浅谈生物药CMC研发进展
2023-03-22
上市批准细胞疗法免疫疗法IPO
前 言
本文主要介绍了国内外生物药进展情况，以及生物药尤其单克隆抗体药物的开发流程，着重阐述单克隆抗体药物CMC环节的承上启下的重要性与技术发展趋势与所遇到问题，从几个新技术点引发CMC领域思考，供行业参考讨论。
生物药物的发展离不开生物技术的发展，1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。上个世纪80年代，美国生物药进入产业化时代。1982年，美国礼来公司上市了世界上第一支重组人胰岛素“优泌林”，具有划时代意义。1986年，世界上首个单克隆抗体药物-抗CD3单抗OKT3获得美国食品和药物管理局（FDA）的上市批准，单克隆抗体药物产业化从此拉开序幕。而中国，首个重组人胰岛素（通化东宝公司）被CFDA批准上市是在1998年，生物药进入产业化时间比美国晚了16年。另外，从国内外首个生物技术公司IPO时间看，美国基因泰克公司IPO是1980年，而中国三生国健（原来是中信国健）公司商业化IPO是2007年，整整晚了27年时间。这些反映出中国国内生物制药发展差不多比美国晚接近30年，起步晚了很多。
值得庆幸的是，细胞治疗领域，尤其CAR-T细胞治疗，国内外研发与产业化进展比较接近。2017年8月，美国首个CAR-T细胞治疗药物Kymriah被FDA批准上市，标准着拉开CAR-T细胞治疗药物进入产业化序幕。2017年12月11日国家 CDE 官网的第一个 CAR-T 疗法临床试验受理的公开信息，标志着中国细胞疗法上市的帷幕已经揭开。希望中国CAR-T细胞治疗药物尽快进入上市，造福中国老百姓。目前，CAR-T细胞治疗药物走在前面的都是个体化CAR-T，产业化质量稳定性和一致性难以控制，而且成本昂贵，所以通用CAR-T细胞治疗是发展趋势。
下表是将中国生物制药归纳三个阶段： 2014年以前归为初始阶段，主要以仿制为主，不注重创新；2014-2016年归为第二阶段，可以理解为转折点，由生物类似药为主转为提倡创新，注重专利保护；2016以后归为最后阶段，创新为主 ，更加关注全球专利保护，走出国门，与美国生物药市场接轨，尤其中美双报，进入国际市场。
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来源: 行舟Drug
1. 生物药单克隆抗体市场情况
2017年全球最畅销的10个药物销售额
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2. 生物单克隆抗体药开发流程
简介药物开发主要流程为：靶点确定、discovery、临床前药学研究（IND）、临床实验（临床I、II、III期）、NDA/BLA、上市，见下流程图。
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但实际上，每个阶段都是需要大量的工作与时间积累，才能走向最终上市，下表是将药物开发每个阶段关键点与时间表进行了汇总。其中discovery时间可能花的时间2-5年，笔者认为此部分工作花的时间与工作量，是非常之关键，因为它决定了后续模块的成败与速度，所以很多做药物开发的工作者，宁愿在discovery阶段将工作做得扎实详细。
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CMC（Chemical Manufacturing and Control）,名词是沿用化学制药领域专有名词，也适用于生物制药，主要是生产工艺、杂质研究、质量研究，稳定性研究等药学研究资料，是药品申报资料中非常重要的部分，它是discovery与临床之间非常重要的环节，也是药品上市重要组成部分。
下表是化学制药与生物制药CMC领域对比，相对于化学制药CMC开发难度，生物制药更加难，因为生物药主要是由活的细胞或生物表达蛋白类大分子，蛋白的空间结构、翻译后修饰、稳定性等比化药复杂，工艺更加难以控制，所以在生物制药领域CMC需要结合生物技术的发展，不断提升CMC水平。
3. 生物药单克隆抗体药CMC技术进展浅析
3.1 细胞株开发
细胞株是单克隆抗体药物CMC非常重要的一个模块，细胞株的好坏，直接决定工艺开发的难度与药物质量好否，甚至决定后续放大生产的成败与速度。下面简单谈谈细胞株开发的几个关键点：
