Crizotinib

近日，贝达药业向中华人民共和国澳门特别行政区药物监督管理局（以下简称“ISAF”）递交盐酸恩沙替尼胶囊（商品名：贝美纳®，以下简称“恩沙替尼”）“拟用于间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的治疗”（即一线适应症）的药品上市申请。恩沙替尼是一种新型强效、高选择性的新一代ALK抑制剂，是贝达药业和控股子公司Xcovery共同开发的拥有完全自主知识产权的创新药。2020年11月，恩沙替尼“适用于此前接受过克唑替尼治疗后进展的或者对克唑替尼不耐受的ALK阳性的局部晚期或转移性NSCLC患者的治疗”（即二线适应症）获得国家药品监督管理局批准上市。2022年3月，恩沙替尼一线适应症在国内获批上市，2023年被纳入国家医保目录。2024年12月，恩沙替尼一线适应症获得美国食品药品监督管理局批准上市，成为首个由中国企业主导在全球上市的小分子肺癌靶向创新药。2025年2月，Xcovery正式启动了恩沙替尼一线适应症欧洲上市申报程序。贝达药业副总裁王三虎表示，此次向澳门ISAF提交恩沙替尼一线适应症的上市申请是公司全球注册战略的重要一环。近年来，公司持续推进全球战略布局，围绕创新药注册需求，建立了科学的注册路径和完善的数据支持体系。恩沙替尼一线适应症已获国家药品监督管理局批准上市，为此次澳门申报提供了有力支撑。后续，公司将积极配合澳门ISAF的审评进程，力争早日实现恩沙替尼在澳门获批上市，惠及更多ALK阳性肺癌患者。贝达药业董事长助理丁师哲表示，继启动欧洲上市申报后，恩沙替尼递交澳门上市申请，是公司拓展创新药全球市场的又一重要实践，也体现了贝达持续推动自主创新药物在更多市场实现可及的坚定决心。作为国产靶向药“走出去”的代表性产品，恩沙替尼正加速在多个国家和地区的上市进程，后续还将覆盖东南亚、“一带一路”沿线国家，持续拓展“出海”版图。未来，公司将继续以患者需求为导向，推动更多医药创新成果在全球落地，努力打造总部在中国的跨国制药企业。

今天为大家介绍的是来自德国美茵茨约翰内斯·古腾堡大学和耶鲁大学Fabian Barthels教授团队在Angewandte上发表的一篇论文，该论文主要构建了一个纳摩尔级别的系统，该系统能够识别定制的荧光（甲基转移酶）MTase探针，最终找到适合METTL和NSUN家族相关药物靶点的荧光探针，最终发现三个微摩尔级别的METTL1的化合物¹。unsetunset一、 研究摘要unsetunsetRNA甲基化是一种与各种疾病相关的代谢过程，因此，RNA甲基转移酶（MTases）在药物发现中变得越来越重要。然而，现有的RNA甲基转移酶抑制剂筛选方法具有很大的局限性。为此该团队构建了一个纳摩尔级别的系统，该系统能够识别定制的荧光MTase探针，基于荧光的结合分析的广泛选择的MTase药物靶点。该团队利用点击化学的代表反应为铜催化的叠氮-炔基环加成反应，构建适合METTL和NSUN家族相关药物靶点的荧光探针，通过对化合物库的筛选，最终确定了有效的METTL1抑制剂(S)-crizotinib。unsetunset二、研究背景unsetunset1. 甲基转移酶与常见抑制剂甲基转移酶 (methyltransferase，MT)能够催化甲基化反应，通常以S- 腺苷- 甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）作为甲基的供体。甲基转移酶作用的底物包括生物大分子 DNA、组蛋白、RNA、病毒蛋白等), 而且也包括体内代谢小分子物质。甲基转移酶的异常表达或活性改变与多种疾病的发生和发展密切相关。在癌症中，甲基转移酶的异常活性可能导致基因表达的异常调控，从而促进癌细胞的增殖和侵袭。甲基转移酶的异常还可能与神经退行性疾病、心血管疾病等的发生有关。