Regorafenib

导读前两期，我们讲到了受体酪氨酸激酶 RTKs（学懂通路第一期、第二期）。RTKs既是承接胞外信号的细胞膜受体，也是将信号传递至细胞内的“中转站”。本期我们将打开细胞的大门，走进细胞，学习一种重要的细胞内信号传递通路，感受信号通路从胞外进入胞内，直到进入核内并调控基因的表达、诱导特定生理效应产生的神奇过程。01前言促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，是细胞增殖、分化、细胞凋亡以及正常条件和病理条件下应激反应的关键信号通路。MAPK 是一组进化保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，可分为4个亚族：ERK、p38、JNK和BMK1（也称：ERK5）， 分别代表四条经典的MAPK通路。MAPK信号通路是一个级联磷酸化的过程，核心成员包括：MAP kinase kinase kinase ( MAPKKK或MKKK)、MAP kinase kinase (MAPKK或MKK)和MAP Kinase（MAPK）。目前，已经分别有25、7、13种MAPKKK、MAPKK、MAPK被鉴定出。其中，以RAF为代表的MAPKKK，作用于以MEK为代表的MAPKK，使之磷酸化并活化，活化的MEK再作用于MAPK家族信号分子，使之磷化并活化，活化的MAPK进入细胞核内调节转录调控。图 1. MAPK的四条经典通路02RAS-Raf-MEK 1/2-ERK 1/2 通路1.1  信号传递过程目前，MAPK家族中研究最为广泛的是ERK1/ERK2激酶。该通路的具体过程是：胞外的生长因子如EGF，激活酪氨酸激酶受体（如EGFR），提供接头蛋白GRB2的结合位点，招募SOS蛋白到细胞膜上。SOS通过消耗GTP活化Ras形成Ras-GTP。图 2. Ras的下游蛋白如上图所示，Ras活化后可以与下游多个蛋白产生效应，包括：AF6、PI3K、PLCε、RAF等。其中，Ras-GTP通过将Raf蛋白招募到质膜上后，使其被其他多种激酶(PKA、PAK、SRC)磷酸化，激活其激酶功能。Raf蛋白家族包含BRAF、ARAF和CRAF（Raf1），BRAF在恶性肿瘤形成、发展过程中发挥重要作用。活化的Raf激酶再进一步与下游的MEK 1/2结合并使ERK1/2激活。激活的ERK1/2 能够继续磷酸化ELK1, ETS, FOS, JUN, MYC 和SP1等转录因子，诱导与细胞周期与细胞增殖有关的基因表达；此外，激活的ERK1/2 也可以磷酸化多种细胞内的激酶，例如：RAKs、MSKs、MNKs，这些激酶对细胞的增殖和粘附产生作用。1.2  信号通路与肿瘤下图是不同实体瘤中发现的与RTK/RAS/RAF 通路相关的突变，这条信号通路与多个癌种的发生密切相关，针对这条通路上的关键靶点，已成功上市多个药物。图 3. 实体瘤中与Ras-Raf-MEK通路有关的突变1.2.1 Ras与肿瘤Ras是一种GTP结合蛋白，主要包括：H-Ras/K-Ras/N-Ras，三者相互间具有85％的氨基酸同源序列，是癌症研究的重要靶标。其中， Kras是Ras家族中最常出现的亚型，占Ras基因突变总数的85%。研究发现，Kras在90 % 胰腺导管癌中均发现突变；此外，在黑色素瘤中，Ras突变近于28％左右，其中N-Ras为主要突变体（93％）。虽然Ras与肿瘤的发生发展密切相关，但是目前仍未有直接针对Ras的靶向药物上市。最主要一个原因在于Ras蛋白的无特征、近乎球形的结构，无明显结合位点，因此在很长一段时间都被当做“不可成药靶点”。但是近年来，针对共价抑制剂研究和靶向降解剂的出现使得靶向KRAS突变体成为可能。图 4.  针对该通路各个环节开发靶向药物1.2.2 BRAF与肿瘤 RAF基因家族包含BRAF、ARAF和CRAF，其中，BRAF在恶性肿瘤形成、发展过程中发挥重要作用。BRAF最常见突变形式为第15外显子的第1,799位核苷酸上T突变为A，导致其编码的缬氨酸变为谷氨酸，即BRAF V600E突变（占BRAF所有突变的80 %）。这一突变使BRAF蛋白持续激活，活性提高约500倍，并且能够不依赖于上游RAS激酶单体，持续激活下游的ERK，最终导致细胞的无限增殖和分裂。目前针对BRAF单靶点/多靶点的药物主要有：达拉非尼、瑞戈非尼、维罗非尼、索拉非尼等。