Romidepsin

磷酸化· 乙酰化 · 泛素化 · 甲基化 · 糖基化 · SUMO化 · 脂质化 · 羟基化 · 硝基化 · 全谱覆盖第一部分：翻译后修饰（PTM）概述什么是翻译后修饰（PTM）？ ·蛋白质在核糖体翻译完成后发生的共价化学修饰 ·修饰可发生于氨基酸侧链、N端或C端 ·改变蛋白质的活性、定位、稳定性、相互作用 ·人类蛋白组约含>20,000 种蛋白，通过 PTM 可产生 >100 万种功能状态 ·PTM 是细胞信号传导的核心"开关"机制PTM 的主要分类维度 ·可逆 vs 不可逆：磷酸化可逆；泛素介导降解多为不可逆 ·小分子修饰 vs 蛋白质修饰：磷酸基/甲基 vs 泛素/SUMO ·共翻译 vs 翻译后：糖基化可共翻译；泛素化为翻译后 ·酶催化 vs 非酶催化：大多 PTM 由专一酶催化 ·特异性氨基酸靶点：Ser/Thr/Tyr · Lys · Arg · Asn/Ser/Thr · Cys 等 核心概念：同一蛋白质的同一位点可以受到多种不同 PTM 的竞争性调控（如 H3K27 可被甲基化激活或被乙酰化激活，可被去甲基化酶逆转），形成精细的"组蛋白密码"。理解 PTM 的时空特异性和 Cross-talk 是现代蛋白质组学的核心挑战之一。  ▶ 主要 PTM 类型相对研究深度与已知位点数量估算（示意） 柱长代表已注释修饰位点的相对数量（基于 PhosphoSitePlus 等数据库估算）第二部分：磷酸化（Phosphorylation） 磷酸化— 细胞信号传导的"主开关" 磷酸化是已知最重要、研究最广泛的 PTM，由蛋白激酶（Kinase）催化，将 ATP 的γ-磷酸基团转移至底物蛋白的特定氨基酸残基上；由磷酸酶（Phosphatase）去除磷酸基（可逆）。人类基因组编码约518 种蛋白激酶（"激酶组 Kinome"），约占基因组 1.7%。  磷酸化靶点 修饰氨基酸 代表激酶 代表磷酸酶 主要功能 可逆性 丝氨酸磷酸化 (pSer) Serine（Ser, S） PKA PKC CaMKII CDK PP1 PP2A PP2B 信号激活/抑制，细胞周期调控，代谢酶活性 可逆✔ 苏氨酸磷酸化 (pThr) Threonine（Thr, T） CDK1 PLK1 Aurora ATM PP1 PP2A 有丝分裂调控，DNA损伤应答，蛋白质相互作用 可逆✔ 酪氨酸磷酸化 (pTyr) Tyrosine（Tyr, Y） EGFR Src JAK PDGFR PTP1B SHP1 SHP2 生长因子信号，癌症驱动，免疫信号 可逆✔ 组氨酸磷酸化 (pHis) Histidine（His, H） NME1/2 PGAM5 PHPT1 代谢调节，中间代谢信号（研究较少） 可逆✔ 天冬氨酸磷酸化 (pAsp) Aspartate（Asp, D） 双组份系统组氨酸激酶（原核） — 原核双组份信号系统应答调节子 相对稳定磷酸化的主要生物学效应 ·激活 激酶激活（EGFR pY1068 · ERK pThr185/pTyr187） ·抑制 酶活性抑制（糖原合酶 pSer，GSK3β底物） ·改变蛋白质构象，暴露或遮蔽结合位点 ·促进蛋白质相互作用（SH2 域识别 pTyr） ·决定蛋白质亚细胞定位（核质穿梭） ·调控蛋白质稳定性与降解（磷酸化触发泛素化）经典信号通路中的磷酸化级联 ·MAPK 通路：Ras → Raf → MEK（pSer） → ERK（pThr/pTyr） ·PI3K/Akt 通路：PI3K → PIP3 → Akt（pThr308/pSer473） ·JAK-STAT 通路：JAK pTyr → STAT pTyr → 转录激活 ·细胞周期：CDK-Cyclin 复合物磷酸化 Rb（pSer/pThr） ·NF-κB 通路：IKK 磷酸化 IκB → IκB 泛素化降解磷酸化检测方法一览 ·磷酸特异性抗体（Western Blot / IF）：最常用，如 anti-pERK · anti-pAkt；优点：特异快速；缺点：需单独制备每个位点的抗体 ·质谱（LC-MS/MS）＋ TiO₂ 磷酸肽富集：金标准，可实现全蛋白组磷酸化位点无偏鉴定 ·Phos-tag SDS-PAGE：利用磷酸根与 Mn²⁺/Zn²⁺ 的亲和力，将磷酸化蛋白在凝胶中迁移率延迟而分离 ·放射性同位素标记（³²P-γ-ATP）：体外激酶活性检测"金标准"，灵敏度高，但需辐射防护 ·FRET/荧光传感器：活细胞实时监测特定激酶活性（如 AKAR · EKAR）第三部分：乙酰化（Acetylation） 乙酰化— 表观遗传与代谢代谢调控的双重角色 乙酰化由乙酰转移酶（HAT/KAT）催化，将乙酰基（-COCH₃）从乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）转移至底物蛋白的赖氨酸（Lys）ε-氨基上，中和赖氨酸正电荷；由去乙酰化酶（HDAC/SIRT）去除（可逆）。乙酰化不仅调控组蛋白，还广泛发生于细胞质和线粒体蛋白（代谢酶、转录因子）。 