Lovastatin

科学在此走向了它自己的现象学时刻。 Cell Painting：原理、方法与应用 摘要 本报告旨在全面、深入地剖析Cell Painting（细胞涂装）这一新兴的细胞表型分析技术。Cell Painting是一种基于图像的高内涵、高通量分析方法，其核心思想是通过一套标准化的荧光染料组合，对细胞内的多个关键细胞器进行同步标记与成像，从而捕获数千个形态学特征，为每个细胞或细胞群体生成一个高维度的“形态学指纹”或“画像”。该技术最显著的特点是其“无偏倚”（unbiased）和“非抗体依赖”的特性，使其能够以一种探索性的、不预设假说的方式，系统性地评估细胞在受到遗传、化学或环境扰动后的状态变化。 本报告将从以下几个维度展开：首先，详细阐述Cell Painting技术背后的核心原理与独特的思维范式，揭示其如何从根本上改变了我们观察和理解细胞状态的方式。其次，通过与两种主流的细胞荧光显微成像技术——传统的免疫荧光（Immunofluorescence, IF）技术和基因编码荧光探针技术——进行多维度、深层次的比较，凸显Cell Painting在标记原理、信息维度、实验通量、数据解读及成本效益等方面的独特优势与差异。报告还将重点关注该技术的最新进展，特别是从传统的固定细胞成像向动态活细胞成像（Live Cell Painting, LCP）的演进，探讨其在染料选择、细胞活力维持和成像动力学方面的革新。在此基础上，本报告将系统梳理Cell Painting在药物发现、基因功能注释、疾病建模和毒理学评估等领域的流行应用，并结合典型案例加以说明。最后，报告将提供一份详尽的Cell Painting典型实验操作指南，涵盖从实验设计、细胞处理、染色、图像采集到数据分析的全流程，并深入探讨实验标准化与质量控制的关键参数与策略，旨在为研究人员在实验室环境中成功实施并优化此项技术提供可靠的参考。通过这份报告，我们期望能够为生命科学领域的研究者提供一个关于Cell Painting技术的全景式视图，并展望其在未来精准医学和系统生物学研究中的巨大潜力。 引言 研究背景：高内涵细胞分析的需求与挑战 进入21世纪第三个十年（我发现我这个AI是不是受了什么奇妙的污染，它最近写引言总喜欢以这个句子起手），生命科学研究已经从对单个分子或通路的线性研究，转向对复杂生命系统进行整体性、系统性的探索。细胞作为生命活动的基本单元，其状态的精准量化与深度解析，是理解健康与疾病、评估药物效用以及揭示基因功能的基石。传统的生物学研究方法，如Western Blot、qPCR或基于特定靶点的酶联免疫吸附测定（ELISA），虽然在特定分子的定量上极为精确，但它们本质上是“还原论”的，通常只能提供关于细胞状态的零散信息，难以捕捉到细胞作为一个完整系统在响应外界刺激时所发生的复杂、多维度的形态和功能变化。 荧光显微成像技术的发展极大地推动了细胞生物学的进步，它使研究者能够在亚细胞层面直观地观察生命过程。然而，传统荧光成像方法也面临着瓶颈。例如，基于抗体的免疫荧光技术虽然特异性强，但严重依赖于高质量抗体的可获得性，开发和验证抗体的周期长、成本高，且多重标记的能力有限，难以实现对细胞状态的全面描绘。此外，这些方法往往是“假设驱动”的，即研究者需要预先决定他要观察什么靶点，这种方法对发现全新生物学现象的可能性的限制正逐渐得到学术共同体的重视。科学界迫切需要一种新型的分析工具，理想地，它应具备以下特点： ·高通量（High-Throughput）：能够快速、并行地分析大量样本（如化合物库、基因敲除文库）。 ·高内涵（High-Content）：能够从单细胞层面提取丰富、多维度的定量信息，而不仅仅是单一的读数。 ·无偏倚（Unbiased）：不依赖于预先的生物学假设，能够以一种探索性的方式全面捕捉细胞的表型变化，从而发现意想不到的生物学关联。 ·标准化与可重复性：方法学稳健，易于在不同实验室间推广和复现，便于构建大规模、可共享的数据库。 Cell Painting技术概述 正是在这样的背景下，由美国博德研究所（Broad Institute）的Anne Carpenter团队开创的Cell Painting技术应运而生，为达到上述目标提供了强有力的解决方案。Cell Painting本质上是一种图像化的细胞分析策略（image-based profiling），其核心理念是将细胞视为一个信息丰富的实体，通过系统性的形态学测量来量化其生理或病理状态。 该技术通过一套精心选择的、包含六种（或更多）不同荧光染料的组合，在五个荧光通道中同时对细胞的主要细胞器或细胞组分进行染色，包括细胞核（DNA）、核仁、细胞质RNA、肌动蛋白丝、高尔基体、质膜、内质网和线粒体。随后，利用自动化高通量显微镜对大量经过处理的细胞进行成像。最后，借助专业的图像分析软件（开源的例如CellProfiler），从每张图像中的数以万计的单细胞中，自动提取多达数千个形态学特征，其中涵盖尺寸、形状、纹理、强度、相关性等多个维度。这些海量的量化特征共同构成了一个高维度的向量，即该细胞在特定扰动下的“形态学特征谱”（morphological profile）或“细胞画像”（cell portrait）。 这种非抗体依赖、无偏倚的方法，使得研究者可以系统地比较不同扰动（如小分子化合物处理、基因过表达或敲除）对细胞产生的表型影响，并在此基础上，通过比较这些“画像”的相似性来对扰动进行聚类、分类和功能注释。例如，作用机制相似的药物通常会诱导出相似的细胞画像，而功能相关的基因在被敲除后也会呈现类似的形态学改变。 