针对HPV相关恶性肿瘤的治疗性DNA疫苗：临床试验的潜在线索

2023-09-24

疫苗临床3期

摘要在2014年和2021年间，两种名为MAV E2和VGX-3100的候选核酸疫苗分别在墨西哥和美国完成III期临床试验，这两种疫苗用于治疗人乳头瘤病毒（HPV）相关患者的高度鳞状上皮内病变（HSIL）。这些耐受性良好但仍未获批的疫苗编码不同的HPV抗原（E2 vs E6+E7）以引起细胞介导的免疫反应；以安慰剂或手术（锥形切除术）为对照，它们的临床效果以HSIL消退或治愈来评价有限，但两者在清除HPV感染方面都非常有效，这将有助于增强疫苗免疫原性的进一步优化策略，实现使致癌性HPV持续感染、且不能从目前的预防性疫苗获益的数百万患者免于恶性肿瘤的最终目标。阻碍高度有效和实用性产品的挑战性主要有以下五个方面：（i）使疫苗在合适的细胞中有效表达和HPV抗原呈递（融合蛋白或表位）；（ii）能够足以覆盖除目前受关注的HPV-16和-18以外的致癌HPV血清型；（iii）直接免疫保护不同的表位生态位，尤其是HPV转化细胞造成严重破坏的肛门生殖器粘膜和上呼吸道消化道；（iv）建立时间窗口和疫苗接种程序，包括剂量、间隔及组合疗法，以达到最大疗效；（v）验证晚期、复发或不可切除恶性肿瘤的预后不良患者的治疗效果。总之，HPV相关恶性肿瘤的治疗性DNA疫苗仍有足够大的改进的空间，对其研发的持续努力可能将延伸到未来十年。1、引言：治疗性抗HPV疫苗的研发需求持续感染HPV-16、-18、-31、-33、-45、-52、-58等近20个血清型的致癌性HPV，使患者易于患宫颈、阴茎、外阴、阴道、肛门和口咽恶性肿瘤。在全球，这些HPV相关恶性肿瘤占所有人类癌症比例的4.5％，自2012年以来每年病例负担在500,000至600,000之间。宫颈癌也是妇女中第二大常见的恶性肿瘤，不同程度地对发展中国家造成影响。尽管两种预防性疫苗Gardasil（2006年上市）和Cervarix（2009年上市）非常有效地防止致癌HPV-16和-18以及低风险的HPV-6和-11新的感染，但这些市售疫苗诱导的由抗原决定（即重组衣壳蛋白）的抗HPV免疫力，在HPV转化的细胞中很少存在。因此，数百万伴随持续性、致癌HPV感染或患有HPV相关恶性肿瘤的患者预计不会从现有的这些产品中受益。相反，新的治疗性的抗HPV疫苗则必须针对其他HPV蛋白，尤其是主要的致癌因子E6和E7。在过去的二十年里，治疗性抗HPV疫苗的研究稳步发展，这反映在与该主题直接相关的大量研究文章中：2021年11月进行的一项调查显示，1999~2004年有73篇PubMed发表文章，2005~2009年有165篇，2010~2014年有120篇，2015~2021年有228篇(图1)。在ClinicalTrials.gov上，从注册的临床试验初步筛选出了130多条与治疗性DNA疫苗相关的条目（处于显著领先位置）。图1.筛选和过滤现有文献的策略。鉴于两个主要公共数据库捕获的大量临床试验和相关文献，本研究的目标是总结目前抗HPV DNA疫苗的研发状况，重点是见解和期望，以及关于潜在共识、剩余差距以及未来的改进或改进方向的问题。CTL，细胞毒性T淋巴细胞；MOA，作用机制。除了针对治疗性抗HPV DNA疫苗所有的研发（R＆D）前提和优势（图2），市场中仍然没有获批的产品，由此提出了三个问题：（i）是否可以从过去和正在进行努力、尤其是临床试验和高影响研究中得出一些共识？（ii）是否存在未来研发必须解决的差距、障碍或瓶颈？（iii）目前的研发格局从改善和改进方面如何演变？本综述将试着基于学术和工业领域的现有数据来回答这些挥之不去的问题，着重于现实的可交付成果和概念研究的证据证明。