乙酰化类型 靶点氨基酸 主要"写入酶"（Writer） 主要"擦除酶"（Eraser） 关键功能 赖氨酸 N-ε-乙酰化 Lys（K）ε-NH₂ KAT2A/GCN5 · CBP/p300 · KAT5/Tip60 · PCAF HDAC1~11（Zn²⁺依赖）· SIRT1~7（NAD⁺依赖） 染色质松弛转录激活（组蛋白）；蛋白质稳定性；酶活性调节 N-端 α-乙酰化 蛋白质 N 端 α-NH₂ NatA / NatB / NatC / NatD 复合物（共翻译） （目前无已知普遍去乙酰化酶） 蛋白质稳定性· 亚细胞定位 · 蛋白质复合物组装组蛋白乙酰化"写入/读取/擦除"系统 ·Writer（写入）：HAT（组蛋白乙酰转移酶）—— KAT2A · CBP · p300 ·Eraser（擦除）：HDAC（组蛋白去乙酰化酶）1-11 类；Sirtuin（SIRT1-7） ·Reader（读取）：含 Bromodomain（BRD）蛋白 —— BET 家族（BRD2/3/4） ·代表性标志：H3K27ac（活性增强子）· H4K16ac（染色质去致密）乙酰化相关药物靶点与临床应用 ·HDAC 抑制剂：伏立诺他（Vorinostat）· 罗米地辛（Romidepsin）—— 血液肿瘤一线 ·BET 溴结构域抑制剂：JQ1 · OTX015 —— 多种肿瘤（临床试验中） ·SIRT1 激动剂：白藜芦醇（Resveratrol）—— 代谢疾病、衰老 ·p300/CBP 抑制剂：A-485 —— 前列腺癌、血液肿瘤（研究阶段） 代谢与乙酰化的关联：乙酰化的供体 Acetyl-CoA 直接来源于细胞代谢（糖酵解 → 丙酮酸脱羧 · β-氧化 · 柠檬酸循环），因此营养状态和代谢活跃程度直接影响全局乙酰化水平。饥饿状态下 Acetyl-CoA 减少 → 组蛋白乙酰化降低 → 染色质压缩 → 特定基因沉默。SIRT1 消耗 NAD⁺ 去乙酰化，因此 NAD⁺/NADH 比值也直接调控乙酰化状态。 第四部分：泛素化（Ubiquitination） 泛素化— 蛋白质命运的决定者 泛素（Ubiquitin，Ub）是一个 76 氨基酸的小分子蛋白质，通过三酶级联（E1→E2→E3）共价连接至底物蛋白赖氨酸（Lys）的 ε-氨基上。泛素化是一种蛋白质修饰（区别于小分子修饰），可形成多聚泛素链（polyUb），不同链型决定截然不同的蛋白质命运。人类基因组含 2×E1 · ~40×E2 · >600×E3，E3 连接酶是底物特异性的决定因子，也是重要的药物靶点。  泛素链类型 连接赖氨酸 信号功能 代表调控通路 可逆性 K48 连接链 Lys48 蛋白酶体降解★ 蛋白质质量控制· 细胞周期蛋白降解 · 抑癌蛋白降解 去泛素化酶（DUB）可逆 K63 连接链 Lys63 非降解性信号★ DNA 损伤修复 · NF-κB 激活 · 内体转运 · 核糖体质控 DUB 可逆 M1 线性链（头尾链） Met1（N端） NF-κB 激活 · 炎症信号 LUBAC 复合物介导 · TNF 信号 · RANKL 信号 OTULIN/CYLD 可逆 K11 连接链 Lys11 APC/C 介导有丝分裂蛋白降解 有丝分裂退出· 细胞分裂 DUB 可逆 K27 连接链 Lys27 线粒体质量控制· 炎症体激活 PARKIN/PINK1 介导线粒体自噬 DUB 可逆 单泛素化（monoUb） 单个 Lys 组蛋白调控· 内吞作用 · DNA修复 H2AK119ub1（PRC1介导沉默）· H2BK120ub1（转录延伸） DUB 可逆泛素化三酶级联系统 E1 泛素激活酶（UBA1/UBA6）：消耗 ATP，形成 E1-Ub 硫酯键，激活泛素；人类仅 2 种 E2 泛素结合酶（UBC/UBE2 家族）：接受 E1 传递的泛素，与 E3 协作转移；人类约 40 种 E3 泛素连接酶（RING · HECT · RBR 类）：识别底物，决定特异性；人类 >600 种，是最重要的靶向药物设计点 DUB 去泛素化酶：~100 种；USP · UCH · OTU · Josephin · JAMM 家族，水解 Ub 链，实现可逆靶向泛素系统的治疗策略 ·蛋白酶体抑制剂：硼替佐米（Bortezomib）· 卡非佐米（Carfilzomib）—— 多发性骨髓瘤一线 ·E3 连接酶抑制剂：MDM2 抑制剂（Nutlin · AMG-232）—— p53 通路激活 ·PROTAC 技术：利用 E3 连接酶（VHL · CRBN）定向降解"不可成药"靶蛋白，是当前新药开发热点 ·DUB 抑制剂：USP7 抑制剂 —— 稳定 p53，抗肿瘤 ·分子胶（Molecular Glue）：沙利度胺· Lenalidomide —— CRBN 底物重定向第五部分：甲基化（Methylation） 甲基化— 表观遗传的精细调节旋钮 甲基化由甲基转移酶（HMT/KMT/PRMT）催化，将 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基（-CH₃）转移至赖氨酸（Lys）或精氨酸（Arg）侧链氨基上。