Cell Painting的核心原理与思维方式 Cell Painting的创新之处完全不在于其技术细节，而是在于其背后所蕴含的科学哲学模式和研究思维的转变。它将细胞分析从“读数”时代带入了“读图”时代，从假设验证扩展到了假设生成。 “细胞画像”的哲学：从单一靶点到整体表型 传统细胞生物学研究范式通常遵循“假设-检验”的还原论线性逻辑。研究者基于现有知识提出一个关于特定基因或蛋白功能的假设，然后设计实验（如免疫荧光、基因敲除）来验证这个假设。这种方法的优点是目标明确、逻辑清晰，但其视野受限于已知的生物学信号转导和调控网络，难以发现全新的、跨通路的作用机制。 Cell Painting则引入了一种“整体论”和“探索性”的思维范式。它并不预设某个特定的分子是关键，而是认为细胞的形态是其内部所有分子网络相互作用状态的综合“输出”。细胞的形状、大小，以及其内部细胞器的结构、分布和相互关系，共同构成了一个反映其健康、应激或疾病状态的复杂图景。Cell Painting的目标就是用定量的语言来“描绘（paint）”这幅图景。 这种思维方式的转变意味着： l从“问一个具体问题”到“系统性地观察一切”：研究者不再仅仅询问“药物X是否抑制了蛋白Y的磷酸化？”，而是提出一个更开放的问题：“药物X对细胞的整体状态产生了什么影响？”。 l数据驱动的假设生成：通过对数千个扰动产生的海量形态学数据进行聚类分析，研究者可以发现意想不到的联系。例如，一个功能未知的化合物可能与已知机制的药物产生了相似的“细胞画像”，这为后续深入研究其作用机制提供了强有力的线索。这种能力被称为“表型筛选”（phenotypic screening），是Cell Painting的核心价值之一。（我是觉得不妨在此直接使用“表型组学”概念） 技术实现机制：六染料、八组分的“调色板” 为了实现对细胞状态的全面描绘，Cell Painting采用了一套经过精心优化和验证的荧光染料组合，这套组合就像画家的调色板，能够以最经济的方式勾勒出细胞的基本结构轮廓。标准的Cell Painting实验方案使用六种小分子荧光染料，它们能够特异性地结合并标记细胞内的八个关键区室。 这套经典的“调色板”包括： lHoechst 33342：一种能穿透细胞膜的DNA小沟结合染料，用于标记细胞核（DNA）。其荧光信号是细胞分割、识别和计数的基础。 lPhalloidin (鬼笔环肽) 的荧光偶联物：特异性结合于丝状肌动蛋白（F-actin），用于可视化肌动蛋白细胞骨架，它决定了细胞的形状和迁移能力。 lMitoTracker Deep Red：一种线粒体特异性染料，其积累依赖于线粒体膜电位，用于标记线粒体网络，反映细胞的能量代谢状态。 lWGA (麦胚凝集素) 的荧光偶联物：结合于质膜和高尔基体上的唾液酸和N-乙酰葡糖胺残基，从而同时勾勒出这两个结构。 lSYTO 14：一种能对RNA和DNA进行染色的核酸染料，但在Cell Painting的浓度和条件下，其信号主要反映细胞质中的核糖体和粗面内质网（富含RNA），以及核仁（rRNA合成场所），因此可以同时标记出核仁和细胞质RNA。 lConcanavalin A (刀豆蛋白A) 的荧光偶联物：结合于内质网（ER）中的甘露糖残基，用于标记内质网结构。 通过这六种染料在五个不同荧光通道的组合成像（例如，WGA和ConA通常在同一通道成像，但可通过后续分析区分），研究者可以经济高效地获得关于细胞核、细胞骨架、能量代谢、蛋白质合成与分泌通路等多个核心生命过程的综合信息。这种非抗体依赖的特性，使得该方法具有极高的普适性和可扩展性，无需为不同靶点或细胞系反复优化抗体，极大地简化了实验流程。 从图像到数据：形态学特征谱的构建 Cell Painting的精髓在于将视觉上的细胞图像转化为可供计算和分析的定量数据。原始的显微镜图像本身是复杂的、非结构化的，而形态学特征谱（morphological profile）则是对这些图像信息进行结构化、高维度量化的结果。这一转化过程是Cell Painting方法的核心技术环节，通常依赖于自动化图像分析软件，其中最著名的是由Anne Carpenter实验室开发的开源软件CellProfiler。 该过程大致分为以下几个步骤： l图像预处理（Image Preprocessing）：包括校正显微镜照明不均（flat-field correction）、减去背景噪声等，以确保图像质量和后续分析的准确性。 l对象分割（Object Segmentation）：这是最关键的一步。软件首先利用Hoechst染料标记的细胞核图像来识别和分割出单个细胞核。然后，以细胞核为“种子”，利用细胞质染料（如SYTO 14或Phalloidin）的信号向外扩展，确定每个细胞的边界（细胞质区域）。通过这种“两步法”，软件能够准确地将图像中的像素归属于单个细胞。 l特征测量（Feature Measurement）：在成功分割出细胞核、细胞质和整个细胞等区域后，CellProfiler会在这些区域内，以及在所有五个荧光通道中，进行大规模的特征测量。这些特征可以分为几大类： n尺寸与形状（Size and Shape）：如细胞/核的面积、周长、长短轴比例（伸长度）、圆度、致密度等。 n强度（Intensity）：各荧光通道在不同细胞区室（核、细胞质）的平均强度、总强度、强度分布的标准差等，反映了被标记细胞器的丰度。 n纹理（Texture）：描述像素强度在空间上的分布模式，例如平滑、粗糙、斑点状等。这通过计算灰度共生矩阵（GLCM）等方法实现，可以捕捉到细胞器精细的结构变化。 