对于最新技术成功用于开发比传统管线时间短得多的mRNA疫苗的影响，也进行了一定程度的讨论。图2. 基于DNA的治疗性抗HPV疫苗的前提和优势。与预防性HPV疫苗诱导HPV特异性抗体中和入侵病毒不同，治疗性DNA疫苗针对HPV诱导的恶性肿瘤必须诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）以消除患有慢性/持续感染患者的HPV感染或转化细胞。几个关键成分用色条标注。APC，抗原呈递细胞；HLA-I，人类白细胞I类抗原（I类重链）；β2M，β2微球蛋白（I类轻型链）。2.开发治疗性抗HPV疫苗的关键优势编码肿瘤特异性抗原的DNA疫苗能够诱导有效的、细胞介导的免疫力（如参考文献中所述）。发展治疗性抗HPV疫苗至少有3个主要优势。首先，HPV基因组相对简单且较小，具有圆形的双链DNA，仅有9个开放式阅读框编码7个控制病毒复制的早期（E）蛋白和2种形成病毒衣壳的晚期（L）蛋白。由于大多数（~90％）HPV感染两年内自发清除（自我治疗），这些病原体的免疫保护相关因素很容易定义。因此，存在形成共识的、通用的、应作为疫苗设计主要靶免疫原的病毒抗原和特异性表位（表1）。其次，各种经临床证实的技术，包括常规巴氏涂片检查(用于宫颈癌)、组织活检和HPV DNA分析，可以常规地促进HPV相关恶性肿瘤的早期诊断。许多组织学确诊的高级别鳞状上皮内病变(HSIL，相当于2期和3期宫颈上皮内瘤变，或CIN2/3)患者，特别是必须面临广泛的年龄相关癌症的老年人和免疫功能受损者，可以被招募参加临床试验而不会受到其他宿主因素的干扰。实际上，大多数已完成I期及以上临床试验的治疗性HPV疫苗依赖于HSIL消退和HPV DNA清除作为疫苗疗效的两个关键指标(而不是患者生存)。第三，已知持续HPV感染并发展为恶性肿瘤的患者具有针对各种HPV表位的免疫记忆，其中一些表位(例如E1, E2和E5表位)不属于E6和E7，但可以用于增强疫苗效力，或间接地作为天然免疫佐剂(通过细胞因子诱导)，或直接通过将这些表位添加到疫苗结构中引发免疫记忆反应。表1.在临床前和临床研究中已知的诱导或增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的致癌HPV衍生表位a这些表位序列有大量重叠。b引入氨基酸取代(粗体和下划线)以增强表位亲和力。c这些15聚肽中的每一个都含有多个最佳表位。缩写：aa，氨基酸；HLA，人白细胞抗原；MHC，主要组织相容性复合体。其他优势还包括合作精神和公共利益。由于HPV相关疾病是传染病(免疫学)和肿瘤学的交叉点，具有不同专业知识的研究人员经常寻找跨地区和国际合作推进该领域的研究。因为与生殖健康相关，公众对HPV相关恶性肿瘤中的关注也很显而易见。事实上，世界卫生组织在2020年发起的一项运动旨在通过积极的疫苗接种、筛查和治疗(90-70-90目标)，将全球宫颈癌发病率降至每年4例/10万妇女以下。目前的研发管线进一步受益于各种资源的可用性，包括用于感染性病毒繁殖的体外系统(例如HPV-18器官型培养)和用于测试疫苗对两种主要致癌亚型(HPV-16和-18)有效性的临床前模型。广泛使用的TC-1是一种表达HPV-16 E6和E7(评价的关键指标)的小鼠肿瘤细胞系，有助于直接比较来自各个实验室的研究数据。3. 阻碍疫苗开发的因素致瘤性HPV以其逃避宿主免疫应答的能力而闻名，三种HPV蛋白(E5, E6和E7)干扰先天(如干扰素)免疫途径和嵌入主要组织相容性复合体(MHC)中的抗原加工和呈递机制。因为多顺反HPV基因表达模式通常是位点特异性或取决于疾病进展阶段，这些病毒特性削弱细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的免疫监视并且可能因组织区室而异。