1）宿主细胞和Select Marker体系选择。CHO宿主细胞种类主要有： DG44、CHO K1、CHO-S、CHOK1SV（lonza公司2002年）和CHOK1SV GS-KO（Lonza公司2012年）、CHO-K1Q（康晟）、CHOZN/CHO K1（Merk公司（原SAFC）2006年）、Horizon Discovery CHO-K1HD-BioP3（Horizon公司） 等。其中Lonaza、Merk、Horizon公司的GS缺陷型宿主细胞，在克隆筛选阶段会缩短一定时间，但收费都较为昂贵；Thermo（原Life technologies）公司的CHO-S宿主细胞，在生长最高密度具有较大优势，Fed-batch培养基最高密度达到30×106 cells/ml以上，同时细胞培增时间在17-20小时范围，对于细胞工艺开发和放大，CHO-S宿主细胞是不错的选择。由于GS体系表达量较DHFR体系高，以及在细胞培养工艺以及放大过程中无需添加Glutamine或GlutaMax，能够避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低工艺控制难度，可有效提高细胞密度和延长细胞生存时间，同时也节省Glutamine或GlutaMax试剂费用。
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研发阶段很多细胞株可以免费试用，商业化生产阶段，均需要支付商业化生产许可费用。
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2）表达载体构建。CHO细胞表达载体，主要在启动子、密码子会进行优化工作，如果是设计单个载体系统，即将轻链、重链插入一个载体中，在启动子方面可能会有差异，一般重链的启动子比轻链的启动子要强。当然商业化的表达载体，目前使用较多的是Thermo（原Life technologies）公司的Freedom pCHO1.0载体，它是单个载体系统，基本与CHO-S宿主细胞配套，一般细胞株可以做到3.0 g/L。
3）单克隆筛选技术。目前随着科技的发展，有传统的 有限稀释法、流式细胞仪法、Clone Pix system筛选法、Single Cell Printer（Cytena）、Beacon单细胞光导系统筛选法 。当然还有单克隆影像学拍照仪器，如： MolecularDevices公司的CSI（Cell SelectImager）仪器、Solentim公司的Cell Metric或Cell Metric CLD 等。仪器越来越高效、越来越智能化。尤其一些新技术，国内引进比较晚，例如 Single Cell Printer（Cytena） 、Beacon单细胞光导系统筛选法两个方法，国内企业陆续采用。 SingleCell Printer分选细胞较流式细胞仪对细胞的损伤要小很多，由于流式细胞仪的鞘液压力较大，以及电场的影响，导致细胞分选过程受损 。 Beacon单细胞光导系统 是集抗体研发和细胞株构建一体的仪器，最大的优点可以快速检测单个细胞表达量以及细胞株的稳定性。
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4）定点整合技术。目前工业上主要是外源基因随机整合到宿主细胞基因组中，通常需要多轮克隆筛选才能产生可接受的高表达克隆，但每当构建新的表达体系时仍然要重新筛选单克隆过程。同源重组或CRISPR/Cas9介导的同源重组技术，对已知强转录活性区实现同源重组，形成可定点插入目的基因的“Landing Pad”，大多数在强转录活性区。定点插入目的基因的细胞无需进行单克隆筛选，在有无选择压力条件下均可实现目的基因的高效稳定表达。但此技术还未大规模推广，主要原因应该技术还未成熟。
3.2 连续工艺
1）灌注培养工艺。 流加工艺（Fed-batch）和灌流工艺（Perfusion） 在达到相同的生产量，培养的体积可能相差10倍左右，所以在很多制药企业，在受场地限制和生产规模限制，而且随着Perfusion工艺技术的提高，很多产品会更加选择Perfusion工艺进行生产。例如，原来产品规模需要2000L规模，如果选择Perfusion工艺，可能仅仅需要200L规模。然而，国内使用Perfusion工艺生产单抗药物的企业局指可数，药明生物、嘉和生物、复宏汉霖等企业具有Perfusion工艺平台，其他大部分企业依然使用Fed-batch工艺。但Perfusion是单抗产业化发展的一个趋势，同时国内企业具有自主开发的培养基，成本也大大降低；国产品牌培养基发展迅速，例如 奥普迈、中山康晟生物、建顺、倍谙基、多宁、源培、艾米能斯 等，也降低了细胞培养成本。
2）灌注与流加结合培养工艺。由于灌注培养工艺中对培养基依赖非常大，对于成本的考虑，或者基于本身工艺的放大风险的控制。有企业开发的工艺会将灌注与流加结合的培养模式进行开发，例如在种子扩增阶段（种子罐）采用灌注培养提高种子密度，而最终大反应器即生产罐采用Fed-batch培养（14天）工艺，目的是可以节省更大的种子罐，同时降低大罐成本以及操作风险。