n相关性（Correlation）：不同荧光通道信号之间的空间相关性。例如，线粒体信号与内质网信号的共定位程度，可以反映细胞器之间的相互作用。 n位置（Location）：细胞器在细胞内的相对位置，如线粒体在核周的聚集程度等。 通过对每个单细胞进行上述测量，可以得到一个包含数千个特征值（通常为1,500到5,000个）的向量。这个高维向量就是该细胞的“形态学特征谱”。一个典型的96孔板实验就能产生数百万个这样的单细胞特征谱，构成了后续数据分析的基础。 “无偏倚”分析的本质 Cell Painting常被视为一种“无偏倚”（unbiased）的方法，准确理解其含义至关重要。这里的“无偏倚”并非指技术上没有任何偏差（任何实验方法都有其固有的系统误差），而是指其在生物学层面的“非假设驱动”特性。 Cell Painting的“无偏倚”体现在两个层面：在标记层面，Cell Painting不针对任何一个预设的、与特定假说相关的蛋白质。它标记的是细胞中最基本、最保守的结构框架。这意味着，无论扰动通过何种分子通路起作用，只要它最终导致了细胞结构或功能的改变，这种改变就有可能被这八个基本组分的形态变化所捕捉。这与免疫荧光形成了鲜明对比，后者必须预先猜测哪个蛋白会发生变化。在分析层面，通过一次性测量数千个特征，Cell Painting为细胞状态提供了一个全面的、高维度的快照。研究者在分析数据时，可以不带任何偏见地探索所有这些特征的变化，而不是仅仅关注一两个预期的指标。机器学习算法可以在这个高维特征空间中自动发现模式，揭示出人眼难以察觉的细微表型差异和样本间的复杂关系。 这种无偏倚的特性使得Cell Painting成为一个强大的发现引擎。它不仅能验证已知的生物学机制，更能以前所未有的广度揭示新的药物靶点、基因功能和疾病标志物，为基于活细胞功能的科学研究开辟了从“大海捞针”到“一网打尽”的新路径。 Cell Painting与其它细胞荧光显微成像方法的比较 为了更深刻地理解Cell Painting的独特性和优势，有必要将其与其它主流的细胞荧光显微成像分析方法进行系统性的比较。本节将重点对比Cell Painting与传统的免疫荧光技术（Immunofluorescence, IF）以及基于基因编码荧光探针（Genetically Encoded Fluorescent Probes, e.g., GFP）的技术。 与免疫荧光技术（Immunofluorescence, IF）的对比 免疫荧光是细胞生物学中应用最广泛的技术之一，它利用抗体与其特异性抗原（通常是蛋白质）结合的原理，通过荧光标记来可视化特定蛋白在细胞内的定位和表达水平。尽管IF在特定靶点的研究中不可或缺，但与Cell Painting相比，两者在哲学、工作流程和信息产出上存在根本差异。 从标记的原理与特异性上说，Cell Painting使用的是小分子荧光染料，这些染料通常识别并结合于某一类生物大分子或细胞器结构，而非单个特定的蛋白质。例如，Phalloidin结合所有F-actin，Hoechst结合所有DNA。这种“类别特异性”而非“分子特异性”是其能够经济、普适地勾勒细胞全貌的基础。免疫荧光则依赖于抗体与靶蛋白表位的特异性识别与结合，具有极高的“分子特异性”。这使得IF成为研究单个蛋白质定位、修饰或相互作用的重要技术手段。然而，这种特异性也带来了巨大的挑战：高质量、高特异性的抗体非常昂贵且难以获得，许多蛋白质缺乏可靠的抗体；抗体的交叉反应、批次间差异以及非特异性结合是IF实验失败和结果难以重复的主要原因。与免疫荧光技术相比，Cell Painting牺牲了对单个分子的极致特异性，换来了对细胞整体结构的普适性、稳健性和可扩展性。IF则恰恰相反，它追求极致的分子特异性，但牺牲了通量和普适性。两者在方法学上形成了完美的互补：Cell Painting用于大规模、无偏倚的筛选和探索，发现表型线索；而IF则用于对这些线索进行深入的、针对特定分子的机制验证。 而就获取信息的维度与广度而言，Cell Painting的设计初衷就是为了获取高维度的信息。通过一次实验，同步捕获8个细胞区室的数千个形态特征，生成一个综合性的“画像”。分析的重点不是单一特征，而是所有特征构成的整体模式。这种多参数的读出方式能捕捉到细胞状态的细微、复杂变化，例如细胞器间的协同变化。免疫荧光则通常是低维度的。一次典型的IF实验可能只标记1-3个目标蛋白。虽然技术上可以通过光谱解混等方法实现更多重标记，但通常不超过5-6重，且技术难度和成本急剧增加。其数据分析通常也集中在几个预设的指标上，如蛋白表达总量、阳性斑点数、共定位系数等。打个比方，Cell Painting提供的是一个“广角镜头”，旨在捕捉细胞状态的全景；而IF则是一个“长焦镜头”，聚焦于整个图像中的某个特定细节。当研究一个未知化合物的作用机制时，Cell Painting可以告诉你它如何影响了线粒体网络、内质网形态和细胞骨架重组；而免疫荧光则需要你先猜测它可能影响了哪个蛋白（如Drp1、Calreticulin或Cofilin），然后逐一进行验证。 在实验流程与通量方面，Cell Painting的实验流程已达到了很高程度的精简化和标准化。其核心是一套预混合的染料“鸡尾酒”，染色步骤简单快捷，非常适合自动化液体处理工作站进行基于384孔板甚至1536孔板的高通量操作。由于不涉及抗体，cell painting省去了抗体孵育、洗涤等繁琐且耗时的步骤。免疫荧光的实验流程相对复杂且耗时。