因此，甲基转移酶抑制剂在药物发现中变得越来越重要。常见的泛甲基转移酶抑制剂包括以下三种：图1.三种常见的泛甲基转移酶抑制剂2. 现有RNA甲基转移酶抑制剂筛选方法与不足基于LCMS分析的^3H标记的SAM的酶闪烁分析是常见的RNA甲基转移酶抑制剂筛选方法，SAM是甲基转移酶（MTase）的甲基供体，在甲基化反应中，SAM的甲基基团会被转移到目标RNA的特定位置上，同时生成SAH作为副产物。通过使用^3H（氚）标记的SAM，可以追踪甲基化反应的发生和位置。使用LCMS技术对SAH进行定量检测，通过比较不同条件下SAH的生成量，评估甲基化反应的活性和特异性。然而，该方法容易受到干扰导致敏感性增加和在高配体浓度下的重现性差等问题，同时这种测试方法成本昂贵且耗时。3. 微量热泳动（MST）技术微量热泳动（MST）是利用热泳动现象，即分子在温度梯度下由高温向低温移动，移动速度与分子特性相关。分子结合后性质变化，导致热泳动速度改变，通过检测这种变化可定量分析分子间相互作用，MST实验具有样品用量少、无需固定、可在复杂生物溶液中测定、操作简便等优点，已广泛应用于生命科学领域的研究。在先前的研究中，该研究团队利用该技术，成功构建DNA甲基转移酶2（DNMT2）抑制剂的筛选方法，同时发现了一种有效的甲基转移酶探针FTAD²。图2.FTAD结构（左）与MST实验示意图（右）unsetunset三、研究材料与方法unsetunset1. FTAD不足（FTAD）探针能够与DNMT2的活性位点结合，为DNA甲基转移酶抑制剂的药物筛选提供了方便的初级检测方法。与SPR（表面等离子体共振）或ITC（等温滴定量热法）等无标记筛选方法相比，因为其并不具有影响催化甲基转移酶活性的功能，避免了药物筛选中容易出现的假阳性命中等问题。然而，在常见的RNA甲基转移酶中，FTAD仅具有弱的结合能力（KD>20µM），严重限制了该探针在这些靶点上的应用。图3.FTAD与NSNU6和METTL1的值2. 候选探针的组合筛选该团队利用组合化学的概念，利用经典铜催化的叠氮-炔环加成反应，构建快速合成荧光探针的方法，该荧光探针共有两个部分组成，含有炔基的SAH类似物与含有叠氮基团的八种不同荧光探针基团。图4.MTase探针的纳米级筛选策略该研究团队首先通过点击化学快速得到一个探针分子库，通过LCMS验证结构正确，通过与目标甲基转移酶结合，再使用SAH进行置换以验证该探针能否被取代置换，再经过HPLC进行进一步合成后再验证得到探针的有效性。作者通过对METTL1进行MST实验，通过对加入SAH与不加SAH所检测到的荧光强度变化，结果显示显示Cy5TAD显示了最大的SAH诱导的位移，这一结果证实Cy5TAD有望成为METTL1的有效候选探针。图5.MTase探针开发策略然而，该研究团队发现，（SAH-triazole）TAD型探针并不适用非罗斯曼折叠的甲基转移酶，为了解决这一问题，该团队遵循了蛋白质数据库（PDB）挖掘策略，通过在PDB中搜索SAH结合袋，通过筛选最终获取到了11种有效的SAH替代结构。通过SHA替代结构与Cy5荧光基团相结合，最终得到了有效的Trmd（独特的SAM辅助因子的开口折叠结合模式而闻名的非罗斯曼折叠的甲基转移酶）荧光探针Cy5TPD。图6.PDB挖掘策略获得候选探针Cy5-TPD该团队随后对所有三种探针（FTAD、Cy5TAD和Cy5TPD）进行了制备规模的验证，这些探针对所研究的MTase靶点都有效。对于生物物理表征，通过MST/FP测定了探针-靶标结合亲和度。图7.三种候选探针结构与对应甲基转移酶值unsetunset四、研究结果与讨论unsetunset1. 荧光探针筛选的流程图确定该团队随后提出了一个利用流程化示意图的形式对不同甲基转移酶进行荧光探针筛选。首先如果该甲基转移酶没有晶体结构，就进行FTAD与Cy5TAD两种荧光探针的测试，如果不能使用，则考虑使用SAH的替代结构进行进一步探针筛选。