与乙酰化中和电荷不同，甲基化不改变电荷，通过引入疏水基团改变识别界面。赖氨酸可被单甲基化（me1）· 二甲基化（me2）· 三甲基化（me3），形成不同功能状态。  甲基化靶点 修饰酶（Writer） 去甲基酶（Eraser） 读取域（Reader） 生物学效应 H3K4me3 SET1/MLL 复合物（COMPASS） KDM5A/B/C/D（JARID1 家族） PHD 结构域（TAF3） 活性转录起始位点标记✔ H3K27me3 PRC2 复合物（EZH1/2） KDM6A/B（JMJD3/UTX） Polycomb EED · CBX 蛋白 基因沉默· PRC1 募集 ✘ H3K9me3 SUV39H1/2 · G9a · SETDB1 KDM3A/B · KDM4A/B/C HP1（Heterochromatin Protein 1） 异染色质形成· 转座子沉默 ✘ H3K36me3 SETD2（NSD1/2 also） KDM2A/B · KDM4A PWWP 结构域 · PHF1 转录延伸· RNA 剪接调控 ✔ H4K20me3 KMT5C（SUV420H2） （尚无已知去甲基酶） 53BP1（DNA 损伤应答） 异染色质维持· DNA 双链断裂修复 R 精氨酸甲基化 PRMT1 · PRMT5 · CARM1 JMJD6（部分活性） Tudor 结构域蛋白 RNA 代谢 · 信号转导 · 转录调控 EZH2 与肿瘤：EZH2 是 PRC2 复合物的催化亚基，通过 H3K27me3 沉默抑癌基因，在多种肿瘤（滤泡性淋巴瘤、弥漫大 B 细胞淋巴瘤、卵巢癌）中高表达或突变激活。EZH2 抑制剂他泽司他（Tazemetostat）已于 2020 年 FDA 获批用于上皮样肉瘤。 第六部分：糖基化（Glycosylation） 糖基化— 细胞表面的"语言密码" 糖基化是将单糖或寡糖链共价连接至蛋白质的修饰，是分泌蛋白和膜蛋白中最常见的修饰，发生于内质网（ER）和高尔基体中。糖基化极大影响蛋白质的折叠、稳定性、溶解性、免疫原性和细胞-细胞识别。约 50% 的人类蛋白质受到糖基化修饰。 1糖基化工程在生物制药中的重要性：单克隆抗体（mAb）的 Fc 段 N297 位 N-糖基化直接决定抗体依赖细胞毒性（ADCC）和补体依赖细胞毒性（CDC）效应。去岩藻糖基化（Afucosylation）可显著增强 ADCC 活性（如 Obinutuzumab）。生物仿制药需严格匹配糖型以确保生物等效性。 第七部分：类泛素修饰（SUMO化 · NEDDylation · ISGylation） 类泛素蛋白修饰（UBL Modifications） 除泛素外，细胞内还存在多种类泛素蛋白（Ubiquitin-Like Proteins, UBL），通过类似的三酶级联系统（E1-E2-E3）共价修饰底物蛋白，但各自功能截然不同。UBL 蛋白与泛素共享β-grasp 折叠，但序列同源性较低。第八部分：脂质化修饰（Lipidation） 脂质化— 膜定位与信号脂筏的基础 脂质化修饰将脂肪酸或异戊二烯基团共价连接至蛋白质，驱动蛋白质与细胞膜的稳定结合，并将蛋白质靶向至特定膜亚区（如脂筏），是调控蛋白质定位和信号激活的关键机制。Ras 家族 GTPase 的脂质化是肿瘤领域研究重心。 第九部分：其他重要 PTM 修饰 羟基化（Hydroxylation） 靶点：Pro · Lys · Asn · His酶：HIF-PHD（缺氧感应）· P4H · BBOX功能：HIF-1α 降解信号（缺氧通路核心）· 胶原稳定性（Pro 羟基化）· FIH 抑制 HIF 转录活性疾病：VHL 突变 → HIF 不被羟基化 → 肾癌；脯氨酸羟化酶缺陷 → 坏血病  ADP 核糖基化（ADP-Ribosylation） 靶点：Glu · Asp · Lys · Arg · Ser（单/多/聚）酶：PARP1/2（DNA 损伤应答核心）· ARTD · PARG（逆转）功能：DNA 损伤修复（PARP 陷阱）· 转录调控 · 细菌毒素机制（霍乱毒素 · 白喉毒素）药物：PARP 抑制剂（奥拉帕利 Olaparib）—— BRCA1/2 突变乳腺/卵巢癌一线  硫酸化（Sulfation） 靶点：Tyr（酪氨酸硫酸化，分泌蛋白）酶：TPST1/2（酪氨酸蛋白磺基转移酶，高尔基体）功能：增强蛋白质-蛋白质相互作用 · 趋化因子受体活性（CXCR4 · CCR5）· 凝血因子 V/VIII特点：发生于高尔基体；影响约 1% 分泌蛋白  亚硝基化（S-Nitrosylation） 靶点：Cys 硫醇基 —— S-NO 键酶/来源：NO 合酶（NOS）产生 NO，非酶促反应功能：血管扩张信号· 神经传递（nNOS）· 蛋白质活性调控特点：氧化还原信号重要介质；与硝化应激和神经退行性病变相关 氧化修饰（Oxidation / Carbonylation） 