标准的免疫荧光染色流程包括固定、透化、封闭、一抗孵育、多次洗涤、二抗孵育（如果一抗未偶联荧光基团的话）、再次多次洗涤等步骤。每一步都需要根据具体的实验条件和试剂选择进行优化，尤其是抗体浓度和孵育时间。这些繁琐的步骤限制了其通量，使其难以应用于大规模的化合物或基因筛选。Cell Painting方法开发的目的即是为了实现高通量分析和筛选。其标准化的流程和对自动化的良好兼容性，使其能够轻松整合到现代药物发现的工业化流程中。相比之下，免疫荧光染色更像是一种“手工作坊”式的精细操作，适用于小规模、精深的研究项目。 在对数据解读与假设依赖性方面，Cell Painting产生的数据是探索性的，其解读方式是“假设生成”。研究者通过比较不同扰动产生的形态学特征谱的相似性来类比推断它们在功能上的相似性。例如，将一个新药的特征谱与一个包含数千种已知药物的参照数据库（JUMP-CP联盟正在建立这种数据库，只能说好人一生平安）进行比对，可以快速预测其作用机制。免疫荧光的数据解读通常是“假设检验”。研究者带着一个明确的问题——“我的处理是否改变了蛋白X的表达量、翻译后修饰或在细胞内的定位？”——然后通过观察荧光信号的变化来回答“是”或“否”。结果的意义是直接且明确的，但其发现新知识的能力受限于最初的假设。 以上对比反映出两种技术在科学研究中所扮演的不同角色。Cell Painting是面向未知领域的技术，用于第一步的假设生成，免疫荧光则负责对生成的假设进行精确的验证。 除科学性外，在成本与可及性方面，Cell Painting的试剂耗材成本相对较低。所用的小分子染料均为商业化、价格低廉的试剂，可以大量采购和长期使用。一次染色覆盖多个细胞器，性价比极高。其主要的硬件成本在于高通量显微镜（这通常指的是高内涵成像分析设备）和数据存储/计算资源。免疫荧光的世纪成本高昂，尤其是在进行多重标记或筛选时。高质量的特异性抗体价格不菲且消耗量大。如果要筛选一个包含1000个基因的siRNA文库，并检测3个蛋白的表达，就需要为3000个抗体染色实验支付巨额费用，这在实践中几乎不可行。好消息是免疫荧光的数据获取在常规的共聚焦显微镜上即可完成。 成本效益是决定技术能否大规模应用的关键因素。在完成固定资产投入后，Cell Painting的低成本和高信息产出比将使其成为进行大规模表型组学研究的首选技术，有望显著降低系统性功能基因组学和药物发现的门槛。 与基因编码荧光探针（Genetically Encoded Fluorescent Probes）的对比 以绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物为代表的基因编码荧光探针，是另一类重要的细胞成像工具。它通过基因工程手段，将荧光蛋白的编码序列与目标蛋白的基因序列融合，从而在活细胞内表达出带荧光标签的目标蛋白。这类技术彻底改变了我们观察活细胞动态过程的能力。 引入方式与细胞扰动：Cell Painting方法所使用的染料是外源性加入的，通常在细胞固定后、或在活细胞成像前短暂地加入。优点是操作简单，不改变细胞的遗传背景。缺点是，即使是用于活细胞成像的染料，也可能存在一定的细胞毒性，尤其是在长时间成像时更为明显。此外，染料的加载效率和分布可能受细胞类型和状态的影响。基因编码探针是在细胞内表达的，需要通过转染、病毒感染或建立稳定细胞系等方式将外源基因导入细胞。优点是可以实现对特定蛋白的稳定、特异性标记，并且是活细胞动态成像的理想工具。缺点是基因改造过程本身可能对细胞产生压力或扰动；融合表达的荧光蛋白标签体积较大，有时可能会影响目标蛋白的正常折叠、定位或功能；过表达也可能导致人为的假象。两者引入标记物的方式各有优劣。Cell Painting的“即用性”更强，对细胞的侵入性（在遗传层面）更小。基因编码探针则提供了更稳定、更特异的标记，但前期构建实验系统的工作量较大。 动态与静态观测：经典的Cell Painting方法是一种终点检测法（endpoint assay），需要细胞在成像前被固定，因此提供的是细胞在特定时间点的“静态快照” ，无法捕捉细胞响应扰动的动态过程、速度和顺序。基因编码探针的最大优势在于活细胞动态成像。研究者可以实时追踪目标蛋白在细胞内的移动、降解、聚集，或细胞器（如标记了Mito-GFP的线粒体）的分裂、融合等动态过程。活细胞Cell Painting (LCP)方法作为经典Cell Painting技术的演进，在一定程度上弥合了这一差距。通过使用低毒性的活细胞染料，LCP可以在一定时间窗口内对细胞进行动态观察，捕捉药物或外源基因操作等扰动在细胞内引起的形态学变化。然而，其时间分辨率和可追踪时长仍受限于染料的光稳定性和细胞毒性，可能不及更稳定的基因编码探针。总之，在观测维度上，基因编码探针在“时间”这一维度上具有先天优势。传统的cell painting方法只能提供空间（终点形态）信息，而活细胞cell painting则能一定程度上将时间维度引入Cell Painting分析框架，使其能够研究动力学问题。我们认为，对于需要长期、高频次追踪单个特定分子行为的研究，基因编码探针仍是首选，而对于在群体水平上观察多种细胞器对刺激的快速、综合响应，活细胞cell painting则能提供独特的研究视角。 多重标记能力：多重标记是Cell Painting方法的核心优势。一套标准染料即可轻松实现对8个细胞组分的同步标记，且光谱分离良好。理论上还可以通过增加染料和通道来进一步扩展维度。通过基因编码探针实现多重标记则具有挑战性。首先，需要同时将多个不同的融合基因导入同一个细胞，并确保它们都能正确表达，这在技术上很复杂。