1.2.3 MEK与肿瘤MEK1/2作为易突变的蛋白Ras、Raf下游蛋白，因此也可以作为一个靶点。目前，该靶点获批的抑制剂主要用于黑色素瘤以及肺腺癌，如曲美替尼（trametinib）、司美替尼（selumetinib）等。1.2.4 ERK与肿瘤 ERK激酶是MEK激酶的唯一下游靶点，研究显示，靶向于ERK靶点的抑制剂能够有效阻断RAS-RAF-MEK-ERK信号通路，同时能够有效逆转由上游BRAF、MEK突变而导致的耐药。目前ERK抑制剂处于临床试验的主要有：AZD0364、KO-947、Ulixertinib。值得注意的是，由上海海和药物与中国科学院上海药物研究所合作开发的小分子抑制剂HH2710也已于2019年9月获美国FDA的临床试验许可，拟用于治疗经检测确认存在MAPK信号通路基因异常的恶性肿瘤。03其他三种MAPK通路图 5. ERK 1/2 和其他三种MAPK通路除了大家熟知的的Ras-Raf-MEK-ERK通路，根据MAPK的种类不同（p38、JNK、ERK5），MAPK还有三条经典的通路。其中，p38和JNK通路涉及的生理效应主要与炎症和细胞凋亡等应激反应有关。2.1 JNK/SAPK级联反应 JNK（JUN N -terminal kinases, JNK）主要包括JNK1/2/3，也称作SAPKs（stress-activated protein kinases）。JNK/SAPK信号通路 可被应激刺激(如紫外线、热休克、高渗刺激及蛋白合成抑制剂等)、细胞因子(TNFα，IL-1)、生长因子(EGF)及某些G蛋白偶联的受体激活。应激反应信号经小分子G蛋白Ras超家族的成员之一Rho 亚家族（Rac、Rho、cdc42）传递到MAPKKK，进一步地依次活化MEK4/7和JNK。JNK磷酸化激活后可以作用下游多种转录因子（例如：JUN、ELK1、ETS2等）与激酶（主要是MNK），产生促进生长、分化、存活、凋亡等多种生理效应。图 6. JNK/SAPK级联反应2.2 p38级联反应P38激酶主要有四种：p38 α, β, γ 和δ，诱导该通路的主要诱因有：缺氧，紫外线辐射，渗透性休克，炎症等应激反应。P38 MAPK激酶主要由ERK3/6磷酸化激活，进一步地通过诱导转录因子及激酶促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。此外，该通路对细胞运动也有促进作用。2.3 BMK1 （ERK5）级联反应ERK5可以被上游的MEK5激活。与ERK1/2通路类似，该通路也与细胞增殖有关。参考文献：[1] Robert, Jacques. Textbook of Cell Signalling in Cancer [M]. Springer International Publishing, 2015.[2]  Wagener C , Stocking C , O. Müller. Cancer Signaling - From Molecular Biology to Targeted Therapy[M]. 2017.[3] Amanda H . Cancer cell signalling[M]. Wiley Blackwell, 2014.[4]  Comprehensive pancancer genomic analysis reveals (RTK)-RAS-RAF-MEK as a key dysregulated pathway in cancer: Its clinical implications. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2017.11.016.部分素材来源于互联网，只为知识传播，不做商业用途，侵删。预告第二期：PI3K通路；第三期：细胞因子通路；做号不易，感恩“分享”

