非内化ADC可开发靶点全球研究进展

2022-11-13

抗体药物偶联物

截至2022年7月，全球总计14款ADC药物（其中FDA批准了12款）获批用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤，此外，尚有100多款ADC候选药物处于临床试验的不同阶段。ADC通常需要内化到癌细胞中，以释放其payload，需要具有高表达高内化靶点才能发挥优异的疗效，事实上，目前FDA批准的所有12种ADC都是内化ADC，其中大多数（10/12）含有可裂解的连接体。有7款（7/12）ADC针对非实体肿瘤类型，即血液癌症，包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。尽管抗乳腺、宫颈和膀胱等实体瘤的ADC已经成功，也需要非内化ADC来扩大癌症靶点范围，尤其是治疗具有致密肿瘤基质的癌症。非内化ADC使得payload可以在内化不良的抗原或其他肿瘤抗原结合时从可裂解linker中释放出来。这不仅可避免ADC药物开发对高表达抗原的依赖，潜在的低效内化导致的疗效不佳，并且可以将癌症靶点的范围大大扩展到细胞外肿瘤基质。这篇综述综述了非内化ADC的最新进展，包括最新的癌症相关细胞表面和细胞外蛋白、癌症基质靶向以及能够释放细胞外有效载荷的连接化学。靶向膜蛋白靶抗原的特征对ADC的成功至关重要，优秀靶抗原应在癌细胞上高度表达，而在健康细胞上不表达，以确保治疗的特异性并避免靶外毒性。抗体-抗原结合相互作用的性质决定了ADC是否发生内化（以及速度）。内化ADC，抗体必须可以诱导快速受体内化、内体运输和溶酶体加工。相反，对于非内化ADC，由于抗原抗体结合后不需要高效内化也能产生较好的疗效。随着人们对非内化ADC的兴趣越来越大，越来越多的不被内化的抗原被发现。B细胞抗原CD20、CD21和CD72Polson等人研究了CD20、CD21和CD72等非内化ADC靶点。在该工作中，使用二硫键、Val-Cit二肽、不可裂解的linker合成了多种ADC（图。研究发现，可裂解的二硫键ADC在体内即使内化非常差的抗原靶点CD20、CD21和CD72也能产生疗效。据推测，二硫键接头可以在细胞外裂解，并通过非内化机制起作用。此外，在这项工作中，包含Val-Cit连接子的抗CD21 ADC的MMAE有效载荷被MMAF替代，MMAF是一种含有带电羧酸末端的类似物（图4C），这阻碍了其发挥旁观者效应。这一变化使得以MMAF为payload的非内化ADC无活性，表明释放的有效载荷在细胞膜上的扩散对活性至关重要，该实验表明Val-Cit连接子可在细胞外释放的作用机制。显然，这一数据与经典观点相矛盾（二硫键和Val-Cit可裂解接头需要内化以释放有效载荷），因此二硫键、VC linker可在TME胞外裂解，释放payload，从而发挥药效。DiJoseph等人的研究证明CD20是有效非内化靶点。通过酸不稳定（腙键）或酸稳定（酰胺）接头将卡利霉素与抗CD20抗体利妥昔单抗 CD20抗体利妥昔单抗偶联。酸可裂解ADC对小鼠B细胞淋巴瘤能有效抑制，而酸稳定ADC（药效与未偶联的利妥昔单抗类似）效果明显不如酸可裂解的ADC，这表明酸介导的连接体裂解的重要性，并意味ADC内化效率较低（否则内化后两种ADC在胞内二硫键均会断裂释放卡利霉素，两者药效可能不会有显著差异）。通过与内化抗原CD22的类似ADC的比较来验证。在这种情况下，酸不稳定ADC与不可裂解ADC的药效相似。因此，由于肿瘤细胞的相对酸性（pH 5.5–7.0）细胞外环境，酸性不稳定的ADC预计可在胞外裂解。PD-L1PD-L1抗体有效率受肿瘤异质性及致密肿瘤基质的不良渗透的限制。因此，开发非内化PD-L1 ADC PD-L1 ADC具有吸引力，因为细胞外有效载荷释放可以克服这些问题。然而，对PD-L1的性质及其内在作用知之甚少。例如，Hung等人构建了几种特异性识别PD-L1糖基化位点的PD-L1抗体。在评估的10种抗体中，只有识别N192和N200糖基化位点的抗体被内化。这表明抗体-抗原结合相互作用的性质是决定其作用机制和是否诱导内化的关键。对于任何ADC的设计，都应仔细考虑这一点。利用FDA批准的avelumab单抗的ADC以前被证明能内化, Boerman等人通过对抗人PD-L1抗体的放射性标记研究表明只能缓慢内化，其在PD-L1 阳性的MDAMB-231孵育24h后仅有25%被内化。，Xiao et al等人发现，avelumab-Val-Cit-MMAE ADC在体外对PD-L1阳性细胞系无效，其IC50与avelumab相似。