其次，可用的荧光蛋白光谱窗口有限，光谱重叠问题需要谨慎考虑，有时可能需要额外引入光谱拆分技术。实现超过3-4种荧光蛋白的同时高质量成像对于现有大多数激光共聚焦显微镜来说可能非常困难。显然，Cell Painting的多重标记能力远超基因编码探针。它能以极高的效率提供一个细胞状态的“全景图”，而基因编码探针技术更适合于深入研究这个全景图中少数几个关键元素之间的动态关系。 Cell Painting的演进：从固定细胞到活细胞成像 任何一项强大的技术都不是静止的，它会随着科学需求的发展而不断演进。Cell Painting技术自诞生以来，其最主要的演进方向就是从对固定细胞的静态分析，发展到对活细胞的动态追踪，即前文中已经提到的活细胞Cell Painting (Live Cell Painting, LCP)。 标准的Cell Painting方案依赖于化学固定（如甲醛）来保存细胞结构，并对细胞膜进行透化以允许染料进入。这种处理方式虽然能够获得高质量的静态图像，但也带来了几个根本性的局限： l丢失时间维度信息：对固定样本的检测本质上是一个终点检测，只能反映细胞在选定时间点（如药物处理24小时后）的最终状态。它无法揭示细胞是如何从初始状态演变到终末状态的。例如，我们无法知道细胞是通过凋亡还是坏死走向死亡，也无法区分药物的早期快速效应和晚期继发效应。 l无法研究动态过程：许多关键的细胞过程，如细胞分裂、迁移、细胞器运输、钙信号响应等，本质上是高度动态的。固定细胞成像完全错失了这些宝贵信息。 l可能引入人为假象：固定和透化过程本身可能会改变细胞的精细结构，或导致某些可溶性分子的丢失。此外，不同细胞对固定剂的反应可能不同，这会给比较带来偏差。 l单点检测的信息量有限：对于剂量-效应或时间-效应关系的研究，传统方法需要为每个剂量和时间点设置独立的实验孔，成本高昂且效率低下。 为了克服上述局限，研究者们开发了活细胞Cell Painting (LCP) 技术。LCP的核心目标是在不杀死细胞的前提下，实现对多个细胞器的同步标记和动态成像，从而将时间维度引入形态学特征谱分析。这一革新主要体现在以下几个方面： 染料选择的变革 实现LCP的关键在于找到一套适用于活细胞的、低毒性、光稳定性好的荧光染料。这与用于固定细胞的染料有本质不同。 l一步法：传统的Cell Painting染色可能涉及多个步骤。而LCP追求的是“即混即读”（mix-and-read）的简单流程，即把所有活细胞染料混合后一次性加入细胞培养基中，孵育片刻即可成像。这大大简化了操作，尤其适合动态监测。 l染料的生物相容性：LCP染料必须具备极低的细胞毒性，确保在成像的时间窗口内（从几分钟到数小时甚至数天），细胞的生理功能不受染料本身的干扰。 代表性LCP染料包括： l吖啶橙（Acridine Orange, AO）：这是一种经典的溶酶体探针，也是最早被用于LCP概念验证的染料之一。AO是一种嗜酸性染料，会聚集在酸性的细胞器（如溶酶体和自噬体）中发出红色荧光，而在细胞核和细胞质中与核酸结合发出绿色荧光。利用这一特性，单一染料就能同时标记出多个区室，用于追踪药物诱导的溶酶体功能障碍或自噬过程。 l商业化的活细胞染料：Saguaro Biosciences开发了ChromaLIVE™、NucleoLIVE™、MortaLIVE™、ER-LIVE™等专门用于活细胞高内涵成像的染料组合。这些染料经过优化，具有更好的光稳定性和更低的光毒性，能够覆盖细胞核、细胞质、线粒体等关键结构，能够在活细胞多重荧光标记方面实现经典Cell Painting所能达到的信息广度。 l对传统染料的活细胞替代：研究者们也在不断寻找能够用于活细胞成像分析的替代染料，例如使用MitoBrilliant替代MitoTracker，或者使用对细胞膜透过性更好的Phalloidin变体等。 维持细胞活力的核心要求 进行LCP实验，除了选择合适的染料，还需要在整个成像过程中维持细胞的健康状态。这要求高通量显微镜配备相应的活细胞培养装置，能够精确控制温度（37°C）、CO₂浓度（5%）和湿度，模拟细胞培养箱的环境。此外，成像参数的优化也至关重要，需要尽量使用较低的激发光强度和尽可能短的曝光时间，以最大限度地减少光毒性对细胞造成的损伤。 捕捉动态过程的能力：从3D到4D LCP的最大价值在于它为形态学分析引入了第四个维度——时间。这使得研究者能够： l追踪细胞对扰动的实时响应：可以观察细胞在加入药物后几分钟内发生的形态变化，如线粒体膜电位的快速下降、细胞质的空泡化或细胞骨架的解体。 l解析事件发生的顺序和动力学：通过连续成像，可以确定不同细胞器发生变化的先后顺序，从而推断信号传导的路径。例如，是线粒体功能障碍先于细胞核固缩，还是反之？ l进行剂量-反应和时间-反应的连续监测：在同一个细胞群体中，可以观察不同浓度的药物或不同作用时间点所引发的表型变化轨迹，从而获得更精细、更具信息量的药理学数据。 l区分不同的细胞命运：能够动态区分细胞凋亡（如细胞皱缩、出泡）、坏死（细胞肿胀、破裂）和自噬等不同的死亡或应激模式。 例如，在Fernanda Garcia-Fossa等人于2025年发表的一项代表性研究中，研究者利用LCP技术，通过吖啶橙染色，成功监测了纳米颗粒对活细胞的低浓度、长时间影响。他们发现，LCP能够比传统MMT终点法更灵敏地检测到纳米颗粒引起的溶酶体功能紊乱，并揭示了其效应的剂量-反应关系；在药物诱导肝损伤化合物筛选中，LCP能够根据诱导的表型对细胞进行聚类，生成图像特征谱，从而区分不同作用机制的化合物，并提供对药物作用机制的见解。