导读上一期我们讲到RTKs的分类、结构功能，并以一个重要的家族—表皮生长因子受体（EGFR）家族RTK为例，阐述配体和受体的结合方式（学懂通路第一期）。本期我们对其他家族的RTKs进行概述。01血小板衍生生长因子 (PDGF) 受体及相关受体家族上图是血小板衍生生长因子（PDGF）受体家族配体与受体激活模式示意图。目前鉴定出能够激活PDGFR的配体主要有四种：PDGFA、PDGFB、PDGFC与PDGFD。它们通过二硫键形成具有活性的同源二聚体(AA, BB, CC、DD)以及异源二聚体（AB）。当二聚体配体与受体结合后，引起受体不同亚型（PDGFR-α, PDGFR-β）的二聚化（αα, ββ，αβ），进一步将信号传递到细胞内，引起胞内效应产生。研究发现，PDGF与肿瘤发生生长过程关系密切，尤其是能够促进肿瘤血管生成。PDGFR通路与另一种肿瘤血管生成有关的信号通路—VEGFR通路关系密切。涉及PDGFR的药物大多为双靶点或多靶点，例如Sunitinib、Axitinib、Cediranib 。此外，除了上述PDGF的受体（PDGFR-α, PDGFR-β）外，本家族还包括SCF、Flt-3LG 和M-CSF/IL-34的受体（参见上期表1）。注：SCF ：Stem Cell Factor干细胞因子，也称作：KITLG (即：KIT配体)；受体为：KIT/ SCFR；FLT3LG: FMSlike tyrosine kinase-3 ligand，FMS样酪氨酸激酶3配体；受体为 FLT3；MCSF: 巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）和白介素- 34 (IL34) 受体均为 CSF1R；02血管内皮生长因子（VEGF）受体家族血管内表皮生长因子（VEGF）主要由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子PGF/PIGF 等5个成员组成（VEGF E和VEGF F是蛇毒来源，此处不作论述）。而血管内表皮生长因子受体（VEGFR）包括三种类型：VEGFR1, VEGFR2 及VEGFR3。VEGF与VEGFR的主要作用模式如上图所示。其中VEGFR-2主要表达在血管内皮细胞，是VEGF的主要受体，VEGFA/VEGFR-2是诱导血管生成的最主要通路。由于肿瘤细胞生长代谢旺盛，需要通过新生血管供应能量，因此靶向VEGF/VEGFR 通路是一种抑制肿瘤生长的思路。前面我们也提到，很多RTKs通路之间存在交叉，VEGFR也不例外。目前FDA批准的涉及VEGFR靶点的药物均为多靶点药物：分别为midostaurin（急性髓细胞性白血病、肥大细胞白血病）、lenvatinib（分化型甲状腺癌）、nintedanib（特发性肺纤维化）、axitinib（肾细胞癌）、regorafenib（结肠直肠癌、肺细胞癌、胃肠道间质瘤）、cabozantinib（肾细胞癌、肺细胞癌、髓甲状腺癌）、ponatinib（慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病）、vandetanib（甲状腺癌）、pazopanib（肾细胞癌、软组织肉瘤）、sunitinib（肾细胞癌、胃肠道间质瘤、胰腺神经内分泌肿瘤）和sorafenib（甲状腺癌、肾细胞癌）。针对VEGF的单抗也已经批准上市，例如:贝伐珠单抗（Bevacizumab）能够高亲和力且特异性地结合VEGF，抑制肿瘤血管增生的作用，获批上市用于转移性结肠癌治疗。03胰岛素受体（INSR）家族胰岛素受体家族包括胰岛素受体( insulin receptor，INSR) ，胰岛素样生长因子受体( insulin-like growth factor receptor，IGFR)，胰岛素受体相关受体( insulin receptor-relatedreceptor，INSRR) 。胰岛素受体家族成员可以与各自的配体：胰岛素(Insulin，INS) 、胰岛素样生长因子( IGF-1或IGF-2)结合发挥激酶作用。配体INS、IGF1、IGF2与不同受体之间的作用模式图如上图所示。根据组织特异性，胰岛素受体（INSR）有A和B两种亚型，IGF-2和INS能够与许多上皮组织表达的INSR-A受体结合（诱导同源二聚化或与INSR-B异源二聚化)，促进细胞生长；而INSR-B是一种高度特异性的胰岛素受体，主要在INS敏感组织中表达，只有INS能够诱导INSR-B同源二聚体的产生，调节葡萄糖稳态。此外，IGF1和IGF2能够诱导IGF1R的同源二聚化，也可以诱导INSR（A或者B）与IGF1R的异源二聚化。写到这里肯定有读者要问：有没有IGF2R？