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▲体内CAR疗法-全球研究与发展格局（2025）免费领取！  理论篇| 靶向实体瘤的CAR-M巨噬细胞药物开发 CAR结构设计|靶向实体瘤的CAR-M巨噬细胞药物开发 本文是我们推出的靶向实体瘤的CAR-M药物开发系列的第三篇文章，本来两周前稿子已完成，准备在理论篇发布后的次日推送本文—工艺篇。然而，发生了一件令人极其沮丧的事情：写好的稿子存在公众号草稿箱里，被我手贱一键删除了，近万字的长文，瞬间一个字也找不到了，心情顿时跌入谷底。总不能，就这样子算了吧，硬着头皮，重新开始查找资料重新码字，并且，将重点放到CAR-M制备工艺上面来。一点点写，终于在今天完稿了。相信大家看完以后，对于体外CAR-M和体内CAR-M的工艺路线差异会有一个较为清晰的认知。希望朋友多点赞支持，这篇实在是写的艰难了。 目前，CAR-M 药物可分为：离体 CAR-M(Ex vivo)和体内 CAR-M(In vivo)。起初，不管是 Carisma，还是国内的鲲石、元迈等公司都在全力开发离体 CAR-M 药物，然而，随着 mRNA-LNP 技术成功商业化，In vivo CAR-T 的风潮袭来，Carisma 竟终止离体 CAR-M 药物的独立开发，选择与 Moderna 合作，All in 体内 CAR-M 药物。实际上，Carisma 首个离体 CAR-M 药物 CT-0508 项目的临床 1 期数据非常好。Carisma 骤然改变工艺路线，放弃已有的成果，除了面临巨大的资金压力，得靠 Moderna 回血以外，实在是近一年多以来，In vivo CAR-T 太火了。体外 CAR-M 药物在制备过程中，工艺繁琐，涉及白细胞单采、巨噬细胞分化、病毒载体生产、病毒转导等多个环节，更重要的是，巨噬细胞在体外的增殖能力极其有限，很难进行大规模培养，反观体内 CAR-M 的制备工艺，尤其是采用 mRNA-LNP 作为技术路线时，工艺变得极其简单，还易于大规模制备，方便储存。In vivo 好处很多，但是，要想实现，首当其冲要解决的一个难题是：如何把编码 CAR 的基因精确并且高效地递送至体内的巨噬细胞？这种递送挑战可以说是地狱级别的。一旦解决了，体内 CAR-T/M/NK 便会遍地开花，mRNA 技术也会迎来梅开二度，再度爆火。 本期内容，我们想跟大家分享一下离体和体内 CAR-M 药物的制备工艺。 1 离体 CAR-M 药物工艺（Ex vivo） 2024 年 12 月，鲲石生物研发团队在 STAR Protocol 发表文章：Protocol for generating of human CAR-engineered macrophages by Vpx-containing lentivirus，他们将基于病毒载体生产离体 CAR-M 的工艺路线划分为 4 个部分：构建病毒质粒载体，病毒生产，巨噬细胞制备，病毒转导。在体外将外源 CAR 基因（质粒或者 mRNA）导入靶细胞的递送工具主要有慢病毒载体、腺病毒载体及其他的非病毒载体（例如，LNP 或者电转等）。根据巨噬细胞来源，离体 CAR-M 药物可分为源自 PBMC-CAR-Mac 和源自 IPSC-CAR-Mac。从患者自身的 PBMCs 中采集单核细胞，使其在体外分化为巨噬细胞，然后，通过递送载体导入外源 CAR 基因，则可制备 CAR-Macrophage；如果将表达 CAR 的单核细胞回输至体内再分化为巨噬细胞，则可制备 CAR-Monocytes。将患者自身细胞重编程为诱导多潜能干细胞，并且导入外源 CAR 基因，再让其在体外分化为巨噬细胞，则可制备 IPSC-CAR-Mac。离体 CAR-M 药物虽说工艺繁琐，但是，能够严格保证 CAR-M 药物的质量和均一性，此外，还易于利用基因编辑技术对巨噬细胞基因组进行改造，制备 Edited CAR-Mac。 1.1 慢病毒载体 慢病毒载体是基于逆转录病毒科慢病毒属里面的病毒进行改造的，最常见来源有 HIV-1，HIV-2，SIV（猴免疫缺陷病毒）等。慢病毒基因组为两条相同的单链正链 RNA，一经感染宿主细胞，便利用反转录酶将其 RNA 转录成 cDNA，让后将其 DNA 整合至宿主基因组上，并可长期表达病毒基因，因此，研究人员通过拆分慢病毒基因组，使其作为基因递送工具，实现外源靶基因在宿主细胞的稳定持久表达。 慢病毒基因组最为显著的特征是在 5’/3’末端拥有 LTR（长末端重复序列），含有基因表达、逆转录和整合到宿主基因组所需要的元件。慢病毒基因组编码的蛋白可分为 3 类：第一，所有的慢病毒均表达的 3 种主要病毒蛋白—gag/pol/env；第二，2 种病毒调控蛋白—tat/rev；第三，其他辅助病毒蛋白—vif/vpr/nef 等。