Napabucasin

深度聚焦类器官应用与3D细胞培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769，点击↑图片领取免费票。上下滑动查看议程： 2024年5月27日，首篇类器官药敏检测英文专家共识《Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development（类器官药物敏感性检测在精准医学和药物研发中的应用专家共识）》正式发表于《Theranostics》杂志（中科院Q1，IF：12.4），填补了类器官药敏检测领域缺乏英文专家共识的空白，开创了中国学者在全球类器官研究中发声、领跑的先河。上海万何圆生物科技有限公司全程参与本专家共识的制定。 上海万何圆生物科技有限公司旗下微信公众号【万象类器官】，获得《Theranostics》杂志独家官方授权，公布此专家共识的中文翻译全文。 类器官药物敏感性检测在精准医学和药物研发中的应用专家共识 摘要 患者来源类器官（Patient-derived organoids, PDOs），已成为临床和转化研究中一个非常有价值的模型。临床结果与使用PDOs预测化疗和/或放疗疗效之间存在着很强的相关性。为了规范基于PDOs的药物敏感性检测（Drug sensitivity testing, DST）在肿瘤精准医疗领域的阐述，并加强科学交流，我们重新审视了该概念，对其进行阐明和界定，提出该专家共识，旨在预测患者的临床响应。同时，我们还指出了利用PDOs进行临床药效预测时所面临的几个主要挑战。 引言 《Nature Methods》将类器官（Organoids）列为2017年度十大技术之一。PDOs已成为一种极具吸引力的研究模型，适用于各种癌症类型，包括结肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、肺癌和儿童肾癌等。这些PDOs可用于转化研究、新药研发和个性化诊疗的预测。根据从器官芯片模型中获得的临床前疗效结果，美国食品药品监督管理局（FDA）首次于2022年7月批准Sutimlimab开展临床试验，无需体内支持数据；这是PDOs应用于药物研发的一个重要里程碑事件。 根据中国国家癌症中心最新报告，2022年中国新发癌症病例估计达到482万例（2020年为457万例）。值得注意的是，2022年中国大约有257万人死于癌症。随着癌症发病率和死亡率的不断攀升，开发精准的肿瘤检测和治疗临床前模型势在必行。本文主要关注实体瘤来源的PDOs。到目前为止，培养血液恶性肿瘤类器官的技术仍不成熟，仅有少数文献报道。 本文概述了PDOs在肿瘤精准医疗和药物研发领域的8点共识。 01 肿瘤类器官在癌症研究和个性化医疗中的应用越来越广泛。它们是具有三维（3D）结构的体外培养模型，由具有干细胞特征的细胞自我分化而成。肿瘤类器官通常可以长期扩增，再现原始肿瘤组织复杂的细胞异质性和空间结构。它们还能模拟起源组织的功能和生物学行为，同时保留病理组织学特征和一些遗传特征（包括驱动基因的突变与扩增）。PDOs是器官或组织的“微型简化版本”，可以在实验室环境中生长，是肿瘤研究和药物发现的重要平台级模型。 主要相关原因如下（图1）： 1) 构建再现原发肿瘤的体外精确模型。PDOs是通过采集不同来源的肿瘤样本培养而成，包括原发性肿瘤、循环肿瘤细胞和转移病灶等。在机械和/或酶消化的作用下对组织进行预处理，肿瘤细胞最终在基质中生长成为三维肿瘤PDOs。这些PDOs内有多种异质细胞，每种细胞在复杂的癌症发生和发展过程中都扮演着独特的角色。 2) 使用肿瘤样本构建活体PDOs生物样本库。PDOs可长期扩增、冷冻保藏和复苏。在PDOs活跃增殖阶段对其进行冷冻保藏可提高其复苏效率。PDOs被置于含有冷冻溶液的冷冻管中，在冰上放置30分钟，然后在-80°C下逐渐冷冻保存过夜，接下来转移到液氮中长期储存。对于PDOs复苏，可以于37°C下快速将其解冻，再将其置于培养皿中进行进一步操作。冷冻/解冻单细胞悬液或大型且分化的类器官时如果操作不当，可能会导致复苏不良、形态变化或对药物筛选结果产生潜在影响。因此，应遵循与细胞系类似的冷冻/解冻原则，且PDOs应在复苏后的1-2周内恢复其扩增能力。 3) 体外肿瘤建模允许对营养物质可用性、氧气供应和药物处理等变量进行操作，以研究它们对肿瘤细胞行为的影响。这些PDOs模型复制了体内肿瘤的结构和微环境，为研究肿瘤生长、侵袭和治疗响应等提供了一个标准化的现实平台。 4) 预测各种肿瘤类型患者的临床响应，包括结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、尿路上皮癌、胃肠道肿瘤和胰腺癌等。PDOs可进行前瞻性治疗评估，从而推进肿瘤精准医疗。研究人员通过培养PDOs来筛选潜在最有效的治疗方案。这种个性化方法通过优化治疗方案和减少不必要的副作用，为改善患者预后提供了可能。 5) 开发基因修饰的肿瘤PDOs模型，并确定肿瘤基因突变的发展机制。通过对肿瘤驱动基因进行CRISPR/Cas9基因编辑，PDOs可用于肿瘤生物学研究、耐药机制探索和癌症治疗新方法的开发。 图1. 类器官模型的应用。PDOs再现了来源组织的生物特征和功能，提供了一个真实、有效的技术平台，在构建疾病模型、建设生物样本活库、基因治疗、药物发现和精准医疗等多个研究领域都有潜在的应用前景。 02 PDOs在药物研发中的作用 在临床前研究中，PDOs是深入了解疾病（包括癌症和各种器官特异性疾病）与探索新治疗方案的有效替代选择（图2）。通过再现来源组织的复杂细胞组成和功能，PDOs为研究疾病机制、阐明分子通路和探索治疗干预措施等提供了一个卓越的平台。随着不同组织来源的PDOs被培养出来，它们可用于多组学和基因编辑研究，在临床前药物研发，尤其是靶点发现方面发挥着越来越关键的作用（图2）。 PDOs在药物研发中的作用： 1) 新型药理靶点的鉴定和验证。肿瘤细胞系是发现新治疗靶点的经典体外模型。然而，二维的细胞系无法模拟体内肿瘤的基本三维细胞组成和异质性，导致新药研发成功率低于1%。而类器官保留了原始组织中存在的特异性基因组改变、分子特征与异质性，使其对研究疾病进展和确定潜在的治疗靶点具有宝贵价值。多组学研究，包括基因组学、蛋白质组学和代谢组学等，进一步提高了应用PDOs发现新型治疗靶点的可靠性。PDOs可以使用CRISPR/Cas9、RNAi或基因过表达等技术进行处理，以验证治疗靶点。此外，涉及PDOs和间充质/免疫细胞的共培养系统为研究除肿瘤细胞以外的治疗靶点提供了巨大的机遇。正常组织来源的类器官在新型药理学发现中也发挥着重要作用。例如，人类诱导性多能干细胞衍生的运动神经元（hiPSC-MN）为运动神经元疾病（如脊髓性肌萎缩症和脊髓/延髓性肌萎缩症）的神经生物学机制提供了新的研究视角。这些hiPSC来源的三维类器官有助于疾病发病机制的探索以及治疗方法的发现和验证（Johns AE, Maragakis NJ. Stem Cells. 2022）。此外，在肺上皮修复研究中，暴露于香烟烟雾提取物的PDOs表现出肺上皮祖细胞受损，且可在前列腺素E2和前列环素处理后恢复（Wu X, et al. Sci Adv. 2022）。在肿瘤药物发现过程中，正常PDOs通常可用于进行疗法副作用的监测。 2) 药物筛选。肿瘤PDOs保留了患者的潜在治疗靶点，并保留了恶性肿瘤的遗传和表型变异性。它们可用于评价特定药物或药物组合的疗效。共培养系统还可纳入非肿瘤细胞类型，如基质细胞和免疫细胞等，从而对其它的治疗手段进行评价。 3) 伴随诊断生物标志物。可以通过预测靶向药物的治疗效果，比较治疗响应者和非响应者之间多组学特征的变化来识别生物标志物。PDOs是鉴别潜在诊断生物标志物的重要平台，随后可通过分析临床样本对其进行验证。例如，细胞外囊泡蛋白和PTP4A已分别被确定为胰腺导管腺癌和黏液表皮样癌的诊断生物标志物（Huang L, et al. JCI Insight. 2020；Wang B, Gan J, Liu Z, et al. J Exp Clin Cancer Res. 2022）。 4) 扩展药物适应症。除了正在开发的药物外，还可以利用全面、多样的肿瘤PDOs生物样本活库来测试仍在临床试验中的药物，以扩展其治疗适应症。结合高通量药物筛选的肿瘤PDOs生物样本活库可以揭示对超适应症药物的敏感性。