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近日，四川大学陈俐娟&杨建洪团队在国际顶级药物化学期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为“具有脑渗透性的高选择性PARP1抑制剂的设计、合成及药效学评价”的研究论文。该研究聚焦于设计、合成并评估一类具有高选择性且能穿透血脑屏障的PARP1抑制剂。研究团队基于临床候选药物AZD9574，通过引入多种取代基，成功筛选出一系列化合物，其中T26表现出优异的PARP1选择性，其IC50值仅为 0.2 nM，对PARP2的IC50值高达 122 nM，显示出超过610倍的选择性。此外，T26 还具有良好的药代动力学特性，与AZD9574相比，其 AUC0−t 和 T1/2 更为出色，有望减少给药频率并降低每日给药可能带来的潜在毒性。在体外和体内模型中，T26 均展现出显著的抗肿瘤效果，且能穿过血脑屏障，对乳腺癌脑转移具有一定的治疗潜力。尽管T26在PARP1选择性和血脑屏障穿透能力方面略逊于AZD9574，但该研究为下一代高选择性 PARP1 抑制剂的开发提供了宝贵的策略骨架。 图片来源：ACS 公众号前文介绍了阿斯利康披露其阿斯利康披露II期临床的中枢穿透性、选择性PARP1抑制剂AZD9574的发现过程（点击下图跳转） 01 Background 研究背景 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）家族在细胞过程如转录、染色质重塑和DNA损伤响应中发挥关键作用。单药PARP抑制剂（PARPi）可诱导具有同源重组修复缺陷的癌细胞合成致死，特别是在BRCA1和BRCA2基因功能受损突变的癌细胞中。这些发现得到了临床前研究和临床试验的证实。目前，已有六种PARP抑制剂获批用于癌症治疗，包括奥拉帕利、鲁卡帕利、尼拉帕利、他拉唑帕利、氟唑帕利和帕米帕利。这些抑制剂被用于治疗携带BRCA1和BRCA2突变的乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。然而，这些PARPi对PARP1和PARP2都有结合和抑制作用。研究表明，单独抑制PARP1就足以诱导同源重组修复缺陷癌细胞死亡，而PARP2抑制与血液毒性相关。研究显示，PARP2的缺失会缩短小鼠红细胞寿命，损害红系祖细胞分化，并导致慢性贫血。此外，小鼠中PARP2的基因敲除会破坏精子发生、脂肪生成和胸腺生成。因此，设计高选择性的PARP1抑制剂不仅可以满足肿瘤治疗的需求，还可以减少与PARP2抑制相关的毒性副作用，同时实现PARP1抑制剂的合成致死。目前，已报道了四种选择性PARP1抑制剂：BYK204165、NMSP118、AZD5305和AZD9574，其中AZD5305在临床开发中最为领先。然而，AZD5305在穿过血脑屏障方面的效果有限。令人鼓舞的是，AZD9574是一种高选择性的PARP1抑制剂，能够穿过血脑屏障且血液毒性低，目前正在进行临床试验。因此，能够穿过血脑屏障的高选择性PARP1抑制剂有望成为PARPi类药物的宝贵补充，为同源重组修复缺陷乳腺癌脑转移提供更有效的治疗。基于这些认识，研究人员着手开发一种能够穿过血脑屏障的高效且选择性的PARP1抑制剂。 图片来源：ACS 02 Drug Design 药物设计与评价 ①基于AZD9574的PARP1抑制剂的合理设计策略 研究团队基于AZD9574这一临床候选药物，采用合理的药物设计策略来开发高选择性的PARP1抑制剂。他们首先通过结构分析已知的PARP1抑制剂，发现酰胺基团是与Ser904和Gly863形成关键氢键的共同片段。接着，团队利用分子对接技术将AZD9574与目标蛋白结合，生成了两个比较模型，分别去除了酰胺基团的NH和羰基氧，并对这些复合物进行了分子动力学模拟。结果显示，完整的AZD9574在1000 ns的模拟时间内能够稳定地结合在口袋中，而缺少NH的配体在两个平行的500 ns模拟中无法稳定地停留在口袋内。虽然缺少羰基的配体也能与PARP1蛋白稳定结合，但其与初始参考构象的RMSD值略高于完整的AZD9574，表明其结合构象与已知复合物晶体结构略有不同。随后，团队进行了MM/GBSA计算，并对残基进行了能量分解，结果表明酰胺基团的“NH”和羰基的缺失显著降低了结合能，残基分解图揭示了在酰亚胺基团结合区域的G863和Y907残基存在显著差异。因此，研究团队推测加强与这两个残基的相互作用可能延长配体在口袋内的停留时间，从而可能增强配体的药代动力学特性。 ②构效关系探究 基于计算模拟结果，研究团队设计了一系列化合物，以探索与AZD9574的构象关系，最初优化了区域A的结构。生物活性测试显示了这一设计的有效性。化合物T1通过将双环上的甲基替换为乙基而得到，以AZD9574为结构模板。尽管这种修饰增加了对PARP1的酶活性，但生物活性测试显示细胞IC50降低至87.1 nM。接着，通过将氮原子从双环的左侧移动到右侧，生成了化合物T2。该化合物对PARP1表现出极佳的活性，IC50值为0.41 nM，而对PARP2的IC50为108 nM，显示出263.4的选择性高指数。然而，其抗增殖活性低于AZD9574，在MDA-MB-436细胞中的IC50为43.1 nM，仍需进一步优化。为了研究电子吸引基团的潜在影响，研究团队从双环上去除了氟原子，得到了化合物T3−5。这一调整意外地发现，化合物T3具有极佳的细胞抗增殖活性，IC50值为2.8 nM，并保持了对PARP1的活性和高选择性指数。相反，引入额外的电子供体基团，如双环上的甲基和环丙基，显著降低了对PARP1/2的选择性，T4和T5的选择性比率分别为59.4倍和小于23.5倍。因此，基于对酶活性、PARP1/2选择性和MDA-MB-436肿瘤细胞中细胞效力的全面评估，选择了T3进行后续修饰。 图片来源：ACS 对于PARP家族蛋白，区域A的结合位点相对保守，而区域B和C对于设计选择性PARP1抑制剂至关重要。因此，研究团队对AZD9574在奥拉帕利与PARP1和PARP2复合物中的1微秒分子动力学模拟进行了残基自由能分解。结果识别出了潜在的选择性残基，包括区域B位点中Asp766（PARP1）和Glu335（PARP2）、Glu763（PARP1）和Gln332（PARP2）之间的差异，以及区域C位点中Leu769（PARP1）和Gly338（PARP2）之间的差异。为了应对区域B的差异，研究团队提出将哌嗪环转换为四氢吡啶，以增强该区域的刚性和极性，与PARP2中的Glu335产生更不利的相互作用，从而增加PARP1的选择性。关于区域C的残基差异以及区域B中Asp766和Glu335的区别，研究团队考虑在芳香环上添加和替换电子吸引基团，以增加其正电荷，进一步增强PARP1和PARP2之间的选择性。研究团队优化了化合物的区域B和C，得到了T13−20。化合物T13−16保持了显著的PARP1抑制活性，T16显示出对PARP1的卓越选择性，选择性指数高达729.2倍。此外，这四种化合物在MDA-MB-436肿瘤细胞中显示出强大的抗增殖效果，IC50值分别为1.8、4.1、3.5和1.9 nM。随后，将区域B中的哌嗪替换为四氢吡啶，合成了化合物T17−20。值得注意的是，这些化合物保持了PARP1抑制活性，T20实现了对PARP1的464.3倍选择性。然而，T17−20的抗增殖效力略有下降，在MB-436肿瘤细胞中的IC50值分别为25.7、5.3、6.5和2.8 nM。基于它们的选择性和抗增殖效力，化合物T16和T20表现出色，被选为进一步的药代动力学筛选。T16和T20之间唯一的结构差异在于区域B，其中T16包含哌嗪，而T20包含四氢吡啶。因此，研究团队通过在小鼠中口服1 mg/kg来确定T16和T20的药代动力学（PK）特性。化合物T20显示出比T16更高的血浆暴露量和最大血浆浓度。基于生物活性和PK的评估，T20被选为进一步研究的对象。 图片来源：ACS 在化合物T20的令人印象深刻的效力基础上，研究团队继续优化区域C，合成了化合物T21−49，并随后评估了它们的生物活性。化合物T21−25在苯环上保留了氰基并引入了各种额外的取代基；然而，这些化合物的生物效力在不同程度上有所降低。然后，研究团队专注于在吡啶环上保留氰基的同时引入新的取代基，得到了化合物T26−29。化合物T26显示出强大的抗增殖活性，IC50为2.6 nM，在1 nM的浓度下实现了93.6%的PARP1抑制率。相比之下，在1 μM的浓度下，PARP2的抑制率仅为72.9%，显示出高度满意的选择性配置。进一步探索化合物T30−31，引入了吡嗪和噻吩环，结果生物活性不佳。随后尝试在吡啶环上引入其他电子吸引基团，如−F（T32）和−CF3（T33），也得到了令人失望的结果。努力优化苯环和吡啶环上电子供体和电子吸引基团的效果，得到了化合物T34−39，但未能阻止观察到的生物效力下降。最后，化合物T40−48中引入了水溶性胺基团，显示出持续的低活性水平。即使将区域C中的单环替换为双环，得到化合物T49，也未能改善生物效力，结果不尽如人意。 