gag 编码核心结构蛋白，pol 编码逆转录酶和整合酶，env 编码包膜蛋白。不同的慢病毒，含有不同的辅助蛋白，例如，Vpx 存在于 HIV-2/SIV，但在 HIV-1 中不存在 Vpx。 慢病毒载体的包装系统经历了三次升级。第一代 HIV-1 衍生的慢病毒载体质粒系统包括以下部分：(1)一个含有Ψ（RNA 包装信号）的转移质粒，携带靶基因，也称为靶基因表达质粒;（2）一个包装质粒，除 gag 和 pol 外，还包含有辅助基因及调节基因；（3）一个包膜质粒。在包膜质粒中，用异源病毒的糖蛋白基因 VSV-G 替换 HIV-1 env 基因，这一过程称为假型（pseudotyping），目的是提高慢病毒感染的宿主范围，因为 HIV-1 的 env 蛋白只能结合表达 CD4+受体的宿主细细胞。需要注意的是，包装质粒 DNA 的序列中缺乏Ψ，使得转录的病毒 RNA 不会被包封到病毒颗粒中，因此，最终产生的是一个没有复制能力的病毒。 在第二代 HIV-1 衍生的慢病毒载体质粒系统中，将有助于致病的辅助基因 vif/vpr/vpu/nef 从包装质粒序列中删除，使得 HIV-1 病毒基因数量从 9 个减少至 4 个。即使发生多个重组事件，形成具备复制能力的逆转录病毒的机会也大大减少，慢病毒载体的安全性得到提升。 在第三代 HIV-1 衍生的慢病毒载体质粒系统中，修改天然的 5'LTR 序列，引入异源启动子，使得慢病毒的转录不再需要 tat，从而将 tat 从包装质粒序列中删除。然后，将剩余的 HIV-1 包装质粒拆分为两个包装质粒，一个含有 gag 和 pol，另外一个含有 rev。这些改造主要是为了减少转移质粒和包装质粒之间的重组概率，降低产生复制能力的逆转录病毒的风险。 HIV-1 慢病毒载体在神经细胞、肝细胞、脑细胞和其他组织细胞中表现出很高的转导效率，然而，它们感染人类原代髓系细胞的能力极差。在 HIV-1 病毒早期感染阶段，人单核-巨噬细胞中的限制因子 SAMHD1 会水解 dNTP，耗竭用于病毒 cDNA 合成的 dNTP 库，从而阻止 HIV-1 感染。与此形成反差的是，HIV-2/SIV 病毒中存在的 Vpx 辅助病毒蛋白会引起 SAMHD1 的降解，从而使得宿主细胞内的 dNTP 浓度恢复至病毒复制所需要的水平，实现成功感染。有趣的是，Vpx 仅存在于 HIV-2/SIV，在 HIV-1 中不存在 Vpx。如果我们让 HIV-1 慢病毒载体中携带 Vpx，是否能够提升其转导巨噬细胞的效率呢？ 鲲石生物尹秀山等人改造基于 HIV-1 的第二代慢病毒载体质粒系统，一方面将 Vpx 结合基序插入到包封质粒 psPAX2 Gag 的 C 端形成 psPAX2-mut 质粒，另外一方面将 Vpx 基因插入到包膜质粒 pMD2G 上形成 pMD2G-Vpx 质粒，以允许 Vpx 与 VSV-g 包膜蛋白共表达。pMD2G-Vpx 和 psPAX2-mut 转染 293T 细胞生成包封有 Vpx 的慢病毒颗粒，其对人巨噬细胞的感染效率可达到 74%，与此相反，常规包膜质粒 pMD2G 和 psPAX2 在 293T 细胞中生产的慢病毒颗粒感染原代人巨噬细胞的效率仅有 3%。此外，在 Vpx-慢病毒感染的原代人巨噬细胞中还发现 SAMHD1 含量发生显著下降[1]。 Michael Klichinsky 等人在第三代慢病毒载体质粒系统（pVSV-G/pRSV-Rev/PMDL-CHP6）中额外添加 pVPX 质粒，与携带 CAR 基因的慢病毒表达质粒，构成 5 质粒包封系统，共转染 293T 细胞，产生携带 Vpx 的慢病毒。Vpx-慢病毒可成功感染 THP-1 细胞，制备 CD3ζ-CAR-M 细胞，靶向 CD19/HER2/MSLN 细胞，表现出抗原特异性的吞噬活性[2]。 1.2 腺病毒载体 腺病毒载体是首个应用于人体的基因递送载体，由腺病毒（adenoviral）改造而成。腺病毒属于无包膜病毒，其病毒衣壳呈典型的二十面体对称结构，由 252 个病毒衣壳粒组成；这些衣壳粒又分为两类，分别是 240 个六邻体（hexons）和 12 个五邻体（pentons）。每个五邻体的末端会延伸出细长的纤突蛋白（fiber protein），该蛋白顶端的球形结构被称为纤突结（fiber knot），而纤突结(fiber knob)的核心功能是与宿主细胞表面的吸附受体相结合。 腺病毒家族目前有 52 个已知血清型，分为 6 个亚群。目前最常用的腺病毒载体为 Ad5，即血清型为 5 的腺病毒，属于 C 亚群。各个血清型纤突结的编码序列存在很大差异，正是这些差异导致不同血清型的腺病毒识别不同的吸附受体。B 组腺病毒(Ad35 等)采用 CD46 作为吸附受体，而其他各种组腺病毒均采用 CAR(coxsackievirus-adenovirus receptors)作为其吸附受体。