例如，人类胃癌PDOs生物样本库就显示出对Napabucasin、Abemaciclib与VE-822的敏感性（Yan HHN, et al. Cell Stem Cell. 2018）。 5) 检测药物的作用机制（MOA）与耐药机制（MOR）。作为比细胞系具有更高治疗相关性的体外模型，肿瘤PDOs可以成为分析治疗药物MOA和MOR的有价值工具。药物耐药性在癌症治疗中是不可避免的，PDOs可以用来全面、高效地研究耐药机制。原发性耐药肿瘤PDOs、敏感肿瘤PDOs及驯化的耐药肿瘤PDOs都是研究MOR的高质量资源。例如，有研究在胰腺导管腺癌中进行了基于多组PDOs的药物响应分析，利用曲线下面积（AUC）来识别与MOA相关的药物敏感性预测因子（Armstrong A, et al. Biomedicines. 2021）。对七种上皮性卵巢癌PDOs的研究准确反映了患者对铂类化疗的临床响应（Tao M, et al. Pharmacol Res. 2022）。同样，从结直肠癌腹膜转移灶中获取的PDOs预测了对细胞减灭术后热灌注腹腔化疗的临床响应（Ubink I, et al. Br J Surg. 2019）。此外，卵巢癌PDOs证明其适用于个性化用药背景下的耐药性检测与筛查（Nanki Y, et al. Sci Rep. 2020）。胰腺癌PDOs的分子和治疗图谱显示了预测耐药性的准确性，进一步推动了个性化医疗的发展（Tiriac H, et al. Cancer Discov. 2018）。 6) 体内药代动力学和药效学研究。PDOs模型已被用于药代动力学/药效学（PK/PD）测试，以评估药物的疗效和安全性。它还与高通量技术相结合，用于高效的化合物筛选。例如，Han等人利用人源化多能干细胞（hPSCs）构建了肺和结肠PDOs模型，并对FDA批准的药物进行了高通量筛选。结果发现，三种小分子药物是SARS-CoV-2进入细胞的强效抑制剂，表明它们有可能成为COVID-19治疗的候选药物（Han Y, et al. Nature. 2021）。患者来源肿瘤异种移植物类器官模型（PDXO）可由患者来源肿瘤异种移植物（PDX）和PDO异种移植物模型（PDOX）获得，这些模型对于评价先导化合物和其它临床候选药物的疗效非常重要。通过这些模型，可以验证候选化合物是否有最具前景的药理结果，有助于分析其药代动力学、最佳剂量和给药方案。与PDX相比，PDOs培养的成功率更高，显著增加了为相同的原始肿瘤材料构建体外和体内配对模型的可能性。 7) 基于类器官的放疗响应预测。类器官模型为了解肿瘤对放疗的敏感性提供了新的视角。例如，Martin等人研究了结直肠和肠道PDOs对辐射的响应（Martin ML, Adileh M, et al. Cancer Res. 2020）。研究人员评估了SIRT1抑制剂对体外辐射后PDOs存活率和大小变化的缓解作用（Fu G, et al. Cancer Lett. 2021）。这些利用功能性PDOs模型进行的研究可为应对放疗引起损伤的医疗策略提供参考信息。PDOs在临床前研究中的作用是变革性的（图2）。这些工程化的3D模型忠实地模拟了患者组织的特征，从而可以作为研究疾病机制、检测新疗法疗效和推进个性化医疗方法的有力替代选择。PDOs是医学研究中前景广阔的前沿领域，为探索更好的治疗方法、改善患者预后以及最终实现抗击疾病的美好未来带来了希望。 专家共识1：PDOs在临床前研究中具有广泛的应用前景，可用于发现和验证新型治疗靶点、药效学评估、伴随诊断标志物的检测、药理学适应症的扩展、药物作用和耐药机制的探索以及模拟体内药代动力学的分析等。 图2. 用于精准医疗的肿瘤PDOs模型（左）和药物发现的机遇（右）。肿瘤PDOs模拟来源组织的生物学特征，提供匹配的个性化治疗策略。目前报道的肿瘤PDOs模型包括但不限于食管癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾癌、结直肠癌和肝癌等（左图）。同时，肿瘤PDOs是药物开发的有效临床前模型，可用于发现新的药物靶点、测试药物剂量、探索伴随诊断生物标志物、对现有药物进行再利用，以及构建PDOX模型等（右图）。 03 用于临床前研究的肿瘤PDOs模型 肿瘤PDOs模型在复制肿瘤微环境方面有很大潜力。解析肿瘤细胞间相互作用、以及肿瘤细胞与周围的细胞外基质（ECM）相互作用，有助于研究影响肿瘤行为、免疫反应和耐药性的关键表型与机制。这种生理相关性提供了对肿瘤生物学的更全面理解，使探索新的治疗靶点和治疗方法成为可能。肿瘤PDOs可以填补许多疾病缺乏临床前模型的空白（图2）： 肿瘤PDOs模型： 1）来自罕见癌症类型的肿瘤PDOs。许多发病率极低的恶性肿瘤，如胶质瘤、骨肿瘤、肉瘤、儿童肿瘤等，都缺乏可靠的临床前研究模型。肿瘤PDOs是填补这一关键研究空白的突破性解决方案。 2）可保留肿瘤细胞系中缺失的新治疗靶点的肿瘤PDOs。现有的肿瘤细胞系不足以概括肿瘤复杂的空间结构和微环境，在研究新的治疗靶点上存在一定的不足。PDOs可以通过识别这些靶点来促进药物开发。例如，Driehuis等人报道，来自头颈部肿瘤患者的PDOs能够重现EGFR表达水平，验证了其优于细胞系的相关性（Driehuis E, et al. J Clin Med. 2019）。神经内分泌肿瘤（NEN）临床前模型的缺乏带来了挑战。Dayton等人构建了来自NEN患者的PDOs，在体外保留了基因表达模式、肿瘤异质性和进化过程（Dayton TL, et al. Cancer Cell. 2023）。此外，血管化PDOs为检测针对VEGF/VEGFR的抗血管生成药物提供了一个广受赞誉的技术平台。免疫疗法方面，肿瘤PDOs与免疫细胞的共培养保留了对于免疫相关疗法（如免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1、免疫细胞疗法（TILs, CAR-T）、模式识别受体（PRRs）等）至关重要的肿瘤相关抗原。 3）具有耐药性的肿瘤PDOs。抗肿瘤治疗药物最终往往会产生耐药性，导致治疗失败。耐药性肿瘤PDOs可促进对MOR的研究。正常类器官在针对肿瘤和非肿瘤疾病的药物开发中都至关重要。它们在预测不良反应、研究药物代谢和毒理学评价方面贡献巨大。例如，模拟正常肝细胞组成和功能的肝脏PDOs为体内生化过程提供了一个生理相关的环境，使它们在药物验证和毒性评价方面具有重要价值（Yang S, et al. Cell Rep Methods. 2023；Shinozawa T, et al. Gastroenterology. 2021；Brooks A, et al. Pharmacol Res. 2021）。 专家共识2：药物的临床前研究很大程度上取决于高效的仿真模型。PDOs非常适合研究罕见恶性肿瘤、尚无现有模型的肿瘤以及耐药性肿瘤。 04 肿瘤治疗临床实践中的PDOs 靶向治疗和免疫治疗的临床疗效往往不尽如人意。用于鉴定基因改变的二代测序技术在指导患者接受大多数治疗方面价值有限。基于每位患者独特药效动力学表型的精准医疗仍未得到精确定义。在临床试验中，包括转移性胃肠肿瘤和结直肠癌等在内的许多肿瘤PDOs表现出的药物敏感性与患者临床响应相似（表1）。通过使PDOs接受不同的药物治疗方案处理，研究人员可以在启动临床试验前预测患者响应和潜在的副作用。这种使用PDOs进行的临床前筛选优化了药物开发过程，增加了在后续临床阶段取得成功的可能性，同时最大限度地降低了与传统方法相关的风险和成本。 表1. 在临床试验中应用PDOs-DST获益的结果 PDOs促进了精准医疗在临床试验中的探索。通过构建针对特定患者的类器官模型，研究人员可以评估这些类器官对不同治疗方案的响应，从而确定针对不同患者的最有效治疗方案。在临床试验中应用PDOs模型必须经过专业规划和实施。截至2023年9月3日，在ClinicalTrial.Gov上已注册了159个与癌症研究相关的PDOs项目，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌等（表1）。这些临床试验的第一种类型是基于PDOs-DST的非干预性的回顾性分析或同期观察性（Co-clinical）研究（62/149）。