两种主要的癌蛋白E6和E7免疫原性差也被证明是具有挑战性的。迄今为止，临床前和临床研究中确定的已知CTL表位数量仍然很少，这些表位多为HPV-16表位而不是HPV-18表位(表1)。如果一些预测的CTL表位得到实验证实，这个列表可能会发生重大变化，而E6和E7癌蛋白以外的表位，包括E5中的表位，也可能有助于扩大CTL靶点的范围。已知可识别HPV CTL表位的HLA I类(HLA-I)等位基因也很有限，这类基因以HLA-A*02(主要是A*02:01)为首(表1)，其他HLA-I等位基因的数据很少。在使用免疫信息学工具的计算机研究中，曾经尝试通过潜在的表位提供有关人群覆盖率的相关信息，但HLA-1等位基因和超类型的实际分布地区和种族差异往往使这种尝试效果难以解释清楚。4. 提高治疗性DNA疫苗免疫原性的策略两种常见的策略——疫苗设计中的密码子优化和疫苗递送中的电穿孔——似乎有效地增强了基于E6和E7的HPV DNA疫苗的免疫原性 (表2)，使用纳米质粒逃避宿主细胞内防御也获得了一些关注。其他修饰已被证明:(i)防止细胞外DNA降解(例如，使用纳米载体)，(ii)将质粒DNA引导到专业抗原呈递细胞(APCs)，包括可以交叉呈递CD4和CD8 T-细胞表位的树突状细胞；(iii)共同递送T-辅助表位以调节CTL功能；(iv)提高DNA转染率;(v)促进质粒DNA进入细胞核，(vi)尽量减少质粒或载体骨架的干扰，以及(vii)结合不同的免疫调节剂实现协同效应。但上述替代策略仍处于临床前评估阶段。表2.四种治疗性DNA候选疫苗的属性，在I期临床试验期间或之后显示出针对多种HPV血清型的良好结果a如文中所述，另外三种单独针对HPV-16(单特异性)的治疗性DNA疫苗也已进入I期试验。b用于各种组合。c无随机分组，无安慰剂对照。d热休克蛋白70有助于将疫苗免疫原引入树突状细胞。eTA-HPV是一种表达HPV-16和-18中E6和E7的重组痘苗病毒，正在不同的治疗组中进行试验。f分为四个治疗组。g持续到2022年7月。缩写：CIN，宫颈上皮内瘤变；IM，肠肌内；mITT，方案阐明修正的意向治疗组；Mtb，结核分枝杆菌；NA，不适用。为了克服短E6蛋白(158个氨基酸)和E7蛋白(105个氨基酸)中T细胞表位的有限选择，在选择性引入增强CTL反应的点突变方面取得了一些成功。在HLA-A*02限制性表位的情况下，KLV9和RTV10(表1)均在锚定位置之外都有一个氨基酸取代。诱导的CTL克隆有望容易识别野生型表位。融合蛋白的使用也有助于扩大抗原谱并增强疫苗的免疫原性。5. 临床前系统的瓶颈与其他药物开发一样，临床前评估对于阐明药效学和药代动力学以及毒性/安全性至关重要。对于抗HPV疫苗的临床前评估，通常在小鼠中植入小鼠肿瘤细胞系TC-1来确定保护性免疫，该细胞系表达HPV-16特异性E6和E8或HPV-18 E6进一步修饰后的产物。由于MHC-TCR相互作用是T细胞活化的先决条件，临床前实验必须仅在C57BL/6 (B6)小鼠中进行。针对其他HPV抗原或非HPV-16/18型E6和E7的疫苗也必须提出包括不同小鼠品系在内的替代临床前系统。6. 已完成III期临床试验的候选疫苗两种有希望的针对HSIL的DNA候选疫苗分别在墨西哥和美国进行了III期临床试验(图3)。第一种疫苗MVA E2试图通过将牛乳头瘤病毒(BHV)特异性E2抗原插入牛痘病毒诱导交叉保护性免疫(表2)。MVA E2在不同发育阶段(超过14岁)的表现在同行评审的出版物中已有报道。2014年报道的迄今为止最大规模的临床试验，招募了1356名患者(含1176名女性)，每隔一周接受6次组织特异性注射1×107 MVA E2病毒颗粒。