基于纳米技术的mRNA疫苗
2023-11-21
信使RNA疫苗
mRNA疫苗已经成为一种革命性的工具，可以产生针对传染病和癌症的快速和精确的免疫反应。与灭活病毒、病毒载体、蛋白质亚基或DNA疫苗等传统疫苗相比，mRNA疫苗具有设计简单、生产速度快、安全性强、疗效高等优势。然而，由于mRNA分子固有的不稳定性和易降解性，有效和有针对性的递送仍然是一个重大挑战。纳米技术为克服这些障碍和增强mRNA疫苗的效力提供了创新的解决方案。递送系统的功能是将RNA运送到靶细胞，介导细胞摄取，并使其释放到细胞质中。值得注意的是，传递系统在很大程度上决定了RNA疫苗的给药途径。目前，脂类及脂源性纳米颗粒（NPs）、聚合物NPs、蛋白质NPs和无机NPs是基因疫苗的主要载体。目前正在开发的mRNA疫苗主要有两种类型:经典的非复制mRNA和自我扩增RNA (saRNA)。非复制mRNA具有传统的mRNA形式，编码5 '和3 '非翻译区两侧的靶抗原。以这种方式产生的靶蛋白的数量受到细胞吸收的mRNA分子的数量和细胞将mRNA转化为蛋白质的速度的限制。mRNA疫苗依靠合适的递送平台将它们运送到细胞内，并通过内体逃逸将它们释放到细胞质中。图1 mRNA疫苗的分类和作用机制a.两种mRNA疫苗类型b. mRNA疫苗的免疫机制合理设计和优化纳米材料以有效封装和保护mRNA分子mRNA疫苗的纳米平台的递送效果和耐受性主要取决于它们的组成和物理和化学性质。此外，基于NPs的mRNA疫苗的给药途径对疫苗的器官分布、蛋白质表达动力学和保护功效有很大的影响。图2 基于纳米技术的mRNA疫苗的实验流程a. 不同的纳米载体影响mRNA疫苗的递送效果b. mRNA疫苗研制中给药途径的选择脂基纳米颗粒（LNPs）由于配方简单、生物相容性和高效率，脂质是目前最先进的输送mRNA的载体。LNPs是以脂类为基础的纳米颗粒，由包裹在水中央隔间的单层或多层磷脂组成，因其固有的生物相容性、显著的通用性以及对亲水和疏水性质的物质的包封性而被深入研究并用作药物输送系统。在mRNA传递的背景下，脂质体通常表现出比LNPs更弱的包封率和转染率。目前，大多数生产RNA疫苗的公司都采用了LNPs递送技术。LNPs是稳定的NPs，主要由四种成分组成：可电离氨基脂、磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂。PKa值、分子结构和可电离脂质比例的变化对LNPs的效率有显著影响。LNPs的输送效率还受疏水结构域中双键的数量，脂尾的饱和度，基团距离影响。薄膜蒸发法和乙醇注入法作为传统的mRNA-LNP制备方法，由于纳米粒大小不一、包封率低、难以规模化和重复性差而逐渐被淘汰，交叉T混合器和微流控器件的发展彻底改变了LNPs的制备方法。聚合物纳米粒子早在1976年，聚合物就被报道能够传递蛋白质和DNA。此后，越来越多的聚合物由于其控制精确、表面修饰容易、有效载荷灵活等优点，被广泛采用作为mRNA传递的非病毒载体，如树突、聚合物胶束等。聚乙烯亚胺(PEI)是研究最广泛的基因传递高分子材料之一。PEI输送效率高，部分原因是pH缓冲范围广。然而，高电荷密度使其易于聚集，从而产生细胞毒性。为了克服这些局限性，通常使用低分子量PEI或PEG修饰，偶联环糊精，二硫键和烷基链来降低体内细胞毒性，提高生物相容性和转染效率。通过两亲性嵌段或接枝共聚物的自组装合成的聚合物胶束可以溶解难溶的化合物，提高它们的生物利用度。