第二种类型（82/149）是前瞻性干预性研究，为基于PDOs-DST的个性化治疗提供了更可靠的数据。 关键应用场景： 1）新辅助治疗：对于局部晚期癌症患者，进行前瞻性和干预性临床研究，筛选肿瘤治疗选择方案并预测新辅助治疗的潜在受益者。 2）挽救治疗：对于复发风险高或已经历复发的患者，进行前瞻性和干预性临床研究，旨在识别潜在的治疗受益者。 3）姑息治疗：对无手术指征的恶性肿瘤复发、转移以及一线或二线治疗失败的患者进行前瞻性和干预性临床研究，以评估精准治疗的潜在受益者。 专家共识3：临床试验表明，基于PDOs-DST的结果与患者的实际临床结果密切相关。将PDOs-DST纳入临床研究可能成为临床治疗响应的预测手段。 图3. PDOs模型用于DST的流程。可归纳为三个步骤：1) 样本采集：包括原发/转移性肿瘤、活检、液体样本以及患者来源的异种移植（PDX）样本等；2) 药物检测：包括样本运输、PDOs培养、药物筛选和数据分析；3) 临床治疗：为患者提供化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗和联合治疗等治疗方案建议。 05 临床实验室自建项目（LDT）探索PDOs-DST的时机到了吗？ LDT模式是一类尚未获得产品注册并在实验室中开发、验证和应用的体外诊断项目。加速LDT项目的开发以支持精准医疗的发展是一个大趋势。在执业医师的监督下，通过认证的医疗机构可以生产符合其单位临床需求的体外诊断试剂。在LDT中探索使用PDOs-DST是一个正在进行研究和开发的前沿领域。PDOs-DST包括利用PDOs针对各种药物或治疗方案进行检测，以评价其响应和敏感性。 用于DST的PDOs模型已在体外对多种实体瘤类型进行了测试，包括乳腺癌、膀胱癌、胃癌和直肠癌等。这些模型证实了实验室数据与临床结果之间的一致性，为研究肿瘤敏感性和耐药性机制提供了一种实用的方法。尽管需要进一步的研究来确定PDOs-DST是否确实改善了患者的无病生存和总生存情况，但为了患者的利益，鼓励将业界提供的PDOs-DST平台纳入医院的LDT计划。通过将PDOs-DST纳入临床LDT，医疗健康服务提供者可以根据患者肿瘤的独特特征定制治疗决策，从而最终改善治疗效果（图3）。在将PDOs-DST纳入临床LDT时，以下几点值得考虑。 在将PDOs-DST纳入临床LDT时，以下几点值得考虑： 1) 在临床LDT中实施PDOs-DST需要严格的验证、标准化和监管审批，以确保其准确性、可重复性和临床实用性。 2) 涉及到在各种监管框架中找到合适的空间与方向，并满足严格的标准，以确保患者的安全性和检测结果的可靠性。 3) 必须指出的是，LDT领域在不断发展，在临床LDT中探索PDOs-DST的决策将取决于多种因素，包括科学证据、监管方面的考虑以及医疗界的需求和优先事项等。 4) 对于PDOs-DST及其纳入临床LDT的最新状态和潜在未来发展的最准确与最新的信息，建议调研科学文献、咨询监管机构以及该领域的专业医疗专家。 在PDOs-DST临床探索取得进展的推动下，从实验室开发向商业化的过渡迫在眉睫： 1) 实验室开发：LDT是在个体实验室内开发和实施的、以解决现有测试未满足的特定需求为目标的项目。截至2023年5月，美国医疗保险与医疗补助服务中心（Centers for Medicare & Medicaid Services）报告称，美国有超过277251家CLIA注册实验室，其中只有不到6%的大型综合实验室有能力开展LDT。 2) 监管和质量控制：对LDT质量和一致性的担忧，使得美国FDA等监管机构考虑加强监管。2023年10月，FDA提议终止对LDT的执法自由裁量权，旨在实施更严格的监管。 3) 向商业化的过渡：从LDT向商业化检测的转变包括： A. 验证与确认：这些过程在商业化之前进行，确保在不同人群中和不同条件下检测的准确性与可重复性。 B. 监管批准：商业化检测需要经过监管部门的严格审查，包括评估分析表现和临床表现，以及是否符合安全性与有效性标准。 C. 扩大生产规模：经监管部门批准后，制造商扩大生产规模，优化流程和质量控制，以满足市场需求。 D. 分销和营销：商业化检测通过各种渠道分销，并制定有针对性的营销策略，以提高其效益并扩大市场覆盖范围。 专家共识4：PDOs-DST在一定程度上已进入临床服务；鼓励通过认证的机构完善其LDT方案。 06 哪些患者将从PDOs-DST中获益？ 在癌症治疗的临床实践中，分子标志物的鉴定和合理应用至关重要。然而，只有7%-11%不等的患者可以通过基因二代测序从精准医疗中获益。Vlachogiannis等人于2018年报道，PDOs-DST在晚期胃肠肿瘤中的阴性预测值和阳性预测值分别达到100%与88%，为PDO的临床应用铺平了道路（Vlachogiannis G, et al. Science. 2018）。 PDOs-DST可为患者对特定药物或治疗方案的响应提供有价值的预测信息，从而指导治疗决策，改善患者预后。据报道，胰腺癌PDOs-DST可以预测吉西他滨的疗效和有效程度（Seppälä TT, et al. Clin Cancer Res. 2022）。Yao等人构建了18个直肠癌PDOs进行DST，准确度、敏感度和特异度分别达到84.43%、78.01%与91.97%（Yao Y, et al. Cell Stem Cell. 2020）。Wang等人评价了结直肠癌PDOs对治疗药物处理的响应，DST结果显示敏感度为63.33%，特异性为94.12%，准确度为79.69%，阳性预测率为90.48%（Wang T, et al. Dis Colon Rectum. 2021）。以下是PDOs-DST可能取得获益的一些临床场景： 临床场景： 1）实体瘤患者。目前的PDOs培养技术主要针对上皮细胞，适用于大多数起源于上皮的实体瘤（如结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌等）。而与实体瘤不同，血液肿瘤起源于骨髓，影响白细胞的生长，肿瘤细胞存在于快速流动的血液中，分散到全身。 2）接受新辅助化疗的患者。新辅助化疗是指在局部治疗（如手术或放疗）前给予的全身化疗。可以缩小肿瘤体积、最大限度地消除微转移灶、降低疾病等级，从而便于后续治疗。在进行新辅助化疗之前，通过穿刺获得的活检样本会进行PDOs培养和DST检测，辅助选择“最有效”的治疗方案。 3) 考虑靶向治疗的患者。PDOs-DST可以帮助预测具有特定基因突变或基因改变的患者对靶向治疗的响应。这些信息可以指导治疗决策，避免不必要地接触无效药物。 4）罕见或难治的肿瘤患者。PDOs-DST可以帮助识别潜在的靶向治疗或新型药物组合，这些治疗方案或组合方案可能对罕见或难治的癌症类型更有效。这些类型的癌症可能治疗方案有限，或者对标准疗法的响应率不理想。 5）初治治疗失败的患者。如果一线治疗无效，患者可能从原发或复发肿瘤活检组织培养出的PDOs-DST中获益，具体取决于使用的各种治疗药物组合。这些评估可以帮助改善接受二线治疗或非传统治疗的患者的预后。 6）复发或转移性疾病患者。PDOs-DST对于复发或转移性疾病患者可能很有用处，因为在这些情况下，治疗决策变得更加复杂。通过检测来自转移部位的PDOs的药物敏感性，临床医生可以深入了解最佳治疗方案，并有可能找出针对特定转移病灶的有效疗法。 7）对放疗有抵抗的患者。放疗是鼻咽癌、宫颈癌和皮肤癌的初始治疗选择。当出现放疗抵抗时，PDOs模型为患者提供了一种潜在的延长生命的药物治疗选择。通过预测原发性肿瘤的敏感性，PDOs模型还能提高接受选择性术前放疗患者的放疗成功率。 8）晚期癌症患者。晚期或转移性患者没有手术指征，化疗和细胞疗法作为此时的标准治疗选择。在治疗前进行活检与PDOs-DST，可以允许选择靶向疗法。如果治疗后出现耐药性，可对耐药后的PDOs进行DST检测。 9）治疗方案有限的患者。由于先前治疗失败、耐药性或特定肿瘤特征等因素而导致治疗选择有限的患者，PDOs-DST极具价值。通过评价PDOs的药物敏感性，临床医生可以确定替代治疗策略，并可能将现有的药物重新用于个性化治疗方法。 PDOs-DST的临床实用性和适用性仍在研究和完善中。对特定患者使用PDOs-DST的决策取决于多种因素，包括疾病类型、治疗史、检测资源和临床判断等。 专家共识5：PDOs-DST与二代测序都属于精准医疗领域的技术。