这充分展示了LCP在毒理学评估和环境健康研究中的巨大潜力。 LCP用于对药物诱导肝损伤（DILI）化合物进行表型分析和聚类。用六种已知DILI风险的化合物（阿司匹林、奥芬那君、依托泊苷、洛伐他汀、环磷酰胺、胺碘酮）及阴性对照处理Huh-7细胞24小时，然后进行LCP成像和表型分析。t-SNE可视化显示，不同化合物诱导了可区分的细胞形态特征谱，例如，奥芬那君和依托泊苷形成了清晰的独立聚类。纹理相关特征是区分DILI化合物表型最重要的特征类型。对奥芬那君和依托泊苷的深入分析显示，其关键形态特征变化与已知药物作用机制相符（依托泊苷引起核结构改变，奥芬那君影响囊泡形态）。有趣的是，LCP揭示了传统毒性分类（DILI等级）未能捕获的损伤表型相似性（胺碘酮与洛伐他汀） 看起来，Live Cell Painting是Cell Painting技术发展的必然趋势。它保留了传统Cell Painting技术的高内涵、无偏倚的优点，同时克服了其静态、终点的局限，将细胞表型分析从“拍照片”提升到了“录像”的层面，为我们理解复杂生命过程的动态与因果关系提供了前所未有的强大工具。 Cell Painting的优势应用领域 凭借其高通量、高内涵和无偏倚的特性，Cell Painting技术已在基础研究和转化医学的多个领域展现出强大的应用价值。 药物发现与高通量筛选 这是Cell Painting最核心、最成熟的应用领域。它正在彻底改变药物筛选的模式。 l基于表型的药物筛选（Phenotypic Drug Discovery, PDD）：传统药物筛选多为基于靶点的筛选（Target-based Drug Discovery, TDD），即针对某个已知的致病蛋白设计抑制剂或激动剂。然而，许多复杂疾病的病因未知或涉及多个靶点，TDD方法在此类疾病上收效甚微。PDD则直接以恢复疾病细胞的正常表型为筛选目标，不预设药物靶点。Cell Painting正是实施PDD的理想平台，它能以高内涵的方式量化“疾病表型”和“健康表型”，并筛选能够将前者“修复”为后者的化合物。 l作用机制（Mechanism of Action, MoA）的反卷积：对于大量在表型筛选中发现的活性化合物，其作用靶点通常是未知的。Cell Painting提供了一种高效的方法来推断其MoA。通过将未知化合物的形态学特征谱与一个包含大量已知MoA药物的参考数据库进行比对，如果未知化合物的“画像”与某个已知药物（如某个激酶抑制剂）高度相似，则可以强烈推断该化合物具有类似的MoA。这一策略被称为“图谱匹配”（profile matching），已成为当代头部药企发现新药和重定位老药的重要工具。 l化合物库的质量控制与多样性分析：在构建和管理大规模化合物库时，可以通过Cell Painting对库中所有化合物进行画像分析。这有助于识别出具有相似生物活性的化合物簇，剔除冗余，优化库的多样性，并发现可能存在杂质或降解的批次。 基因功能注释与遗传筛选 与化学扰动类似，遗传扰动（如CRISPR-Cas9介导的基因敲除或siRNA介导的基因沉默）同样会引起细胞形态的改变。Cell Painting为系统性的功能基因组学研究提供了强大的读出手段。 l大规模基因功能注释：通过对全基因组或特定基因家族进行系统性的敲除/沉默，并利用Cell Painting分析其表型，可以为大量功能未知的基因赋予功能注释。功能相似的基因（如参与同一信号通路或复合体的基因）在被扰动后，通常会产生相似的形态学画像。研究者可以基于表型相似性将基因进行聚类，从而构建出基于细胞形态的功能基因网络。 l遗传相互作用图谱绘制：Cell Painting可以用于系统地研究基因之间的相互作用，如协同致死（synthetic lethality）。例如，在一个特定的癌症突变背景下，再系统性地敲除其他基因，通过寻找能够特异性杀死癌细胞的“双重打击”组合，可以发现新的癌症治疗靶点。Cell Painting能够提供比简单的细胞存活率更丰富的表型信息，从而更精确地识别和分类这些遗传相互作用。 疾病建模与机制研究 Cell Painting为在细胞层面研究复杂疾病提供了新的范式。 l识别疾病特异性表型：通过比较来自健康供体和患者的细胞（如诱导多能干细胞iPSC分化而来的特定细胞类型），可以利用Cell Painting发现并量化疾病相关的细胞形态学缺陷。这些量化的表型特征不仅可以作为疾病诊断的潜在生物标志物，还可以作为药物筛选的客观指标。 l深入理解疾病机制：通过将疾病细胞的形态学画像与基因或化合物扰动的画像数据库进行比对，可以推断哪些通路或生物学过程在疾病中失调。例如，如果某种神经退行性疾病患者的神经元细胞画像与已知线粒体功能抑制剂的画像相似，则提示线粒体功能障碍可能是该疾病的关键致病机制。 毒理学评估 细胞形态是细胞健康状况最敏感的指示器之一。Cell Painting，特别是Live Cell Painting，正在成为新一代的体外毒理学评估工具。 l高内涵细胞毒性分析：传统的毒性测试通常只依赖单一指标，如LD50或ATP水平（细胞活力）。Cell Painting则能提供更丰富、更深入的毒性信息，揭示化合物在引起细胞死亡之前所诱发的亚致死性应激反应。它可以区分不同的死亡途径（凋亡、坏死），并指出首要的受损细胞器（如线粒体毒性、内质网应激、DNA损伤等）。 l早期、灵敏的毒性预测：LCP能够实时监测细胞在接触化合物后的早期反应，可能在传统的终点检测方法显示出毒性之前数小时就捕捉到形态异常。