与单独使用mRNA-LNP相比，添加聚合物胶束后，肝脏中mRNA的表达水平显著增加。此外，不同聚合方式的胶束对mRNA的包封能力也有影响。RNA寡核苷酸衍生物或胆固醇部分已被用来桥接mRNA和多阳离子，以稳定复杂的胶束，从而有效地递送mRNA。基于聚合物的NPs可以作为一种有利的工具将mRNA传递到特定的靶点。然而，由于某些高分子量聚合物在体内容易聚集和细胞毒性，基于聚合物的设计仍然对开发mRNA传递系统具有挑战性。纳米乳液纳米乳液（MEs）是由分散在不同液体中的微小纳米液滴组成的非均相胶体体系，由表面活性剂或乳化剂稳定，NEs的配方和相的多功能性允许包埋saRNA在内的多种治疗分子。角鲨烯阳离子纳米乳液(CNEs)已被广泛探索用于saRNA递送。2014年，诺华公司团队开发了一种用于saRNA疫苗接种的基于角鲨烯的CNE配方，该配方在注射部位诱导了与病毒载体类似的蛋白质表达谱，更重要的是，在包括非人灵长类动物在内的不同动物模型中，以相对较低的剂量产生了针对各种抗原的强大免疫反应。在一项后续研究中，该CNE-saRNA疫苗平台在恒河猴中表现出对HIV的强大免疫原性和最低的全身毒性。由于其显著的包封性和高效的递送能力，CNEs作为saRNA疫苗的有前途的载体已经引起了广泛的兴趣。然而，它们易于聚集和阳离子脂类引起的长期毒性的可能性需要彻底的评估和优化。蛋白质纳米颗粒由于具有良好的生物相容性、可调性和生物降解性，天然衍生的蛋白质NPs作为mRNA的载体越来越受到人们的关注。铁蛋白家族、多肽和病毒样颗粒(VLP)是应用最广泛的蛋白质纳米颗粒。铁蛋白是一种独特的蛋白质NPs，由24个相同的多肽组成，其肿瘤靶向性、高生物相容性和易降解特性确保了其作为体内给药载体的安全。然而，铁蛋白的天然电负性限制了核酸的负载。为此，通过正向突变内表面上带负电荷的氨基酸，构建了具有带正电荷的内腔的核酸负载铁蛋白载体，从而能够有效地负载核酸。多肽分子上的阳离子或两亲胺基团如精氨酸可以通过静电作用与mRNA结合。CureVac目前开发的平台利用富含精氨酸的鱼类精子蛋白多肽作为mRNA载体，用于传染病和癌症的广泛临床试验。有趣的是，各种细胞穿透性多肽也可以通过瞬时表达mRNAs为疾病的诊断和治疗提供重要的策略。VLP主要由病毒衣壳蛋白组成，可以模拟病毒的真实结构，有效地包装mRNA。由于这些VLP没有病毒基因组，不能在细胞内复制，但可以完全激活免疫反应，因此它们更安全、更具可扩展性和更强的免疫原性。目前，用于mRNA传递的VLP是基于逆转录病毒，mRNA被特定的病毒衣壳蛋白识别，随后整合到病毒颗粒中。总之，多种多样的蛋白质类型为制造具有不同递送功能的NPs提供了充足的机会。然而，用于mRNA传递的蛋白质纳米粒的发展仍然面临挑战，包括mRNA包封率低、内毒素诱导的毒性和突释问题。此外，蛋白质的天然性质在制造和配方过程中可能会发生变化，克服这些挑战对于充分利用蛋白质NPs作为基于mRNA治疗有效载体的潜力至关重要。无机纳米颗粒无机NPs的发展为mRNA的传递提供了新的途径。与传统的有机纳米载体相比，这些载体可能具有高效绿色合成、大小和表征可调、通用性强等特点。金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、量子点和氧化铁纳米粒子是目前利用最多的无机纳米粒子类型。