不过，PDOs-DST的应用场景向前推进了一步，如新辅助化疗和/或姑息化疗、一线治疗无效、晚期与罕见癌症、转移性肿瘤等，可贯穿癌症治疗的全过程。 07 哪些类型的样本可用于PDOs培养？ PDOs可根据具体的研究或临床目标使用不同类型的样本培养构建。不同样本类型对PDOs培养的适用性可能因相关器官、可及性和组织完整性的保存等因素而异。采集高质量样本对于PDOs的成功构建至关重要。在避免使用坏死、受损或纤维化组织的同时，采集更多的肿瘤细胞，成功率会更高。各种来源组织的取样要求如下： 取样要求： 1) 手术切除的新鲜样本。手术后应立即采集包括原发肿瘤和转移瘤在内的样本进行PDOs构建（应保存2-3个花生颗粒大小的碎片，建议大于50 mg）。这类样本的PDOs培养成功率最高，药物敏感性检测结果最可靠。这对于研究器官特异性疾病或探索特定组织对药物或治疗的响应尤为重要。 2) 经皮或内镜活检的样本。通过微创手术获得的肿瘤活检组织常用于PDOs培养，可使用原发灶和转移灶肿瘤的1-2条穿刺样本，或在胃肠道内镜下夹取1-2个组织块。这些样本的挑战在于确定穿刺组织是否足够进行PDOs构建和DST，这对于评价药物的整体疗效至关重要。穿刺样本的长度应达到1 cm，并准备2-3条。对于内镜活检，通常在内镜引导下夹取1-2个组织块进行进一步评估。 3) 液体活检来源的样本。血液（> 5 ml）、尿液（> 5 ml）、胸水（> 2 ml）、腹水（> 2 ml）、心包积液和其它液体活检对于临床诊断和转化研究至关重要。这些液体标本已被有效地应用于PDOs模型构建。基于体液的PDOs模型可深入探索癌细胞在全身系统环境中的行为，有助于监测疾病进展或对治疗的响应（表2）。 表2. 常规PDOs与基于液体样本的PDOs的区别 4）冷冻保存的样本。也可以使用在-80°C或液氮条件下通过组织保存液保存的切碎冷冻活组织，或者已预消化并保存在-80°C的单细胞悬液。但是，使用冷冻活组织构建PDOs的成功率较低，而且需要较长的扩增期。 5）患者来源的PDX样本。PDX模型是将患者的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠中。这些肿瘤异种移植样本可用于培养产生PDOs，从而在实验室环境中扩展患者特异性的肿瘤特征。 专家共识6：对于PDOs-DST，可以将通过穿刺或内镜获取的外科活检样本作为癌症组织进行培养。PDOs培养的成功取决于起始组织样本中细胞的活性和质量，以及用于培养PDOs的具体操作步骤与培养条件。研究人员和临床医生在选择最适合其研究或临床应用的样本类型时，需要考虑这些因素。 08 PDOs-DST可以利用到哪些患者治疗方法中？ 1 化疗 化疗是目前治疗实体瘤的主要方法，也是PDOs-DST的主要应用方向，包括单药和药物联合治疗。PDOs-DST与患者临床响应之间的相关性已经得到了广泛的报道。 2 放疗 与化疗相似，包括单独放疗和与其它药物联用的组合治疗。 3 靶向治疗 靶向治疗在大多数实体瘤治疗中都尚未得到充分利用，但肺部和乳腺恶性肿瘤除外，这两种肿瘤的靶向治疗相对成熟。对于临床诊断和治疗建议，PDOs-DST、组织学标记与大规模、高通量基因突变筛查可能会成为常规手段。 4 免疫疗法 免疫疗法在肿瘤治疗中大有可为。然而，利用PDOs-DST预测其临床疗效还需要更多的研究： A. 如何在体外维持免疫微环境。PDOs既可以与样本中的免疫细胞和先天性免疫微环境要素共同培养，也可以利用气-液界面（ALI）等培养系统构建肿瘤微环境（TME）模型，以模拟一个更接近真实的肿瘤微环境。 B. 如何与免疫细胞共培养。与免疫细胞共培养的PDOs，可以在免疫细胞的刺激下体外培养，从而创造一个更接近体内生长的环境。目前有两种免疫细胞与PDOs共培养的方法：维持和扩增类器官中的原有免疫细胞，以及在PDOs培养过程中引入免疫细胞。 C. 如何评价免疫检查点抑制剂的疗效，并将它们与化疗药物在PDOs系统中结合起来。PDOs可以预测肿瘤对免疫检查点抑制剂（ICIs，包括CTLA-4和PD-1/PD-L1抗体）的响应。PDOs可能有助于预测和评价使用PD-1/PD-L1抑制剂的肿瘤患者响应，从而指导临床转化。 D. 如何评价体外试验中如CAR-T和TILs等细胞疗法的疗效。肿瘤PDOs集成了内源性抗原表达，能更准确地评价CAR-T细胞的靶点反应性、反应阈值和特异性，可用于早期评估肿瘤细胞特异性，并作为优化CAR-T疗法的体外检测平台。作为模拟体内微环境的三维细胞培养模型，肿瘤PDOs能形成类似器官的空间结构，并分化出相应的功能，显示出高度的组织一致性和临床相关性。它们可以作为“患者替身”来预测和评价TILs的疗效，而且可以快速高效地实施，从而实现个体化精准治疗。 5 优化联合疗法 PDOs-DST可以帮助优化联合疗法。通过检测PDOs对各种药物组合的响应，临床医生可以确认增强治疗效果的协同或叠加效应。这些信息有助于设计个性化的联合疗法策略，有可能提高响应率并克服药物耐药性。特别是，PDOs-DST可用于优化现有的免疫与联合疗法，以及评价新型的联合手段。在临床上，免疫疗法正在越来越多地与化疗、放疗和靶向疗法相结合。目前已经有各种多中心、前瞻性和大规模的联合疗法临床研究，这些临床试验的结果将通过PDOs模型进行验证。 专家共识7：PDOs-DST可用于预测个体患者的化疗、放疗、靶向治疗与免疫疗法的疗效。 09 对于PDOs-DST的临床应用，必须解决哪些缺陷或重大挑战？ PDOs-DST的临床应用面临着一些挑战和限制，须加以解决，才能得到更广泛的应用。需要关注的一些重大挑战领域包括（图4）： 1 样本的可用性和处理 获得足够高质量的组织样本进行PDOs培养可能具有挑战性，尤其是对于某些罕见肿瘤类型或转移性病灶。获得新鲜、有活力的组织样本是成功构建PDOs的关键。需要优化样本采集与处理方法，制定样本保存策略，并探索如微创操作或液体活检等替代性来源。 2 标准化 PDOs培养操作和DST方法需要标准化，以确保不同实验室之间的结果一致性和可重复性。标准化工作应关注样本处理、培养条件、质量控制措施和结果解释等因素。这对于确保不同机构之间的结果可靠性、可比性以及制定临床实施的指南至关重要。 3 周期与可扩展性 理想情况下，PDOs-DST应在临床相关的合理时间窗口内快速提供结果以指导治疗决策。因此，需要优化工作流程并缩短PDOs培养与药物敏感性检测的周期。此外，应解决PDOs培养和检测的可扩展性问题，以适应更大的患者群体，并促进广泛的临床实施。对于接受手术后化疗的患者，1-3周内进行药物敏感性检测是可以接受的；而接受新辅助化疗的或晚期的肿瘤患者则需要在可行的情况下尽快进行检测，可能需要在2周内完成。然而，肿瘤具有异质性，不同肿瘤或同一肿瘤的不同部位的进展速度各不相同；对于生长速度缓慢的肿瘤，PDOs-DST过程需要更长的时间。由于PDOs培养和DST的周期，与患者疾病的进展速度存在冲突，因此与临床医生讨论如何在各种临床决策情况下选择合格的肿瘤样本至关重要。 4 肿瘤PDOs培养的成功率 PDOs培养受到肿瘤细胞组成、肿瘤异质性、细胞活性等因素的影响。要提高培养成功率，就必须制定合格、成熟的操作方案与流程。 5 TME的重建 TME重建具有挑战性，因为TME中可能包含“正常”细胞。当前的PDOs模型往往缺乏体内的一些组分，如免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞等。构建包含血管和免疫细胞的PDOs是一项挑战，但这一障碍将很快就能得到解决。在解释PDOs-DST结果时，应评估非肿瘤细胞成分对药物检测结果的影响。 6 培养条件对于药物的影响 PDOs培养基中存在影响细胞信号通路（如ALK通路）的变量，可能会影响针对该系统的药物检测的自然结果。对于某些癌症类型，需要使用合适的培养基。 7 肿瘤PDOs-DST的药物浓度 由于给药后的药代动力学，患者体内的药物浓度与体外作用于肿瘤细胞的药物浓度不同。过高的药物浓度会导致细胞死亡，而这种细胞杀伤作用并非由药物的抑制作用引起。使用基于PDOs的DST进行实际临床应用时，应注意以下两个因素。首先，连续传代的PDOs已经脱离了周围TME的支持和保护，此时PDOs中的每个细胞基本上都是肿瘤细胞。确定药物浓度有两种主要方法：第一种也是最常用的一种方法是根据剂量-反应曲线计算IC50；第二种方法是参考特定药物在临床试验或药物标签上报告的Cmax值。