原代人巨噬细胞表面高表达 CD46，恰好是 B 组腺病毒的吸附受体，因此，将 Ad35 型腺病毒的纤突结插入到 Ad5 腺病毒中，获得一种"改外壳"的腺病毒杂合载体 Ad5F35。Michael Klichinsky 等人使用 Ad5F35 嵌合病毒载体转导原代人巨噬细胞，成功在细胞表面高效表达 CD3ζ-CAR。 腺病毒的基因组为线性双链 DNA，其末端带有 ITR 序列（即长倒置末端序列），紧邻 ITR 序列的是包装信号 Ψ。从功能划分来看，腺病毒基因组主要包含两类基因：一类是病毒 DNA 复制前期表达的 E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4 基因，它们负责编码病毒调节蛋白；另一类是 DNA 复制后期表达的 L1～L5 基因，主要编码病毒结构蛋白。 在第一代腺病毒载体中，基因组的 E1/E3 区域被删除，这部分缺失区域成为外源靶基因的插入位点。其中，E1 基因为腺病毒复制所必需，删除 E1 后，腺病毒便无法完成自身复制；而 E3 基因编码的蛋白，主要通过改变抗原呈递、抑制细胞因子及触发凋亡等方式破坏宿主细胞的免疫反应，且该基因并非腺病毒复制的必需条件，因此删除 E3 可减少宿主的免疫反应。与慢病毒相比，腺病毒基因组不会整合到宿主基因组中，其感染宿主细胞后，能快速启动基因表达。 目前广泛应用的腺病毒包装系统主要包括 pAdEasy 系统与 pAdMax 系统。其中，pAdEasy 系统由三部分构成：一是携带外源靶基因的穿梭质粒，二是携带腺病毒基因组的骨架质粒，三是作为宿主的原核细胞（BJ5183）。该系统的包装流程为：先将线性化后的穿梭质粒与环状骨架质粒共同转化至 BJ5183 感受态细胞中，借助同源重组机制，使外源靶基因整合到腺病毒基因组内，从而获得重组腺病毒基因组；最终，将线性化的重组腺病毒基因组质粒转染至 HEK-293 细胞，即可包装得到携带外源基因的重组腺病毒。与依赖同源重组的 pAdEasy 系统不同，pAdMax 系统利用 Cre-loxP 或 FLP-frt 位点特异性重组酶介导重组过程：将穿梭质粒与骨架质粒共转染至 HEK-293 细胞后，通过上述重组酶的作用，两种质粒在细胞内发生特异性重组，进而包装形成重组腺病毒。 除上述两种主流系统外，Michael Klichinsky 等人还采用了第三种腺病毒包装系统。该系统通过酶切连接的方式，直接将外源基因插入腺病毒基因组质粒中，待腺病毒重组质粒线性化后转染至 HEK–293 细胞，最终成功包装出携带 CAR 基因的 Ad5F35 嵌合腺病毒。 1.3 PBMC-CAR-Mac 生产工艺 我们前面提到，基于患者 PBMCs 制备的 CAR-PMac 药物，可分为 CAR-Macrophage 和 CAR-Monocytes，其对应的药物代表分别为 Carisma 开发的 CT0508 和 CT0525。CT0508 是 Carisma 公司利用 Ad5F35 嵌合腺病毒载体制备的一款靶向 HER2 的 离体 CAR-M 药物，也是全球首款进行临床试验的 CAR-M 药物，那它是如何被生产出来的呢？首先，需要从患者外周血中采集白细胞。从外周血中采集白细胞时，需要提前注射非格司亭（粒细胞集落刺激因子），剂量为 10μg/kg/每天，持续注射 4 天，旨在进造血祖细胞迁移至外周血中，提升单核细胞数量。接着，从采集到的白细胞（主要成分为 PBMCs）中分离出 CD14+单核细胞，并且在 GM-CSF(粒细胞-单核细胞集落刺激因子)刺激下，使单核细胞分化为巨噬细胞。最后，使用制备好的携带 CAR 基因的 Ad5F35 腺病毒颗粒转导巨噬细胞，使其细胞表面成功表达 HER2-CAR，便得到最终的 CAR-M 药物。从血液采集到冻存 CAR-M，整个生产工艺周期为 7 天。此外，在旧文康德赛|巨噬细胞的GMP级别生产与mRNA技术改造，我们曾详细介绍过 PBMCs 来源的 GMP 级别巨噬细胞制备所需的设备和工艺流程，感兴趣的朋友可以回顾查阅。CT0525 是对 CT0508 工艺的一种简化升级，不需要在体外将采集到的单核细胞分化为巨噬细胞，而是直接用携带 CAR 基因的 Ad5F35 腺病毒颗粒转导单核细胞，然后，将表达 CAR 的单核细胞回输至病人体内，让其自行在体内分化为 CAR-M 巨噬细胞。 1.4 IPSC-CAR-Mac 生产工艺 诱导多能干细胞（iPSC）是通过对已分化的体细胞进行重编程，使其回到多能状态，从而具备自我更新能力和分化为不同细胞类型的潜力。2020 年，赛元生物张进团队开启利用 iPSC 制备 CAR-iMac 的研究，其制备工艺主要分为以下三大核心步骤[3]： 第一步：健康供体 PBMCs 重编程为 iPSCs 。