图片来源：ACS 03 In vitro 体外活性评价 ①T26和AZD9574的药代动力学特性 研究团队对化合物T26和AZD9574的药代动力学特性进行了评估。研究采用了小鼠模型，分别以1 mg/kg的剂量进行口服给药。结果显示，T26在小鼠体内表现出优越的药代动力学特性，其血浆暴露量为16420.20 ng/mL·h，最大血浆浓度为3021.59 ng/mL，显示出较高的生物利用度和有效的药物吸收。此外，T26的半衰期为76.07小时，表明其在体内的持续作用时间较长，可能支持每隔一天给药一次的方案。相比之下，AZD9574的药代动力学参数较低，显示出T26在药物开发中的潜在优势。 图片来源：ACS ②T26透过BBB的能力 研究团队评估了T26穿越血脑屏障（BBB）的能力。实验中，小鼠口服给药后，分别在给药后1小时和6小时收集全血和脑组织样本，以定量检测T26和AZD9574在小鼠脑组织中的浓度，进而评估它们穿越BBB的能力。实验结果显示，在给药后1小时，T26在小鼠脑组织中的浓度为413 ng/g，略高于参考化合物AZD9574（412 ng/g）。而在给药后6小时，T26的脑组织浓度进一步增加至619 ng/g，而AZD9574的浓度则降低至48 ng/g。 ③T26是PARP1的有效选择性抑制剂 研究团队通过一系列实验验证了T26作为一种高效且选择性的PARP1抑制剂的特性。实验结果表明，T26对PARP1的抑制作用非常强大，其IC50值仅为0.2 nM，显示出超过610倍的选择性，即对PARP1的抑制效果远高于对PARP2的抑制。此外，T26在10 μM的浓度下对104种激酶进行了筛选，结果显示T26对这些激酶均无抑制作用，进一步证实了其作为PARP1选择性抑制剂的特性。为了在细胞水平上验证T26的选择性，研究团队使用了PARP1和PARP2基因敲除的同源细胞系进行PARylation实验。结果显示，T26在PARP1敲除细胞系中几乎不表现出抑制作用，而在PARP2敲除细胞系中则显示出显著的抑制效果，这表明T26在细胞内对PARP1具有超过5000倍的选择性抑制。 研究团队进一步探讨了T26作为PARP1捕获剂的效能。实验结果显示，T26能够在单个数字纳摩尔浓度下诱导PARP1的剂量依赖性捕获，其DNA捕获活性的EC50值为0.9 nM。相比之下，即使在1 μM的浓度下，T26对PARP2的捕获作用也不显著，其EC50值高达4326 nM。这些发现证实了T26作为一种选择性抑制剂和捕获剂的作用，对PARP1具有显著的活性，而对PARP2则几乎没有活性。这表明T26在治疗同源重组修复缺陷的癌症方面具有潜在的应用价值，因为它能够有效地捕获PARP1，从而阻止DNA修复过程，导致癌细胞死亡。 图片来源：ACS ④T26有效抑制MDA-MB-436细胞和DLD-1细胞系的增殖 研究团队评估了T26对MDA-MB-436细胞和DLD-1细胞系增殖的抑制效果。实验结果表明，T26在BRCA突变的MDA-MB-436细胞和DLD-1 BRCA2-KO细胞中显著降低了生存率，呈现出剂量依赖性。具体来说，T26处理后，MDA-MB-436细胞的凋亡细胞百分比从19.3%增加到31.8%，表明T26能够诱导细胞凋亡。此外，流式细胞术分析显示，T26处理导致MDA-MB-436细胞中S期细胞减少，G2/M期细胞增加，尤其是在较高浓度下，这表明T26能够诱导细胞周期停滞在G2/M期，从而抑制细胞增殖。 图片来源：ACS ⑤T26诱导DNA损伤积累 研究团队探讨了T26对DNA损伤积累的影响。实验结果显示，T26处理后，MDA-MB-436细胞中γH2AX焦点显著增加，且这种增加比AZD9574处理更为明显。γH2AX是一种标记DNA损伤的蛋白，其表达量与DNA损伤程度呈正相关。此外，通过彗星实验进一步评估DNA损伤程度，结果显示T26处理后，MDA-MB-436细胞和DLD-1 BRCA2-KO细胞的彗星尾部强度显著增强，表明DNA损伤程度加剧。这些结果表明，T26能够触发DNA损伤，并阻碍DNA同源重组修复的关键组分，最终导致细胞凋亡。 图片来源：ACS ⑥T26的分子对接 研究团队通过分子对接实验来探究T26与PARP1结构域的相互作用方式。预测的结合模式显示，T26的酰亚胺基团与Gly863和Ser904形成了三个氢键，键长分别为1.9 Å、2.1 Å和2.2 Å。此外，T26的双环部分还与Tyr907形成了强的π-π堆积相互作用，这些相互作用有助于稳定配体在口袋中的位置。研究团队还对T26与PARP2进行了对接实验，结果显示T26也与Gly429和Ser479形成氢键，但氢键距离为2.8 Å，比与PARP1的氢键距离长。