在使用浓度梯度检测药物对类器官的药效时，可以利用多种方法检测细胞的总活性，包括活-死染色法（钙黄绿素-PI染色法）、PDOs大小/面积定量法、MTT、MKI67、Brud和CellTiter-ATP检测法等。要获得最佳用药浓度，还必须考虑正常PDOs的情况。如果在特定用药剂量下对正常PDOs也有很强的抑制作用，就不能准确反映对患者的效果。需要进一步考虑对有关技术人员、配药天平和移液器的要求。因为由于人为或仪器误差，PDOs中的实际药物浓度可能会与标准不同，批次间的差异也会影响PDOs对药物敏感性的稳定性。 8 PDOs是否能够可靠地用作药物敏感性的衡量标准 由于培养基中含有各种添加剂，PDOs在培养过程中可能会受到正常细胞的污染。因此，在开展药物敏感性检测之前，需要对PDOs进行质量控制。例如，在进行DST之前，部分样本要进行NGS测序，以确定PDOs是否仍含有与药物响应有关的重要基因突变。如果与原始组织有显著偏差，应谨慎评估该PDOs株的药物敏感性结果。由于肿瘤的异质性，一些肿瘤PDOs生长不良，可能在加入药物后解体，导致假阳性结果。一些肿瘤类器官发展出耐药性并生长过快，导致假阴性结果。针对这种现象，可考虑重复接种。如果在添加药物之前，同一样本不同培养孔中类器官的生长不一致，这可能会影响药物敏感性结果的解释。为了减少人工操作造成的差异，可以使用自动采样设备或多点采样。 9 验证与临床结果的相关性 需要进行广泛的临床回顾性验证，以确定类器官PDOs-DST的临床相关性和预测准确性。必须将PDOs-DST结果与临床结果相关联，以证明其在指导治疗决策和改善患者预后方面的效用。需要进行纵向研究，并涉及更大规模的患者队列和多种癌症类型，以评估PDOs-DST的临床价值和性能。 10 监管方面的考量 需要明确将PDOs-DST纳入临床实践的监管环境。监管机构必须制定与PDOs-DST相关的验证、质量控制和伦理考量指南。明确的法规将确保在临床环境中使用PDOs-DST的安全性、可靠性与伦理道德。 11 成本效益和报销 在临床实践中实施PDOs-DST需要考虑成本问题。要使PDOs-DST在经济上可行，就必须制定具有成本效益的方案、实现工作流程自动化并优化资源。此外，还需要制定报销政策（如医保参与），以支持PDOs-DST的临床应用，并确保患者能够获得这项前景广阔的技术。 专家共识8：解决这些上述挑战，需要研究人员、临床医生、监管机构和医疗保障利益相关者的通力合作，共同推进PDOs-DST领域的发展，使其能够广泛应用于临床。在开展PDOs-DST时，应始终考虑及时性。在1-3周内完成报告是可能的，必须通过技术开发逐步缩短PDOs-DST所需的周期。持续的探索、验证研究、技术进步和建立共识，对克服这些局限性并展示PDOs-DST在精准医疗中的全部潜力至关重要。 图4. PDOs-DST模型的挑战和改进方向。目前，PDOs的临床转化发展面临某些挑战，需要研究人员不断努力改进和克服。它们至少包括下列几点：1）样本采集和处理；2）标准化操作流程；3）PDOs构建和DST周期；4）肿瘤PDOs构建成功率；5）肿瘤微环境的模拟；6）培养基的优化；7）药物浓度的确定；8）肿瘤PDOs的优化；9）临床方案的确定；10）监管标准；11）时间和财务成本的考虑。 参考文献 Xiang D, He A, Zhou R, Wang Y, Xiao X, Gong T, Kang W, Lin X, Wang X, PDO-based DST Consortium, Liu L, Chen YG, Gao S, Liu Y. Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development. Theranostics 2024; 14(8): 3300-3316. doi: 10.7150/thno.96027. 原文链接 https://www.thno.org/v14p3300.htm 本共识制定专家组成员 执笔专家： 向冬喜（肿瘤系统医学全国重点实验室、上海市肿瘤研究所、上海交通大学医学院附属仁济医院），何爱娜（上海市第六人民医院），周榕（上海交通大学医学院附属第九人民医院），王永刚（上海市第六人民医院），肖秀英（上海交通大学医学院附属仁济医院），宫婷（天津医科大学总医院），康文岩（上海交通大学医学院附属瑞金医院），林晓琳（上海交通大学医学院附属仁济医院），王晓晨（浙江大学医学院附属第二医院），刘连新（中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）），陈晔光（清华大学、南昌大学基础医学院），高绍荣（教育部“细胞干性与命运编辑”前沿科学中心、同济大学），刘颖斌（上海交通大学医学院附属仁济医院、肿瘤系统医学全国重点实验室、上海市肿瘤研究所）。 专家委员会成员（按照姓氏笔画排序）： David T. Breault（美国哈佛大学医学院、美国波士顿儿童医院），Wei Duan（澳大利亚Deakin大学医学院），Nima Saeidi（美国哈佛大学医学院、美国麻省总医院），Junhan Zhao（美国哈佛大学陈曾熙公共卫生学院），上海健康生活促进会类器官与临床转化专业委员会、王立东（省部共建食管癌防治国家重点实验室、郑州大学附属第一医院），王亚龙（广州实验室），王许安（上海交通大学医学院附属仁济医院），王斌（陆军军医大学西南医院），王湛（海军军医大学第二附属医院（上海长征医院）），王嘉倍（中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）），牛耿明（上海万何圆生物科技有限公司），孔宪明（上海健康医学院），邓初夏（澳门大学），邢力刚（山东省肿瘤医院），庄艾（上海交通大学医学院附属第九人民医院），刘天舒（复旦大学附属中山医院），刘嘉烨（四川大学华西医院），刘泽兵（上海交通大学医学院附属仁济医院），刘增军（山东省肿瘤医院），孙晶（上海交通大学医学院附属瑞金医院），李璡（复旦大学附属肿瘤医院），李志辉（四川大学华西医院），杨庆诚（上海市第六人民医院），杨诚（海军军医大学第二附属医院（上海长征医院）），肖声平（上海万何圆生物科技有限公司），吴远波（湖北阳新县人民医院），何悦（上海交通大学医学院附属第九人民医院），张建明（上海交通大学），张剑（复旦大学附属肿瘤医院），张剑军（上海交通大学医学院附属同仁医院），陈红旗（上海市第六人民医院），陈茂荣（云南大学），周长春（山东省肿瘤医院），钟来平（复旦大学附属华山医院），贾斌（天津市肿瘤医院），夏树前（湖北阳新县人民医院），钱晓哲（上海交通大学医学院附属仁济医院），高钢龙（上海交通大学医学院附属仁济医院），曹杰（上海交通大学医学院附属仁济医院），龚帅（上海交通大学医学院附属仁济医院），崔越宏（复旦大学附属中山医院），康晓楠（上海交通大学医学院附属仁济医院），蒋斐（海军军医大学第一附属医院（上海长海医院）），谢莹（广西医科大学），魏桂英（上海万何圆生物科技有限公司）。 利益冲突：本共识工作组所有成员均声明不存在利益冲突。 PDOs能够忠实地再现肿瘤组织的结构、细胞和分子复杂性，代表了生物学、医学和工程技术的前沿交叉，是人类智慧的证明，也是正在进行的抗击癌症的斗争中不可或缺的资产。 本专家共识由陈晔光院士（清华大学、南昌大学基础医学院），高绍荣院士（教育部“细胞干性与命运编辑”前沿科学中心、同济大学）、刘连新教授（中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院））、刘颖斌教授和向冬喜教授（肿瘤系统医学全国重点实验室、上海市肿瘤研究所、上海交通大学医学院附属仁济医院）牵头制定，其中整理、归纳、统筹了业内多名专家的共同专业意见与经验，可作为类器官药敏检测应用于肿瘤临床精准医疗及临床前药物研发的重要规范性与指导性文件，将成为相关临床和临床前活动的指导依据，并为将来类器官临床应用指南的制定提供重要的理论支持。 上海万何圆生物科技有限公司（Shanghai OneTar Biomedicine）始终坚持以客户为中心、以这最前沿的类器官技术为核心，致力于打造“类器官+”的精准医疗、新药研发及转化医学平台。 作为一家具有社会责任感的企业，万何圆全程参与本专家共识的制定，并将依据共识精神，在PDOs-DST的应用场景探索中不断进取，致力于为肿瘤患者提供最优质的个性化精准医疗服务，全面推动类器官技术的产业转化与终端应用。 让每一位患者第一时间用对药（One Target），是每一位万何圆人的最终目标（One Target）。 专家共识英文全文及中文翻译版本 ▼长按识别下图二维码▼ 免费获取 免责声明：本文信息来源于网络，本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 END 深度聚焦类器官应用与3D细胞培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769 戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额！