整体结果表明，1051名(89%)女性在治疗后上皮内病变完全消除，81%的女性清除了致癌的HPV。180名接受MVA E2 E2治疗的男性中，上皮内病变全部清除。但由于没有对照组平行对比，因此无法确定该疫苗接种方案的实际疗效(及其置信区间)。一项较早的II期试验表明，接受MVA E2 E2的34名HSIL女性中有31名(91%)CIN2/3完全消除或病灶大小减少了50%，所有接种疫苗的女性CTL升高且HPV病毒载量降低。相比之下，对照组(锥形切除术，n=20)中80%的女性CIN2/3完全消除，但HPV没有清除。尽管疫苗接种组的病毒载量和CTL数据最终可能转化为改善的长期效益(例如，CIN复发率的潜在降低)，但两组患者之间11%的差异是微不足道的，因为大约15%的手术患者在随访中可能存在持续性/复发性CIN。图3.两种有前景的候选疫苗(MVA E2和VGX-3100)已完成HPV相关癌前病变(主要是高级别鳞状上皮内病变)患者的III期临床试验，在研发路径上具有里程碑意义。关键研发阶段的结果已经发表在同行评议的出版物或在线资源。下划线标注的是两项高引用研究(每项引用超过250次)的主要作者。第二种候选治疗药物VGX-3100使用两种质粒的混合物，两种质粒中含有与HPV-16和-18的E6和E7基因对应的密码子优化序列(表2)。四个研发阶段(临床前和临床评价)(图3)持续了13年最新的三期临床试验的数据(REVEAL 1的研究)在2021年3月以一份新闻稿的形式发表，结果表明这种疫苗在修正的意向治疗(mITT)分析中(排除了没有足够结果的8个病人) 满足了主要临床终点——在mITT子集内 (N = 193),接种组的131名患者有23.7%产生应答(HSIL回归和HPV清除),而62名安慰剂组有11.3%在36周才产生应答。与MVA E2的结果相比，两组的无应答率都相当高，但适度的疫苗效价(12.4%的差异，95%置信区间= 0.4%~22.5%)确实超过了统计阈值(p = 0.02)。同时进行的一项198名参与者的III期试验(REVEAL 2)预计将于2022年7月达到主要临床终点。值得注意的是，同样的疫苗在治疗HPV-16/18相关的肛门发育不良和外阴发育不良方面也显示出有希望的II期临床结果。就作用机制而言，由MVA E2编码的BPV E2抗原旨在诱导对HPV具有交叉保护的免疫反应——与非常成功用于天花疫苗的做法类似。MVA E2的一个明显优势是潜在地激活HSIL部位周围的组织驻留T细胞(通过重复的局部注射)。尽管对BPV和HPV E2蛋白之间共享的保守CTL表位知之甚少，但最近对头颈癌患者的HPV特异性肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的分析表明，E2和E5可以成为治疗性疫苗的重要靶点，因为这两种抗原经实验证明都富含CTL表位。相比之下，VGX-3100使用裸质粒结合专利无针电穿孔递送系统递送不同HPV类型的HPV E6和E7抗原，该技术已知可显著增强T细胞免疫力，但产生的效应T细胞必须经过很长一段路才能到达靶细胞，然后才能在不友好的环境中艰难地发挥作用。观察到的与特定部位注射MVA E2疫苗相关的不良反应，包括不同比例(6%至69%)的头痛、短暂性发热、腹部和关节疼痛，所有这些不良反应都被认为是轻微的(1级，无需立即干预)。对于需要IM注射和电穿孔的VGX-3100, III期试验未发现与治疗相关的严重不良事件；轻至中度不良事件如早期临床试验所见，大多可自行消退。总的来说，MVA E2 E2和VGX-3100在设计、给药系统、给药位点、剂量程序和疗效方面存在明显差异(表2)，因此不可能就正确途径达成共识。