而对于晶体结构存在的甲基转移酶，则主要考虑MTase结合袋的灵活性决定了B’-因素与SAH分子在晶体结构中的构象，如果该结构为柔性的，则考虑使用FTAD探针，而刚性的则需要考虑SAH分子在晶体中的构象，如果是SAH在该晶体构象中是延展结合的，则使用Cy5TAD这一探针，如果是扭曲结合的，则使用Cy5TPD这一探针。图8.探针选择的流程示意图2. 抗癌药物靶点METTL1的高通量药物筛选最终，该团队利用新鉴定的Cy5TAD探针对尚未开发的抗癌药物靶点METTL1进行高通量药物筛选，通过对2230种候选药物的内部库的筛选来找出能够靶向METTL1的先导药物。候选药物库被加入到由重组表达的METTL1蛋白（1µM）、Cy5TAD探针（20 nM）以及最终药物化合物浓度200µM组成的混合液中（图9A）。将那些能够至少置换出50%（<20 mP）Cy5TAD探针且不干扰探针荧光性质的化合物定义为筛选命中物。图9.利用Cy5TAD对METTL1进行高通量药物筛选利用该筛选方案，作者最终筛选到三种有抑制活性的METTL1抑制剂（图9B），进一步研究结果表明，与泛甲基转移酶抑制剂SAH不同，这三种抑制剂在METTL3/14，DNMT2，Trmd等甲基转移酶上并不具有抑制能力。进一步研究机制表明，通过METTL1/WDR4抑制作用筛选活性化合物（500µM）的³H闪烁分析显示，仅(S)-crizotinib和广谱甲基转移酶抑制剂Sinefungin能够抑制METTL1/WDR4甲基转移酶（CPMA）的活性（图9D）。作者最终通过FP（=138µM）、ITC（ =177µM）、SPR（=178µM）和酶抑制（=158µM），最终确认(S)-crizotinib是一种有效的METTL1抑制剂。unsetunset五、总结展望unsetunset研究的创新性：（1）Click Chemistry技术是一种具有高选择性、高产率和快反应速率的化学反应，在生物大分子标记和超分子结构构建方面得到了广泛应用。其基本机制是通过炔烃和叠氮化物的1,3-偶极环加成反应形成1,2,3-三唑，本文通过该方法快速构建甲基转移酶抑制剂探针，快速筛选得到所需要的甲基转移酶荧光探针。（2）作者对不同类型的甲基转移酶，构建了一个简单的筛选系统，对于后续其他甲基转移酶荧光探针的选择具有重要意义。unsetunset参考文献：unsetunset(1) Meidner, J. L.; Frey, A. F.; Zimmermann, R. A.; Sabin, M. O.; Nidoieva, Z.; Weldert, A. C.; Hoba, S. N.; Krone, M. W.; Barthels, F. Nanomole Scale Screening of Fluorescent RNA-Methyltransferase Probes Enables the Discovery of METTL1 Inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl 2024, 63 (48), e202403792.(2) Zimmermann, R. A.; Schwickert, M.; Meidner, J. L.; Nidoieva, Z.; Helm, M.; Schirmeister, T. An Optimized Microscale Thermophoresis Method for High-Throughput Screening of DNA Methyltransferase 2 Ligands. ACS Pharmacol Transl Sci 2022, 5 (11), 1079-1085.投稿人：段吉隆责任编辑：许燕红