首先，通过电转将编码重编程因子的游离型质粒导入来自健康供体的 PBMCs 中，启动重编程过程；随后，需逐步更换培养基，从初始的 H3000+CC100 培养基过渡至 E8 培养基（无饲养层 iPSCs 专用培养基），以适应 iPSCs 的生长需求；通常在电转后 15~25 天，可在培养体系中观察到 iPSC 克隆，此时需挑取形态良好的克隆进行后续培养；长期培养过程中，采用 Matrigel Matrix（来源于天然胞外基质成分)作为培养基质，为 iPSCs 提供贴近体内的生长微环境，维持其多能性。 第二步：携带 CAR 基因的慢病毒感染 iPSCs 。首先，将 pMD2G、psPAX2 两种辅助质粒与携带 CAR 基因的穿梭质粒共同转染 HEK-293 细胞，包装出携带 CAR 基因的重组慢病毒；待慢病毒包装完成并测定滴度合格后，使用该慢病毒感染已获得的 iPSCs，使 CAR 基因稳定整合至 iPSCs 基因组中，获得 CAR-iPSCs。 第三步：CAR-iPSCs 分化为巨噬细胞该步骤是将 CAR-iPSCs 定向诱导为功能成熟的巨噬细胞。赛元生物曾公开相关专利《一种用于干细胞分化成巨噬细胞的培养基及方法》，其核心技术是在培养过程中通过依次更换六种专用培养基，模拟巨噬细胞体内发育的微环境信号，逐步引导 CAR-iPSCs 经历诱导中胚层、造血干细胞定向分化、髓系细胞扩增、单核细胞分化等阶段，最终分化为具有靶向杀伤功能的 CAR-iMac（CAR 修饰的诱导多能干细胞来源巨噬细胞）。 1.5 Edited CAR-Mac 生产工艺 旧文，我们介绍的重点在于如何通过 CAR 设计来增强巨噬细胞的抗肿瘤活性，但是，CAR-Mac 回输至病人体内后，在肿瘤微环境中容易转变为抑炎型巨噬细胞，进而失去抗肿瘤功能。此外，CAR-IPSC 在分化为成熟巨噬细胞的过程中，也可能很难保证持续的促炎表型。因此，赛元生物张进团队利用 CRISPA 基因编辑技术对于 IPSC 的代谢通路或者表面受体进行改造，使其可维系长久的促炎活性，增强抗肿瘤活性。目前，张进团队在开发 Edited CAR-Mac 方向上做了两方面的尝试： （1）衣康酸通过烷基化使得 KEAP1 失活，促进 NRF2 的积累和核转位，最终抑制促炎基因的转录，增强抗氧化基因的转录，而 ACOD1 是负责衣康酸产生的唯一酶。张进等人在 CAR-iMac 中发现敲除 ACOD1 基因会降低免疫代谢物衣康酸盐的水平，使 KEAP1 能够阻止 NRF2 进入细胞核以激活抗炎程序，从而实现更持久的促炎状态，增强释放 ROS，提升吞噬活性和细胞毒性[5]。 （2）唾液酸（Sialic acid）是一种带负电荷的 9 碳糖，在肿瘤细胞表面高表达，并且能够将其分泌到 TME。大多数免疫细胞表面表达 Siglecs（唾液酸结合受体），识别结合肿瘤细胞表面的唾液酸后会传递免疫抑制信号。赛元生物张进团队发现 MSLN-CAR-iMac 在分化和成熟过程中，Siglecs 家族成员的基因表达水平显著上升，这些高表达的 Siglecs 成员与肿瘤细胞表面的唾液酸结合后，会抑制 CAR-iMac 的激活和吞噬活性。他们利用基因编辑技术将 CAR-IPSC 细胞中的 Siglec-5 和 Siglec-10 基因双敲除，待其历经 28 天分化为成熟的巨噬细胞 DK-CAR-iMac，发现其 M2 型巨噬细胞比例显著降低，而对肿瘤细胞的吞噬活性和毒性得到显著增强[4]。 1.6 质量控制 在 CAR-M 药物回输患者之前，需对其质量进行严格检测。在 CT0508 的Ⅰ期临床试验中，流式细胞术检测结果显示：CAR-M 细胞的平均活率达 86.39%，平均纯度达 86.78%，CAR 的平均转导效率达 79.28%。为评估 CT0508 的杀伤活性，研究采用了两种对该 CAR-M 药物敏感性不同的肿瘤细胞系。结果表明，CT0508 对过表达 HER2 的人乳腺癌细胞系 AU565 表现出强烈的杀伤活性，而对过表达 HER2 的人卵巢癌细胞系 SKOV3 则表现出较弱的杀伤活性。研究将 CT0508 的吞噬活性定义为表达 GFP 的靶细胞在巨噬细胞中的占比。实验发现，与未表达 CAR 的对照组巨噬细胞相比，CT0508 与 AU565 或 SKOV3 共孵育后，均表现出显著的吞噬活性。 单细胞转录组学（scRNA-seq）分析促炎基因表达水平显示，相较于未表达 CAR 的巨噬细胞，CT0508 呈现出明显的促炎极化特征。此外，与其他非特异性抗原（如 MSLN）刺激相比，在 HER2 抗原刺激下，CT0508 能分泌更高水平的促炎细胞因子和趋化因子。利用可同时检测转录组与细胞表面蛋白的单细胞测序技术 CITE-seq，对 CT0508 及其前体单核细胞进行分析，结果再次证实 CT0508 已彻底分化为促炎型巨噬细胞。 