靶点：Cys（—S—S—/—SOH/—SO₂H）· Met · His · Pro来源：活性氧（ROS）：H₂O₂ · •OH · O₂•⁻功能：氧化还原信号（Cys 硫醇 switch）· 蛋白质损伤标志（羰基化）· 2-Cys Prx 传感逆转：Trx/Grx（硫氧还蛋白/谷氧还蛋白）; 不可逆氧化为损伤标志  瓜氨酸化（Citrullination） 靶点：Arg → Cit（精氨酸脱氨基，去除正电荷）酶：PAD1~4/6（肽基精氨酸脱氨基酶）· Ca²⁺ 依赖功能：组蛋白 H3 Cit 诱导染色质去致密（NET 形成）· 髓鞘碱性蛋白（MBP）修饰疾病：类风湿关节炎（RA）的抗环瓜氨酸肽抗体（anti-CCP）是重要诊断标志物  琥珀酰化（Succinylation） 靶点：Lys（与乙酰化竞争同位点）酶：KAT2A 等（部分非酶化学修饰）; SIRT5 去琥珀酰化功能：线粒体代谢酶调控· 核代谢感应 · 影响酶活性与蛋白质互作特点：引入大基团（-2价负电荷），对蛋白构象影响大于乙酰化  蛋白质糖化（Glycation，非酶促） 过程：还原糖（葡萄糖）与 Lys 或 N 端 Ala 非酶促发生 Maillard 反应终产物：晚期糖基化终末产物（AGEs）疾病：糖尿病并发症核心机制· 动脉硬化 · HbA1c 是糖尿病诊断和监控金标准注意：与酶促 O-GlcNAc 糖基化完全不同  NEDDylation（NEDD8 化） 靶点：Cullin 蛋白 Lys · 非 Cullin 底物（p53 · EGFR 等，争议中）酶：NAE1-UBA3（E1）· UBC12/UBE2F（E2）· DCN1 等（E3）功能：激活 CRL 泛素连接酶 → 促进底物泛素化降解（细胞周期蛋白 · p27 等）药靶：Pevonedistat（MLN4924）—— 血液肿瘤临床 III 期 第十部分：PTM 间 Cross-talk 互作网络 什么是 PTM Cross-talk（串扰）？同一蛋白质（尤其是组蛋白）上的不同 PTM 相互影响的现象——某种修饰可以促进、阻止或依赖另一种修饰。理解 Cross-talk 是解码"组蛋白密码"和细胞信号网络的关键。  关系类型 修饰 A 对修饰 B 的影响 修饰 B 机制说明 竞争排斥 H3K27me3 抑制 → 阻止 H3K27ac 激活 同位点（K27）甲基化与乙酰化互斥；PRC2 募集 vs HAT 招募相互竞争 磷酸化触发泛素化 IκBα pSer32/36（IKK 催化） → 招募 SCF-βTrCP → 促进 IκBα K21/22 泛素化 → 26S 蛋白酶体降解 磷酸化产生 E3 识别信号（phosphodegron），激活 NF-κB 通路 磷酸化阻止甲基化 H3S10 磷酸化（Aurora B） → 阻止 HP1 结合 H3K9me3 读取被阻断 有丝分裂期 pSer10 产生"磷酸化-甲基化 switch"，使 HP1 从染色质释放 去泛素化促进乙酰化 H2BK120 去泛素化（USP22） → 依赖于 H3K4me3（Set1 COMPASS 依赖 H2Bub1） H2BK120 单泛素化是 H3K4me3 和 H3K79me 的必要前提（trans-histone 调控） O-GlcNAc vs 磷酸化 O-GlcNAc（OGT，高营养） → 竞争同位点 → 阻止 Ser/Thr 磷酸化（激酶催化） 营养充足时 OGT 活跃 → 阻止 Akt 磷酸化 → 抑制凋亡；低营养反之 SUMO 化依赖磷酸化 Ser 磷酸化（PDSM 序列中） → 增强 相邻 Lys SUMO 化（PDSM 模式：ψKxExxSP） 磷酸化依赖 SUMO 修饰基序（PDSM）增强 E2 Ubc9 对底物 Lys 的识别效率第十一部分：PTM 检测方法速查表 检测方法 适用 PTM 分辨率 优点 局限性 PTM 特异性抗体（WB / IF / IP） 磷酸化· 乙酰化 · 甲基化 · 泛素化 位点特异 操作简便；适合常规验证；定性 / 半定量 需单独开发每个位点抗体；交叉反应；难以检测稀有 PTM 质谱（LC-MS/MS） 几乎所有 PTM 单位点分辨 无偏全蛋白组鉴定；精确定位；定量（SILAC · TMT · DIA） 需前处理优化；设备昂贵；不稳定 PTM（磷酸化）需富集步骤 磷酸肽/修饰肽富集 磷酸化（TiO₂ · IMAC）· 糖肽（凝集素 / HILIC） 全蛋白组 大幅提升低丰度修饰肽检出率 富集偏好性；与磷酸化无关酸性肽干扰（IMAC） Phos-tag SDS-PAGE 磷酸化 蛋白质整体 直观区分磷酸化亚型；无需位点特异抗体 分辨率有限；凝胶优化复杂；只能看整体磷酸化状态 ChIP-seq（染色质免疫共沉淀测序） 组蛋白 PTM（H3K27ac · H3K4me3 等） 全基因组 绘制全基因组修饰分布图谱；鉴定增强子/启动子 需高质量 PTM 抗体；需大量细胞；假阳性问题 FRET / 荧光传感器 磷酸化（特定激酶活性）· 泛素化（部分） 活细胞实时 