其实是有的，但是IGF2R结合IGF2之后，并不能转录信号，反而引起通路抑制，因此我们这里就不提了。研究表明，INSR-A和IGF1R在肿瘤细胞高表达；PI3K途径（第四期介绍）是INS、IGF激活相应受体下游的主要通路。反之，IGF2R则表现出肿瘤抑制的功能。04成纤维细胞生长因子（FGF）及其受体成纤维细胞因子家族一共有18种细胞因子，而与之对应的是4种成纤维细胞因子受体（FGR1、FGR2、FGR3、FGR4）。FGF-FGFR的主要功能是将FGF信号转导到RAS-ERK和PI3K-AKT等途径的信号级联放大。FGR1、FGR2、FGR3都存在两种b、c亚型，在间质(结膜)组织或上皮组织表达。简易的作用模式图如上图，图中仅展示了7种FGF。FGFR的功能异常在多种肿瘤中发现，其中基因扩增、基因突变以及染色体重排是导致FGFR异常激活的主要原因。目前，单一针对FGFR的抑制剂很少，大多是多靶点抑制剂。05肝细胞生长因子(HGF)和c-MET受体肝细胞生长因子(HGF)主要通过细胞膜上的特异性受体c-MET发挥生物学作用。c-MET是原癌基因c-MET编码的具有自主磷酸化活性的跨膜受体，由50 KD的α亚基和145 KD的β亚基组成的异二聚体。HGF具有两个c-MET受体结合域，其前体经蛋白水解酶水解作用产生活性形式。成熟的HGF分子由分子量为96KD的α链和分子量为34KD的β链组成。HGF是由间质细胞分泌，但c-MET受体却主要在上皮细胞表达，故认为HGF是上皮-间质相互作用的介质。细胞癌变的一个典型标志是出现上皮-间质转化，而c-MET被认为在其中起到了关键驱动作用。研究发现，由于c-MET基因扩增、突变、染色体重排等导致c-MET在多种肿瘤中异常表达，而c-MET的不适当激活促进细胞增殖、细胞运动、侵袭性和血管生成，并与更具侵袭性的表型和较低的生存率相关。   06胶质细胞神经营养因子(GDNF)和RET受体胶质细胞神经营养因子（GDNF）家族包括 neurturin、persephin、artemin及 GDNF 四个成员。GDNF能够被胞外蛋白GFRα1/2/3/4特异性地结合,但由于GFRα1/2/3/4缺乏跨膜和胞内结构域，无法单独完成信号传导。因此，GFRα通过促进RET蛋白受体的磷酸化并使RET进入激活状态，激活下游通路。RET是由c-RET原癌基因编码的一种受体酪氨酸激酶，磷酸化的RET激活其下游的丝裂原活化蛋白激酶MAPK、P13激酶等，导致一系列胞内途径的激活，从而发挥GDNF家族神经营养因子的生理功能。RET的突变与II型多发性内分泌肿瘤相关，甲状腺髓样癌（MTC）中可观察到RET基因的突变，突变形式主要是点突变。总的来说，RET基因突变比较低频，主要的突变形式是与其他基因发生融合。07间变性淋巴瘤激酶受体（ALK）和白细胞受体酪氨酸激酶受体(LTK)ALK(间变性淋巴瘤激酶)和LTK(白细胞受体酪氨酸激酶)，最早是在淋巴瘤中被发现。在大部分正常细胞中ALK呈非活化状态，当ALK基因发生突变，常导致蛋白异常活化。ALK激活突变主要发生在神经母胶质瘤（neuroblastoma）中，在甲状腺癌、肺癌等肿瘤中也能检测到ALK激活型突变。由于没有鉴定出ALK的配体，长久以来ALK一直是一个孤儿受体（orphan receptor）（曾有研究人员鉴定出Pleiotrophin (PTN) 和Midkine (MK)可以与ALK结合，但是争议很大）。2015年1月，耶鲁大学医学院药理学系主任Joseph Schlessinger的研究团队在science发文称：herparin（肝素）是ALK真正的受体。目前已经上市的ALK 小分子抑制剂包括1代的克唑替尼（Crizotinib）；2代的塞瑞替尼（Ceritinib）、阿来替尼（Alectinib）、布加替尼（Brigatinib）；以及3代的劳拉替尼（Lorlatinib）。国产的2代药恩沙替尼（Ensartinib）也已经在去年上市。08血管生成素(ANG)和TIE受体血管生成通过人体中存在的诸多互补和复杂的信号途径调节的。其中主要的三条通路有：血管内皮生长因子 (VEGF)- 血管内皮生长因子受体 (VEGFR) 、血管生成素 (ANG)-TIE2 轴和 DLL4-Notch通路。ANG家族是唯一既含激动作用又含抑制作用的促血管生成因子，包含ANG1, 2 和 4三个成员，通过诱导内皮细胞上的酪氨酸激酶受体TIE-2同源二聚化，参与血管生成；同时，ANG-2也可以通过诱导TIE-1、TIE-2 异源二聚化，从而抑制血管生成。