP、切割型 PARP、caspase-3、caspase-7、caspase-9及caspase-9表达的影响。 7. PITA抑制紫杉醇耐药TNBC转移集落形成 PITA抑制紫杉醇耐药细胞（PacR-4T1）的CSC特性 PacR-4T1细胞球状体富集CSC样亚群。对比贴壁培养与3D悬浮培养的PacR-4T1细胞，球状体中的CSC特征显著增强： ALDH1阳性细胞比例超90%，CSC标志物表达也显著上调（图7A-B）。紫杉醇对球状体数量影响极小，却显著增加其体积（图7D），提示紫杉醇可能进一步富集CSC样亚群。 PITA破坏耐药细胞球状体形成并清除CSCs。PITA处理使PacR-4T1细胞球状体数量和体积均呈剂量依赖性显著减少（图7C）。极限稀释实验显示，PITA处理后CSC频率下降（图7E）；PacR-4T1细胞经PITA处理后CSC频率显著下降，5μM PITA处理后CSCs被完全清除（图7F），证实PITA对耐药细胞 CSCs 清除效果更显著。 PITA在体内抑制紫杉醇耐药CSCs的肺定植与转移 构建PacR-4T1细胞球状体静脉注射转移模型，PITA处理组小鼠肺部生物发光强度显著低于对照组，紫杉醇处理组转移反而增加（图7G）。H&E 染色显示，PITA组肺部转移结节显著减少，紫杉醇组则广泛肺定植（图7H）。安全性评估显示，PITA组小鼠肝肾功能指标无异常，紫杉醇组ALT、AST升高，凸显PITA安全优势。 PITA与紫杉醇联合使用对TNBC类器官呈协同抑制效应 TNBC类器官模型中，在7天的实验期间，紫杉醇（5nM）单独处理对肿瘤类器官体积影响极小，PITA（5μM）单独处理则可有效抑制类器官生长，而PITA与紫杉醇联合处理显著缩小肿瘤类器官体积（图7I-J）。联合组细胞活力显著低于单独处理组，联合指数（CI）在不同效应分数（Fa）下均< 1（图7K），证实二者呈强协同效应。 图7. 匹伐他汀（PITA）抑制紫杉醇耐药三阴性乳腺癌（TNBC）细胞的转移潜能。A. 将紫杉醇耐药4T1细胞（PacR-4T1细胞）以 3×10⁵个 / 毫升的密度，分别在常规培养基或无血清悬浮培养基中培养 5天，通过流式细胞术检测Aldefluor-positive细胞比例。B. 检测紫杉醇耐药4T1细胞球状体中CD49f和CD44蛋白的表达变化。C-D. 对比紫杉醇耐药4T1细胞在暴露于不同浓度匹伐他汀（C）或紫杉醇（D）5天后的球状体形成能力。E-F. 对亲本4T1细胞（E）和紫杉醇耐药4T1细胞（F）进行极限稀释实验：将不同接种密度的细胞培养8天以形成球状体，通过极限稀释分析（ELDA）图谱计算癌症干细胞（CSC）频率。G-H. 体内实验检测匹伐他汀对紫杉醇耐药4T1细胞肺定植能力的影响：将1×10⁵个来自紫杉醇耐药 4T1 细胞球状体的细胞接种到雌性 BALB/c 小鼠尾静脉，随后立即静脉注射匹伐他汀、紫杉醇或对照溶剂。G. 对照组、匹伐他汀处理组和紫杉醇处理组小鼠肺转移的代表性生物发光成像（BLI）结果；H. 肺组织H&E染色结果，红色虚线区域标记肺内转移灶，对转移结节数量进行定量分析。I-K. 匹伐他汀与紫杉醇联合处理对TNBC类器官生长抑制的协同效应：I. 分别用匹伐他汀、紫杉醇或两者联合处理后，第1天和第7天TNBC类器官生长的代表性图像；J. 用CellTiter-Glo 3D检测法，在匹伐他汀和 / 或紫杉醇处理7天后，于第1天和第7天评估类器官生长速率；K. 计算联合指数（CI）以评估不同剂量组合的匹伐他汀与紫杉醇在TNBC类器官中的药物协同作用。使用 CompuSyn 软件生成CI值以量化药物相互作用：CI<1表示协同作用，CI=1表示相加作用，CI>1表示拮抗作用。 8. 假设模型总结 匹伐他汀为TNBC提供了一种新型治疗选择（图8）：该药物可与Mcl-1蛋白内的BH3结合槽结合，诱导线粒体功能障碍，进而导致ROS生成增加和细胞色素c释放，最终触发胱天蛋白酶介导的细胞凋亡。此外，匹伐他汀还可通过抑制P-gp并调控信号转导与STAT3/AKT信号通路，逆转紫杉醇耐药性。通过靶向癌症干细胞样细胞，匹伐他汀能够抑制TNBC肿瘤生长并阻止其转移扩散。 图8 匹伐他汀对紫杉醇耐药性及三阴性乳腺癌作用的假设模型。 03 研究意义 Research Significance 该研究从机制层面填补了PITA抗癌作用的关键空白，首次明确PITA为Mcl-1直接抑制剂，明晰 “Mcl-1抑制-线粒体损伤-细胞凋亡” 核心通路；同时揭示PITA可靶向CSCs，逆转紫杉醇耐药，为 “老药新用” 抗TNBC提供清晰机制支撑，推动Mcl-1靶向治疗临床转化。 此外，研究体现了患者来源肿瘤类器官（PDTOs）在肿瘤研究中具有不可替代的重要性。其核心价值在于能高度模拟体内肿瘤的三维结构、微环境特征及细胞异质性。在肿瘤机制研究中，PDTOs可精准还原肿瘤细胞（包括癌症干细胞）的生长特性、耐药表型及分子表达模式，为解析肿瘤发生发展、耐药与转移机制提供更贴近临床真实场景的实验体系；在药物研发与筛选领域，PDTOs能基于患者个体肿瘤特征开展 “个体化”药物测试，快速评估候选药物的疗效与安全性，助力筛选出更具临床转化潜力的治疗方案，为制定精准联合治疗策略提供关键依据；此外，PDTOs还能缩短从基础研究到临床应用的转化周期，减少对动物模型的依赖，在提升研究效率的同时，为推动肿瘤精准医学发展奠定重要技术基础。 扫描二维码可下载原文 大橡科技类器官模型，为老药新用评估赋能精准支撑 客户文章解读｜一年卖出百亿片的“延寿神药”二甲双胍的抗病毒新机制 客户文章解读系列｜肝癌类器官解析传统中药抗原发性肝癌机制 珍芯严®全场景解决方案 你有思路，我来想！你出方案，我来做！ 以专业眼光洞察数据，让决策更加清晰！ 珍芯严®面向药企药物早期研发与高校、医院的基础科研，我们倾力打造类器官芯片全场景解决方案。凭借创新的类器官芯片技术，打破传统细胞与动物研究瓶颈，高效产出优质数据，从实验室到临床，我们与您并肩作战！ 客服电话/微信:18610798010 扫描二维码可联系我们 小红书 设计: Summer、Rebecca｜封面: Rebecca