这是因为ADC缺乏内化（这可能是溶酶体二肽裂解所必需的）。流式细胞术分析显示，孵育2h后，在MC-38、SK-MES和MDA-MB-231细胞系中仅有约20%的avelumab内化，但在MDA-MB231细胞系中约有40% atezolizumab内化。鉴于avelumab缀合物的有限内化，avelumab可能更适合于开发抗PD-L1非内化ADC。尽管在先前的研究中，观察到可裂解的Val-Cit连接子在细胞外裂解，但在本研究中，可能是因为在细胞外Val-Cit连接子裂解水平不够，因此仍需要内化。胞外蛋白酶或其他连裂解接触因素因细胞系、肿瘤类型以及临床前小鼠模型和人而异。CEACAM5癌胚抗原细胞粘附分子5（CEACAM5）是许多种类型癌症的生物标志物，通常不会显著内化。靶向该抗原已在临床前肿瘤模型中得到成功验证，利用pH敏感的碳酸盐或酯连接体与中间体在细胞外酸性肿瘤微环境中ADC释放SN-38。22–24Goldenberg等人研究了抗CEACAM5 labetuzumab CEACAM5 labetuzumab ADC，ADC含有酸不稳定的碳酸盐或酯、另外也具有蛋白酶可裂解的苯丙氨酸赖氨酸（Phe-Lys）（图6）。酸不稳定接头具有中等稳定性，在人血清中的半衰期为10-65小时。令人欣慰的是，尽管CEACAM5内化不良，但24个ADC在靶CEACAM4阳性淋巴瘤肿瘤模型种具有良好的效果，其中携带双可裂解连接子CL2的ADC的体内表现最佳。作者提出了SN-38从ADC细胞外缓慢释放的非内化机制，游离药物的局部积累。SN-38与Auristatin或maytansinoid有效载荷相比，具有中等的细胞毒性，碳酸盐/酯键的相对不稳定性被认为适合与SN38一起使用，这允许药物较易释放而不会产生明显的靶向毒性。高度内化抗原Trop-2，用高度稳定的连接取代CL2A连接显著降低效率，表明从CL2A接头逐渐释放SN-38有助于效率。26NKANa+/K+-ATP酶（NKA）的非内化ADC。NKA是一种质膜离子泵，对所有细胞的功能至关重要：抑制NKA可导致细胞死亡。与经典的ADC方法不同，没有开发针对NKA的抗体（正常细胞也表达该蛋白），而是利用了与NKA之间的关联性的其他癌症相关蛋白。Dysadherin是一种细胞膜糖蛋白，在许多转移性癌症中过度表达，并与NKA相互作用。将NKA的抑制剂与抗Dysadherin抗体结合，使抗体与dysadherin结合，从而使抑制剂与NKA非常接近。抑制剂与NKA的结合随后通过诱导细胞肿胀和随后的膜破裂导致细胞死亡。这种策略特别有趣，因为其无需可裂解linker，抑制剂在细胞外起作用。已知与NKA相互作用的靶蛋白包括CD20、CD38、CD147和CD56。令人兴奋的是，ADC剂量低350倍就能达到与游离药物相似的抗肿瘤效果，这验证了靶向方法的优越性。靶向肿瘤微环境依赖靶向膜抗原有几个缺点：很少有癌症均匀地过表达抗原肿瘤可以通过抗原表达的改变获得抗性细胞外基质中的靶蛋白Gal-3-BP半乳糖凝集素-3-结合蛋白（Gal-3-BP）是大多数癌症中大量持续分泌的，这使其成为靶向癌症微环境的ADC的一个有吸引力的靶点。Iacobelli等人开发了一种对Gal-3-BP的凝集素结合域具有特异性的人源化抗体。通过直接与C端半胱氨酸和含硫醇的DM1、DM3或DM4形成二硫键，以“无接头”方式实现药物的偶联。LRG1富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1（LRG1）是一种在许多肿瘤的微环境中丰富的分泌型糖蛋白。LRG1的高表达与不良预后相关，因为它会导致血管功能障碍并阻碍治疗药物通过血流输送.Chudasama等人证实，LRG1在分泌后保持在细胞外，因此可构建非内化ADC，包括通过蛋白酶裂解的Val-Cit接头与magacizumab、MMAE偶联。在体外，由于细胞培养中细胞外组织蛋白酶浓度有限，其最初对LRG1阳性的B16F0细胞无效。尽管无效，但证实了LRG1 ADC的非内化特性。用小剂量顺铂联合治疗（5 mM）后将使组织蛋白酶从濒死细胞中有效释放，以激活其ADC。这种组合方法ADC的IC50为15 pM，表明通过联合使用额外的化疗药物启动连锁反应，随着细胞死亡的增加，ADC的药物释放得到改善。MMP9基质金属蛋白酶（MMPs）是一个蛋白酶家族，在癌症进展中具有多种作用，在乳腺癌中经常上调。尽管抑制MMP是一种有吸引力的抗癌策略，但由于该家族催化域中的序列相似性，已证明很难用小分子选择性靶向家族中的一种MMP，靶向MMP抑制剂通常选择性较低，因剂量限制毒性或临床效率不足而终止。