金纳米粒子因其尺寸小、可伸缩性、良好的生物相容性和可调节的细胞毒性而成为有吸引力的mRNA载体材料。然而，未经修饰的裸金纳米粒子不稳定，容易以金属颗粒的形式聚集和沉淀。目前，金纳米粒子主要通过共价键或超分子偶联组装来促进载体与mRNA的结合。硅基纳米颗粒通常被设计成纳米载体，用于输送不同的核酸分子。总体而言，无机纳米粒子在尺寸、结构和几何形状上表现出高度可控的特性。然而，这些无机纳米材料的潜在长期毒性和有限的生物降解性仍然存在。给药途径纳米载体是促进mRNA转运到靶细胞的不可或缺的工具，从而使mRNA疫苗的高效输送成为可能。不同的给药途径直接影响纳米材料的选择和设计。此外，纳米平台的设计和特性也会受到注射途径的影响，这决定了纳米载体与人体接触的生理环境，如注射部位的生理条件、细胞类型和免疫微环境。这些因素都会影响纳米载体的稳定性、颗粒大小以及它们与靶细胞相互作用的方式。因此，针对不同的mRNA递送系统选择合适的给药途径是研制核蛋白mRNA疫苗的关键。每种管理方法都有其优点和局限性。静脉注射的主要缺点之一是全身效应，如果NPs不易从体内清除，可能会产生更大的副作用。在静脉注射中，不同电荷和大小的NPs会影响血液中的清除率，较大的NPs的清除率更快。皮下注射在皮肤和骨骼肌之间传递高局部浓度的mRNA，适合一些慢性病患者。但皮下注射对剂量有一定限制，皮下脂肪血管分布不佳则不利于疫苗快速释放。相比之下，皮内注射在发现许多免疫细胞的表皮和真皮之间传递mRNA疫苗，有效地诱导免疫反应。然而，因为两者都不能实现大剂量给药，需要分批注射或多次给药。肌肉注射用于将靶基因转移到肌肉组织，这是目前已批准的新冠肺炎疫苗中使用最广泛的途径。这种用法便于大剂量注射，但可能会产生明显的副作用，如注射部位疼痛、肿胀和发红。鼻腔途径可以产生黏膜和系统免疫反应，减少对针状免疫的依赖，并有助于预防带有粘膜病原体的疾病。然而，目前鼻腔接种疫苗的有效性主要在动物模型中得到证实，还需要进一步的研究来确定是否可以在临床环境中使用。不同给药途径的RNA表达持续时间不同。皮内、肌肉和皮下注射的表达时间最长(10天)，其次是静脉注射(1-4天)。免疫原性和清除率也受给药途径的影响，皮内和肌肉内途径的清除率相似，而鼻腔途径产生的免疫反应较低，清除率较快。只有选择合适的给药方法，纳米材料才能以更低的剂量、更少的副作用和更大的安全性来传递更大的免疫效果。mRNA递送纳米平台表征和毒性不同的化学成分和结构特征影响NPs的mRNA传递效率和免疫原性。与传统的化学物质不同，NPs的分析除了需要它们的化学组成和结构外，还需要对它们的大小和形状、分散状态和表面电荷进行检测。Zeta电位是检测NPs电荷的有效方法，但易受pH值和离子强度的影响。通过测试不同pH和离子强度下的Zeta电位，找到合适的pH和离子强度，或者通过添加具有电位电阻效应或特定吸附电荷的表面保护剂，可以提高NPs的稳定性。尽管有多种可用的测量技术，但确定NPs的关键特性和阐明明确的结构-活性关系仍然是目前基于纳米材料的mRNA疫苗的重要挑战之一。纳米材料可能通过诱导氧化应激和炎症反应等机制诱导对生物体的毒性反应。因此，通过合理设计和优化NPs，安全有效地包封mRNA，调节mRNA疫苗与生物体的相互作用，可以最大限度地减少和消除其在体内产生的毒性。纳米颗粒的mRNA包封效率封装效率在评估NPs作为合适递送载体的潜力方面起着至关重要的作用。通常，mRNA的包封效率是用荧光法测量的，可以通过不同的方式实现。