2 体内 CAR-M 药物工艺（In vivo） 2022 年 1 月 7 日，美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的 Jonathan A. Epstein 等人在 Science 上发表文章：CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury ，他们采用 T 细胞靶向性的 CD5-LNP 递送 FAP-CAR-mRNA(靶向成纤维活化蛋白)，将其注射到心力衰竭小鼠模型中，从而在小鼠体内产生瞬时有效的 CAR T 细胞群，使其能够消融病理性激活的成纤维细胞，从而减轻心脏纤维化，修复损伤后的心脏功能。这项研究正式开启了体内 CAR-T 研究的热潮，同时，考虑到体内高丰度的巨噬细胞，也有人开始尝试如何在体内高效生成 CAR-M，利用其抗原特异性的吞噬效应，更好地攻克实体瘤。 2.1 外泌体靶向递送 CAR-mRNA 在小鼠肺癌组织内发现大量浸润的巨噬细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和肺泡巨噬细胞（AM）。基于这一点，中山大学附属第五医院黄曦团队想在小鼠肺部原位生成 MSLN-CAR-M 细胞，以靶向 MSLN 阳性的肺癌细胞，达到抑制肿瘤生长的治疗效果。他们选择将 MSLN-CAR mRNA 递送至肺癌组织内的巨噬细胞中，那么，就必须找到一种高效精确的递送载体。 2018 年，苏黎世联邦理工学院 Ryosuke Kojima 等人开发了一种包封特定 mRNA 的 EXOtic 外泌体递送系统—实现在工程化的哺乳动物细胞中高效、可定制地生产设计外泌体。EXOtic 系统由 RNA 包装系统、靶向系统及胞质递送辅助系统构成。RNA 包封系统由 C/D box RNA 结构元件与古细菌核糖体蛋白 L7Ae 组成，其机制为：嵌入到 CAR-mRNA 3'UT 序列中的 C/D box RNA 结构元件与与 L7Ae（与外泌体最为广泛的标记物 CD63 融合表达）特异性结合，从而使得 CAR-mRNA 被包封进入外泌体。靶向系统由能够与靶细胞表面受体发生特异性结合的 scFv 与跨膜蛋白 lamp2b 融合表达而成。胞质递送辅助系统由 Cx43-S368A（Cx43 突变形式，具有长久活性）构成，其机制为：富集于外泌体表面的 Cx43(间隙连接蛋白)会形成六聚体通道，这将有利于 mRNA 从外泌体转移至靶细胞细胞质[6]。 基于 EXOtic 外泌体靶向递送系统，黄曦团队构建了三种慢病毒表达质粒：anti-CD206-LAMP2-neo(新霉素)负责外泌体靶向 M2 巨噬细胞表面标记物 CD206；CD63-L7Ae-P2A-Cx43S68A-Hygro(潮霉素)负责外泌体包封 mRNA 及胞质释放 mRNA；MSLN-CAR-C/D box-Puro(嘌呤毒素)负责转录 C/D box 元件的 CAR-mRNA。将上述质粒分别与慢病毒包装辅助质粒共转染 293T 细胞，能够产生三种携带不同抗生素标签的重组慢病毒。随后，用三种慢病毒依次转导 HEK293T 细胞，在进行下一轮病毒转导之前，完成每一轮转导成功克隆的筛选，最终得到能够稳定产生 MSLN-CAR mRNA@aCD206 sEVs 的单克隆细胞系。将获得的单克隆细胞系在含有无外泌体胎牛血清的 DMEM 培养基中扩增 2 天。之后，收集细胞培养上清液，并使用差速离心从培养基中分离得到 MSLN-CAR-mRNA@aCD206 sEVs，由此制备出一种可靶向 M2 巨噬细胞、内部包封 MSLN-CAR-mRNA 的外泌体制剂。 考虑到静脉注射导致 sEV 主要在肝脏和脾脏中积累，研究人员将 CARmRNA@aCD206 sEV 外泌体通过吸入式给药递送至 MLSN 阳性的肺癌小鼠模型体内，结果显示，CARmRNA@aCD206 sEV 具备良好的肿瘤浸润能力，聚集在肺部肿瘤组织内，凭借 CD206 scFv 的靶向性，能够将 CAR mRNA 精准递送给巨噬细胞，促使原位 MSLN-CAR-M 巨噬细胞的产生，在 CAR 介导下靶向吞噬 MSLN 阳性肿瘤细胞，触发适应性免疫反应，有效抑制肿瘤生长[7]。 2.2 去核间充质干细胞靶向递送 CAR-Plasmid 多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的颅内肿瘤之一，目前尚无有效的治疗方法。在 GBM 肿瘤组织内，浸润性小胶质细胞/巨噬细胞（GAM）比例占到 30%~50%。基于这一点，郑州大学史进进等人利用去核间充质干细胞（eMSCs）将 CD133-pCAR 质粒递送至颅内胶质瘤部位，原位生成 CAR-M 细胞，达到抑制肿瘤生长的目的。