此外，由于PARP1和PARP2在Asp766和Glu335残基上的差异，T26在PARP2中的双键向下弯曲，这可能是T26选择性的一个关键因素。 图片来源：ACS 04 In Vivo 体内活性评价 ①体内抗肿瘤功效评估 研究团队对T26的体内抗肿瘤效果进行了评估。他们使用了MDA-MB-436细胞接种的皮下异种移植小鼠模型。当肿瘤平均体积达到约150 mm³时，AZD9574以1 mg/kg/天的剂量口服给药，而T26则以0.3、1或3 mg/kg的剂量每隔一天口服给药，持续28天。定期监测小鼠的体重和肿瘤大小，每两天测量一次。 结果显示，T26以剂量依赖性方式显著抑制了MDA-MB-436异种移植瘤的生长。在低剂量0.3 mg/kg时，T26的肿瘤生长抑制率就达到了89.9%。1 mg/kg每隔一天口服给药进一步增强了治疗效果，导致显著的肿瘤消退率59.4%。当T26剂量增加到3 mg/kg时，肿瘤消退率达到了79.8%。此外，T26在给药剂量下耐受性良好，这通过小鼠体重的稳定得到证实。组织学分析（H&E染色）进一步证实T26对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏没有造成显著损伤。此外，研究团队还测量了Ki67阳性比率，这是一种评估癌症增殖的临床标志物。结果进一步证实T26在皮下异种移植模型中导致Ki67染色较弱。 图片来源：ACS ②T26颅内抗肿瘤疗效评估 研究团队评估了T26对颅内肿瘤的治疗效果。他们构建了荧光素酶标记的乳腺癌细胞MDA-MB-436的颅内异种移植肿瘤模型，并以AZD9574作为阳性对照。实验中，小鼠每天接受3 mg/kg的AZD9574或3 mg/kg和10 mg/kg的T26治疗，持续34天。通过测量生物发光信号来评估肿瘤的消退情况，结果显示治疗具有剂量依赖性。接受治疗的小鼠生存率显著提高，且在治疗停止后效果仍然持续。对照组的小鼠在第34天全部死亡。这些结果表明T26能够穿过血脑屏障，并对乳腺癌脑转移具有一定的治疗潜力。 图片来源：ACS ③T26体内安全性评估 研究团队对T26在体内的安全性进行了评估。他们进行了急性和亚急性毒性实验，以评估口服给药的AZD9574和T26在小鼠中的安全性。实验中，小鼠单次口服剂量为100 mg/kg和300 mg/kg，或连续每天一次给药30 mg/kg和100 mg/kg（AZD9574）或每隔一天一次给药（T26）。 实验结果显示，在给药后的14天内，没有观察到死亡或体重显著变化。组织学分析（H&E染色）显示，连续给药14天后，心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的组织结构和细胞形态没有显著变化。此外，血液生化指标显示，与对照组相比，治疗组小鼠的心脏、肝脏和肾脏功能没有显著差异。这些结果表明，T26与AZD9574一样，在体内表现出良好的安全性。 图片来源：ACS 总结 研究团队总结了他们的研究成果。他们基于临床候选药物AZD9574设计了一系列新型的PARP1抑制剂小分子。通过引入各种取代基，成功筛选出具有高选择性、能够穿透血脑屏障的PARP1抑制剂。生化实验结果表明，T26是一种高效且选择性的PARP1抑制剂，其IC50值为0.2 nM，而对PARP2的IC50值为122 nM，显示出超过610倍的选择性。此外，T26具有良好的药代动力学特性，与AZD9574相比，其AUC0−t和T1/2更优，可能减少给药频率并降低每日给药可能带来的潜在毒性。研究团队进一步评估了T26在MDA-MB-436细胞皮下异种移植肿瘤模型中的体内抗肿瘤效果。T26每隔一天口服给药，而AZD9574则每天口服给药，持续28天。体内评估显示，T26在3 mg/kg剂量下诱导了显著的肿瘤消退（79.8%），且没有明显的毒性效应。颅内异种移植肿瘤模型的荧光成像显示，T26的口服给药导致剂量依赖性的肿瘤消退，并显著提高了肿瘤携带小鼠的生存率。这些结果表明，T26是一种能够穿透血脑屏障的选择性PARP1抑制剂，在体内和颅内模型中均显示出显著的肿瘤抑制效果。然而，T26在PARP1选择性和血脑屏障穿透能力方面略逊于AZD9574，因此仍有改进空间。此外，本研究提供的设计策略为下一代选择性PARP1抑制剂的开发提供了宝贵的框架。 参考来源： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02463 药物筛选中心（暨南大学）对外提供新药筛选服务 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