目前，广泛使用的定量包封效率技术是Quant-it Ribogreen RNA试剂盒，这种方法特别适用于进行高通量平板测定，能够快速有效地分析被封装的RNA水平。此外，mRNA配方的稳定性可以通过颗粒大小来监测。凝胶电泳和荧光相关光谱可用于确认mRNA的大小和完整性，或者可以使用高效液相色谱技术或反转录定量PCR来验证mRNA是否被降解。mRNA疫苗体外细胞测定在体外，细胞水平的评估可以通过将mRNA疫苗与目标细胞孵育，并使用共聚焦荧光显微镜和流式细胞术观察靶细胞对mRNA的摄取进行。荧光素酶报告基因检测可以作为一种筛选方法来评估NPs在感兴趣的细胞中的递送效率。细胞毒性试验、细胞活性试验、细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、细胞凋亡和细胞周期试验可用于mRNA疫苗对靶细胞生物学功能的影响。采用荧光定量PCR、western blotting和免疫荧光检测靶基因mRNA和蛋白表达。体内动物水平评估为了评估mRNA疫苗的免疫原性，可以根据NPs的理化性质和mRNA的治疗目的，采用合适的动物模型和注射途径进行免疫接种。可采用多种方法评估mRNA疫苗的药代动力学特性，如聚合酶链反应和质谱法，通过测量血液或尿液等生物样品的核酸浓度。利用免疫组织化学染色和血清学分析研究了基于纳米技术的mRNA在其他器官中的毒性积累。为了研究mRNA疫苗对动物免疫微环境的影响，可以使用流式细胞术、酶联免疫吸附试验等检测体内免疫细胞和细胞因子的变化。为了评估对致瘤性疾病的疗效，可以通过肿瘤生长(肿瘤体积测量、肿瘤重量测量和高频超声成像)、肿瘤中靶蛋白的表达(免疫组织化学和western blotting)和动物存活率来评估模型。临床评估mRNA疫苗在投入临床使用时应持续监测和评估其有效性和安全性。通常，在首次给药之前和之后的一段时间内，使用酶联免疫吸附法或化学发光免疫分析法测量IgG或IgA等抗体水平，可用于评估mRNA疫苗的有效性，并指导和优化mRNA疫苗接种方案。然而，对于需要多大浓度的中和抗体才能达到mRNA疫苗的预防和治疗目的，目前缺乏公认的标准。此外，应及时监测和报告mRNA接种后严重不良事件的类型和发生率。mRNA疫苗应用COVID-19SARS-CoV-2是一种具有包膜和线性单链阳性链的RNA冠状病毒，编码病毒刺突蛋白(S)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和核蛋白(N)。S、E和M蛋白是表面蛋白，插入包膜中，而N蛋白包裹在基因组RNA周围。SARS-CoV-2主要通过S蛋白进入靶细胞诱导免疫应答。因此，S蛋白被广泛用作COVID-19 mRNA疫苗的免疫原。自科学家首次发表并公布SARS-CoV-2的RNA序列以来，多个疫苗平台参与了候选疫苗的开发。Moderna开发的mRNA-1273和Pfizer-BioNTech开发的BNT162b2使用相同的抗原靶标编码全长刺突蛋白S。这两种疫苗在mRNA生产过程中都使用1mΨ代替U和双链RNA片段去除来进行常规的碱基修饰，从而显著降低mRNA的先天免疫反应。为了使mRNA能够到达细胞质，两种疫苗都使用LNPs作为包封和递送的载体。NPs的组成相似:可电离阳离子脂质(SM-102和ALC-0315)，聚乙二醇修饰脂质(PEG2000-DMG和ALC-0159)和常见的辅助脂质(胆固醇和二硬脂酰磷脂)。