为了改进这些小分子MMP抑制剂，Merritt等人通过将泛MMP抑制剂与高度特异性的MMP9靶向抗体结合，开发了细胞外ADC。靶向基质或肿瘤血管系统许多实体瘤表现出致密的细胞间基质：结缔组织和血管网络，阻碍大分子深入肿瘤。这是ADC治疗实体瘤的障碍。靶向基质屏障后面的肿瘤细胞的一种新兴策略是靶向基质本身。基质中ADC的积累可以使细胞外有效载荷在肿瘤微环境中释放，然后可以扩散到附近的肿瘤细胞中。由于小分子的扩散大于抗体，活性药物对实体肿瘤的渗透性有望提高。这被称为“肿瘤基质靶向治疗”（CAST）。此外，由于靶抗原表达的异质性，对几种实体肿瘤ADC（结肠、肺、胰腺）的治疗受到限制。肿瘤细胞外基质的成分包括Collagen、Fibrin、tenascin-C和Fibronectin，这些是治疗实体瘤有吸引力的靶点。CollagenCollagen是肿瘤细胞外基质中基质的主要成分。Matsumura及其同事的针对肿瘤微环境设计了一种靶向Collagen-4的ADC，以使SN-38能够在肿瘤微环境中持续释放。SN-38通过酯酶可裂解的酯键与Collagen-4的单抗偶联， DAR为7-8。FibrinFibrin是一种实体肿瘤基质含量较高的纤维蛋白，Matsumura等人开发靶向Fibrin的ADC。与针对Collagen-4的工作类似，他们利用酯键结合SN-38。在这种情况下，分支接头在每个半胱氨酸偶联三个SN-38，得到DAR24的ADC。Fibronectin快速血管生成是大多数浸润肿瘤的特征，但不是健康组织的特征，因此选择性靶向肿瘤血管是可能的。此外，与靶向异质表达的抗原相比，靶向癌症血管系统使肿瘤治疗分布更广泛。Fibronectin是一种与血管生成相关的糖蛋白，是肿瘤血管内皮下细胞外基质的组成部分。由于选择性剪接，存在不同形式的纤维连接蛋白，即EDA和EDB。这些物质在实体肿瘤中大量存在，积聚在新形成的血管周围，健康组织中很少，这使其成为针对新形成的肿瘤血管中的诱人靶点。L19抗体已被确定为纤维连接蛋白EDB结构域的高亲和力抗体，且不内化。F8抗体为了靶向纤维连接蛋白的EDA结构域高亲和力抗体。Tenascin-CTenascin-C是一种存在于实体瘤基质中的丰富蛋白，但不存在于健康组织中。Tenascin-C的A1结构域可以被F16抗体靶向。Val-Cit-MMAE合成了非内化抗tenascin-C ADC。令人印象深刻的是，ADC在两种不同的小鼠异种移植模型疗效达到100%。虽然这表明在肿瘤部位成功释放有效载荷，但IgG ADC在小鼠血浆中不稳定，在瓜氨酸部位观察到裂解，可能是由于小鼠血浆中的羧基酯酶1c（Ces1c），已知其可酶切该部分。因此，尚不清楚有效载荷的释放和由此产生的ADC功效是否是连接子在小鼠血浆不稳定性的结果，还是细胞外肿瘤组织蛋白酶切割的结果。通过外源触发在细胞外释放虽然大多数ADC依赖于内源性触发物来释放有效载荷，例如肿瘤相关酶或不同的pH，但已经开发了一种替代方法，通过该方法，小分子触发物被外源性地引入使ADC发生裂解。外源触发可裂解的非内化ADC，允许有足够的时间使ADC与靶抗原结合，并有足够时间从血液中清除任何未结合的非靶向ADC。随后，施用外源性释放触发器，仅激活作用部位的ADC。与传统的ADC不同，这种方法不依赖于天然生物激活机制的切割，因此，外源激活具有可预测的药物释放速率。Click-to-release肿瘤相关糖蛋白72（TAG72）在多种实体肿瘤的癌细胞表面过表达。Rossin等人证明了其作为非内化ADC靶点的适用性，他们利用生物正交反电子需求Diels-Alder（IEDDA）反应生成非内化抗TAG-72 ADC。Exogenous palladiumBernardes等人开发了一种含双功能硫醚炔丙基氨基甲酸酯接头，允许外源钯激活裂解释放有效载荷。HER2纳米体ADC通过半胱氨酸与连接到阿霉素的硫醚炔丙基氨基甲酸酯接头的生物连接构建。Exogenous platinum非内化抗tenascin C ADC的通过铂外源激活释放有效载荷，Oliveira等人描述了一种基于抗tenascin-C的F16抗体的非内化ADC，利用铂外源激活释放有效载荷。结论目前越来越多的注意力转向了具有细胞外有效载荷释放机制的非内化ADC的开发，目的是改善与经典内化ADCs相关缺陷。非内化ADC是一个令人兴奋的新兴领域，可能有助于克服内化ADCs一些障碍，并有望在未来实现更广泛实体瘤治疗。参考文献：Non-internalising antibody–drug conjugates.DOI: 10.1039/d2cs00446a‍‍