具体来说，该治疗方法包括两个核心要点： 第一，设计 CD133-CAR 结构。与正常组织相比，GBM 组织高表达 CD133，且 CD133 水平与病人存活率呈负相关，说明 CD133 可作为肿瘤治疗的理想靶标。 第二，去核间充质干细胞作为编码 CD133-pCAR 的递送载体，以自身凋亡实现巨噬细胞的精准靶向递送。eMSCs在细胞核移除后仍保持固有的肿瘤趋向迁移能力，但是，无法长期生存，大约在 60 小时活性后即启动程序性细胞凋亡。该凋亡过程以磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和表面暴露为特征，产生特异性"吞噬信号"从而促进巨噬细胞高效识别。 采取细胞松弛素 B 处理小鼠脂肪源性间充质基质细胞（MSCs），通过梯度超速离心获得 eMSCs。首先，将 CD133-pCAR 质粒、Zn2+离子及 NLS（核定位序列肽）混合以制备 NP/pCAR，然后，将 NP/pCAR 与 eMSCs 孵育便可获得包封 pCAR 的 eMSCs。 值得一提的是，他们还使用 LNP 递送 pCAR，LNP 配方由可电离脂质 DLin-KC2-DMA，辅助脂质 DSPC，胆固醇，PEG 2000-DSPE 构成。然而，在原位胶质细胞瘤小鼠模型中，静脉注射 eMSC/pCAR 要比 LNP/pCAR 表现出更高的递送效率，更加显著的抗肿瘤效果。 2.3 甘露糖修饰 LNP 递送 CAR-mRNA 胰腺导管腺癌（PDAC）占所有胰腺癌病例的 90% 以上，且其五年生存率低于 10%。PDAC一个关键病理特征是广泛的纤维化。超过 90% 的 PDAC 组织由非肿瘤细胞组成，包括癌症相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和细胞外胶原 。这些成分形成一道致密的 “壁垒”，包裹并浸润胰腺癌细胞，阻碍药物渗透和免疫细胞浸润，进而导致耐受肿瘤药物。活化的 CAFs 被认为是维持纤维化屏障最重要的细胞，同时，也是细胞外胶原的主要来源。针对活化 CAFs 的 CAR-T 疗法在心力衰竭（心脏纤维化）中已显示出治疗潜力。然而，由于免疫抑制性的肿瘤微环境，CAR-T 在克服实体瘤中的纤维化和治疗屏障方面仍面临重大挑战。 FAP（成纤维细胞激活蛋白-α）是激活 CAFs 的特异标志物，其高表达与患者预后负相关，因此，FAP 是清除纤维化屏障的理想靶点。中国药科大学杨勇/王文广/李娴静团队希望在体内原位生成靶向 FAP 的 CAR-M 细胞，高效清除掉 CAFs，从而降低肿瘤纤维化屏障，增强化疗药物和免疫治疗对 PDAC 的敏感性。 鉴于 CD206 是 M2 巨噬细胞表面的甘露糖受体，因此，他们选择在 LNP 配方中加入甘露糖，制备甘露糖修饰的脂质体(MLNP)，递送 FAP-CAR mRNA，特异性靶向 M2 巨噬细胞，从而原位生成靶向 FAP 的 CAR-M 细胞。在 PDAC 皮下荷瘤小鼠模型或者原位 PDAC 小鼠模型中，静脉注射 FAP-CAR-mRNA-MLNP+吉西他滨（GEM）或者 PD1 可显著抑制肿瘤生长，延长生存期。 3 小结 在商业化过程中，CAR-M 药物首先选择的工艺路线是离体制备，原因在于在体外用病毒载体将 CAR 基因递送至巨噬细胞的难度较小，并且，病毒载体生产和细胞培养的工艺相当成熟。此外，体外生成的 CAR-M 药物更容易对其进行质量控制，保证均一性。然而，体外 CAR-M 药物的制备是针对每一个病人个体的，无法实现大规模的通用性制备，耗费的人力物力巨大。病人自身的健康状态也会影响体外 CAR-M 的最终质量。相反，In vivo CAR-M 制备，是可以规模化生产和存储的现货型药物，极大降低了生产成本，提升了生产效率。只要能够解决 LNP 靶向递送的问题，基于 mRNA 技术的体内 CAR-M 药物一定会成为未来免疫细胞疗法的经典范例。 参考文献： Enhanced infection efficiency and cytotoxicity mediated by vpx-containing lentivirus in chimeric antigen receptor macrophage (CAR-M).       Human chimeric antigen receptor macrophages for cancer immunotherapy.   A second-generation M1-polarized CAR macrophage with antitumor efficacy.   Targeted glycan degradation potentiates cellular immunotherapy for solid tumors.       