这种高灵敏度对于在药物研发早期阶段快速筛除具有潜在毒性的候选分子至关重要，可以有效降低后期临床试验的失败率。 Cell Painting典型实验操作与标准化 在实验室中成功实施Cell Painting检测，需要对从细胞培养到数据分析的整个流程进行精心的设计和优化。本节将详细介绍一个典型的固定细胞Cell Painting实验流程，并探讨实现实验标准化和高质量控制的关键。 实验设计与准备 a. 细胞系选择：选择贴壁生长良好、形态相对均一的细胞系。常用的细胞系包括U2OS（骨肉瘤细胞）、A549（肺癌细胞）、MCF7（乳腺癌细胞）等。不同细胞系对染料的反应和最终的形态特征会有所不同。 b. 多孔板选择：通常使用适合高内涵成像的黑色、光学底的多孔板（如96孔或384孔板），以减少孔间串扰和背景荧光。 c. 实验布局（Plate Layout）：精心设计孔板布局是保证数据质量的关键。一个典型的布局应包括： l阴性对照（Negative Controls）：通常是只加入溶剂（如DMSO）而未加化合物的细胞。它们代表了细胞的基准状态，用于后续数据归一化。建议在每块板上设置多个阴性对照孔，并将其分散布局，以评估板内差异。 l阳性对照（Positive Controls）：选择几种已知能诱导明确且稳定形态学变化的化合物作为阳性对照。这些对照用于评估实验的可重复性和检测窗口的稳定性。例如，可以选择作用于细胞骨架、线粒体、蛋白酶体等不同靶点的化合物。 l样本孔：即加入待测化合物或进行遗传扰动的孔。 细胞培养与扰动处理 a. 细胞接种：根据细胞的生长速率和目标处理时长，确定合适的接种密度。目标是确保在成像时，细胞汇合度达到一个合适的范围（如50-80%），既能获得足够数量的细胞进行分析，又避免因过度拥挤导致的接触抑制和形态改变。 b. 扰动处理：在细胞贴壁并恢复生长后（通常在接种后24小时），加入小分子化合物、siRNA转染复合物或CRISPR病毒等。处理的时长需要根据研究目的进行优化，对于小分子化合物，典型的处理时间为24-72小时。 细胞染色步骤 以下是一个典型的固定细胞染色方案。需要注意的是，不同实验室可能会根据自身条件进行微调。 l线粒体染色（活细胞步骤）：在固定前，首先对活细胞进行线粒体染色。将含有MitoTracker Deep Red的预热培养基加入孔中，在37°C培养箱中孵育30-60分钟。 l固定：吸去染料培养基，用预温的含甲醛的缓冲液（通常为3.2-4%的多聚甲醛）在室温下固定细胞20分钟。 l透化：吸去固定液，用洗涤缓冲液（如PBS）洗涤细胞。然后加入透化缓冲液（如含0.1-0.25% Triton X-100的PBS），在室温下处理10-15分钟，使细胞膜通透，以便后续染料进入。 l混合染色：吸去透化液并洗涤。然后加入包含其余五种染料的“鸡尾酒”染色液。这通常包括：Hoechst（细胞核）、Phalloidin偶联物（肌动蛋白）、WGA偶联物（高尔基体/质膜）、Concanavalin A偶联物（内质网）和SYTO 14（核仁/RNA）。在室温、避光条件下孵育30-60分钟。染料的最终工作浓度需要预先进行优化。 l洗涤与封片：吸去染色液，用PBS进行多次洗涤，以去除未结合的染料，降低背景。最后在孔中加入PBS或专用的成像缓冲液，并用铝箔封口膜密封，即可进行成像。 图像采集 显微镜选择：一般考虑使用自动化的高内涵成像系统（尽管基于传统的激光共聚焦显微镜和大规模人力阵列的“大力飞砖”也是能够想象的）。高内涵系统至少集成了自动化显微镜和图像采集/分析软件，能够实现无人值守的全板成像；其成像系统可以使用宽场或共聚焦显微镜，后者能提供更好的信噪比和Z轴分辨率，但成像速度与前者相比略慢。 成像参数设置: l物镜：通常选择20x或40x物镜，以在视野范围和亚细胞分辨率之间取得平衡。 l荧光通道：根据所用染料的激发和发射光谱，设置对应的滤光片或光源/检测器组合。典型的五通道设置为：DAPI通道（Hoechst）、FITC通道（Phalloidin/SYTO 14）、TRITC通道（WGA/ConA）、Cy5通道（MitoTracker）等。 l曝光时间与光强：对每个通道，需要优化曝光时间和激发光强度，确保信号足够强但未过饱和，同时尽量减少光漂白。 lZ轴层扫（Z-stack）：对于贴壁细胞，一些方法可能采集3-5个Z轴层面，之后通过最大强度投影（Max Projection）或反卷积算法融合成一张更清晰的2D图像。 l视野：在每个孔内采集多个不重叠的视野（可能4-9个），以确保采集到足够数量的细胞（原则上应在每个孔中采集数百至数千个细胞），减少由孔内空间异质性带来的偏差。 图像处理与特征提取 这一步骤完全由自动化软件完成，例如开源软件CellProfiler，或高内涵设备厂商提供的专用图像分析软件。 l建立分析流程（Pipeline）：在CellProfiler中，用户需要通过拖拽模块的方式，建立一个图像分析流程。该流程通常包括：加载图像、校正图像、识别主对象（细胞核）、识别次对象（细胞质）、测量对象特征、导出数据等步骤。 l特征提取：如前所述，软件将对每个细胞的数千个形态学特征进行测量。 l数据输出：最终软件会生成一个庞大的数据表（通常为.csv或.txt格式），每一行代表一个单细胞，每一列代表一个形态学特征。这个文件是所有后续统计分析的起点。 数据分析与解读 这是从海量数据中挖掘生物学意义的关键一步，通常需要生物信息学家的参与。 l数据清洗与归一化：首先，需要过滤掉因分割错误或细胞状态不佳（如凋亡碎片）产生的无效数据。