时空动态实时监测；活细胞成像 传感器设计复杂；仅适用于特定靶点 近端连接分析（PLA） PTM 与蛋白质相互作用联合检测 细胞 / 组织 同时检测 PTM 及其诱导的蛋白相互作用；原位检测 需两抗体同时满足条件；背景较高 放射性标记（³²P / ¹⁴C） 磷酸化· 甲基化 · 乙酰化（体外） 体外激酶/酶活性 极高灵敏度；金标准体外活性检测 放射性防护要求；无位点特异性（需结合测序）第十二部分：PTM 与疾病及药物靶点速查肿瘤驱动性 PTM 异常 ·磷酸化 EGFR · ALK · BCR-ABL 激酶激活突变 → 组成性激活 pTyr → 细胞失控增殖（靶向药：吉非替尼 · 克唑替尼 · 伊马替尼） ·甲基化 EZH2 过表达/突变 → H3K27me3 升高 → 抑癌基因沉默（靶向药：他泽司他） ·泛素化 MDM2 过表达 → p53 被过度泛素化降解 → 抑癌功能丧失（靶向药：MDM2 抑制剂） ·乙酰化 HDAC 过表达 → 染色质压缩 → 抑癌基因沉默（靶向药：HDAC 抑制剂）神经退行性疾病中的 PTM ·磷酸化 Tau 蛋白过度磷酸化（pSer/pThr · GSK3β · CDK5 过活）→ NFT 形成 → 阿尔茨海默病 ·磷酸化 α-突触核蛋白 pSer129 → Lewy 小体标志物 → 帕金森病 ·泛素化 PARKIN/PINK1 功能缺失 → 受损线粒体不被泛素标记 → 无法线粒体自噬 → 帕金森病 ·糖基化 O-GlcNAc 降低 → Tau 磷酸化升高（竞争性调控）→ 神经退行心血管疾病中的 PTM ·PKA 磷酸化 RyR2 过度：Ca²⁺ 泄漏→ 心律失常 ·eNOS S-亚硝基化：NO 生产调控 → 血管张力 ·组蛋白 H3K9me3 升高：压力过负荷诱导→ 心衰基因组改变 ·蛋白质糖化（AGE）：糖尿病血管并发症· 动脉硬化核心机制感染性疾病中的 PTM 劫持 ·病毒劫持泛素系统：HPV E6 利用 E6AP（E3）降解 p53；SARS-CoV-2 Nsp5 切割 ISG15 ·细菌毒素 ADP 核糖基化：霍乱毒素修饰 Gsα（激活 cAMP）· 白喉毒素修饰 EF-2（抑制翻译） ·病毒去磷酸化干扰素信号：多种 RNA 病毒编码磷酸酶抑制 IRF3 pSer → 拮抗 IFN-β ·ISGylation 抗病毒：ISG15 修饰病毒蛋白 → 抑制病毒组装速查总结蛋白质翻译后修饰十大核心概念 ✦ Writer · Reader · Eraser 三元系统 — PTM 的写入、读取与擦除构成精密的可逆调控回路 ✦ 磷酸化是信号转导"主开关" — 518 种激酶组成激酶组，是最大的可成药靶点群 ✦ 48 泛素链 → 降解；K63 泛素链 → 信号 — 同一修饰不同链型命运截然不同 ✦ 乙酰化感应代谢状态 — Acetyl-CoA 水平直接决定全局乙酰化水平，连接代谢与表观遗传 ✦ 组蛋白密码"由多种 PTM Cross-talk 构成 — 相邻位点修饰相互依赖或排斥 ✦ 基化是分泌蛋白 / 膜蛋白的身份标签 — 影响折叠、稳定性和免疫识别 ✦ 脂质化锚定膜定位 — Ras 脂质化是其激活和致癌的必要条件 ✦ PROTAC 利用 E3 连接酶靶向降解蛋白质 — PTM 系统已成为药物设计新范式 ✦ 氧通过 PHD/HIF 羟基化感应 — VHL → PHD → HIF 羟基化 → 降解是氧气感应核心 ✦ PTM 动态 · 时空特异 · 可逆性 — 同一蛋白在不同细胞周期阶段和应激条件下修饰谱系完全不同 蛋白质翻译后修饰是细胞将有限基因组信息放大为无限功能多样性的核心策略——掌握 PTM 即掌握细胞信号的语言。 Post-Translational Modifications — The Hidden Language of the Proteome  —如有错漏，敬请指出！ 期待您的宝贵意见。顺祝研安！—

本文为我们此前发布的 Cell Painting 技术介绍文章。鉴于近期仍有许多读者和客户咨询相关内容，特重新整理发布，供参考 表型药物筛选（Phenotypic Drug Discovery, PDD）通过在细胞或组织水平上观察化合物对疾病表型的调控作用来发现新药，尤其适用于多基因疾病或靶点不明确的肿瘤类型。与传统靶向筛选相比，PDD 更易发现具有新机制的潜在药物[1]。高内涵筛选（High Content Screening, HCS）作为 PDD 的核心技术，通过自动化显微镜获取细胞图像，并利用 AI 加持的图像分析算法提取形态学特征，从而量化化合物效应，在疾病模型的药物筛选阶段，提供出色的筛选速度和筛选能力。 Cell Painting 是当前最常用的高内涵形态学分析方案之一，由 Gustafsdottir 等人于 2013 年提出[2]。该技术使用六种荧光染料标记八个细胞结构（细胞核、核仁、内质网、线粒体、高尔基体、细胞膜、RNA 和细胞骨架），通过多通道成像获取上千个形态特征，从而全面捕捉细胞状态的变化[3]。