3）封闭系统技术。从上游到下游，尤其是DS和DP，工艺中提倡采取全程封闭系统，降低污染风险。此技术应用于CAR-T细胞治疗领域比较多，由于细胞治疗药物更需要封闭系统操作降低外源因子污染的风险。
4）层析连续流工艺。纯化工艺效率直接影响单抗产业化成本，国内浙江大学林东强教授提出了层析连续流、混合模式层析等理论，在纯化层析效率以及成本降低得到显著效果，尤其是层析连续流正在大规模生产应用。
5）在线实时监测技术。目前大部分工艺依然为离线监测，但在线实时监测是早期工艺开发、中试和GMP生产更贴近制药工业的GLP/GMP规范和PAT/QbD的设计理念。例如反应器中细胞密度、活率和细胞代谢产物乳酸、铵根离子、葡萄糖浓度、抗体滴度等等，还有下游纯化过程中杂质、物质结构等监控，目前工业上较多使用是Kaiser Raman拉曼光谱仪，无需取样，可以实时在线监测多个生物工艺参数。
3.3 大规模生产技术对于单抗药物，一次性技术应用于单抗药物产业化越来越多，主要原因为：a）传统不锈钢设备，建厂时间长，CIP（在位清洗）和SIP（在位灭菌）成功昂贵以及验证复杂，交叉污染的风险高，运行成本高等；b）一次性生产技术无需：清洁洁净、消毒灭菌、建厂工程设计、产能验证等，降低建厂投资成本、降低厂房生产面积、提高批生产效率。目前国内大部分单抗制药公司生产厂房采用一次性生产技术。
基于封闭系统、连续工艺等新兴技术的发展，在大规模生产技术革新中，最近几年，提出模块化工厂理念，更加快速、高效的建厂与生产。
4. 国内生物制药挑战与机遇
4.1 国内生物制药企业创新理念
从国内单抗药物申报情况来看，绝大部分企业都是从事生物类似药（bio-similar或者bio-better），较少企业从事单抗创新药物。可能的原因：1）创新药物研发周期长、投资大、风险高，往往多数创新药物开发在临床阶段出现问题，最终不能成功。而生物类似药风险相对低很多，它的药效、毒理以及临床数据，已经具有参考，所以出问题的几率相对小；2）国内企业很少从事前期发现（discovery）工作，尤其是药物的发现和药物前期研究，毕竟企业是需要盈利，大部分企业不愿意从事这样的工作；3）国内生物制药企业，数量多，但不强。据不完全统计，国内有7000家药品生产企业，但能进入国际品牌的制药公司，寥寥无几。而国外的制药企业，尤其美国，制药企业投入研发的资金比例远远超过国内企业，并且大部分企业具有创新理念，例如辉瑞、罗氏、基因泰克等。
4.2 国内单抗行业趋势与机遇
国内主要生物制药支持政策
2011.7《国家“十二五”科学和技术发展规划》
2011.10《医学科技发展“十二五”规划》
2011.11《“十二五”生物技术发展规划》
2012.1《医药工业“十二五”发展规划》
2012.7《“十二五”国家战略性新兴产业发展规划》
2012.12《国务院关于印发生物产业发展规划的通知》
2013.1《生物产业发展十二五规划》
2014.32015年重大新药创制科技重大专项启动
2016.3《关于促进医药产业健康发展的指导意见》
2017.1《中华人民共和国国民经济和社会发展第十三个五年规划纲要》和《“十三五”国家战略性新兴产业发展规划》
2017.1“十三五”生物产业发展规划
2017.6中国加入ICH
2017.10《关于深化审评制度改革鼓励药品医疗器械创新的意见》
同时随着单克隆抗体的技术不断发展和成熟，抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC)和双特异性抗体在国内近几年发展较快，是未来重要的发展趋势。
单克隆抗体药物在国内市场空间巨大、国家支持政策较大、大量回国技术人员创业就业以及工艺技术日益成熟，在国内单抗行业是非常具有很好的前景。
5. 结语
目前中国抗体药物市场空间非常巨大，同时国家支持政策很大，人才不断聚集，单抗产业正进入关键的发展时期，鼓励企业和高校做创新药，同时开发自己的培养基和细胞培养工艺平台模式，积累大规模培养技术和生产技术，选择合适的CMC产业化方式，促使整个抗体药物产业健康发展。
6. 参考文献
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[9] 陶维红，李宗海，李荣秀. 我国单克隆抗体药物产业化进展浅谈，生物产业技术
[10] Goldman Sochs，China Biotech Primer
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