1. STAT3背景STAT3（信号转导和转录激活因子3，Signal transducer and activator of transcription 3)是一种转录因子，可调节各种生物过程，包括增殖、转移、血管生成、免疫反应和耐药。在正常细胞中，STAT3受到严格调控以维持瞬时活性状态，而在癌症中持续的 STAT3 激活，且与患者不良预后和肿瘤进展有关。靶向 STAT3 是一种有前途的肿瘤治疗策略。虽然目前尚未有靶向STAT3的抑制剂上市，但一些已成功进入后期临床试验。本综述系统地总结了过去几年在发现靶向STAT3 小分子抑制剂和降解剂方面的进展，主要关注它们的结构特征、设计策略和生物活性。2. STAT3结构和信号通路STAT3包含约770个氨基酸，相对分子量为88 kDa，哺乳动物STAT3有4种亚型，即STAT3α、STAT3β、STAT3γ和STAT3δ。如图1所示，STAT3与该家族其他成员具有共同的结构基序，包括N端结构域（NTD，残基1−138）、卷曲结构域（CCD，139−320）、DNA结合结构域（DBD，321−494）、连接结构域（LD，495−583）、Src同源结构域（SH2，SH2,584−688）和反转录结构域（TAD，689−770），它们在信号转导和基因转录激活过程中发挥着不同的作用。N端结构域是一个保守的序列，具有STAT3二聚体核易位、协助的DNA结合等多种功能。CCD由四个由短环连接的α-螺旋组成，具有一个较大的亲水表面，主要参与STAT3的招募到其受体。DBD，以β桶状结构为特征，负责识别和结合到一个特定的DNA序列。LD是一个由一系列α-螺旋组成的区域，它允许将DBD与SH2结构域连接起来，突变研究发现它对转录激活很重要。SH2结构域是该家族中最保守的区域，它是在TAD中特定酪氨酸残基磷酸化后形成STAT3二聚体所必需的。TAD中的Tyr705和Ser727，是STAT3的两个重要的磷酸化位点。激活后，Tyr705被磷酸化，然后通过磷酸化的一个单体的Tyr705与相对亚基的SH2结构域结合，促进STAT3二聚。此外，Ser727的磷酸化进一步增强了STAT3靶基因的转录。图1. (A)与DNA识别位点结合的STAT3同源二聚体的结构（PDB:1BG1，缺乏N端结构域；如果需要，见PDB:4ZIA）。结构域用不同的颜色表示，虚线表示缺失的残基。球体代表共价结合抑制剂的Cys542或Cys259位点。在STAT3的(B) SH2结构域特征中，蓝色代表亲水区域，橙红色代表疏水区域。图2. STAT3信号通路，通过细胞因子，白介素和癌蛋白等结合对应受体激活JAK2和TYK2，以致STAT3被磷酸化，磷酸化STAT3后形成二聚体，然后入核激活转录活性。3. STAT3在癌症发展中的激活在正常生理条件下，STAT3信号被严格调节以维持短暂的激活状态。然而，持续的STAT3激活经常发生在广泛的人类实体和血液系统恶性肿瘤(约70%)中，包括但不限于结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤和白血病。此外，STAT3的组成性激活也被发现与癌症的不良预后密切相关。在机制上，过度活化的STAT3可以通过产生和维持肿瘤干细胞(CSC)或通过上调抗凋亡相关蛋白如Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-2和Survivin来驱动细胞的不受控制的增殖和生存，并导致细胞毒性和靶向药物治疗的耐药性。此外，异常激活的STAT3还通过诱导基质金属蛋白酶(如MMP-1、MMP-2和MMP-9)和其他STAT3靶基因的表达促进癌症的侵袭和转移。此外，持续激活的STAT3通过下调抗肿瘤免疫应答所需的促炎细胞因子/趋化因子和上调抑制免疫反应的肿瘤/免疫抑制因子(如VEGF、IL-10、PD1/PD-L1和COX2)促进肿瘤免疫逃逸。这些发现支持异常STAT3信号通路常通过多种机制与癌症进展相关。因此，靶向STAT3蛋白是一种潜在的治疗肿瘤的治疗策略。 早期发现的STAT3抑制剂是分子探针，包括多肽、肽模拟物和寡核苷酸，这些方法存在许多挑战，如稳定性有限、亲和力低、细胞通透性和生物利用度。另外，肽和寡核苷酸也容易启动宿主的免疫原性反应。拟肽类药物是第一批靶向STAT3的抑制剂，但尚未进入I期临床试验。与分子探针相比，非肽小分子探针具有细胞通透性好、理化稳定性高、靶点特异性强等优点。因此，近年来更多的研究转向开发靶向STAT3的小分子抑制剂，如TI-101、OPB- 31121、OPB-111077已进入临床试验，用于治疗肿瘤。直接STAT3抑制剂可根据其作用机制分为不同的类别，包括阻断STAT3磷酸化、乙酰化、二聚化、核易位和STAT3 DNA结合活性。根据其来源，STAT3抑制剂可分为天然的、半合成的和合成的，而根据其结合位点，STAT3抑制剂在功能上分为4大类:(1)N端结构域;(2) Cys和tyr磷酸化;(3) SH2结构域;(4) DNA结合域。SH2结构域是许多非肽分子(如S3I-201、Stattic和STA-21)的重要结合位点(图3)。如图1中STAT3: STAT3- DNA三元复合物的晶体结构所示，SH2结构域蛋白表面包含3个溶剂可及的子袋，可被小分子STAT3抑制剂靶向。这些子口袋包括:(1)磷酸化Tyr705 (pTyr705)结合口袋(pY子口袋，残基591,609 - 620);(2) Leu706子位点(pY+1子口袋，残基626 ~ 639);(3)疏水侧口袋(pY-X子口袋，残基592 - 605)。pY子口袋广泛由极性残基Lys591、Ser611、Glu612、Ser613和Arg609组成，这些残基可以在STAT3与其他STAT家族成员的同源二聚化或异源二聚化过程中与p-Tyr705形成氢键和盐桥。与pY子口袋相反，子口袋pY+1和pY- x主要是非极性和疏水性的。pY+1口袋被Thr620、Trp623、Lys626、Gln635、Val637和Ile659包围，是最动态和最难靶向的。pY-X子口袋由Glu594, Arg595, Ile597和Ile634等残基组成，是STAT3所特有的，可能有助于设计选择性STAT3抑制剂。需要注意的是，大多数STAT3抑制剂通常占据一个以上的子口袋。然而，这三个子口袋对结合亲和力的贡献并不相等，其中pY子口袋是最突出的一个。虽然靶向SH2结构域的小分子已成为研究的主流，但干扰SH2结构域从而抑制STAT3磷酸化和二聚化并不能完全抑制异常的STAT3信号传导。研究表明，STAT3可能在没有酪氨酸磷酸化的情况下参与肿瘤的发生和转录调控，未磷酸化的二聚体STAT3可与DNA结合实现其生物学功能。因此，靶向STAT3的DNA结合域(DBD)可能是消除STAT3信号传导的另一种有效方法。尽管靶向转录因子的DNA结合域具有挑战性，因为潜在的选择性有限(活性DNA结合位点太浅或太相似，使得小分子不能紧密和特异性地结合相应的DBD)。研究表明，通过靶向STAT3的DBD抑制STAT3功能是一种切实可行的方法，成功的例子包括C48, MMPP, inS3 – 54。相反，针对LD和CCD的化合物鲜有报道。图3. 针对SH2或DBD结构域的代表性STAT3抑制剂的化学结构。4. STAT3抑制剂的最新进展4.1.基于BTP的衍生物作为STAT3抑制剂。BTP是一种重要的药效团，存在于多种STAT3抑制剂中，如Static(1)、HJC0123 (2)和HJC0146(3)（图4）。