Cell Painting 的优势在于其无需预设靶点，能够发现未知机制化合物，并适用于多种细胞类型和扰动方式。近年来，随着图像分析算法、深度学习方法和计算平台的快速发展，Cell Painting 已在肿瘤机制研究、药物发现和毒性预测等领域展现出广泛的应用价值，并且推动了多种候选药物进入临床或临床前阶段[4]。 本文将系统回顾 Cell Painting 技术的原理与进展，重点阐述其在肿瘤研究中的应用现状，特别是在药物筛选和机制解析方面的作用，并对当前面临的挑战和未来发展方向进行讨论。 Part.1 Cell Painting 技术原理与流程 Cell Painting 自提出以来历经十年发展，技术已经过多个版本的更新，优化了重复性与标准化流程，目前全球超 36 家学术机构及 51 家企业采用。标准 Cell Painting 实验采用经过优化的染料组合方案：Hoechst 33342 用于标记细胞核，Concanavalin A-Alexa Fluor 488 特异性染色内质网，SYTO 14 显示核仁与胞质 RNA 分布，Phalloidin（如 Alexa Fluor 568 或 750）标记 F-肌动蛋白细胞骨架，Wheat Germ Agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 555 揭示高尔基体与细胞膜结构，MitoTracker Deep Red 则用于跟踪线粒体。成像过程通常使用高质量物镜，采集多通道 Z-stack 图像，后续通过图像处理软件对多层图像进行投影或深度投影算法进行分析处理，可获取包括形态、纹理、强度等在内的千余个特征，从而构建高维形态谱[3]。 由于 Cell Painting 技术涉及样本制备、染色、成像及数据分析等多个实验环节，各环节操作差异易影响结果稳定性，为提升实验数据的可比性与重现性，国际合作组织 JUMP-CP（Joint Undertaking for Morphological Profiling – Cell Painting）通过构建包含 90 种不同作用机制化合物的阳性对照体系，首次实现了 Cell Painting 实验条件的系统性定量优化。该优化策略不仅有效提升了实验数据质量，还显著增强了不同检测平台间结果的一致性[5]。 Fig 1. Morphological profiling using the Cell Painting assay[4]. A) Schematic representation of Cell Painting assay. B) Imaging and segmentation. C) Deep learning-based methods are applied to measure or calculate morphological features from the images. D) Downstream analysis. E) BODIPY to mark lipid droplets in lipid-accumulating cells. F) Coronavirus antibody against human coronavirus 229E (CoV-229E) viral protein 早期的 Cell Painting 数据分析依赖于传统的图像处理软件（如 CellProfiler），通过分割细胞和亚细胞结构来提取形态特征。然而，这种方法在处理大规模数据时计算成本高、耗时长。近年来，基于人工智能的深度学习方法的引入极大地提升了图像分析的效率与准确性。例如，Molecular Devices 公司的 IN Carta 分析软件，能够直接从原始图像中提取特征，无需多步骤显式分割，不仅在速度上具有优势，还在多通量药物筛选任务中表现出比传统方法更高的图像分割以及分割后分类的准确率。 Video 1. Six Cell Painting assays being acquired using MetaXpress Acquire (Molecular Devices) at 20x magnification on a 84 well plate IN Carta 软件中的特征提取。在 IN Carta 软件中创建分析方法用于分割各种细胞结构 IN Carta 软件中具有多种数据可视化工具 Part.2 Cell Painting 在肿瘤药物筛选中的应用 虽然 2D 细胞模型具有操作简便、成本较低的优势，但其在模拟肿瘤微环境复杂性、细胞间相互作用机制和药物渗透性特性方面存在明显局限。3D 细胞模型通过模拟体内细胞外基质结构，构建三维生长微环境，可重现细胞间紧密连接、梯度营养分布及细胞与基质的相互作用，更贴近生理状态下的细胞功能。其药物渗透、代谢及毒性反应评估结果与体内实验相关性更高，能更精准预测药物在体疗效与安全性，为临床前药物筛选提供更可靠的科学依据，助力提升药物研发效率与成功率。 