诺华公司发现新E3连接酶配体，可用于克服CRBN耐药性

2024-02-01

蛋白降解靶向嵌合体免疫疗法

近日，来自诺华公司的Claudio R. Thoma和Martin Schröder 在 Nature Communications上发表了一篇题为《DCAF1- based PROTACs with activity against clinically validated targets overcoming intrinsic- and acquired-degrader resistance》的文章。报道了一种基于E3连接酶受体DCAF1的非共价PROTACs分子开发，DCAF1是CRL4连接酶亚家族中包含WD40重复结构域（WDR）的E3连接酶，作者以核蛋白BRD9和酪氨酸激酶BTK作为降解对象，证明了DCAF1的PROTACs可用于靶向降解，并提供了一种替代策略来解决VHL和CRBN耐药。

靶向蛋白质降解 (TPD) 通过小分子诱导的 E3 连接酶重定向来泛素化新底物并标记它们进行蛋白酶体降解，从而调节蛋白质水平。TPD最近已成为药物发现的关键模式。到目前为止，人类基因组编码超过600种E3连接酶，只有少数E3连接酶被用于TPD，包括 CRBN、VHL、cIAPs、MDM2、DCAF15、DCAF16和KEAP1等，基于这些E3连接酶已经开发了一些E3连接酶配体，包括常见的VHL配体VHL-7, CRBN配体免疫调节抑制药物（IMiD）泊马度胺、来那度胺及其衍生物等。在TPD应用中，很少有其他非共价配体能与这些E3酶的效果相匹配。E3连接酶的共价配体具有一定的缺点：降低了PROTAC分子的催化性质、可能会阻断天然底物的降解、更容易产生靶向毒性。共价E3配体的不可逆性质也可能使高特异性连接酶配体产生复杂化。用于TPD最广泛的免疫调节药物是沙利度胺及其衍生物，它们已被批准用于治疗多发性骨髓瘤（MM），它是一种依赖IKZF转录因子的浆细胞恶性肿瘤。但IMiD治疗的MM患者中，大约30%的难治性患者的CRBN水平发生了改变，在大多数情况下会出现拷贝丢失，而较低的CRBN含量会导致IMiD介导的IKZF降解减少，进而出现耐药。CRBN是一种基于全基因组CRISPR KO研究的非必需基因，因此，靶向必需的E3连接酶是一种潜在的策略，可以避免或至少延缓治疗耐药性的出现。

选择性DCAF1 E3连接酶binder的发现

近期WDR配体的发现（EED27和WDR52）表明WDR是可靶向的，23年一篇文章报道了DCAF1的WD40 domain的可逆配体，进一步强调了开发基于非共价DCAF1的PROTACs的潜力。在约600个E3连接酶中，作者重点研究了48个含有WDR结构域作为推定识别基序的E3连接酶。DCAF1是CRLDAF1和EDVP复合物的一部分，显示出与DDB1相似的肿瘤重要性。此外，DCAF1已被证明是Cullin4连接酶组合中的首选受体，并且是CRL4 E3连接酶中第二丰富的CRL4受体，仅次于CRBN（图1）。

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来源: 精准药物

利用核磁共振、计算机辅助药物设计、生物物理学和结构-活性关系等方法，作者筛选和优化了EED27的WDR配体，发现了化合物13通过伯胺占据DCAF1 WDR donut-hole口袋的支架，另一端的哌嗪位于口袋出口，可以用于后续的衍生。作者于是构建了炔基衍生的化合物16并进行了化学蛋白质组学实验，实验结果表明化合物16可以成功富集到整个CRL4-DCAF1复合物（包括CUL4A/B，DDB1，DDA1和RBX1）（图1）。

DCAF1-BRD9 PROTAC的合成和验证

考虑到DCAF1主要定位在核质中，作者首先测试了DCAF1 PROTAC能否靶向降解BRD9。作者将已知的BRD9溴结合域配体与化合物13的哌嗪部位偶联，得到了PROTAC分子DBr-1，并通过TR-FRET和SPR评估了其对DCAF1的结合力，结果成功证明了DCAF1- DBr-1-BRD9三元复合物的形成。随后作者在细胞内验证了DBr-1的降解能力，结果显示在HEK293细胞中1000 nM的DBr-1在6 h后成功降解了90%的BRD9，且该过程可以被蛋白酶体抑制剂所抑制。浓度为1000 nM DBr-1的时间梯度降解实验显示，30 min后降解90%并保持6h以上，24h和48h后缓慢反弹。选择性实验也表明，DBr-1在降解BRD9的同时仅对BRD7有微弱的影响（图2）。