具有这部分物质的抑制剂通常通过抑制STAT3的Tyr705磷酸化和促进活性氧（ROS）的产生，对肿瘤细胞表现出的抗增殖活性和凋亡诱导作用。Stattic刺激ROS形成，减少线粒体ATP产生。乙烯基砜基通过共价不可逆相互作用抑制STAT3是必不可少的。通过对BTP在STAT3蛋白中对接模式的分析，发现其平面支架仅占据所必需的p-Tyr705结合位点，与Arg609、Ser611和Ser613残基形成3个氢键。图4. BTP基衍生物的化学结构1−4。（氢键用虚线表示，阳离子-π相互作用用绿线表示。）图5. 基于BTP的衍生物6−8作为STAT3抑制剂的结构。鉴于姜黄素(curcumin)在抑制多种致癌过程(包括阻断JAK2/STAT3通路和诱导ROS产生)方面的生物活性(5，图5)，在STAT3抑制剂且具有ROS产生活性的姜黄素- BTP偶联物57在其结构中，哌嗪基团作为中心连接体被引入以提高代谢稳定性。值得注意的是，最有效的杂合物6显示出显著的抗肿瘤活性和对MCF-7细胞的选择性，IC50为0.52 μM，并在体内抑制MDA-MB- 231异种移植瘤的生长，腹腔注射剂量为10 mg/kg，而没有明显的毒性。它能有效地下调IL -6诱导的STAT3磷酸化和STAT3特异性癌基因的表达，并阻断STAT3介导的DNA结合活性。此外，6诱导的细胞内ROS积累促进了癌细胞凋亡和细胞周期阻滞。分子对接研究表明，6通过与Arg609、Lys626和Gln635残基形成3个氢键，与STAT3的SH2结构域紧密结合。其哌嗪连接体为与STAT3的两个结合袋（Leu706和pY705位点）相互作用提供了合适的长度和角度。4-溴取代的衍生物7也通过阻断STAT3的激活，在体外和体内显示出对乳腺癌细胞生长的强大抑制作用。4.2.磺酰胺衍生物作为STAT3抑制剂。图6. BP-1-102的结构改造。如上所述，SH2结构域包含三个能够与小分子配体结合的关键子袋。然而，大多数报道的STAT3抑制剂只能结合其中的两种。为了提高STAT3结合的亲和力和抑制效果，一些tripedal SH2域抑制剂通过同时占据这三个口袋被开发出来。早期发现的五氟苯基磺胺衍生物BP-1- 102(9，图6)是一种口服生物利用的STAT3 SH2域抑制剂，被认为是最有希望转化为临床实践的抑制剂。在SPR实验中，BP-1-102以504 nM的强结合亲和力(Kd)与STAT3结合，并在EMSA中以6.8 μM的IC50抑制STAT3的DNA结合活性。它可以选择性地抑制STAT3依赖性肿瘤细胞的生长、存活、迁移和侵袭，并抑制乳腺癌(MDA-MB-231)和肺癌(A549)异种移植瘤模型的肿瘤生长。以BP-1-102为起点，后续的HIT优化工作产生了几个有吸引力的STAT3抑制剂，例如基于异羟肟酸的类似物SH5-07(10)和基于苯甲酸的衍生物SH4-54(11)，两者都比BP-1-102有显著改善(EMSA:IC50分别为4.7和3.9 μM)。图7. 作为STAT3抑制剂的磺酰胺衍生物的结构TTI-101（19，图7），也被称为C188-9，是一种口服STAT3抑制剂，目前正在进行临床试验（III期）。Ball研究组合成并评估了一系列TTI-101类似物作为STAT3抑制剂。SPR分析表明，萘环上1、2、4位的取代基显著影响了抑制剂对STAT3的分子识别。在这些实体中，含有全氟苯环的s-链化合物20在基于SPR的实验中显示出显著的结合亲和力，是TTI-101的6倍（半抑制浓度值分别为0.7和4μM）。此外，化合物20对AML细胞系（HL-60、MOLM-13和半抑制浓度-1）的STAT3磷酸化水平呈剂量依赖性下降，半抑制浓度值在0.8和1.9 μM之间。AML的异种移植模型进一步验证了其在减少肿瘤进展中的作用。利用铑-小分子偶联物靶向STAT3的非传统方法。Rh-萘基磺酰胺偶联物21在STAT3结合、磷酸化抑制和诱导凋亡方面都远远大于TTI-101。氯硝柳胺（25, Niclosamide）是FDA批准的抗蠕虫药物，但已被发现具有STAT3抑制活性。考虑到−SO2NH2是一个关键基团与STAT3（包含氢键供体和氢键受体，广泛发生在许多STAT3抑制剂），亲水−SO2NH2基团氯硝柳胺提高其水溶性和生物利用度。用−SO2NH2替代−Cl，得到化合物NGT 02（26），亲水性提高，但抗肿瘤活性降低。NGT 02的进一步结构修饰导致化合物27，这是本系列中活性最高的，对过表达STAT3的MDA-MB-23a、1-31、HCT-116和SW480肿瘤细胞系的半抑制浓度值为0.61−1.11μM（略高于氯硝柳胺）。4.3.醌类似物作为STAT3抑制剂。图8. 醌类类似物28−31作为STAT3抑制剂的结构。醌类衍生物作为STAT3抑制剂也已被广泛证实。醌衍生物(含有1,4-或1,2-片段)是一种高效的亲电子分子，在生物学和药理学中有着广泛的应用。1,4-苯醌是具有多种生物活性的醌衍生物中最简单的骨架。化合物28 (BPMP，图8)是一种不可逆的STAT3抑制剂，在荧光素酶报告实验中，它可以抑制STAT3依赖的转录活性(IC50 = 3.57 μM)，并显著抑制3 μM的组成型表达STAT3的人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MDA-MB-468)的增殖。化合物28抑制STAT3的机制不同于许多靶向SH2结构域和/或DNA结合结构域的其他STAT3抑制剂。这种化合物不影响Tyr705和Ser727的磷酸化和核定位，而通过质谱分析，它能够通过Michael加成反应选择性地在连接结构域(LD)内烷化Cys550。因此，28被报道为第一个STAT3 LD抑制剂。医学将老药新用作为抗癌药物的开发提供了一个很有前途的策略。最近发现了萘醌基衍生物阿托瓦酮（29），一种被FDA批准的抗菌药物，是一种有效的STAT3抑制剂。它可以显著下调关键生存和增殖相关靶基因的表达，包括survivin、Bcl-2家族成员和细胞周期蛋白D1。图9. 萘醌类似物32−36作为STAT3抑制剂的结构。Plumbagin（PL，32，图9）是从黄花中分离出来的天然萘醌，通过抑制STAT3磷酸化显示出对乳腺癌的潜在抗癌活性。它与有效的STAT3-SH2抑制剂（1,4-萘醌核心，如STA-21和LLL-3）具有非常相似的结构，并通过与Ser611形成氢键和与Lys591的阳离子-π相互作用延伸到pTyr705口袋，但不能与侧口袋相互作用。为了增加PL的STAT3结合亲和力，在PL中引入了一个芳香环，使新的衍生物能够同时嵌入pTyr705位点和侧袋中。SARs的结果表明，C-5处的羟基对STAT3的抑制活性至关重要。此外，在芳香环上引入额外的基团和合适的连接剂也有利于其活性。化合物33被证实是本系列中最有效的一种，在对抗三种癌细胞系（MDA-MB-MB-231、HepG2和A549）时，它的效力是PL的2倍。因此，它可以抑制STAT3磷酸化和下游基因（Survivin和Mcl-1）表达，而不影响其上游酪氨酸激酶（Src和JAK2）的表达和p-STAT1的磷酸化水平。 图10. Napabucasin衍生物的结构37−42。芳香族环融合萘醌类作为STAT3阻滞剂也已被研究，其中呋喃萘醌类尤其值得关注。Napabucasin(37，也称为BBI608，图10)于1982年被分离并确定为通过靶向STAT3通路的干性抑制剂(stemness inhibitor)，已于2016年底被FDA批准作为治疗胃癌/胰腺癌的孤儿药。在许多研究中，napabucasin被声称可以通过结合STAT3的SH2结构域来抑制STAT3，但缺乏晶体学证据。通过广泛的分子动力学和集合对接模拟发现，所有研究的13种选择性STAT3抑制剂均非特异性地与STAT3和STAT1的几乎整个蛋白表面结合，这与实验观察到的结果相差甚远。图11. angular isonapabucasin衍生物的结构43−47。angular isonapabucasin衍生物作为其同分异构体也被报道具有STAT3抑制活性。基于napabucasin 和β-lapachone（43、图11），发现了44，它是两倍的磷酸化抑制活性（HTRF，EC50为0.87和2μM，），这两种药物对MDA-MB-MB231细胞（IC50=0.74和2.1 μM）。