然后，对特征数据进行归一化处理，通常是相对于板内的阴性对照（DMSO孔）进行Z-score标准化，以消除板间差异。 l特征选择与降维：在数千个特征中，许多是高度相关的。可以通过去除相关性高的特征或使用降维算法（如主成分分析PCA）来减少数据维度，抓住主要的变异方向。 l构建特征谱：将每个扰动（如每个化合物）处理下的所有单细胞特征进行汇总，通常是计算所有细胞特征的中位数或平均值，从而为每个扰动生成一个单一的高维特征谱。 l下游分析：聚类分析使用层次聚类或k-means等算法，根据特征谱的相似性对所有扰动进行聚类，作用机制相似的化合物预期会聚在同一分支；分类器预测是利用已知MoA的化合物数据，训练一个基于机器学习技术的分类器（如支持向量机、神经网络），用于预测未知化合物的MoA；“命中”筛选则首先定义一个代表“目标表型”的特征谱（可能从疾病模型中提取，或人为定义），然后计算库中所有化合物的特征谱与此目标谱的距离或相似度，得分最高的即被认为“命中”化合物。 实验标准化与质量控制 为了确保Cell Painting数据的可重复性和可比性，尤其是在进行跨实验室、大规模合作项目（如JUMP-CP联盟）时，标准化和严格的质控至关重要。 l协议的稳健性：尽管Cell Painting协议在不同实验室间存在一些差异（如染料浓度、培养基品牌），但研究表明，该检测的核心结果在各种协议变化下表现出相当的鲁棒性。 l关键优化参数：当在一个新实验室建立该技术时，需要对一些关键参数进行优化和验证，包括： n细胞密度：找到最佳的接种密度。 n染料浓度：对每种染料进行滴定，找到能提供最佳信噪比且毒性最低的浓度。 n显微镜设置：针对特定仪器优化曝光、光路等设置。 l质量控制指标：在数据分析层面，需要建立一套QC指标来监控实验质量。例如： n细胞计数：每孔的细胞数是否在预期范围内？过少可能意味着毒性，过多可能影响分割。 n阴性/阳性对照的性能：阳性对照是否能诱导出预期的、与阴性对照显著不同的表型？阴性对照在不同板之间的变异是否足够小？ nSSMD (Strictly Standardized Mean Difference)：计算阳性对照与阴性对照之间特征谱的差异强度，是评估检测窗口大小的常用指标。 lJUMP-CP联盟的努力：“形态学分析联合项目”（Joint Undertaking for Morphological Profiling, JUMP）是一个由多家学术机构和制药公司组成的大型联盟，其目标是创建一个包含超过14万个扰动（包括化合物和遗传扰动）的、史上最大规模的公开Cell Painting数据集。该项目通过系统性的优化和跨地点验证，大大推动了Cell Painting协议的标准化和数据的可共享性，为全球研究者提供了一个宝贵的参考基准。好人一生平安。 结论与展望 Cell Painting技术作为一种革命性的细胞表型分析工具，已经深刻地改变了我们在系统层面理解细胞生物学和进行药物发现的方式。它以其无偏倚的视角、高内涵的信息输出和高通量的执行能力，完美地契合了后基因组时代对生命科学研究提出的新要求。通过将复杂的细胞形态转化为可计算、可比较的高维数据，Cell Painting为我们提供了一把解锁细胞状态黑箱的钥匙，让我们能够以前所未有的广度和深度，绘制出连接基因、化合物与细胞表型之间的功能图谱。 本报告通过与传统免疫荧光和基因编码探针技术的详细比较，清晰地界定了Cell Painting的独特生态位：它是一个强大的、以数据驱动的发现引擎，尤其擅长于大规模筛选、功能聚类和假设生成。而向Live Cell Painting的演进，则为其增添了时间的维度，使其能够捕捉生命的动态之美，在毒理学评估和实时药效学研究中展现出巨大潜力。 展望未来，Cell Painting技术的发展将与多个前沿领域深度融合： l与多组学的整合（Multi-omics Integration）：将Cell Painting的形态学数据与基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据进行整合分析，将构建一个更加全面、立体的细胞状态模型。例如，通过关联分析，我们可以找出哪些特定的形态学特征与哪些基因的表达水平或蛋白的丰度变化高度相关，从而更直接地建立从分子到表型的联系。 l人工智能与深度学习的应用：随着数据量的爆炸式增长，更先进的计算方法将是充分挖掘Cell Painting数据潜力的关键。深度学习模型，特别是卷积神经网络（CNN），可以直接从原始图像中学习和提取特征，有可能超越CellProfiler等传统软件定义的特征，发现更抽象、更具预测性的表型模式。 l新型探针和标记技术的发展：对Cell Painting“调色板”的持续优化和扩展将是未来的一个重要方向。开发更多、更特异、光性能更好的活细胞染料，或将Cell Painting与其它标记技术（如原位杂交FISH）结合，将进一步提升其信息维度和应用广度。 l标准化与全球数据共享：JUMP-CP等联盟的成功实践预示着一个新时代的到来，即全球科学家可以共享标准化的形态学数据，共同构建一个庞大的、可查询的“细胞画像”知识库。这将极大地加速药物的重定位、新靶点的发现以及对人类疾病共同机制的理解。 总之，Cell Painting代表着一种新的研究方式。它鼓励我们以一种更整体、更无偏的眼光去审视复杂的生命系统。随着技术的不断成熟和应用的持续深化，我们有理由相信，Cell Painting将在未来的精准医学、系统生物学和人工智能驱动的生物学发现中扮演越来越核心的角色。