09肝配蛋白（Ephrins）及EPH受体促红细胞生成素产生肝细胞受体 (Eph)及其配体ephrins作为酪氨酸蛋白激酶受体家族最大的亚群，在细胞黏附、定位、迁移和分化过程中起关键作用。Ephrins可分为A、B两类，对应两类EPH受体，其相互作用模式目前还未完全研究清楚。EPH受体介导的分子内信号传递主要由细胞内酪氨酸激酶ABL及Rho GTP酶的鸟苷酸交换因子介导，对细胞的增值/迁徙产生激活或抑制作用。10神经营养酪氨酸激酶受体（NTRK）/ 原肌凝蛋白受体激酶(TRK )Tropomyosin receptor kinase （原肌球蛋白受体激酶，TRK ），也称作Neurotrophin receptor kinase（神经营养受体酪氨酸激酶，NTRK），是一类受体酪氨酸激酶家族，包括分别由NTRK1、NTRK 2和NTRK3基因编码的TrkA、TrkB和TrkC三种受体。在健康组织中，NTRK与神经生长因子（NGF）等配体组成的通路参与神经系统的发育和功能以及细胞存活，在健康组织中起重要的作用。在某些情况下，NTRK 基因与一个不相关的基因融合，导致 Trk 信号不受控制地激活，从而导致癌症发生。在常见的癌症如肺癌，乳腺癌，结直肠癌中，只有1%~5%的患者存在NTRK 基因融合，而一些罕见的癌症，比如婴儿纤维肉瘤和分泌型乳腺癌，存在NTRK融合的频率却高达90%~100%。针对NTRK融合突变上市的药物及在研的药物临床效果显著，因此NTRK也称为“钻石”基因。目前，全球上市的用于治疗NTRK融合基因实体瘤的药物有两个，分别是拜耳/LOXO的拉罗替尼（2018年11月被FDA批准上市）以及罗氏的恩曲替尼（2019年8月被FDA批准上市）。11TAM受体 TAM受体包括三个成员，即：TYRO3、AXL和MERTK受体。与之对应的是两个配体：GAS6和PROS1。该受体家族的基因最初从白血病细胞中克隆出来的，并被认为是原癌基因，其表达水平与实体肿瘤，尤其是胶质母细胞瘤的恶性程度有关，但未发现基因突变或重排。12盘状结构域受体（DDR受体）盘状结构域受体（discoidindomain receptors, DDRs）是一种受体型蛋白酪氨酸激酶，包括 DDR1 和 DDR2，该类蛋白的胞外结构域上含有一个类似于盘基网柄菌凝集素盘状结构域 1的结构，也称盘状结构域（DR 区）；其次，在 DR 区与跨膜区之间有很长的近膜区（JM区）。     DDRs 在人和小鼠组织中表达广泛，能与多种胶原蛋白特异性结合并被激活,参与多种疾病过程,如肿瘤、炎性反应和纤维化的发生发展。13受体酪氨酸激酶样孤儿受体（ROR）受体酪氨酸激酶样孤儿受体（ROR）家族包括ROR1、ROR2两个受体，与核受体中的ROR家族不同，ROR是一类膜受体，由于ROR蛋白最初发现时配体未知，所以被定义为孤儿受体 。有研究表明：ROR1通过识别WNT蛋白介导的非经典WNT信号通路传递，在多种生理过程中发挥重要作用，包括调节细胞分裂、增殖、迁移和细胞趋化等。14ROS 受体ROS受体是由原癌基因c-ROS编码的受体酪氨酸激酶，其配体未知。ROS基因重排在胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌等多个恶性肿瘤中发现，导致激酶持续激活，上调多种下游信号通路，导致细胞持续增殖生。此外，ROS基因还与多个基因发生融合突变。参考文献：[1] Robert, Jacques. Textbook of Cell Signalling in Cancer [M]. Springer International Publishing, 2015.[2]  Wagener C , Stocking C , O. Müller. Cancer Signaling - From Molecular Biology to Targeted Therapy[M]. 2017.[3] Amanda H . Cancer cell signalling[M]. Wiley Blackwell, 2014.部分信息图片来源于网络，侵权联系后台删除。下期预告第三期：MAPK通路；第三期：PI3K通路；感谢支持，欢迎“分享”和“点赞”