尽管 Cell Painting 技术最初是针对 2D 细胞模型开发的，但近年来已有多项研究证实其在 3D 肿瘤模型中的成功应用[6]。其中，由Molecular Devices、Tulane University 和 Protein Fluidics 联合开展的一项研究，首次将 Cell Painting 技术应用于 3D 肿瘤模型的药物筛选。该研究从一名对传统化疗（阿霉素、环磷酰胺、紫杉醇）耐药的三阴性乳腺癌患者体内建立了 TU-BcX-4IC 细胞系，该细胞系代表了一种化生性乳腺癌伴有三阴性乳腺癌（TNBC）表型[7]。通过将 2D 扩增的细胞接种于 U 型底超低吸附 384 孔板中，成功形成了均匀的 3D 肿瘤球。利用 Molecular Devices 公司的 ImageXpress confocal 高内涵成像系统搭配自动化工作站，对 168 种 FDA 批准的抗癌药物进行了五浓度筛选（10 nM 至 100 μM）。以 24 小时为时间间隔进行明场和荧光成像，并利用 MetaXpress 和 IN Carta™ 分析软件评估肿瘤球的大小、完整性和细胞活性。 Fig 2. Schematic diagram of the experimental workflow including generation of patient-derived cell line, formation of tumoroids in 384 well U-shape low attachment plates, compound treatment, staining, imaging and analysis[7]. 该研究通过 Cell Painting 的优化方案（包括延长染色时间、使用远红色 Phalloidin 分离肌动蛋白与高尔基体信号），成功获取了 3D 肿瘤球的六通道荧光图像，结合图像的深度学习分割和数据分析，研究人员从每个肿瘤球中提取了 210 个形态特征，并利用分析软件进行主成分分析（PCA）和聚类分析，计算出每种药物的表型距离分数，以此评估药物对肿瘤类器官的影响。结果显示，该筛选体系成功识别出多种机制类别的活性化合物，包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂（romidepsin、panobinostat）、蛋白酶体抑制剂（bortezomib、carfilzomib）和激酶抑制剂（trametinib、dasatinib）等。通过层次聚类分析，这些化合物根据其形态谱被分为不同的类别，与已知的作用机制（MoA）注释高度一致。该研究还比较了 2D 与 3D 模型在药物响应方面的差异。结果显示，对于某些化合物（如 carfilzomib、trametinib），3D 模型表现出更高的 EC50 值，提示其更好的耐药性模拟能力。 Fig 3 The Cell Painting assay modified for 3D spheroids. A) Spheroids were labeled with phalloidin,MitoTracker, WGA, SYTO 14, concanavalin A and Hoechst 33342. B) Scatterplot representing the phenotypic distance score for each compound is shown. C) Results of cluster analysis are represented as a hierarchical dendrogram. D) Example images grouped by cluster from the Cell Painting assay Part.3 Cell Painting 在表型活性与毒性预测的应用 传统的细胞健康评估方法通常依赖于单一指标，如细胞活性或细胞死亡率，这些方法在反映细胞在复杂条件下的健康状态方面存在局限性。相比之下，Cell Painting 作为一种基于图像的形态学表型分析技术，通过多通道荧光成像多种细胞组分，能够提供细胞的多维度形态特征，从而更全面地反映细胞的健康状态。有研究利用 Cell Painting 技术对经不同化合物处理的细胞进行多通道荧光成像，该技术通过标记六种细胞器结构，生成了高达每细胞 1700 个维度的丰富形态学特征谱。随后，他们进一步采集了与之匹配的、由特定荧光报告基因测定的细胞健康表型数据，并以此作为机器学习模型的训练标签。通过数学统计算法，成功构建了包括死细胞比例（R²=0.62）、S 期细胞数量（R²=0.64）和凋亡细胞百分比（R²=0.37）等多种细胞健康表型[8]。 Cell Painting 技术不仅能够识别有效化合物，还能在早期筛选阶段有效排除具有潜在毒性的候选分子，从而显著降低药物研发后期失败的风险。 Part.4 Cell Painting 技术的挑战与未来 尽管 Cell Painting 在肿瘤药物筛选中展现出巨大潜力，但其进一步发展仍面临若干挑战。 