MVA E2 E2和VGX-3100同时获批上市的几率仍然很低：从III期到监管部门批准的总体成功率约为50%，肿瘤产品的成功率更低(<40%)。7.通过临床试验的其他候选疫苗的有希望的线索另外两种针对HPV多种亚型(HPV-16和-18)的DNA疫苗已经在韩国(NCT01634503)和美国(NCT00788164)完成了I期试验(表2)。GX-188E疫苗的结果于2014年报道，而pBI-11疫苗的结果在7年后公布。无论是单独注射还是采用改良方案(例如与第二种疫苗联合)，两种疫苗在耐受性、CIN消退和HPV清除方面均显示出阳性结果。多方面的NCT00788164试验将持续到2022年夏季。另外四种仅针对HPV-16(即单特异性)DNA候选疫苗处于I期或I/IIa期试验阶段，其结果于2004年至2021年间发表。同样，E6和E7抗原是唯一的免疫原，除了DNA划痕疫苗外，疫苗通过皮内或肌肉注射给药。值得注意的是，其中两种疫苗都有内置佐剂：TG4001中的IL-2和VB10.16中的MIP-1。第三种候选基因AMV002(以前称为NTC-HPV16-E6/E7)涉及部分密码子优化，保留部分野生型HPV序列以确保同时诱导先天免疫应答。因为已知密码子优化引入的对隐表位的免疫反应会使T细胞应答偏离预期的(真实的)表位，部分密码子优化提供的改进不是微不足道的。假设上述候选药物成功完成II期试验并进入III期试验，那么MVA E2 E2和VGX-3100设定的完成各临床阶段的时限在6~8年之间(图3)。加上收集试验数据和获得监管部门批准所需的额外时间(大约两年)，最好的情况是在8~10年内看到现有候选疫苗之一获得批准，即这些现行管线可能还需要10年才能交付最终产品。8.进一步改进的方向对HSIL效果良好的治疗性候选疫苗 (表2)，对于具有免疫抑制和天然高度异质性的晚期恶性肿瘤，可能达不到预期效果。在最坏的情况下，几个明显的瓶颈(表3)可能迫使新的研发工作回到起点：选择HPV感染和转化细胞内源性的保护性CTL表位。例如，最近的一项令人信服的研究结果表明，HPV E5中的多个CTL表位也可能作为治疗性疫苗的重要靶点。表3.过去和正在进行的基于DNA的抗HPV疫苗的研发要点总结a特别是在两种主要的HPV癌蛋白E6和E7中(如表1所示)。b可以扩展到覆盖HPV-18(表1)。c迄今为止，大多数试验仅涉及癌前患者(表2)。d用于细胞特异性基因编辑(CRISPR-Cas9)。缩写:APC，抗原呈递细胞；LNP，脂质纳米颗粒(直径约80-200 nm)。在经典的免疫学工具箱中，适当使用免疫佐剂，可以提高对基于蛋白质疫苗的免疫反应的强度、广度和持久性，但佐剂的选择和配方是否可以增强CTL反应或诱导多功能CD4细胞以帮助有效和持久的抗肿瘤免疫并不总是很清楚。激活自然杀伤(NK)细胞，诱导树突状细胞与CD4和CD8 T细胞两者交叉免疫是另一种有价值的途径，但对这些细胞机制的反复评估无疑会进一步延迟研发进度。癌症免疫治疗的新前沿是直接调节肿瘤微环境。尤其是，T细胞抑制性受体可以被市售的针对几种T细胞检查点抑制剂(如PD-1和PD-L1)的抗体阻断。培养用于过继细胞治疗的TILs是另一个最终可能转化为联合治疗的活跃研究领域。新的临床试验的成功可能进一步取决于癌症侵袭性和预后的生物标志物，因为患者入组和数据分析可以调整以最大化治疗结果。事实上，使用生物标志物进行患者选择的临床试验似乎比不使用生物标志物的试验成功率要高得多。9.近期mRNA疫苗开发成功的影响在此前两种针对SARS-CoV-2感染的预防性mRNA疫苗击败所有DNA疫苗首先获得紧急使用授权、然后获得美国食品和药物监督管理局的正式批准大规模用于成人和青少年之后，COVID-19大流行给疫苗研发领域带来了巨大变化。即使是5-11岁的幼儿，早期对急性和慢性不良反应的认知和关注大多被忽视。