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来源: 精准药物

基于VHL的BRD9 PROTAC VZ185也可以降解BRD7和9，而CRBN的PROTAC dBRD9可以选择性地降解BRD9。为了评估DCAF1 PROTAC的选择性并对其性能进行测试，作者直接比较了DBr-1与VZ185、dBRD9在HEK293细胞中降解BRD9和BRD7的能力。结果显示，DCAF1的降解效果与CRBN和VHL基本相当（图3）。

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来源: 精准药物

DCAF1 PROTAC介导酪氨酸激酶的降解

在成功降解BRD9之后，作者探索了DCAF1 PROTACs是否也可以介导核外蛋白的降解。dasatinib结合超过30种激酶，并在低纳摩尔浓度下抑制ABL、DDR、TEC、SRC和EPH亚家族的57种酪氨酸激酶。作者将dasatinib偶联到DCAF1配体上，合成了另一个的PROTAC DDa-1。首先通过WB测试DDa-1对四种非受体酪氨酸激酶的作用：C-Src酪氨酸激酶（CSK）、Lck/Yes相关蛋白酪氨酸激酶（LYN）、LIM结构域激酶2（LIMK2）和Abelson蛋白酪氨酸激酶1（ABL1）。结果显示CSK和LIMK2蛋白水平在6小时后以蛋白酶体（26Si）和CRL依赖方式（NAE1i）显著降低，但LYN或ABL1蛋白水平没有下降。与CRBN-dasatinib降解剂CDa-1相比，DDa-1对这两种降解激酶的降解能力有所降低（图4）。

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来源: 精准药物

为了深入了解全局蛋白丰度的变化，作者利用蛋白质组学的方法分析了DDa-1处理6小时后的HEK293T细胞。证实了两种激酶CSK和LIMK2的下调，并进一步发现了另外两种非受体酪氨酸激酶TEC和TNK2显示出显著的蛋白水平降低。据报道，TEC和TNK2都优先定位于质膜。布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是TEC家族的另一个成员，已被证明是PROTAC介导的劫持CRBN降解的一个有吸引力的靶标。因此作者后续构建了一个BTK筛选系统，在该系统中测试DDa-1验证了内源性BTK降解的发现（图4）。

有效的BTK特异性DCAF1 PROTAC的发现

随后作者使用一个特异性的BTK配体合成了不同的DCAF1-BTK PROTACs。选择了两个分子进行进一步的表征，DBt-5是通过一个长的聚乙二醇linker连接，而DBt-10通过一个更刚性的linker连接DCAF1和BTK配体。通过TR-FRET和SPR评估这两种PROTAC的DCAF1二元亲和性。DBt-5对DCAF1的亲和性略高于DBt-10。在TR-FRET和SPR实验中，额外的BTK增加了DBt-10对DCAF1的亲和力，而降低了更柔性的DBt-5对DCAF1的亲和力（图5）。

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来源: 精准药物

作者进一步评估了DCAF1-PROTAC-BTK三元复合物的形成以及两种PROTAC处理后BTK的体外泛素化。DBt-10的初始速度和最大SPR响应高，说明稳定的三元配合物可以提高泛素化效率。尽管DBt-5和DBt-10表现出不同的二元和三元配合物稳定性和细胞渗透性，但DBt-5和DBt-10都能有效降解BTK-GFP。DBt-10的毒性比DBt-5小，因此选择DBt-10进行后续实验，结果表明DBt-10具有高选择性并能显著降解BTK（图5）。以上结果证明DCAF1配体也可以用于开发高选择性的PROTACs。

DCAF1-PROTACs为缺乏VHL表达或对基于CRBN的降解物具有获得性抗性的细胞提供了选择

作者选择缺乏VHL表达的768-O细胞作为模型。基于VHL的降解剂VZ185并不能有效降解BRD9。在相同的实验环境下，DCAF1和基于CRBN的BRD9降解剂DBr-1和DBRD9对BRD9的降解效率基本一致。这些结果证实，在VHL不表达的生物学环境中，DCAF1是PROTACs应用的另一种必需连接酶（图6）。

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来源: 精准药物

随后作者又测试在基于CRBN的PROTACs失去降解能力的情况下，必需的连接酶DCAF1是否可以作为替代品。DCAF1和CRBN都需要相同的结合伙伴（如DDB1和CUL4A）来形成活性E3连接酶复合物。使用CRBN-BTK PROTAC敏感和耐药的TMD8细胞来进行研究，研究结果显示用DBt-10检测TMD8 CBt敏感和耐药的细胞，结果显示BTK的降解没有差异，而使用CBt处理这两种TMD8细胞系导致了100倍的增殖抑制差异。以上实验数据表明DCAF1是一种极具潜力CRBN和VHL的替代物（图6）。

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