图3 COVID-19 mRNA疫苗的结构表征及mRNA疫苗抗传染病的机制其他传染病鉴于mRNA疫苗在减少COVID-19感染方面的成功，针对其他传染病的mRNA疫苗的研究正在迅速扩大。表达感染因子抗原的mRNA疫苗可诱导对病毒、细菌和寄生虫感染的强而有效的细胞和体液免疫，是预防和治疗传染病的有前途的工具。疟疾mRNA疫苗的临床前实验选择环孢子子蛋白作为靶抗原。LNPs用于保护mRNA并将其传递到小鼠的靶细胞中进行翻译，从而诱导针对疟疾的功能性保护性免疫应答。目前，赛诺菲和Translate Bio宣布，他们已开始季节性流感mRNA疫苗的I期临床试验，成为首个进入临床试验的预防甲型流感病毒(H3N2) mRNA疫苗。随后，Moderna、Pfizer、CureVac等多家疫苗公司也开始了流感、HIV、呼吸道合胞病毒(RSV)、埃博拉病毒(EBOV)、狂犬病毒(RV)、疟疾和登革热(DENV)的预防性mRNA疫苗的临床研究。抗癌mRNA疫苗癌症是mRNA技术目前关注的主要疾病，与mRNA技术相关的临床试验处于不同的评估阶段。抗癌mRNA疫苗主要分为两类:编码免疫刺激剂的mRNA和编码肿瘤抗原的mRNA。编码免疫刺激剂的疫苗主要通过递送编码抗体、细胞因子和免疫检查点抑制分子(PD1、CTLA4和LAG3)的mRNA来刺激或抑制免疫通路并重塑肿瘤微环境。基于该技术，已在黑色素瘤、乳腺癌、淋巴瘤等肿瘤患者中开展临床研究。针对传染病的mRNA疫苗通常是具有编码明确抗原特性的预防性疫苗，可通过MHC-II途径诱导抗体。然而，与传染病疫苗不同，大多数癌症mRNA疫苗是治疗性疫苗，除了CD4+T细胞介导的免疫应答外，还需要更强的MHC-I途径介导的CD8+T细胞免疫来杀死和清除肿瘤细胞。此外，肿瘤抗原的个体可变性对识别和有效递送具有高免疫原性的肿瘤特异性抗原提出了挑战。需要多次高剂量注射以达到治疗目的。图4 mRNA癌症疫苗的机制限制和优化虽然mRNA疫苗被广泛认为是一种很有前途的预防和治疗方法，但现有的mRNA疫苗在功能开发过程中仍面临许多限制，包括细胞内和细胞外屏障、免疫原性、储存和安全性等。如果想要克服这些挑战并加快其他mRNA疫苗的临床应用，就需要进一步优化和创新。安全和有效地跨越细胞外和细胞内屏障是mRNA疫苗有效递送到细胞质的紧迫技术限制。细胞外的技术困难包括延长滞留时间和靶向性。由于其对核糖核酸酶的敏感性，mRNA在生理环境中容易降解。此外，单核系统吞噬作用和肾脏清除率极大地限制了mRNA在体内的滞留时间。因此，需要强大的交付载体来克服障碍。基于NPs的非病毒载体由于其免疫原性较低、有效载荷较大且易于合成，是目前应用最广泛的用于克服mRNA疫苗递送生理障碍的递送系统。mRNA NP配方的快速混合可以通过静电相互作用产生稳定的纳米结构。这种稳定性有助于保护NPs免受核酸酶的降解，最终导致免疫的产生。向NPs中添加PEG可减少血清蛋白吸收，并进一步降低单核吞噬细胞系统识别和肾滤过清除率。目前，绝大多数纳米载体主要将mRNA传递到肝脏。改变纳米材料的比例和化学结构或添加特定分子有助于将mRNA靶向递送到特定细胞或非肝脏器官。储存和安全性是mRNA疫苗开发过程中面临的挑战。在mRNA疫苗的储存和物流配送过程中，热稳定性一直是一个亟待解决的问题。除了对mRNA本身进行优化外，还可以通过修饰纳米载体来提高mRNA的稳定性。