在西方世界，mRNA疫苗取得的可见性的压倒性和范式转变的成功，迫使所有研发团队至少考虑到，现有的mRNA疫苗平台可以用于具有人用和兽用重要性的下一代治疗性疫苗的快速和具有成本效益的开发。许多努力和许多资源正在转向这些新的、备受关注的管线，但必须首要认识到的一点是， mRNA疫苗的获得，仍然局限于少数几个具备mRNA疫苗的生产、运输和储存的物流能力的国家。除非mRNA疫苗及其背后的纳米技术(脂质纳米颗粒)，可以重新制剂以确保mRNA在常温下几周甚至几个月时间内的完整性，否则它们在资源有限地区是不实用的。因此，稳定、具有成本效益、对制造工艺的要求不那么严格、而且比mRNA疫苗的保质期长得多的DNA疫苗，在可预见的未来仍将发挥重要作用。10.结论经过几十年的不懈努力，各种研发管线在开发针对HPV相关恶性肿瘤的治疗性DNA疫苗方面取得了稳步进展，但尚未有获批的终产品用于患者的进一步治疗。两种主要的候选药物在后期临床试验中显示出一定的疗效，但即使是在最基本的目标免疫原和递送系统方面，它们没有进一步的可达成共识的相似性。从这些疫苗和其他具有临床数据的候选疫苗中吸取的教训、以及对HPV特异性TILs的分析指出，目前仍然存在具有挑战性的多个差距和瓶颈。因此，该领域可能需要对备选策略进行几轮反复评估，以获得最佳结果。参考资料：Tang J, Li M, Zhao C, Shen D, Liu L, Zhang X, Wei L. Therapeutic DNA Vaccines against HPV-Related Malignancies: Promising Leads from Clinical Trials. Viruses. 2022 Jan 25;14(2):239. doi: 10.3390/v14020239. PMID: 35215833; PMCID: PMC8874761.抗体行业在过去几十年中经历了快速而显著的发展，成为生物医药领域中一个快速发展且备受关注的领域。自20世纪80年代第一种单克隆抗体药物（Muromonab-CD3）获得批准以来，许多抗体药物已经被批准用于各种疾病的治疗，包括肿瘤、免疫性疾病和感染性疾病等。市场上已经有数十种成功抗体药物，并且在临床开发和研究中有更多的候选药物，预计未来将有更多新药上市。如今，除了传统的单克隆抗体，越来越多的新型抗体技术被陆续开发出来，包括双特异性抗体、多克隆抗体、人源化抗体、重组抗体、抗体偶联药物等。这些新技术使得抗体药物具有更高的特异性、亲和力、稳定性和生产可行性，拓宽了抗体的应用范围。今年是COVID-19大流行趋于稳定后的第一年，人民生活逐渐走向正轨，经济也在缓慢但有力的复苏之中，而各抗体企业也依然在不断奋进、不断突破、不断超越，使抗体领域蓬勃发展，硕果累累。为促进抗体行业的交流与创新，2023年10月14-15日第六届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。会议内容时间：2023年10月14-15日地点：苏州（酒店定向通知）规模：600-800人主办单位：生物制品圈、抗体圈指导单位：康维讯生物、夏尔巴生物会议费用：免费FREE!（仅收取50元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），9月15日报名定金提高到100元，先到先得，报完即止，超过9月20日预登记将收取会议费！报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。日程安排更多嘉宾仍在邀请中。。。。。。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。