图12. 苯或杂环融合醌类类似物48−50作为STAT3抑制剂的结构。除上述呋喃融合萘醌外，还有少数苯或杂环或杂环融合醌具有STAT3抑制活性（图12）。苯融合的萘醌（蒽醌）衍生物48通过结构筛选，被发现为STAT3的抑制剂。化合物48直接与STAT3蛋白结合，SPR的结合亲和力为4.59 μM，显著抑制STAT3的磷酸化和转录活性，有助于其对持续激活STAT3的MDA-MB-468乳腺癌细胞的高生长抑制。不幸的是，该化合物还抑制了STAT1和STAT5的磷酸化。4.4.黄酮类化合物及其类似物作为STAT3抑制物。图13. 天然黄酮51−54作为STAT3抑制剂的结构。黄酮类化合物是一类治疗上重要的酚类衍生物，包括黄酮、黄酮醇、黄酮、查尔酮、异黄酮和黄烷醇。有关黄酮类化合物的研究因其多种生物学功能和低毒性而受到广泛关注。的潜在机制广泛的天然类黄酮发挥抗癌活性尚未完全阐明。最近的研究表明，天然的类黄酮的细胞毒性效应至少来自干扰STAT3通路，如图13所示，黄酮类化合物（51）是一种直接的STAT3抑制剂，通过结合SH2结构域和DNA结合结构域，从而阻碍了STAT3的激活、二聚化、核易位、DNA结合和转录活性图14. 类黄酮衍生物55−61作为STAT3共价抑制剂的结构。STAT家族成员之间的高度同源性可能为开发STAT3抑制剂提供了一种方法。考虑到这一点，色酮酰肼STAT3抑制剂通过将各种替换6位置和改变的末端苯环STAT5抑制剂55（图14），其结构熊色酮支架的黄酮和异黄酮。118值得注意的是，引入叔丁基的6位置（化合物56）导致增加8倍STAT3抑制效力伴随着一个巨大的损失活动对STAT5 FP-based的竞争结合试验与最初打55相比，是最活跃和选择性STAT3抑制剂。用分子模型来解释，即叔丁基占据了一个由Pro639、Glu612和Ser613形成的疏水口袋。图15. 类黄酮类似物62−64作为STAT3共价抑制剂的结构。由于类黄酮类似物生物利用度差和低效力，姜黄素需要结构修改，和一些成功的例子主要集中在环化β-二酮连接剂等化合物62和63（HO-3867，图15）。与姜黄素相比，这些化合物显示对STAT3抑制活性增强。基于合理药物设计的生物等位空间性原理，合成了一系列HO-3867衍生物作为抗癌药物。4.5.萜烯作为STAT3抑制剂。图16. 萜烯作为STAT3抑制剂的结构。天然产物是鉴定新药物先导物的重要来源。与上述的黄酮类物质一样，天然产生的萜烯也具有广泛的药理特性，如抗菌、抗炎和抗肿瘤活性。从细菌中筛选了细胞毒性成分，发现bruceantinol（65，图16）在低纳摩尔浓度下对人结直肠结直肠癌细胞具有强大的抗增殖活性。机制研究表明，bruceantinol介导的抗癌作用伴随着对STAT3-DNA结合活性的显著抑制，在EMSA分析中半抑制浓度值为2.4 pM。与体外实验结果一致，在bruceantinol治疗结束时，HCT-116异种移植模型的肿瘤体积减少了54%。4.6.其他杂环化合物作为STAT3抑制剂。图17. 嘧啶衍生物77−82作为STAT3抑制剂的结构。芳香族杂环部分，如嘧啶、喹唑啉、喹啉和唑类杂环，经常出现在许多化学物质中，并与包括抗癌特性在内的各种生物活性有关。这些杂环具有显著的偶极矩，能够与生物大分子形成有利的氢键。嘧啶和嘧啶样衍生物大多被称为激酶抑制剂，但它们也可以作为STAT3相关通路抑制剂。图18. 作为STAT3抑制剂的喹啉衍生物83−85的结构。喹啉衍生物STX-0119（83，图18）是由Asai研究组通过虚拟筛选方法发现的STAT3二聚抑制剂，其多效抗癌作用已在包括替莫唑胺耐药细胞系在内的多种恶性肿瘤中包括胶质母细胞瘤细胞系中得到证实。最近，对STX-0119进行了结构优化，鉴定了喹啉羧酰胺衍生物YHO-1701（结构尚未公开），在生化分析中比STX-0119更有效。图19. STAT3抑制剂其他芳香杂环衍生物的结构。STX-0119中的恶二唑环是抑制STAT3的一个关键分子特征。Kim等人通过基于结构的高通量筛选，发现了基于恶二唑的ODZ10117（86，图19）作为特异性的STAT3抑制剂。与已知的STAT3抑制剂S3I-201，STA-21，nifuroxazide,，ODZ10117更抑制STAT3激活通过直接阻断STAT3的SH2结构域，然后抑制其同源二聚和转录活性，介导其不同的抗癌作用对乳腺癌细胞包括凋亡诱导以及减少迁移和入侵。4.7.抑制剂与STAT3之间的相互作用总结。在细胞水平上，上述大多数抑制剂对具有构成性STAT3激活的人类癌细胞表现出很强的抑制活性。具有构成型激活STAT3的各种类型的人类癌细胞系。STAT3抑制剂发挥功能通过抑制STAT3磷酸化，结合到SH2域，直接扰乱STAT3-DNA结合，或抑制STAT3转录活性。由一些体外化验包括EMSA，MST，ELISA，SPR，FP，MST，BLI，荧光素酶测定，HTRF，alphaScreen分子水平。鉴于STAT3和STAT1在癌症进展中发挥的相反作用，许多这些化合物被证明是选择性的STAT3抑制剂，对STAT1有轻微或没有抑制作用。5. STAT3蛋白降解剂图20. PROTAC SI-109作为STAT3降解剂的设计，及其与STAT3的共晶结构（PDB: 6NUQ）。目前，开发诱导蛋白质降解的靶向嵌合体的蛋白水解（PROTACs）技术是一种很有前途的技术。该技术用于解决由疾病相关蛋白的异常表达驱动的疾病。典型的PROTACs是由三个基本成分组成的异双功能分子：用于结合目标蛋白（POI）的配体，用于结合和招募E3连接酶降解复合物的第二个配体，以及将两个配体连接在一起的连接体。PROTACs同时与POI和E3-泛素连接酶结合，从而导致细胞中蛋白酶体对POI的泛素化和降解。Wang的研究组最近首次发现了一种高效、选择性的STAT3 PROTAC降解剂，该剂可以在低纳摩尔浓度下诱导STAT3的快速降解。他们对模板分子CJ- 887（96，图20）进行了几轮优化，这是STAT3 SH2结构域的有效抑制剂（Ki = 47 nM），将SI-109（97）作为结合STA3（Ki = 14 nM）的合适配体。由SI-109的共晶结构发现，SI-109中的八元环的氨基暴露在溶剂结构中，这表明它是连接E3配酶配体的合适位点。对连接子优化发现SD- 36（98）是最好的。SD-36可降低急性髓系白血病Molm-16和间变性大细胞淋巴瘤SU-DU-HL-1细胞系的STAT3和p-Y705水平，DC50值分别为0.06和0.028 μM。毫不奇怪，他们的有效STAT3降解结果在两种细胞系中都与细胞生长抑制有良好的相关性（半抑制浓度值分别为0.013和0.61μM）。此外，SD-36在Molm-16异种移植模型中非常有效。每周给予50 mg/kg，可有效抑制肿瘤生长，连续3周，同时肿瘤完全消退。6. STAT3抑制剂总结与展望早期治疗试验已经验证了靶向STAT3的临床重要性。已进入临床试验的主要STAT3小分子抑制剂，其中一些显示出了令人鼓舞的结果。在这些临床试验中，STAT3抑制剂已单独使用，或与化疗药物或靶向药物联合使用。在过去的20年里，人们发现了大量不同的化合物通过各种策略直接抑制STAT3活性，如虚拟和高通量筛选以及基于结构和配体的分子建模。成功的STAT3抑制剂不应影响密切相关的蛋白STAT1的活性，该蛋白在SH2结构域序列上与STAT3具有很大的相似性。由于靶向SH2结构域缺乏对STAT3的完全抑制，STAT3的其他结构域，包括DBD、LD和CCD，以克服SH2靶向分子的局限性。除了直接阻断STAT3的活性外，STAT3的降解可能是另一种有效的癌症治疗策略。Wang小组使用PROTAC技术验证了这一点。然而，靶向STAT3的PROTACs的开发似乎比发现抑制剂更具挑战性。例如，最近设计并合成的基于甘蓝甘素的PROTACs。出乎意料的是，这些PROTACs诱导了ZFP91的显著降解，而不是STAT3。除了异双功能的PROTACs外，发现有效的单价降解物可能是靶向STAT3的另一种替代策略。参考文献：linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0968089623002304声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