冻干的阳离子蛋白包膜mRNA编码RV糖蛋白，在5-25℃下保存36个月后仍能保持生物活性。自扩增mRNA疫苗包含工程化mRNA序列以永久产生特异性抗原，从而增强和延长免疫应答。疫苗的接种需要进入人体，这必然要求疫苗具有极高的安全性，不会在体内造成严重的副作用。mRNA生产所需的原料和合成酶可以来自商业产品，从而在一定程度上减少了细胞培养和有毒化学物质带来的安全问题。除了过敏反应引起的全身副作用外，脂质成分的积累也可引起局部细胞毒性。未来的研究将侧重于选择合适的脂质成分或表面修饰，以减轻mRNA疫苗递送载体相关的免疫原性，从而在阳性佐剂和阴性炎症之间实现最大的mRNA递送效率。展望在过去的十年中，基于纳米技术的递送策略主要致力于克服mRNA递送过程中的细胞屏障，并提高了mRNA疫苗的功效，是COVID-19和其他mRNA疫苗开发的创新标志之一。然而，目前mRNA疫苗的效力可以通过更多的优化或技术进步进一步提高。未来几年，对mRNA疫苗免疫机制的深入研究、新纳米材料的发现、新的给药途径的使用、mRNA生产良好生产规范的标准化以及多学科合作将使mRNA疫苗在多个领域得到应用。除了mRNA的免疫激活特性外，在开发基于纳米技术的mRNA疫苗时，考虑NPs本身的免疫药理学特性至关重要。NPs的组成、表征和表面电荷可能影响纳米载体与先天免疫系统和适应性免疫系统的相互作用，从而影响mRNA传递的免疫原性。深入研究mRNA疫苗的免疫机制，可以为优化mRNA序列、递送系统、佐剂或配方策略提供重要的理论依据，有利于开发下一代高效、安全、持久的mRNA疫苗。目前，无论是作为预防性疫苗还是治疗性疫苗，大多数mRNA疫苗都需要多次高剂量治疗才能诱导足够强的免疫反应。事实上，临床使用mRNA疫苗联合其他免疫治疗方法(免疫检查点抑制剂、周行免疫疗法、溶酶病毒等)可以引起更强的免疫反应。目前正在探索软膏、贴片、微针、滴眼液、滴鼻液甚至阴道粘膜等非侵入性给药方案，作为未来给药mRNA疫苗的途径。mRNA疫苗的潜在应用范围超出其目前的用途，包括癌症和传染病等多种领域。最近的临床研究表明mRNA疫苗在癌症治疗的个性化免疫治疗中具有革命性的潜力。未来的方法将包括将mRNA肿瘤疫苗与其他免疫疗法相结合，以达到最佳效果。此外，正在努力开发自我扩增的mRNA疫苗，这种疫苗只需要一次剂量就能有效治疗肿瘤。除了癌症和传染病外，mRNA疫苗在遗传代谢疾病和衰老等疾病方面也显示出令人鼓舞的临床前结果。对疾病发病机制的深入研究和基于纳米技术的mRNA疫苗的进展将推动各种疾病mRNA疫苗的发展，从而在未来取得成功的临床应用。mRNA疫苗的优化面临着无数的挑战，但过去和正在进行的努力已经明确表明，基于纳米技术的mRNA疫苗在临床应用方面具有巨大的潜力。了解mRNA疫苗的生物学机制和推进纳米递送技术仍将是未来十年的主要焦点，为进一步改进提供了重要机会。随着许多数据库和协作平台的出现，mRNA疫苗社区正在迅速发展。这些致力于mRNA疫苗的资源和专题讨论会提供了基于纳米技术的mRNA疫苗的最新研究，使非专业人员能够随时了解情况并与该领域的知名研究人员进行讨论。通过学术界和产业界的持续创新和合作，我们希望看到开发出更有效和临床适用的mRNA疫苗。文献来源：Nanotechnology-based 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