Cell Painting 生成的高维数据虽然信息丰富，但如何将其转化为具有生物学意义的见解仍是一大难题。许多形态特征缺乏直观的生物学解释，且不同特征之间可能存在高度共线性。 同时，生物学模型也进入高速发展阶段，目前比 2D 细胞更具有仿生性的 3D 细胞模型已逐渐走入更多的实验室，但是为了追求更加仿生且稳定的体外模型，科学家们正致力于构建更复杂、更加多元化的类器官及类器官共培养体系。但是 3D 环境中的光散射、荧光淬灭和细胞重叠等问题增加了图像采集与分析的难度。当前多数研究仍依赖于 2D 投影而非真正的 3D 重建，可能导致信息丢失或误解。开发更先进的 3D 图像采集技术、3D 信息重构技术和深度学习分割算法，将有助于提升 3D Cell Painting 的数据质量与分析精度。 另外如前文所述，Cell Painting 涉及多个步骤，需要更多例如 JUMP-CP 等研究组织以及更多的实验室，建立标准化的操作流程和数据处理方法，施以更多努力以实现真正的数据互通与整合。 Part.5 讨论 Cell Painting 作为一种高通量、多参数、无偏的细胞表型分析技术，已成为肿瘤药物筛选和机制研究的重要工具。通过全面捕捉细胞在扰动下的形态变化，它不仅能够预测化合物的作用机制和毒性，还能揭示新的生物学见解和治疗靶点。随着 3D 模型、深度学习技术和多模态数据整合方法的不断发展，Cell Painting 有望在个性化医疗和精准肿瘤学中发挥越来越重要的作用。然而，要实现其全部潜力，仍需在数据解读、标准化和技术创新方面取得进一步突破。 扫码下载资料 基于细胞绘画法的 高内涵表型分析 扫码下载资料 数据分析提高 Cell Painting 的可靠性 相关产品链接： ImageXpress HCS.ai 智能高内涵成像分析系统 参考文献 [1] Swinney DC, Anthony J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 2011 Jun. [2] Gustafsdottir SM, Ljosa V, Sokolnicki KL, Anthony Wilson J, et.al. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 2013 Dec. [3] Bray MA, Singh S, Han H, Davis CT, et.al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 2016 Sep. [4] Seal S, Trapotsi MA, Spjuth O, et.al. Cell Painting: a decade of discovery and innovation in cellular imaging. Nat Methods. 2025 Feb. [5] Cimini BA, Chandrasekaran SN, Kost-Alimova M, et.al. Optimizing the Cell Painting assay for image-based profiling. Nat Protoc. 2023 Jul. [6] Imamura Y, Mukohara T, Shimono Y, et.al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 2015 Apr. [7] Oksana Sirenko, Courtney K Brock, Angeline Lim, et.al. Evaluating Drug Response in 3D Triple Negative Breast Cancer Tumoroids with High Content Imaging and Analysis. Research Square. 2022 Aust. [8] Way GP, Kost-Alimova M, Shibue T, et.al. Predicting cell health phenotypes using image-based morphology profiling. Mol Biol Cell. 2021 Apr. 关于美谷分子仪器 Molecular Devices 始创于上世纪 80 年代美国硅谷，并在全球设有多个代表处和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海设立了中国代表处，2010 年加入全球科学与技术的创新者丹纳赫集团，2011 年正式成立商务公司：美谷分子仪器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持续创新、快速高效、高性能的产品及完善的售后服务著称业内，我们一直致力于为客户提供在生命科学研究、制药及生物治疗开发等领域蛋白和细胞生物学的创新性生物分析解决方案。