Metabolic Reprogramming via ACOD1 depletion enhances function of human induced pluripotent stem cell-derived CAR-macrophages in solid tumors.         Designer exosomes produced by implanted cells intracerebrally deliver therapeutic cargo for Parkinson’s disease treatmen.         Lung metastasis and recurrence is mitigated by CAR macrophages, in-situ-generated from mRNA delivered by small extracellular vesicles.     In vivo generation of CAR macrophages via the enucleated  mesenchymal stem cell delivery system for glioblastoma therapy.   In vivo FAP-CAR macrophages enhance chemotherapy and immunotherapy against pancreatic cancer by removing the fibrosis barrier.         识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

“癌中之王”胰腺癌的突破，比想象中来得更加快。 9月10日，Revolution Medicines（RVMD）公布Daraxonrasib在一线治疗转移性胰腺癌（PDAC）的一期临床结果，单药治疗的客观缓解率（ORR）为47%（18/38），疾病控制率（DCR）为89%（34/38）；Daraxonrasib联合吉西他滨和白蛋白紫杉醇（GnP）方案展现出更高的缓解率，在31例可评估的患者中ORR为55%、DCR为90%，RVMD计划将在2025Q4启动PDAC的一线三期临床。 另外，RVMD也公布了Daraxonrasib在2L+转移性PDAC一期长期随访数据，在携带RAS G12X突变（26例）及任意RAS突变（38例）患者中保持持久的疗效，mPFS分别达到8.5个月和8.1个月，高盛预计Daraxonrasib针对2L+转移性PDAC的全球三期入组将于年底结束，并有望在2026年公布数据。 受临床数据催化，RVMD当日股价大涨14.31%，市值突破85亿美元。 先驱RVMD的突破，必将带动专注KRAS家族靶点的Biotech价值的水涨船高，突破“癌王”所带来的潜在市场价值和情绪价值，必将是巨大的。 01 RVMD一锤定音 按现有的早期临床结果显示，无论是在一线还是二线及以上的PDAC，Daraxonrasib均对现有标准疗法展现出碾压性的优势。 Daraxonrasib成药性经早期临床数据支撑下，RVMD计划推动四个适应症同步进行临床三期验证，除了2L/3L转移性非小细胞肺癌已经进入三期（RASolve301研究）外，在PDAC适应症上，公司的2L转移性PDAC已经进入三期临床（RASolve302研究），并且治疗可切除PDAC的辅助治疗、1L转移性PDAC适应症的三期临床启动也在路上，基本上做到了适应症全域覆盖。 在Daraxonrasib的首发适应症2L转移性PDAC中，在携带RAS G12X突变或携带任何RAS突变患者，其确认ORR分别为35%与29%，DCR则分别为92%与95%，mPFS约8.5个月与8.1个月，mOS达13.1与15.6个月。 现有2L转移性PDAC的联合化疗方案，ORR基本上在个位数，mOS均未超过7个月，Daraxonrasib疗效数据呈现出碾压性的优势。 一线转移性PDAC的早期临床数据Daraxonrasib的单药和联合用药组的ORR分别为47%和55%，而DCR均在90%左右。目前一线PDAC的标准治疗（化疗方案）中最常用的包括改良的FOLFIRINOX方案和GnP方案，前者ORR为31.6%以及mOS在11.1个月，后者ORR大约在23%以及mOS在8.5个月。对比下来，Daraxonrasib的疗效数据存在较大的优势（其中单药组随访时间在9.3个月，且多数患者在数据截止时仍在接受治疗），后续能否将ORR优势转化为强效的OS获益，值得期待。 当然，Daraxonrasib也存在美中不足的地方。 在治疗1L转移性PDAC患者的研究中，无论是一期临床还是未来要进行的三期临床（RASolve303研究），联合GnP组都设计为减量1/3（从单药最高剂量的300mg减到目前200mg），或许是为了更好的平衡疗效和安全性。 对比治疗1L转移性PDAC患者一期临床的两个队列，同样40位患者的队列，Daraxonrasib单药300mg治疗队列的患者≥3级不良反应发生率为35%，而特定的≥3级不良事件仅有1例贫血；而200mg Daraxonrasib联用GnP方案治疗队列的患者≥3级不良反应发生率为58%，而特定的≥3级不良事件包括3例肝毒性反应（2例ALT升高和1例AST升高）。另外，市场也有观点认为一线单药ORR从47%到联合用药ORR的55%的这一缓解深度变化未见显著差异，担忧联合用药策略可能因累积毒性而面临挑战。 这或许能够给后来者提供一些做出Me better的思路。 02 EARS，潜在Me better？ 在海外，嘉越医药授权给美国Erasca的Pan-RAS(ON) 抑制剂JYP0015 (ERAS-0015)，大行Jefferies将其视为潜在的Me better分子。 由于ERAS-0015目前尚未有临床数据，但其对比RVMD的Daraxonrasib，两者均靶向CypA（亲环蛋白A），与CypA形成复合物后与不同RAS蛋白结合达到阻断下游信号传导的目的。 ERAS-0015核心的差异化优势点在于：1）与CypA结合形成复合物后，同时靶向RAS的ON和OFF状态，设计上不区分RAS的GTP/GDP结合状态（Daraxonrasib选择性抑制RAS的GTP结合态）；2）对CypA亲和力更高，较Daraxonrasib高出8-21倍的结合亲和力；3）半衰期更长，可与选择性地与KRAS结合，在目标肿瘤细胞上具有更长停留时间； 从Erascagoing公布的临床前数据看，其具备Me better的潜力。 在KRAS G12D PDAC CDX模型和不敏感的KRAS G12V NSCLC CDX模型中，ERAS-0015仅用1/10剂量便实现了与Daraxonrasib相当的抗肿瘤活性。 另外在体内研究显示，ERAS-0015相比Daraxonrasib具有更优的肿瘤分布和更长的驻留时间。 Erasca预计将在2026年公布ERAS-0015的初步临床数据，目前其临床试验已开始招募患者。截至2025Q2，Erasca的现金余额为3.87亿美元（目前公司市值为4.43亿美元），资金可支持至2028H2。 另外，Erasca的pan-KRAS抑制剂ERAS-4001也将在2026年公布初步临床数据，有望获得先发优势。 03 国产管线：劲方、加科思领衔，一哥闷声干 从现有临床数据角度来看，无论是pan-RAS抑制剂还是KRAS G12D抑制剂，均在PDAC这一适应症中展现出不错的疗效，上市公司中加科思、劲方医药和恒瑞医药等选手名列前茅。 而在pan-KRAS抑制剂的开发上，加科思的JAB-23E73预计是国产管线中进度最快的，目前正在中美进行剂量爬坡试验，预计2026年上半年公布一期数据。 在9月初的业绩会交流上，公司展示了两例PDAC患者的基线与第六周的肿瘤对比图，均展示出部分缓解（PR）的疗效。同时在爬坡剂量下，观察到皮肤毒性（发生率为10%、均为1级），尚未观察到大于3级的肝毒性，初步安全性良好。 正在港交所招股的劲方医药有一款pan-RAS抑制剂GFH276，其路线与RVMD的Daraxonrasib类似，通过与RAS(ON)蛋白形成三元复合物阻断下游信号通路，同样其临床前数据显示：在动物体内仅需Daraxonrasib的1/10剂量即可达到同等的抗肿瘤效果。目前，GFH276已在国内获批I/II期临床，用于治疗RAS突变阳性或KRAS扩增的晚期实体瘤患者。 不过，劲方医药目前价值占比最大的部分在KRAS G12D抑制剂GFH375。2025 ASCO大会公布的GFH375/VS-7375最新研究数据显示（经治晚期KRAS G12D突变实体瘤患者，75%的患者入组时已经接受过二线及以上治疗）：在23名可评估的胰腺导管腺癌（PDAC）患者中，ORR达到了52%，DCR更是高达100%，这意味着所有接受治疗的胰腺癌患者的病情都得到了控制或改善。（以上队列患者接受400mgQD、600mgQD或300mgBID治疗） 在二线及以上的胰腺导管腺癌患者缺乏有效治疗手段背景下，GFH375取得这样的疗效数据，显然存在巨大潜力。 除此之外，恒瑞医药的KRAS G12D抑制剂HRS-4642进度也靠前，目前进入临床二期，等待释放进一步的临床数据。 结语：市场愿意给胰腺癌突破性药物如此乐观的市场预期，关键在于目前该领域缺乏有效延长患者OS的创新治疗药物，也就是说全新一代的药物推出，能获得极高的渗透率，并且将给患者等待后续新药物留出一定治疗窗口，无论是市场价值还是时代意义都是拉满的。 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。